POLITECHNIKA GDAŃSKA

POLITECHNIKA GDAŃSKA WYDZIAŁ CHEMICZNY KATEDRA TECHNOLOGII CHEMICZNEJ Ćwiczenia laboratoryjne CHEMIA I TECHNOLOGIA MATERIAŁÓW BARWNYCH ANALIZA I CHROMATOGRAFICZNE ROZDZIELANIE BARWNIKÓW ROŚLINNYCH GDAŃSK ROK 2011 1

1. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie Studentów ze strukturą i właściwościami ważnych, powszechnie występujących w naturze barwników organicznych oraz nabycie przez Studentów umiejętności izolacji tych związków z surowców roślinnych z wykorzystaniem metod chromatograficznych. 2. Wprowadzenie 2.1. Karotenoidy Wśród organicznych barwników naturalnych, w zależności od ich struktury, można wydzielić kilka grup, np. barwniki: izoprenoidowe, porfirynowe, flawonoidowe, betalainowe, chinoidowe i inne. Przykładami barwnych związków naturalnych są karotenoidy. Karotenoidy należą do barwników polienowych czyli mających sprzężony układ wiązań podwójnych. Są to jednocześnie związki izoprenoidowe zbudowane z ośmiu jednostek izoprenowych połączonych w ten sposób, że układ reszt izoprenowych jest odwrócony w środku cząsteczki. Karotenoidy obejmują karoteny czterdziestowęglowe związki węglowodorowe oraz ich pochodne zawierające grupy hydroksylowe, ketonowe a także modyfikowane w inny sposób. Tlenowe pochodne karotenów to ksantofile. Karotenoidy występują praktycznie we wszystkich roślinach i są kumulowane w organizmach wszystkich zwierząt. Zidentyfikowano ponad 800 karotenoidów występujących w surowcach naturalnych. Sumaryczny wzór wszystkich karotenów jest taki sam - C 40 H 56, są więc izomerami, które różnią się liczbą pierścieni i liczbą podwójnych wiązań (jedno wiązanie podwójne odpowiada zamknięciu jednego pierścienia). W produktach naturalnych występuje mieszanina kilku do kilkudziesięciu karotenoidów ale są też związki charakterystyczne (dominujące) dla danego produktu. W marchwi takim dominującym związkiem jest β-karoten, w cząsteczce którego występuje 11 wiązań podwójnych w układzie sprzężonym powodując, że roztwór tego związku ma barwę żółtopomarańczową (krystaliczny jest ciemnoczerwony lub brązowy) a maksima absorpcji w widmie UV-Vis występują przy 450 i 478 nm (w heksanie). β-karoten jest najbardziej rozpowszechnionym karotenoidem w produktach naturalnych. 2

β-karoten Widmo UV-Vis β-karotenu Dla pomidorów charakterystycznym karotenem jest likopen. Jest to jaskrawoczerwony związek z niebieskawym odcieniem (λ max =443, 471 i 502 nm w heksanie). likopen Widmo UV-Vis all-trans-likopenu (linia ciągła) i równowagowa mieszanina all-trans- i 13-cislikopenu (linia przerywana) W owocach papryki występuje m.in. czerwony barwnik kapsantyna. 3

2.2. Chlorofile Do najbardziej fundamentalnych barwników na Ziemi należą porfiryny. Podstawowy szkielet cząsteczki stanowi układ 4 pierścieni pirolowych połączonych przez grupy metinowe. Do barwników porfirynowych zaliczany jest chlorofil. Podstawowym układem chromoforowym chlorofili a i b jest chloryna. Jest to porfiryna, w której zewnętrzne wiązanie jednego z pierścieni jest uwodornione. Dla chlorofilu charakterystyczne jest występowanie dwóch grup karboksylowych, z których jedna jest zestryfikowana dwudziestowęglowym alkoholem terpenowym fitolem, a druga metanolem. Niebieskozielony chlorofil a przy C-3 ma grupę metylową a żółtozielony b grupę formylową. W widmie UV-Vis charakterystyczne pasma absorpcji występują: dla chlorofilu a przy 428 i 661 nm a dla chlorofilu b przy 453 i 642 nm (w eterze dietylowym). Chlorofile są związkami mało trwałymi, mogą ulegać szeregu przemianom. W wyższych temperaturach, szczególnie w środowisku kwaśnym, tracą jon Mg 2+. Powstają oliwkowobrunatne feofityny a i b. Dodatkowo zachodzi hydroliza wiązań estrowych. Natomiast w środowisku zasadowym zachodzi hydroliza wiązań estrowych bez usuwania Mg 2+. Powstające chlorofiliny zachowują barwę zieloną, a ich sole (Na +, K + ) są dobrze rozpuszczalne w wodzie. Charakterystyczną właściwością chlorofilu jest możliwość wymiany jonów Mg 2+ na jony innych metali. Wymiana Mg(II) na Cu(II) lub Zn(II) powoduje zwiększenie stabilności zielonej barwy chlorofilu. Chlorofil jest podstawowym barwnikiem chloroplastów ale obok niego występują inne barwniki, m.in. z grupy karotenoidów: karoteny i ksantofile (tlenowe pochodne karotenów, np. luteina, wiolaksantyna czy neoksantyna). 4

Chlorofil a Widma UV-Vis chlorofili: chlorofil a, ----- chlorofil b 5

2.3. Chromatografia kolumnowa Chromatografia kolumnowa polega na rozdzielaniu mieszanin substancji chemicznych poprzez wprowadzenie ich na stałą fazę stacjonarną (adsorbent) umieszczoną w cylindrycznej kolumnie i rozdzieleniu jej na poszczególne składniki przy użyciu ciekłej fazy ruchomej. Typowa kolumna chromatograficzna to rurka szklana o stosunku średnicy do długości od ok. 1 : 15 do 1 : 60. W kolumnie umieszcza się adsorbent. W chemii organicznej najczęściej stosowany jest żel krzemionkowy (adsorbent silnie polarny). Na szczyt kolumny nanosi się mieszaninę związków. Przez kolumnę przepuszcza się odpowiedni rozpuszczalnik (zwany eluentem) lub mieszaninę rozpuszczalników i w wyniku istnienia różnic w sile oddziaływań międzycząsteczkowych dla różnych związków pomiędzy składnikami mieszaniny a fazą ruchomą oraz składnikami mieszaniny a fazą stacjonarną następuje jej rozdzielenie na indywidualne substancje. Związki polarne adsorbują się silniej na polarnych cząsteczkach żelu krzemionkowego, dlatego gdy zastosujemy rozpuszczalnik mało polarny, będą wymywane z kolumny później niż składniki mniej polarne. Odpowiedni dobór rozpuszczalników ułatwia znajomość tak zwanego szeregu eluotropowego, który polega na uszeregowaniu eluentów według wzrastającej mocy elucyjnej (zależnej od stałej dielektrycznej rozpuszczalnika). Dla polarnych faz stacjonarnych kolejność ta przedstawia się następująco: n-pentan < n-heksan < cykloheksan < tetrachlorek węgla < toluen < chloroform < dichlorometan < eter dietylowy < octan etylu < aceton < etanol < metanol Napełnianie kolumny Sposób napełniania kolumny ma decydujący wpływ na poprawne rozdzielanie substancji z użyciem chromatografii kolumnowej. Suchą kolumnę umieścić na statywie w pozycji pionowej. Przy wylocie kolumny umieścić zlewkę lub kolbę stożkową do odbierania eluentu. Do zlewki wlać eluent i wsypać adsorbent. Zamieszać zawiesinę i zanim opadnie na dno, przelać do kolumny (napełnić zawiesiną około 2/3 wysokości kolumny). Odczekać chwilę do ubicia się adsorbentu w kolumnie (ew. lekko postukać wężykiem z PCW). W czasie napełniania kranik powinien być lekko otwarty. 6

Spuścić eluent, aż do momentu gdy wysokość eluentu nad adsorbentem wyniesie ok. 5 mm. Zamknąć kran. Aplikacja próbki na kolumnę Próbka rozpuścić w możliwie jak najmniejszej ilości eluentu. Ostrożnie wprowadzić ją na warstwę adsorbentu. Następnie należy ostrożnie dodać eluent, tak by nie dopuścić do zmieszania się z rozdzielaną próbką. Rozwijanie kolumny i zbieranie frakcji Ostrożnie otworzyć kran. Dolewać rozpuszczalnik starając się utrzymywać stałą jego wysokość nad fazą stacjonarną. Od dołu kolumny odbierać kolejne frakcje w kolbki stożkowe. Proces prowadzić do czasu aż wszystkie analizowane związki opuszczą kolumnę. Należy zapamiętać, że nie należy dopuścić do obniżenia się poziomu rozpuszczalnika poniżej poziomu adsorbentu! 2.4. Chromatografia cienkowarstwowa Rozdzielanie substancji może być zrealizowane również wtedy, gdy faza stacjonarna jest w postaci cienkiej warstwy naniesionej na powierzchnię szkła, folii aluminiowej lub z tworzywa sztucznego. Tak realizowaną chromatografię nazywa się chromatografią cienkowarstwową (Thin Layer Chromatography TLC) lub planarną. I tu najczęściej stosowanym adsorbentem jest żel krzemionkowy. Zalety TLC to prostota wykonania rozdzielania, niski koszt wyposażenia i wykonania, duża czułość, duża szybkość rozwijania chromatogramów, możliwość kontrolowania stopnia rozdzielenia substancji na każdym jego etapie, możliwość przechowywania płytek z rozdzielonymi substancjami czy też możliwość zastosowania różnych metod detekcji. Substancje wzorcowe oraz analizowaną mieszaninę nanosi się na płytkę dopasowaną wielkością do wielkości komory chromatograficznej oraz ilości analizowanych substancji, np. o wymiarach 4x8 cm, punktowo (za pomocą kapilary, plamki powinny być jak najmniejsze), na linię startu zaznaczoną ołówkiem w odległości 0,8-1,0 cm od dolnej krawędzi płytki. Między punktami nanoszenia poszczególnych substancji powinna być zachowana odległość 1 cm. Skrajne plamy 7

startowe powinny znajdować się w odległości nie mniejszej niż 1 cm od brzegu płytki. W przypadku rozcieńczonych roztworów nakłada się je kilkakrotnie w to samo miejsce (susząc płytkę po każdej takiej operacji). Następnie płytkę wstawia się do wcześniej przygotowanej komory chromatograficznej, w której znajduje się 0,5 cm warstwa eluentu. Komora powinna być wysycona parami eluentu (tj. pozostawiona z eluentem na kilka minut, korzystne jest również wyłożenie komory płatkiem bibuły, co ułatwia wysycenie komory parami rozpuszczalników). Chromatogram rozwija się poprzez wędrówkę cieczy w górę płytki, na skutek działania sił kapilarnych. Gdy czoło eluentu osiągnie linię mety (ok. 1 cm od górnej krawędzi płytki) chromatogram wyjmuje się z komory i suszy. Jeśli badane substancje nie są barwne, należy chromatogram wywołać np. za pomocą odpowiedniego odczynnika (powszechnie stosowane jest wywoływanie chromatogramu w parach jodu). Dogodną metodą detekcji jest światło UV. Stosuje się wówczas żel zawierający fluoryzujące dodatki. Cechą każdej substancji identyfikowanej metodą TLC, w określonym układzie chromatograficznym (adsorbent i faza ruchoma) jest tzw. współczynnik Rf (ang. retardation factor), wyznaczany jako stosunek dróg przebytych jednocześnie przez środek strefy migrującej substancji i czoło eluentu: Rf = a b dystans przebyty przez srodek plamki = dystans przebyty przez czolo fazy ruchomej Sposób obliczania współczynnika Rf z chromatogramu Porównanie wartości Rf substancji badanej i wzorca w kilku układach chromatograficznych (przynajmniej trzech) stanowi podstawę do jej identyfikacji. 2.5. Literatura 1. H.T.Quach, R.L. Steeper, G. W. Griffin, J. Chem. Educ. 81, 3 (2004) 8

2. Ćwiczenia laboratoryjne z chemii bioorganicznej, Wyd. Uniwersytetu Opolskiego, P. Kafarski, P. Wieczorek, Opole 1997 3. http://www.chem.uw.edu.pl/zcho/iiirok/izo/izolabb.pdf 4. Ćwiczenia z biochemii, L. Kłyszejko-Stefanowicz; Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999 5. Chemia ogólna, Ćwiczenia Laboratoryjne, red. E. Luboch, M. Bocheńska, J.F. Biernat, Wyd. PG, Gdańsk 2003 Zagadnienia, na które należy zwrócić szczególną uwagę przygotowując się do zaliczenia ćwiczenia to: Budowa chemiczna takich barwnych związków naturalnych, jak: β-karoten, likopen i w uproszczeniu chlorofil (układ porfirynowy). Jakie elementy struktury są odpowiedzialne za barwność tych związków? Chromatografia kolumnowa i szereg eluotropowy rozpuszczalników. Technika chromatografii cienkowarstwowej, wyznaczanie współczynnika R f. 3. Metodyka badawcza W części praktycznej ćwiczenia studenci w największym stopniu będą wykorzystywali techniki chromatograficzne (grawitacyjna, adsorpcyjna chromatografia kolumnowa, chromatografia cienkowarstwowa) a także metody ekstrakcyjne, w celu wyizolowania z surowców naturalnych barwnych substancji organicznych. Do zatężania i odparowywania roztworów wykorzystają odparowywacz rotacyjny. Dodatkowo zarejestrowane zostaną widma UV-Vis wyizolowanych i rozdzielonych substancji. W tym celu wykorzystany zostanie spektrofotometr UNICAM UV300 series. 4. Wykonanie doświadczeń 4.1. Wydzielanie i rozdzielanie barwników z papryki 5 g suchej, sproszkowanej papryki miesza się, silnie wstrząsając, ze 100 ml chlorku metylenu przez ok. 15 min. Po usunięciu nierozpuszczalnej pozostałości z przesączu usuwa się rozpuszczalnik za pomocą rotatora i sporządza widmo UV-Vis mieszaniny produktów barwnych. Mieszaninę tą analizuje się za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, używając płytek pokrytych żelem krzemionkowym. Chromatogram dodatkowo wywołuje się parami jodu. 9

Rozdzielania mieszaniny dokonuje się za pomocą chromatografii kolumnowej. W tym celu do kolumny wlewa się mieszaninę żelu krzemionkowego w chlorku metylenu. Po przygotowaniu kolumny na jej szczyt nanosi się mieszaninę barwników papryki w 2 ml chlorku metylenu i prowadzi się elucję tym rozpuszczalnikiem. Zbiera się poszczególne barwne frakcje i bada ich czystość za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i spektrofotometrii UV-Vis. 4.2. Wydzielanie i rozdzielanie barwników ze szpinaku a). Próbkę rozmrożonego szpinaku należy dobrze odcisnąć między warstwami bibuły. Odważyć 10 g odciśniętego szpinaku i umieścić go w moździerzu. Dodać do niego ok. 15 g bezwodnego siarczanu magnezu (w celu usunięcia reszty wody) i ucierać ok. 10 minut aż do uzyskania pudrowej, gładkiej konsystencji szpinaku (dokonujemy w ten sposób mechanicznej lizy komórek roślinnych, co ułatwi ekstrakcję barwników). Po uzyskaniu jasnozielonej mieszaniny, zawartość moździerza należy przenieść do zlewki i dobrze rozmieszać z ok. 40 ml acetonu. Odstawić na ok. 10 minut, aby osad mógł swobodnie opaść. Następnie należy zdekantować warstwę acetonową do przygotowanej kolbki okrągłodennej (niewielką ilość mieszaniny należy przenieść do fiolki i wykorzystywać tą próbkę do analizy chromatograficznej TLC) i rozpuszczalnik odparować na rotatorze do sucha w możliwie niskiej temperaturze. Pozostałość rozpuścić w ok. 2 ml acetonu i nanieść na szczyt kolumny chromatograficznej wypełnionej żelem krzemionkowym w eterze naftowym. Kolumnę eluować eterem naftowym, który wymyje z niej karoteny (można też zastosować mieszaninę eter naftowy- aceton 20:1). Gdy eluat stanie się bezbarwny, należy wymienić odbieralnik i wyeluować chlorofile za pomocą acetonu. Następnie należy zbadać skład poszczególnych frakcji (mieszanina nanoszona na kolumnę, poszczególne frakcje z kolumny i wzorcowy β- 10

karoten) za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (obliczyć wartość R f dla poszczególnych barwnych plam) i poddać je analizie spektrofotometrycznej. Przykładowy chromatogram początkowej mieszaniny, w układzie eter etylowy: cykloheksan : octan etylu : aceton : metanol (60:16:10:10:4), pokazano poniżej: Inne proponowane układy do rozdzielania: - heksan : aceton 70 : 30 - i-oktan : aceton : eter naftowy 60 : 20 : 20 - cykloheksan : aceton : eter naftowy 50 : 25 : 25 Przykładowe, literaturowe wartości R f barwników liści w układzie heksan:aceton (7:3) Barwnik Barwa Wartość R f β-karoten żółto-pomarańczowy 0,91 Feofityna szary 0,75 chlorofil a niebiesko-zielony 0,63 chlorofil b zielony 0,58 ksantofile żółte 0,53; 0,47; 0,32 b). 10 g odciśniętych liści mrożonego szpinaku ucierać w moździerzu porcelanowym z 20 ml acetonu. Acetonową zawiesinę przesączyć. Operację ucierania powtórzyć jeszcze dwukrotnie. Połączone ekstrakty acetonowe przenieść do rozdzielacza i ekstrahować kilkakrotnie eterem naftowym. Oddzielone frakcje eteru naftowego przenieść ponownie do rozdzielacza i przemyć je dwukrotnie małymi porcjami wody. Oddzielić warstwę organiczną i wysuszyć ją MgSO 4 lub Na 2 SO 4. Osuszony roztwór barwników zatężyć odparowując rozpuszczalnik na rotatorze i nanieść go na kolumnę chromatograficzną. Dalej postępować jak w punkcie a). 4.3. Otrzymywanie kompleksu feofityny z miedzią 11

Pocięte na paski liście ogrzewać w 10% roztworze kwasu octowego zawierającym chlorek miedzi. Równolegle ogrzewać liście tylko w roztworze kwasu octowego (próba kontrolna). Obserwować zmiany zachodzące w obu roztworach. 4.4. Rozdzielanie barwników zawartych w koncentracie pomidorowym (likopen i β-karoten) metodą TLC a). Ok. 10 g koncentratu pomidorowego umieścić w rozdzielaczu, do którego wlano uprzednio ok. 50 ml chlorku metylenu. Wyekstrahować barwniki do fazy organicznej i odebrać ją do kolbki okrągłodennej o pojemności 100 ml. Rozpuszczalnik odparować na rotatorze. Do pozostałości dodać niewielką ilość chlorku metylenu i zanalizować jej zawartość metodą TLC odnosząc dodatkowo na płytce wzorzec β-karotenu (dobrać odpowiedni układ chromatograficzny). b). Na płytkę do preparatywnej TLC o wielkości 20x20cm nałożyć pasmowo uzyskany w punkcie a) roztwór i rozwijać w dużej komorze chromatograficznej w dobranym w punkcie a) układzie. Po wysuszeniu płyty wyskrobać pasmo wytypowane jako likopen i odmyć żel krzemionkowy chlorkiem metylenu. Roztwór zanalizować wykonując TLC oraz widmo UV-Vis. Porównać uzyskane widmo z widmem literaturowym. 5. Opracowanie wyników W sprawozdaniu należy podać wzory strukturalne barwnych związków naturalnych, które były przedmiotem wykonywanych ćwiczeń, opisać te ćwiczenia (łącznie z zamieszczeniem schematycznych rysunków uzyskanych chromatogramów). Omówić skuteczność rozdzielania barwników przy użyciu chromatografii kolumnowej na podstawie wykonanej analizy TLC. Krótko omówić uzyskane widma UV-Vis (sczytać maksima absorpcji i porównać widma z literaturowymi). 12