Novazym Products Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email info@novazym.com AmpliQ 5x HOT EvaGreen qpcr Mix Plus (ROX) Gotowy premix zawierający polimerazę hot-start i barwnik fluorescencyjny EvaGreen do prowadzenia analiz ilościowych metodą Real-time qpcr (zawiera barwnik referencyjny ROX) Numer katalogowy produktu EVQ-0500R (500 reakcji) EVQ-1000R (1000 reakcji) Wydanie 1 (Grudzień 2012) Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, NIP 9721099648, email info@novazym.com, www.novazym.com
1. Przeznaczenie Premix przeznaczony jest do prowadzenia ilościowych reakcji PCR z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym (ang. Real-time PCR). W Real-time PCR wykorzystuje się barwniki fluorescencyjne lub sondy molekularne w celu monitorowania przyrostu ilości produktu amplifikacji, w każdym cyklu reakcji, w czasie rzeczywistym. Dzięki temu cała procedura analizy jest bardzo szybka i pozwala wyeliminować etap rozdziału i oceny produktu po zakończeniu reakcji. Umożliwia ona także wgląd w kinetykę reakcji, a co za tym idzie pozwala na oszacowanie ilości DNA w matrycy podanej do reakcji, co jest niemożliwe w konwencjonalnej reakcji PCR. Ponadto ryzyko zanieczyszczenia badanej próby jest minimalizowane dzięki temu, że reakcja i detekcja produktu odbywa się w jednym zamkniętym naczyniu. AmpliQ 5x HOT EvaGreen qpcr Mix Plus (ROX) jest gotową do użycia mieszaniną do prowadzenia analiz qpcr. Premix zawiera wszystkie niezbędne komponenty reakcji, czyli: polimerazę hot-start, mieszaninę ultra czystych dntps [10 pmol/µl], MgCl 2, wiążący się do dsdna barwnik EvaGreen oraz barwnik referencyjny ROX. Aby przygotować reakcję, należy do premixu dodać wodę, startery oraz matrycę DNA. Polimeraza hot-start jest aktywowana przez 15-minutową inkubację w 95 C. Ta właściwość uniemożliwia wydłużanie starterów, które hybrydyzują do matrycy w miejscach niespecyficznych oraz zapobiega powstawaniu dimerów starterów w ni skiej temperaturze podczas reakcji qpcr. EvaGreen jest barwnikiem fluorescencyjnym nowej generacji, który wiąże się ilościowo do dwuniciowego DNA. W przypadku braku dsdna fluorescencja pozostaje na bardzo niskim poziomie (1-4 % false positive). Zakres widma barwnika EvaGreen jest podobny do barwnika SYBR Green, jednak może stanowić lepszą alternatywę do analiz qpcr ze względu na kilka cech tj. wysoka stabilność, nie inhibuje reakcji PCR oraz udowodniono, że nie jest mutagenny ani cytotoksyczny. EvaGreen jest kompatybilny z większością dostępnych platform do analiz Real-time PCR, po ustawieniu tych samych parametrów, jak dla SYBR Green lub FAM. EvaGreen jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy BIOTUM, INC. ROX jest wewnętrznym pasywnym barwnikiem referencyjnym, który umożliwia normalizację sygnału fluorescencyjnego reportera, generowanego w reakcji qpcr. AmpliQ 5x HOT EvaGreen qpcr Mix Plus (ROX) może być z powodzeniem wykorzystywany w następujących aplikacjach: analiza jakościowa i ilościowa materiału genetycznego DNA i cdna profilowanie ekspresji genów detekcja mikrobiologiczna określanie obciążeń wirusowych. 2
2. Zasada działania testu W reakcji Real-time PCR analizowany jest przyrost ilości produktu w czasie rzeczywistym. Przyrost ilości kopii badanej cząsteczki kwasu nukleinowego jest monitorowany w każdym cyklu reakcji amplifikacji. W technice Real-time PCR wyznacznikiem początkowej ilości matrycy DNA w reakcji jest ilość cykli (C T ), po których kinetyka reakcji wchodzi w fazę logarytmicznego wzrostu. Ilość produktu w reakcji PCR wzrasta wykładniczo z każdym cyklem, aż do momentu, wyczerpania się któregoś z komponentów reakcji. Zawartość zestawu Lp. KOLOR ELEMENT 500 reakcji 1000 reakcji [1] Żółty AmpliQ 5x HOT EvaGreen 1 4 qpcr Mix Plus (ROX) [2] Żółty MgCl 2 [25 mm] 1 1 [3] Biały H 2 O MQ do reakcji PCR 1 1 Skład mieszaniny AmpliQ 5x HOT EvaGreen qpcr Mix Plus (ROX) Polimeraza DNA hot-start Bufor reakcyjny 5x EvaGreen qpcr buffer MgCl 2 12.5 mm Mix dntps 10 pmol/µl Barwnik EvaGreen Barwnik referencyjny ROX. Przechowywanie -20 C Chronić przed światłem Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. 3. Przeprowadzenie testu PCR Zalecany program reakcji Real-time qpcr Etap reakcji Denaturacja wstępna Amplifikacja Metoda Ilość Temperatura Czas Pomiar analizy cykli fluorescencji - 1 95 C 15 min - Quantification (2) 40 denaturacja 95 C 15 s - hybrydyzacja (1) 60-65 C 20 s - elongacja 72 C 20 s single Krzywa Melting 1 denaturacja 90 C 15 s topnienia hybrydyzacja 75 C 15 s elongacja 95 C 0 s continuous slope = 0,1 C/s Chłodzenie - 1 40 C 30 s 3
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej [1] Lp. SKŁADNIK OBJĘTOŚĆ STĘŻENIE KOŃCOWE AmpliQ 5x HOT EvaGreen (1) 4 µl [1x] qpcr Mix Plus [5x] [2] Starter forward [10 pmol/µl] 0,16 0,5 µl [80 250 nm] [3] Starter reverse [10 pmol/µl] 0,16 0,5 µl [80 250 nm] [4] [5] Matryca DNA Opcjonalnie MgCl 2 MgCl 2 [25 mm] 1-5 µl [0,01 10 ng/µl] należy dostosować [6] H2O MiliQ do 20 µl RAZEM 20 µl [2.5 5 mm] (1) Premix AmpliQ 5x HOT EvaGreen qpcr Mix Plus [5x] zawiera w swoim składzie MgCl 2 w stężeniu 12.5 mm. Stężenie końcowe MgCl 2 w reakcji 1x PCR wynosi 2.5 mm. Stężenie MgCl 2 zaleca się modyfikować w zakresie 2.5 5 mm. 4. Interpretacja najczęściej spotykanych problemów w reakcji PCR W przypadku braku produktu lub pojawienia się niespecyficznych produktów reakcji PCR zalecamy przeprowadzenie optymalizacji metody poprzez zastosowanie: gradientu temperatury hybrydyzacji starterów w zakresie +/- 5 C od średniej Tm starterów gradientu stężenia MgCl 2 w zakresie od 1.5-5 mm kontroli pozytywnej reakcji, pozwalającej ocenić poprawność przebiegu amplifikacji docelowego produktu kontroli negatywnej reakcji, pozwalającej ocenić czystość odczynników używanych do reakcji PCR (zamiast matrycy DNA do reakcji należy podać tę samą objętość wody). Lot nr Exp. date Ograniczenia w zastosowaniu: Ten produkt został zaprojektowany i wykonany wyłącznie do celów badawczych. Nie został przetestowany w kierunku zastosowania do celów diagnostycznych i do bezpośredniej produkcji leków oraz do celów związanych z produkcją leków. UWAGA! Pewne składniki buforu reakcyjnego oraz buforu służącego do przechowywania mogą działać silnie drażniąco. Radzimy podczas pracy ze wszystkimi związkami chemicznymi przestrzegać ogólnie obowiązujących przepisów BHP. 4
SHORT ENGLISH PROTOCOL Description: AmpliQ 5x HOT EvaGreen qpcr Mix Plus (ROX) is an optimized ready-to-use solution for real-time quantitative PCR assays, incorporating EvaGreen dye. It comprises all the components necessary to perform qpcr: hot-start DNA Polymerase, 10 pmol/µl ultrapure dntps, MgCl 2, EvaGreen dye and ROX reference dye. The user simply needs to add water, template and primers. Hot-start DNA Polymerase is activated by a 15 min incubation step at 95 C. This prevents extension of non-specifically annealed primers and primerdimers formed at low temperatures during qpcr setup. Applications: Detection and quantification of DNA and cdna targets Profiling gene expression Microbial detection Viral load determination Mix Composition: Hot-start DNA Polymerase 5x EvaGreen qpcr buffer MgCl 2 12.5 mm (1x PCR solution - 2.5 mm MgCl 2 ) dntps mix 10 pmol/µl EvaGreen dye ROX dye EvaGreen Dye: EvaGreen is a DNA-binding dye with many features that make it a superior alternative to SYBR Green I for qpcr. Apart from having similar spectra, EvaGreen has three important features that set it apart from SYBR Green I: EvaGreen has much less PCR inhibition, is extremely stable dye and has been shown to be nonmutagenic and noncytotoxic. EvaGreen is compatible with all common realtime PCR cyclers - simply select the standard settings for SYBR Green or FAM! ROX Dye: ROX is an internal passive reference dye used to normalize the fluorescent reporter signal generated in qpcr. Shipping and Storage conditions: Routine storage: -20 C Shipping and temporary storage for up to 1 month at room temperature has no detrimental effects on the quality of AmpliQ 5x HOT EvaGreen qpcr Mix Plus (ROX). Recommended qpcr reaction mix: AmpliQ 5x HOT 4 µl 1x EvaGreen qpcr Mix Plus Primer For [10 µm] 0.16-0.5 µl 80-250 nm Primer Rev [10 µm] 0.16-0.5 µl 80-250 nm DNA template 1-5 µl 0.01-10 ng/µl H2O PCR grade up to 20 µl Recommended qpcr cycles: Initial 95 C 15 min x1 denaturation Denaturation 95 C 15 s Annealing 60-65 C 20 s x40 Elongation 72 C 20 s Safety warnings and precautions: This product and its components should be handled only by persons trained in laboratory techniques. It is advisable to wear suitable protective clothing, such as laboratory overalls, gloves and safety glasses. Care should be taken to avoid contact with skin or eyes. In case of contact with skin or eyes, wash immediately with water. EvaGreen is a registered trademark of BIOTIUM, INC. The purchase of this product conveys to the buyer the nontransferable right to use the purchased amount of the product and components of the product in research conducted by the buyer, w here such research does not include testing, analysis or screening services for any third party in return for compensation on a per test basis. The buyer cannot sell or otherwise transfer (a) this product, (b) its components or (c) materials made using this product or its components to a third party or otherwise use this product or its com ponents or materials made using this product or its components for Commercial Purposes. SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. LightCycler is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc. Some applications this product is used in may require a license which is not provided by the purchase of this product. Users should obtain the license if required.