Łukasz Czupkałło Ocena systemu RANK/RANKL/OPG w płynie dziąsłowym u kobiet w ciąży fizjologicznej oraz pacjentek ciężarnych z chorobą przyzębia. STRESZCZENIE Choroba przyzębia jest procesem zapalnym polegającym na destrukcji struktur podtrzymujących zęby. Zachwianie równowagi pomiędzy biofilmem płytki bakteryjnej i odpowiedzią immunologiczną organizmu skutkuje w nadekspresji cytokin prozapalnych i następowej destrukcji kości. Na poziomie molekularnym, resorpcja kości regulowana jest poprzez wzajemne oddziaływanie ligandu aktywatora receptora jądrowego NF- κ B (RANKL) i osteoprotegeryny (OPG), czyli systemu dwóch białek należących do grupy białek czynnika martwicy nowotworów (TNF). Odkrycia z ostatnich lat odnośnie białek RANKL i OPG pozwoliły rozjaśnić wcześniej niewyjaśniony fenomem podstaw resorpcji kości. Badania potwierdziły, że zarówno białko OPG, jak i RANKL mogą być wykryte w płynie dziąsłowym, który stał się oknem na świat w nieinwazyjnej analizie wskaźników stanu tkanek przyzębia, potwierdzając podwyższony poziom białka RANKL w chorobie przyzębia, podczas gdy poziom białka OPG obniża się. Resorpcja kości zapoczątkowana jest poprzez związanie białka RANKL z receptorami RANK obecnymi na powierzchni dojrzałych osteoklastów, a także ich prekursorów, co doprowadza do różnicowania i aktywacji osteoklastów. OPG będący inhibitorem RANKL ma skolei przeciwstawne właściwości do RANKL, powodując obniżenie procesu osteoklastogenezy. Mimo wszystko, dokładny mechanizm resorpcji kości nie został do tej pory wyjaśniony. Niewiele jest doniesień naukowych dotyczących wpływu ciąży na utratę przyczepu łącznotkankowego (CAL). Przypuszcza się, że utrata przyczepu łącznotkankowego następuje w wyniku długotrwałego, przewlekłego zapalenia dziąseł, trwającego dłuższy okres czasu od samej ciąży. Celem mojej pracy jest ocena zmian białek szlaku odpowiedzialnego za proces resorpcji kości w płynie dziąsłowym oraz surowicy krwi u kobiet w okresie ciąży fizjologicznej, a więc bez cech zapalenia przyzębia oraz pacjentek ciężarnych z chorobą przyzębia. We współpracy z Wojewódzką Przychodnią Ginekologiczno-Położniczą w Lublinie zbadano parametry kliniczne stanu przyzębia, pobrano płyn dziąsłowy oraz krew, a następnie określono metodą immunoenzymatyczną ELISA stężenie białek szlaku 1
RANKL/RANK/OPG. Przeprowadzono także badania biochemiczne surowicy krwi w kierunku indykatorów stanu zapalnego w przyzębiu tj. aminotransferazy asparaginianowej oraz fosfatazy alkalicznej. Przeprowadzone badania stężenia białek RANKL i OPG u pacjentek ciężarnych w ciąży fizjologicznej oraz ze stwierdzoną chorobą przyzębia miały na celu uzyskanie odpowiedzi na pytania: 1. Czy materiał pobrany ze szczeliny dziąsłowej lub kieszonki przyzębnej może być przydatnym materiałem diagnostycznym? 2. Czy istnieją różnice w stężeniu białek RANKL i OPG w materiale pobranym z kieszonki dziąsłowej lub przyzębnej i surowicy krwi obwodowej? 3. Czy istnieją korelacje pomiędzy poziomami białek RANKL i OPG w płynie ze szczeliny dziąsłowej a ich poziomami w surowicy krwi? 4. Czy istnieje różnica w stężeniu badanych białek (RANKL, OPG) w grupie pacjentek ciężarnych cierpiących na chorobę przyzębia w stosunku do pacjentek z ciążą fizjologiczną (bez stwierdzonego periodontitis)? 5. Jak zmieniają się wskaźniki periodontologiczne w obydwu grupach kobiet ciężarnych? 6. Czy istnieją korelacje pomiędzy stężeniami cytokin OPG i RANKL, a parametrami periodontologicznymi stanu przyzębia w obydwu grupach? 7. Jakie inne czynniki mogą wpłynąć na poziom stężenia badanych białek? Jak zmieniają się poziomy cytokin RANK, OPG, ALP i AST u kobiet ciężarnych w zależności od wieku, wykształcenia czy wykonywanej pracy? Badaniem objęto łącznie 30 kobiet będących w III trymestrze ciąży. Kobiety były pacjentkami Wojewódzkiej Przychodni Ginekologiczno-Położniczej przy Samodzielnym Publicznym Szpitalu Wojewódzkim im. Jana Bożego w Lublinie. Badania zostały przeprowadzone na dwóch grupach pacjentek: - grupie badanej (B) utworzonej przez 12 pacjentek ciężarnych z rozpoznaną badaniem klinicznym chorobą przyzębia, - grupie kontrolnej (K) złożonej z 18 kobiet w okresie ciąży fizjologicznej bez uchwytnej choroby przyzębia (periodontitis). Spotkałem się z obiektywnymi trudnościami z uzyskaniem materiału do badań od pacjentek ciężarnych. W mojej pracy doktorskiej zdecydowałem się na wykorzystanie 2
komórek płynu dziąsłowego i surowicy krwi. Procedura pobrania płynu dziąsłowego jest nieinwazyjna, prosta i tania w wykonaniu, w związku z tym jest przydatną metodą uzyskania materiału komórkowego do badań. Jednakże wiele z badanych kobiet nie chciało się poddać badaniu ze względu na pobranie krwi obwodowej, która jest już inwazyjną metodą, jednakże niezbędną dla przeprowadzenia zaplanowanych badań. Materiał pobierany był zawsze po uzyskaniu pisemnej zgody pacjentki. Przed przystąpieniem do badania każdej pacjentce przedstawiono do wypełnienia kwestionariusz osobowy oraz ankietę odnośnie stanu zdrowia, higieny i ewentualnych nałogów, a także oceniono poziom higieny jamy ustnej. Do oceny stanu przyzębia i dziąseł posłużyłem się wskaźnikami SBI (Sulcus Bleeding Index), PPD (Pocket Probing Depth) oraz CAL (Clinical Atachment Loss). Po przeprowadzeniu badania klinicznego stanu przyzębia kwalifikowałem kobietę ciężarną do jednej z dwóch grup. W kolejnym etapie badania pobierano próbki płynu dziąsłowego oraz krew żylną z żyły łokciowej, po odwirowaniu i zabezpieczeniu zamrażano i transportowano do laboratorium Zakładu Patofizjologii Instytutu Medycyny Wsi w Lublinie celem przeprowadzenia części laboratoryjnej badań. W niniejszej pracy podjąłem się próby oceny znaczenia liganda receptora aktywującego jądrowy czynnik κb i współzawodniczącej z nią osteoprotegeryną oraz znalezienia ewentualnych zależności pomiędzy nimi, wartościami fosfatazy alkalicznej, aminotransferazy asparaginianowj, a parametrami klinicznymi stanu przyzębia. Chororba przyzębia powiązana jest z infekcją bakteriami G-, która skutkuje w lokalnym i ogólnym zwiększeniu poziomów cytokin i prostaglandyn prozaplanych. W zapaleniu przyzębia dochodzi do dowierzchołkowej migracji przyczepu łącznotkanowego, co skutkuje destrukcją kości wyrostka zębodołowgo i tkanki łącznej. Co więcej, istnieje wystarczjąco dużo dowodów na wnikanie tych bakterii do krwioobiegu poprzez mechanizmy angażujące mediatory zapalne, co skutkować może w bezpośrednim wtargnięciu bakterii do płynu owodniowego. Wszelkie patologie w obrębie jamy ustnej przyszłej matki mogą mieć negatywne konsekwekcje dla płodu, wliczając w to niską masę urodzeniową noworodków, przedwczesny poród, a w rzadkich przypadkach nawet obumarcie płodu. Zapalenie dziąseł jest odwracalnym procesem, który nie wpływa na utratę przyczepu łącznotkankowego. W zapaleniu przyzębia zaś dochodzi do nieodwracalnej utraty włókien kolagenowych, tkanek miękkich i kości, co skutkuje w zwiększeniu ruchomości zębów, aż w końcu ich wypadnięcięciem. 3
Jedynie tylko kilka publikacji poświęconych zostało wpływowi ciąży na poziom przyczepu łącznotkankowego przyzębia. Wyniki moich badań wskazują na podwyższony poziom RANKL w płynie dziąsłowym u kobiet ciężarnych z chorobą przyzębia w porównaniu z grupą kontrolną. Poziom RANKL w surowicy krwi pacjentek ciężarnych z dolegliwościami ze strony przyzębia także okazał się wyższy porównując do grupy bez cech zapalnych. W moich badaniach poziomy OPG w surowicy krwi okazały się bardzo zbliżone do siebie. Różnice pomiędzy grupami były nieistotne statystycznie. Przeprowadzone przeze mnie badania udowodniły, że różnice w zawartości OPG w płynie dziąsłowym pomiędzy grupą badaną i kontrolną są istotne statystycznie. Stężenie RANKL wśród kobiet ciężarnych ze schorzeniem przyzębia było 14 razy wyższe w GCF w porównaniu do poziomu w surowicy krwi, natomiast wśród ciężarnych ze zdrowym przyzębiem stosunek ten był niewiele mniejszy (13 razy wyższy). Poziom OPG zaś w płynie dziąsłowym w grupie badanej okazał się być ponad 400 krotnie wyższy, a w grupie kontrolnej ponad 250-krotnie wyższy niż poziomy tej cytokiny w surowicy. Na podstawie analizy statystycznej wyników badań udało się ustalić istotne statystycznie korelacje w grupie badanej pomiędzy stężeniami OPG w surowicy krwi, a płynem dziąsłowym, pomiędzy stężeniem OPG w surowicy krwi, a stężeniem RANKL w surowicy krwi, pomiędzy stężeniem OPG w surowicy krwi, a stężeniem RANKL w płynie dziąsłowym, pomiędzy stężeniem OPG w płynie dziąsłowym, a stężeniem RANKL w surowicy, pomiędzy stężeniami OPG i RANKL w płynie dziąsłowym oraz pomiędzy stężeniami RANKL w surowicy krwi, a płynem dziąsłowym. W grupie kontrolnej zaś stwierdzono istotną statystycznie ujemną zależność liniową pomiędzy poziomami w surowicy krwi cytokin OPG oraz RANKL. W obydwu grupach kobiet zanotowałem wiele istotnych statystycznie korelacji związanych z cytokinami OPG i RANK oraz ze wskaźnikami stanu przyzębia. Pomiary biochemicznych markerów przebudowy tkanki kostnej odzwierciedlają procesy, które zachodzą w obrębie szkieletu i stosowane są często do oceny tempa procesu tworzenia i resorpcji kości. Uznanym markerem kościotworzenia jest fosfataza alkaliczna - 4
enzym charakterystyczny dla dojrzałych i aktywnych osteoblastów. Jest nieswoistym enzymem hydrolitycznym, który jest związany z procesami wapnienia oraz remodellingu tkanki kostnej. Stężenie ALP w ślinie, a tym bardziej w płynie szczeliny dziąsłowej jest nieporównywalnie wyższe u osób z cechami zapalenia przyzębia, niż u pacjentów ze zdrowymi dziąsłami albo zapaleniem dziąseł. Stężenie fosfatazy alkalicznej w surowicy to parametr, który jest najczęściej oznaczany do oceny metabolizmu tkanki kostnej. W moich badaniach zdecydowałem się także na oznaczenie właśnie fosfatazy alkalicznej, jako markera kościotworzenia uzyskując liczne korelacje istotne statystycznie. W badaniu własnym wykazałem także, że w płynie dziąsłowym pomiędzy grupą kontrolną, a badaną istnieją statystycznie bardzo istotne różnice w stężaniach fosfatazy zasadowej oraz w stężeniach aminotransferazy asparaginianowej. W badaniu uzyskałem istotną statystycznie dodatnią korelację jedynie pomiędzy poziomem AST w surowicy krwi z wartością głębokości kieszonki dziąsłowej w grupie kontrolnej. Zdecydowałem się również na określenie stosunku RANKL do OPG w płynie szczeliny dziąsłowej oraz surowicy krwi. Stosunek RANKL/OPG może być uważany za podstawową determinantę metabolizmu kości. W wielu systuacjach resorpcja kości stymulowana jest zarówno poprzez zwiększony poziom RANKL i obniżony OPG, które oddziałują jako sygnały proresorpcyjne. Wskazana jest współpraca lekarzy ginekologów z lekarzami dentystami w celu szerzenia świadomości wśród ciężarnych pacjentek odnośnie konieczności utrzymania właściwej higieny jamy ustnej, a co za tym minimalizacji schorzeń dziąseł i przyzębia. Celowe się wydaje również wprowadzenie obligatoryjnych badań stomatologicznych u ciężarnych na początku oraz w trakcie jej trwania. Potrzeba także większej świadomości wśród przyszłych matek o konsekwencjach wszelkich schorzeń przyzębia dla kobiety ciężarnej, a w szczególności dla płodu. 5