MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA

ISSN 0025-8601 eissn 2545-2517 MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA ORGAN NARODOWEGO INSTYTUTU ZDROWIA PUBLICZNEGO PAŃSTWOWEGO ZAKŁADU HIGIENY 2-4 MDMIAZ 71 (2-4) 65-162 (2019) ROK LXXI KWARTALNIK 2019 NARODOWY INSTYTUT ZDROWIA PUBLICZNEGO PAŃSTWOWY ZAKŁAD HIGIENY

MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA ORGAN NARODOWEGO INSTYTUTU ZDROWIA PUBLICZNEGO PAŃSTWOWEGO ZAKŁADU HIGIENY 2-4 ROK LXXI KWARTALNIK 2019 NARODOWY INSTYTUT ZDROWIA PUBLICZNEGO - - PAŃSTWOWY ZAKŁAD HIGIENY

MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA Organ Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny i Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów REDAKCJA Redaktor: WALDEMAR RASTAWICKI Zastępca Redaktora: RAFAŁ GIERCZYŃSKI Sekretarz: KATARZYNA ZACHARCZUK Redaktor językowy (język polski): STANISŁAW KAŁUŻEWSKI Redaktor językowy (język angielski): MARIA DOMINGUEZ Redaktor statystyczny: DANIEL RABCZENKO KOMITET REDAKCYJNY D. Dzierżanowska - Warszawa, S. Giedrys-Kalemba - Szczecin, E. Gołąb - Warszawa, E. Gospodarek - Bydgoszcz, P.B. Heczko - Kraków, A. Jaworski - Łódź, B. Litwińska - Warszawa, K. Piekarska - Warszawa, B. Różalska - Łódź, A. Stankiewicz - Warszawa, E.M. Szewczyk - Łódź, A. Szkaradkiewicz - Poznań, J. Szych - Warszawa, E.A. Trafny - Warszawa, S. Tyski - Warszawa, M.L. Zaremba - Białystok, A.A. Zasada - Warszawa, Z. Zwolska - Warszawa Adres Redakcji: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24 E-mail: medmikrobiol@pzh.gov.pl Tel: 22 54 21 325; 22 54 21 240 Fax: 22 54 21 307 www.medmikro.org.pl Indeks 365226 Punktacja za publikację wg MNiSW 20 pkt. Index Copernicus 91,64 pkt. Kwartalnik Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia jest indeksowany w bazie danych pn. Polska Bibliografia Lekarska (PBL). W latach 1949-2017 kwartalnik Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia ukazywał się jako organ Państwowego Zakładu Higieny (obecnie Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego - Państwowy Zakład Higieny) w Warszawie oraz Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów NARODOWY INSTYTUT ZDROWIA PUBLICZNEGO - - PAŃSTWOWY ZAKŁAD HIGIENY Skład i druk: Agencja Reklamowa TOP, ul. Toruńska 148, 87-800 Włocławek, tel.: 54 423 20 40, fax: 54 423 20 80, www.agencjatop.pl

SPIS TREŚCI PRACE ORYGINALNE T. Kasperski, A. Buda, E. Jachowicz, S. Trojnar, S. Parasion, J. Geller, M. Pobiega. Molekularna charakterystyka lekooporności oraz czynników wirulencji szczepów Klebsiella pneumoniae opornych na kolistynę, izolowanych z dróg oddechowych pacjentów hospitalizowanych w południowej Polsce...69 W. Rastawicki. Długotrwała odpowiedź humoralna na antygeny Francisella tularensis w przebiegu tularemii u ludzi...81 M. Paśnik, M. Kierzkowska, A. Majewska, A. Sawicka-Grzelak, A. Młynarczyk, G. Młynarczyk. Oporność na imipenem wśród beztlenowych pałeczek Bacteroides sp. i Parabacteroides sp. izolowanych od pacjentów hospitalizowanych w Klinikach Szpitala Klinicznego Dzieciątka Jezus w Warszawie...89 S. Brzezińska, J. Dziadura, A. Zabost, M. Klatt, M. Szołkowska, E. Augustynowicz-Kopeć. Molekularna diagnostyka preparatów histopatologicznych jako uzupełnienie badań mikrobiologicznych gruźlicy...97 A. Zabost, K. Kostrzeńska, S. Brzezińska, M. Klatt, E. Augustynowicz-Kopeć. Epidemiologia i mikrobiologiczna diagnostyka gruźlicy pozapłucnej w Polsce w latach 2008-2016... 109 A. Trzcińska, A. Częścik, B. Łagosz. Referencyjny test inaktywacji wirusów jako narzędzie weryfikacyjne wykonania badania aktywności wirusobójczej środków dezynfekcyjnych... 119 P. Kozłowski, A. Waszczuk-Gajda, J. Drozd-Sokołowska, A. Pawelczyk, M. Bednarska, R. Salamatin, H. Janasz, M. Brzozowska, T. Dzieciątkowski, J. Dwilewicz-Trojaczek, W.W. Jedrzejczak, O. Ciepiela, G.W. Basak. Efektywność mikroskopii świetlnej, testów immunofluorescencji, ELISA, hodowli i PCR w wykrywaniu zakażenia Blastocystis sp...127 W. Grzybowska, E. Bocian, A.E. Laudy, S. Tyski. Ocena bakteriobójczej oraz bójczej aktywności wobec grzybów drożdżopodobnych preparatu zawierającego chlorheksydynę i chlorek didecylodimetyloamoniowy (1:1) z zastosowaniem szczepów standardowych oraz wielolekoopornych klinicznych szczepów bakterii, według Norm Europejskich...137 ARTYKUŁ HISTORYCZNY S. Kałużewski. Zagadnienie PPLO i zmienności typu L drobnoustrojów w patologii i mikrobiologii...149

CONTENTS ORIGINAL ARTICLES T. Kasperski, A. Buda, E. Jachowicz, S. Trojnar, S. Parasion, J. Geller, M. Pobiega. Molecular analysis of resistance and virulence of colistin-resistant Klebsiella pneumoniae strains isolated from respiratory tract infections from hospitalized in Southern Poland...69 W. Rastawicki. Long-lasting humoral response to Francisella tularensis in human tularemia...81 M. Paśnik, M. Kierzkowska, A. Majewska, A. Sawicka-Grzelak, A. Młynarczyk, G. Młynarczyk. Resistance to imipenem among anaerobic bacilli of the genus Bacteroides and Parabacteroides isolated from patients hospitalized in clinics of The Infant Jesus Teaching Hospital in Warsaw...89 S. Brzezińska, J. Dziadura, A. Zabost, M. Klatt, M. Szołkowska, E. Augustynowicz-Kopeć. Molecular diagnostics of histopathological samples as a complement to microbiological diagnosis of tuberculosis...97 A. Zabost, K. Kostrzeńska, S. Brzezińska, M. Klatt, E. Augustynowicz- Kopeć. Epidemiology and microbiological diagnostics of extrapulmonary tuberculosis in Poland in 2008-2016...109 A. Trzcińska, A. Częścik, B. Łagosz. Reference test for virus inactivation as a verification tool of testising virucidal activity of disinfectants... 119 P. Kozłowski, A. Waszczuk-Gajda, J. Drozd-Sokołowska, A. Pawelczyk, M. Bednarska, R. Salamatin, H. Janasz, M. Brzozowska, T. Dzieciątkowski, J. Dwilewicz-Trojaczek, W.W. Jedrzejczak, O. Ciepiela, G.W. Basak. The Effectiveness of Light Microscopy, Immunofluorescence Assays, ELISA, Culture, and PCR in Detecting Blastocystis sp Infection...127 W. Grzybowska, E. Bocian, A.E. Laudy, S. Tyski. Evaluation of biocidal activity of preparation containing chlorhexidine digluconate and dodecyl dimethyl ammonium chloride (1:1), using bacterial and Candida spp. standard strains and multidrug resistant bacterial isolates, according to European Standards...137 HISTORICAL ARTICLE S. Kałużewski. PPLO and L-type variability of microbes in pathology and microbiology...149

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2019, 71: 69-79 https://doi.org/10.32394/mdm.71.07 Molekularna charakterystyka lekooporności oraz czynników wirulencji szczepów Klebsiella pneumoniae opornych na kolistynę, izolowanych z dróg oddechowych pacjentów hospitalizowanych w południowej Polsce Molecular analysis of resistance and virulence of colistin-resistant Klebsiella pneumoniae strains isolated from respiratory tract infections from patients hospitalized in Southern Poland Tomasz Kasperski, Aneta Buda, Estera Jachowicz, Sylwia Trojnar, Sylwia Parasion, Justyna Geller, Monika Pobiega* Biophage Pharma SA, Krakow, Poland W pracy przeanalizowano wyniki badań 19 szczepów Klebsiella pneumoniae, opornych na kolistynę, wyizolowanych od pacjentów hospitalizowanych w południowej Polsce. Szczepy te poddane zostały wnikliwej charakterystyce sprawdzono zarówno ich wrażliwość na szeroki panel antybiotyków, wliczając antybiotyki najnowsze, rekomendowane przez EUCAST, jak również zbadano występowanie u nich genów oporności i wirulencji. Weryfikowano obecność najczęstszych determinant oporności na beta- -laktamy, a także plazmidowo kodowanych genów oporności na kolistynę. Wśród genów wirulencji, poszukiwano zarówno tych związanych z syntezą otoczki, jak również tych odpowiedzialnych za pozyskiwanie żelaza (m.in. sideroforów). Wykazano, że geny oporności i wirulencji często występują w badanej populacji szczepów. Słowa kluczowe: Klebsiella pneumoniae oporna na kolistynę, czynniki wirulencji, lekooporność ABSTRACT Objectives: Colistin resistance is reported in K.pneumoniae isolates worldwide. Due to the overuse of antimicrobial agents, colistin has become the only alternative treatment option. The aim of this study was to analyze the resistance and virulence of 19 colistin-resistant K.pneumoniae strains isolated from patients with pneumonia in four Polish hospitals. Methods: All strains were screened for antibiotic susceptibilities by the disc diffusion method. Resistance and virulence genes were detected with PCR. * correspnding author

70 T. Kasperski i inni Results: Seventeen strains were considered as XDR (Extensively Drug Resistant). Fourteen (75%) strains were ESBL-positive, all possessed bla CTX-M. KPC gene was detected in one strain, mcr-1, mcr-2, mcr-3, mcr-4 and mcr-5 genes was not found. One strain (5%) was of capsular serotype K1, four (21%) of serotype K2. entb gene was detected in 19 strains (100%), iuta in 5 (26%), ybts in 10 (53%), whereas mrkd in 19 (100%). uge was detected in 15 (79%) of strains, rmpa in 7 (37%). Conclusions: Colistin resistance in K.pneumoniae becomes common pattern that must be monitored even in patients not previously treated with colistin. As we demonstrated, virulence genes are ubiquitous in colistin-resistant strains. Keywords: colistin-resistant Klebsiella pneumoniae, virulence factors, antimicrobial resistance INTRODUCTION Colistin resistance is reported in Klebsiella pneumoniae isolates worldwide (10, 23, 35), outbreaks have been reported (19, 20). Due to the overuse of antimicrobial agents and emergence of MDR (Multidrug Resistance) or XDR (Extensive Drug Resistance) isolates, colistin has become the only alternative treatment option, regarding the fact that for a long time it had been kept as a last resort drug due to the safety reasons. The main mechanism responsible for colistin resistance is modification of the lipid A phosphate moieties of the bacterial LPS (Lipopolysaccharide) that reduces the electrostatic interaction between cationic polimyxins and anionic LPS (26). This modification is associated with the mutations in genes that regulate the expression of pmrc gene (26). There are also other molecular mechanisms and mutations that may lead to colistin-resistance phenotype. Characterization of the structural alterations of LPSs with regard to polymyxin resistance has shown the involvement of phop/phoq and pmra/pmrb. The phop/phoq and pmra/pmrb systems are upregulated in Klebsiella pneumoniae exposed to polymyxins, indicating that these systems are involved in polymyxin resistance in this bacterium (24). Some latest studies describe the pattern that colistin resistance is not associated with decreased virulence (1, 6). Colistin resistance may be encoded by mcr-1 gene, that is localized on the transferrable plasmid, often together with KPC gene (25). There are also other mcr genes connected with colistin resistance, mcr-2, mcr-3, mcr-4 and mcr-5 and their variants, but those genes are detected more rarely in K. pneumoniae (27). There are known virulence genes that are associated with invasive infections. One of them is maga, associated with mucoviscosity, encoding capsular polymerase, located within the gene cluster specifying capsular phenotype K1 (36). The gene rmpa is regulating the mucoid phenotype A strains carrying this gene possess hypermucoviscous phenotype (37). Invasive isolates of K. pneumoniae exhibits frequently hypermucoviscous phenotype and belong to serotype K1 or K2 (8). For that reason it is advisable to screen the strains according to their serotype. One of the method that can be use is multiplex PCR for 5 or 6 serotypes (33, 34). Next gene, uge, is involved in capsule synthesis, as it encodes uridine diphosphate galacturonate 4-epimerase, responsible for biosynthesis of the capsule and smooth LPS.

Charakterystyka K. pneumoniae opornych na kolistynę 71 Strains that are considered as hypervilurent may possess a number of iron acquisition systems, such as siderophores (aerobactin encoded by iuta, enterobactin encoded by ent, yersiniabactin encoded by ybts), as well as kfu-gene, that mediates the uptake of ferric iron (2). The gene alls is correlated with strains isolated from liver abscess (7). This gene is involved in allantoin metabolism. Other gene that is correlated with elevated virulence is mrkd type 3 fimbrial adhesin that mediates binding to the extracellular matrix (16). The aim of this study was to analyze the resistance and virulence of colistin-resistant K. pneumoniae strains isolated from patients with pulmonary infections in four Polish hospitals in 2016 and 2017. MATERIALS AND METHODS Bacterial strains. Nineteen colistin-resistant Klebsiella pneumoniae isolates were collected in 2016 and 2017 from hospitalized patients. All strains were isolated from clinical samples (respiratory tract infections) and identified with automated systems (VITEK- 2Compact, BioMerieux or MALDI-TOFF identification with Maldi Biotyper, Bruker). MICs of colistin (CS-0.064-1024 mg/l) were determined with E-test (Liofilchem Diagnostici, Italy). When the result of MIC testing was above 2 mg/l and the strains should be considered as colistin-resistant, those results were confirmed by microdillution method (SensiTest Colistin; Liofilchem Diagnostici, Italy). String test of hypermucoviscosity was assessed by using inoculation loop on bacterial colonies grown for 24 h at 37 o C. This test was considered as positive if the string reached at least 5 mm. Susceptibility testing. Antibiotic susceptibilities were determined by the disc diffusion method on Mueller-Hinton agar plates according to the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) guidelines. Antimicrobial agents tested were: piperacillin (PRL-30μg), piperacillin/tazobactam (TZP-30μg/6μg), ampicillin/sulbactam (SAM-20µg 1:1), amoxicillin/ clavulanic acid (AMC-30µg 2:1), ticarcillin (TIC-75μg), ceftazidime (CAZ-10μg), cefotaxime (CTX-5μg), cefepime (FEP-30μg), cefuroxime sodium (CXM-30μg), ceftaroline (CPT-5μg), ceftriaxone (CRO-30μg), imipenem (IPM-10μg), ertapenem (ETP-10μg), meropenem (MEM-10μg), doripenem (DOR-10μg), aztreonam (ATM-30μg), ciprofloxacin (CIP-5μg), levofloxacin (LEV-5μg), moxifloxacin (MXF-5μg), ofloxacin (OFX-5μg), amikacin (AK-30μg), gentamicin (CN-10μg), netylmicin (NET- 10μg), tobramycin (TOB-10μg), sulfamethoxazole/trimethoprim (SXT-25μg 19:1), chloramphenicol (C-30μg) (Oxoid, Ltd., Basingstoke, UK) and ticarcillin/clavulanic acid (TTC-85µg (75+10)), ceftobiprole (BPR-5μg), ceftolozane/tazobactam (T/C-40µg (30+10)) (Liofilchem Diagnostic, Italy). Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of tigecyclin (TGC-0,016-256 mg/l) was determined with E-test (Liofilchem Diagnostici, Italy). Extended spectrum beta-lactamases (ESBLs) were detected by E-test (Cefotaxime/Cefotaxime+Clavulanic acid; Liofilchem Diagnostici, Italy). Phenotypic test for the presence of KPC was performed with E-test (MIC Test Strip KPC with meropenem/meropenem+boronic acid; Liofilchem Diagnostici, Italy). Results were interpreted using clinical breakpoints as defined by the current guidelines of the EUCAST version 8.0 (http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/). DNA isolation. Genomic Mini AX Bacteria Kit (A&A Biotechnology) was used for extraction of genomic DNA from K. pneumoniae isolates in accordance with the manufacturer s protocol. DNA extracted from pure cultures were stored at -20 o C for further examination.

72 T. Kasperski i inni Detection of resistance genes. Isolates showing ESBL activity were screened with multiplex-pcr for the presence of bla CTX-M, bla SHV and bla TEM genes and a simplex PCR for bla OXA-1 gene using previously published primers (21). KPC gene was detected with PCR using method published by Schechner et al. (2009) (30). Colistin resistant isolates were screened by PCR for the presence of mcr-1, mcr-2, mcr-3, mcr-4, mcr-5 genes according to previously published method by Rebelo et al. (2018) (27). Virulence genes detection. Common virulence genes were detected with PCR according to previously published protocol: maga (mucoviscosity-associated gene A) (11) and uge (the gene involved in capsule synthesis) (28), rmpa (4), ybts (yersiniabactin), entb (enterobactin), iuta (aerobactin), alls, mrkd (8). Capsule types (K2, K5, K20, K54, K57) were detected with previously published primers (33, 34). RESULTS Antimicrobial susceptibility testing. Altogether, 19 unique Klebsiella pneumoniae strains resistant to colistin were studied all of them were isolated from hospitalized patients. The range for colistin resistance was 2-16 mg/ml, MIC50 = 3 mg/ml. Sixty-three percent of the strains came from male patients (n=12) and the median patient age was 77 years (Quartile 1: 39; Quartile 3: 86). All strains came from respiratory tract infections (sputum, bronchoalveolar lavage, bronchial aspirate, bronchial secretion) patients were diagnosed with pneumonia. Five strains were considered as hypemucoviscous, according to string test. Seventeen strains (90%) were considered to be extensively drug-resistant (XDR), while 2 were classified as multidrug resistant (MDR). Fourteen (74%) strains were able to produce extended spectrum beta-lactamases (ESBLs). All strains were resistant to ticarcillin. One strain was non-susceptible to all studied carbapenems (Table 1). Almost all strains were resistant to the most common cephalosporins, as well as the newest cephalosporins with inhibitors (ceftolozan/tazobactam). Resistance genes. Fourteen strains (74%) were able to produce EBSL, according to phenotypic results. All of those strains possessed bla CTX-M gene. Bla SHV-1 gene were present in all 19 strains. TEM-1 gene was present in 13 strains (68%), whereas bla OXA-1 in 9 (47%). KPC gene was detected in 1 strain this strains was resistant to all antimicrobials tested except tygecycline. The presence of KPC was proven by phenotypic test, described in Method section. mcr-1, mcr-2, mcr-3, mcr-4, mcr-5 genes were not detected among the strains. The gene encoding an aminoglycoside 6 -N-acetyltransferase (aac-6 -Ib) was present in 13 (68%) strains all of them were non-susceptible to amikacin and tobramycin. Virulence genes. One strain (5%) was of capsular serotype K1, whereas four (21%) of serotype K2. None of the strains were of capsular serotype K5, K20, K54 or K57. entb gene was detected in 19 strains (100%), aerobactin gene (iuta) was present in 5 strains (26%), ybts in 10 (53%). mrkd was prevalent in 19 (100%) of strains. uge was detected in 15 (79%) of strains, whereas rmpa in 7 (37%). No strains with alls were found.

Charakterystyka K. pneumoniae opornych na kolistynę 73 Table 1. Number and percentage of strains non-susceptible to particular antimicrobials. Antimicrobial class Penicillins Cephalosporins Carbapenems Antimicrobial Number of nonsusceptible strains % of nonsusceptible strains ampicillin/sulbactam (SAM) 15 79% amoxycillin/clavulanate (AMC) 19 100% Piperacillin (PIP) 18 95% piperacillin/tazobactam (TZP) 15 79% Ticarcillin (TIC) 19 100% ticarcillin/clavulanate (TIM) 18 95% Cefepime (FEP) 13 68% Cefotaxime (CTX) 14 74% Ceftaroline (CPT) 17 89% Ceftazidime (CAZ) 15 79% Ceftobiprol (BPR) 19 100% Ceftolozan/tazobactam (T/C) 18 95% Ceftriaxone (CRO) 17 89% Cefuroxime (CXM) 13 68% Doripenem (DOR) 8 42% Ertapenem (ETP) 14 74% Imipenem (IMP) 1 5% Meropenem (MEM) 1 5% Monobactams Aztreonam (AZT) 17 89% Fluoroquinolones Aminoglycosides Ciprofloxacin (CIP) 15 79% Lewofloxacin (LVX) 15 79% Moxifloxacin (MOX) 17 89% Ofloxacin (OFX) 18 95% Amikacin (AK) 13 68% Gentamycin (CN) 9 47% Netilmycin (NET) 13 68% Tobramycin (TOB) 14 74% Tetracyclines Tigecycline (TGC) 6 32% Miscellaneous Chloramphenicol (C) 10 53% Polymyxins Colistin (COL) 19 100% Miscellaneous trimpetoprim/sulfametoxazol (SXT) 14 74%

74 T. Kasperski i inni Table 2. Virulence genes among colistin-resistant Klebsiella pneumoniae strains. Strain number Antimicrobial resistance profile* Identified virulence genes ** 7 SAM-AMC-PRL-TZP-TIC-TIM-CTX-CPT-CAZ-BPR-C/T-CRO-CXM-ETP-ATM-CIP-LEV-MXF-OFX-AK-CN- NET-TOB-C-CS-SXT rmpa, uge, mrkd, entb, iuta 42 AMC-PRL-TIC-TIM-CPT-BPR-C/T-CRO-DOR-ATM-MXF-OFX-CS K2, rmpa, uge, ybts, mrkd, entb, iuta 46 AMC-PRL-TIC-TIM-CPT-BPR-C/T-CRO-DOR-ETP-ATM-OFX-CS K2, rmpa, uge, mrkd, entb, iuta 48 SAM-AMC-PRL-TZP-TIC-TIM-FEP-CTX-CPT-CAZ-BPR-C/T-CRO-CXM-DOR-ETP-IMP-MEM-ATM-CIP-LEV- MXF-OFX-AK-CN-NET-TOB-C-CS-SXT uge, mrkd, entb 53 AMC-PRL-TIC-TIM-BPR-C/T-CRO-MXF-OFX-TGC-CS K1, rmpa, uge, ybts, mrkd, entb 54 SAM-AMC-PRL-TZP-TIC-TIM-CPT-BPR-CIP-LEV-MXF-OFX-C-CS-SXT uge, mrkd, entb 59 SAM-AMC-PRL-TZP-TIC-TIM-FEP-CTX-CPT-CAZ-BPR-C/T-CRO-CXM-DOR-ETP-ATM-CIP-LEV-MXF-OFX- AK-NET-TOB-TGC-CS-SXT mrkd, entb 60 AMC-TIC-BPR-C/T-ATM-CS rmpa, uge, ybts, mrkd, entb 62 87 91 93 97 98 99 105 115 117 119 SAM-AMC-PRL-TZP-TIC-TIM-FEP-CTX-CPT-CAZ-BPR-C/T-CRO-CXM-ETP-ATM-CIP-LEV-MXF-OFX-AK- CN-NET-TOB-TGC-C-CS-SXT SAM-AMC-PRL-TZP-TIC-TIM-FEP-CTX-CPT-CAZ-BPR-C/T-CRO-CXM-ATM-CIP-LEV-MXF-OFX-AK-CN- NET-TOB-CS SAM-AMC-PRL-TZP-TIC-TIM-FEP-CTX-CPT-CAZ-BPR-C/T-CRO-CXM-DOR-ETP-ATM-CIP-LEV-MXF-OFX- AK-CN-NET-TOB-C-CS-SXT SAM-AKC-PRL-TZP-TIC-TIM-FEP-CTX-CPT-CAZ-BPR-C/T-CRO-CXM-DOR-ETP-ATM-CIP-LEV-MXF-OFX- AK-CN-NET-TOB-C-CS-SXT SAM-AMC-PRL-TZP-TIC-TIM-FEP-CTX-CPT-CAZ-BPR-C/T-CRO-CXM-DOR-ETP-ATM-CIP-LEV-MXF-OFX- AK-CN-NET-TOB-TGC-C-CS-SXT SAM-AMC-PRL-TZP-TIC-TIM-FEP-CTX-CPT-CAZ-BPR-C/T-CRO-CXM-DOR-ETP-ATM-CIP-LEV-MXF-OFX- TOB-C-CS-SXT SAM-AMC-PRL-TZP-TIC-TIM-FEP-CTX-CPT-CAZ-BPR-C/T-CRO-CXM-ETP-ATM-CIP-LEV-MXF-OFX-AK- CN-NET-TOB-C-CS-SXT SAM-AMC-PRL-TZP-TIC-TIM-FEP-CTX-CPT-CAZ-BPR-C/T-CRO-CXM-ETP-ATM-CIP-LEV-MXF-OFX-AK- NET-TOB-CS-SXT SAM-AMC-PRL-TZP-TIC-TIM-FEP-CTX-CPT-CAZ-BPR-C/T-CRO-CXM-ETP-ATM-CIP-LEV-MXF-OFX-AK- NET-TOB-TGC-C-CS-SXT SAM-AMC-PRL-TZP-TIC-TIM-FEP-CTX-CPT-CAZ-BPR-C/T-CRO-CXM-ETP-ATM-CIP-LEV-MXF-OFX-AK- CN-NET-TOB-CS-SXT SAM-AMC-PRL-TZP-TIC-TIM-FEP-CTX-CPT-CAZ-BPR-C/T-CRO-CXM-ETP-ATM-CIP-LEV-MXF-OFX-AK- NET-TOB-TGC-CS-SXT uge, ybts, mrkd, entb K2, rmpa, uge, mkrd, entb, iuta uge, ybts, mrkd, entb uge, ybts, mrkd, entb uge, ybts, mrkd, entb uge, ybts, mrkd, entb uge, ybts, mrkd, entb ybts, mrkd, entb mrkd, entb K2, rmpa, uge, mrkd, entb, iuta mrkd, entb * - all abbreviations of antimicrobial names are presented in Table 1. ** - maga - mucoviscosity-associated gene A; uge - the gene involved in capsule synthesis; rmpa - positive regulator of extracapsular polysaccharide synthesis; ybts yersiniabactin; entb enterobactin; iuta aerobactin; alls - gene involved in allantoin metabolism; mrkd - type 3 fimbrial adhesion; K2, K5, K20, K54, K57 - capsule types genes.

Charakterystyka K. pneumoniae opornych na kolistynę 75 DISCUSSION Klebsiella pneumoniae is widely known as an etiological factor of community acquired and hospital acquired infections, responsible for bacteremia, liver abscesses, pneumonia or meningitis. As the incidence of such infections has increased in recent years, it led to overuse of antimicrobials and as following to the occurrence of multidrug or extensively drug resistant pathogens. Klebsiella pneumoniae strains resistant to all antimicrobial drugs, including carbapenems and colistin were noticed worldwide (17, 19, 20, 26). In this study we analyzed the resistance and virulence of selected 19 strains, isolated from patients with pneumonia. mcr-1, mcr-2, mcr-3, mcr-4, mcr-5 genes, connected with plasmid mediated colistin resistance, were not detected among the strains, similarly to previous studies (3, 10). We suppose that colistin resistance in our strains was due to molecular changes in pmra, pmrb, and mgrb genes. Unfortunately we have no possibility to conduct deeper molecular studies. Fortunately, all isolates except one (18/19) were susceptible to imipenem and meropenem, but the vast majority of isolated strains was non-susceptible to most commonly used drugs, such as penicillins and cephalosporins. What may be of serious concern, the vast majority of strains were resistant to ceftolozan/tazobactam that is considered as quite new treatment option for ESKAPE pathogens. In contrast to previous studies this antimicrobial was less efficient than cefepime, cefuroxime or cefotaxim (32). Similar results were obtained for ceftaroline, drug approved by FDA in 2010 only 2 strains were susceptible for this antimicrobial. Three-fourth of the strains produced ESBLs, all of them possessed CTX-M gene, similarly to previous report (23). Nine out of 19 strains had all four beta-lactamase genes studied: CTX-M together with TEM, SHV-1 and OXA-1. The only one carbapenem-resistant, colistin-resistant strain possessed KPC gene such strains have been reported previously (12). Previous studies have shown that hypermucoviscous strains are not resistant to many antimicrobials (15, 31). Here, 5 of 7 strains possessed both genes. KPC strains are detected in Poland the number of such strains has been growing since 2017. Klebsiella pneumoniae serotypes K1 and K2 are associated with highly virulent strains. Both are the most prevalent serotypes found in pyogenic liver abscess and are also frequent in strains isolated from community acquired pneumonia (9). In our study, K1 and K2 represented 26% of all colistin resistant strains, similarly to the data provided by Wasfi R et al. (2016) (35), where only MDR strains were studied. K1 and K2 were less prevalent among studies conducted in Japan on general K. pneumoniae strains (11.8%) (13). Capsular serotype K2 plays an important role in determining virulence and may worsen the course of infection caused by K. pneumoniae (11). Remarkably, rmpa gene, that is a positive regulator of extracapsular polysaccharide synthesis (it confers a mucoid phenotype), was present in 7 strains studied (37%), what was consistent with previous data (37). Aforementioned studies conducted by Yu W et al. have shown a strong correlation between the rmpa gene and virulence in terms of abscess formation for hypermucoviscous K. pneumoniae strains (37). Here we noted that maga gene together with rmpa was present in two isolates. Such strains may be admitted as hypervirulent and may lead to worsening the progress of infection. It is worth mentioning that maga gene may be useful as a marker for the diagnosis of invasive K. pneumoniae infections. Here, the only one strain with maga gene was also hypermucoviscous according to string test results.

76 T. Kasperski i inni Type 3 fimbrial adhesin (encoded by mrkd gene) is involved in binding of bacterial cells to endothelial cells of the respiratory tract. Interestingly, mrkd gene was detected in all strains, what is consistent to previous studies (29, 35). Iron acquisition systems are essential for the growth of bacterial pathogens especially in vivo during the infection (22). What is more, siderophore secretion by K. pneumoniae may contribute to inflammation and bacterial dissemination during pneumonia (14). The most prevalent gene connected with iron uptake was entb, found in 100% of strains. It is consistent with the data shown by Wasfi R et al. (2016) and Candan et al (2015) (5, 35). Previous data published by Lawlor M et al suggested that yersiniabactin may be a key virulence factor for Klebsiella pneumoniae during pulmonary infection (18). Here, we detected ybts gene in 53% and iuta gene in 26% of strains. Notably, the vast majority (74%) of studied strains contained at least 2 siderophore-related-genes. The presence of uge gene is connected with colonization ability and virulence of K. pneumoniae strains, what was previously confirmed - K. pneumoniae uge mutants were unable to produce experimental urinary tract infections in rats and were completely avirulent in two different animal models (septicemia and pneumonia) (28). In our study, in 4 strains resistant to colistin uge was not detected what is not consistent to previous data provided by Yu et al. (37). As none of those strains was isolated from patients with liver abscess, the absence of alls gene was expected and this trait was confirmed (38). This study has several limitations. We have no data about mortality in patients with pneumonia. The number of samples was relatively small what may give selection bias. We were also not able to give detailed information about mechanisms of colistin-resistance in those particular K. pneumoniae strains. CONCLUSIONS Colistin resistance in K. pneumoniae strains becomes more and more common pattern. Some authors conclude that colistin resistance must be monitored even in patients not previously treated with colistin (3). As we demonstrated, virulence genes are ubiquitous in colistin-resistant strains. None to declare CONFLICT OF INTEREST FUNDING This study was supported by a grant nr RPMP.01.02.01-12-0499/16 from European Union Developmental Fund (Regional Operational Programme for the Małopolska Region for 2014-2020). ACKNOWLEDGMENTS We would like to thank to the staff of microbiological laboratories in Krakow and Ruda Slaska who provided us all the strains.

Charakterystyka K. pneumoniae opornych na kolistynę 77 REFERENCES 1. Arena F, De Angelis LH, Cannatelli A, et al. Colistin resistance caused by inactivation of the MgrB regulator is not associated with decreased virulence of sequence type 258 KPC carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 2016; 60: 2509 12. 2. Bachman MA, Oyler JE, Burns SH, et al. Klebsiella pneumoniae Yersiniabactin Promotes Respiratory Tract Infection through Evasion of Lipocalin 2. Infect Immun 2011; 79: 3309 16. 3. Barragán-Prada H, Ruiz-Hueso P, Tedim AP, et al. Emergence and dissemination of colistin-resistant Klebsiella pneumoniae isolates expressing OXA-48 plus CTX-M-15 in patients not previously treated with colistin in a Spanish university hospital. Diagn. Microbiol Infect Dis 2019; 93: 147 53. 4. Brisse S, Fevre C, Passet V, et al. Virulent clones of Klebsiella pneumoniae: Identification and evolutionary scenario based on genomic and phenotypic characterization. PLoS One. 2009; 4: e4982. 5. Candan ED, Aksöz N. Klebsiella pneumoniae: Characteristics of carbapenem resistance and virulence factors. Acta Biochim. Pol. 2015; 62: 867 74. 6. Cannatelli A, Santos-Lopez A, Giani T, et al. Polymyxin Resistance Caused by mgrb Inactivation Is Not Associated with Significant Biological Cost in Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother 2015; 59: 2898 2900. 7. Chou HC, Lee CZ, Ma LC, et al. Isolation of a chromosomal region of Klebsiella pneumoniae associated with allantoin metabolism and liver infection. Infect Immun 2004; 72:3783 92. 8. Compain F, Babosan A, Brisse S, et al. Multiplex PCR for detection of seven virulence factors and K1/K2 capsular serotypes of Klebsiella pneumoniae. J Clin Microbiol 2014; 52: 4377 80. 9. Decré D, Verdet C, Emirian A, et al. Emerging severe and fatal infections due to Klebsiella pneumoniae in two university hospitals in France. J Clin Microbiol 2011; 49: 3012 14. 10. Esposito EP, Cervoni M, Bernardo M, et al. Molecular epidemiology and virulence profiles of colistin-resistant Klebsiella pneumoniae blood isolates from the hospital agency Ospedale dei Colli, Naples, Italy Front Microbiol 2018; 9: 1463. 11. Fang C-T, Chuang Y-P, Shun C-T, et al. A Novel Virulence Gene in Klebsiella pneumoniae Strains Causing Primary Liver Abscess and Septic Metastatic Complications. J Exp Med 2004; 199: 697 705. 12. Del Franco M, Paone L, Novati R, et al. Molecular epidemiology of carbapenem resistant Enterobacteriaceae in Valle d Aosta region, Italy, shows the emergence of KPC-2 producing Klebsiella pneumoniae clonal complex 101 (ST101 and ST1789). BMC Microbiol 2015; 15: 260. 13. Harada S, Ishii Y, Saga T, et al. Molecular epidemiology of Klebsiella pneumoniae K1 and K2 isolates in Japan. Diagn Microbiol Infect Dis 2018; 91:354 9. 14. Holden VI, Breen P, Houle S, et al. Klebsiella pneumoniae siderophores induce inflammation, bacterial dissemination, and HIF-1ɑ stabilization during pneumonia. MBio 2016; 7.

78 T. Kasperski i inni 15. Ikeda M, Mizoguchi M, Oshida Y, et al. Clinical and microbiological characteristics and occurrence of klebsiella pneumoniae infection in Japan. Int J Gen Med 2018; 11: 293 9. 16. Jagnow J, Clegg S. Klebsiella pneumoniae MrkD-mediated biofilm formation on extracellular matrix- and collagen-coated surfaces. Microbiology 2003; 149: 2397 405. 17. Jeannot K, Bolard A, Plésiat P. Resistance to polymyxins in Gram-negative organisms. Int J Antimicrob Agents 2017; 49: 526 35. 18. Lawlor MS, O Connor C, Miller VL. Yersiniabactin is a virulence factor for Klebsiella pneumoniae during pulmonary infection. Infect Immun 2007; 75: 1463 72. 19. Marchaim D, Chopra T, Pogue JM, et al. Outbreak of Colistin-Resistant, Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae in Metropolitan Detroit, Michigan. Antimicrob Agents Chemother 2011; 55: 593 9. 20. Mezzatesta ML, Gona F, Caio C, et al. Outbreak of KPC-3-producing, and colistinresistant, Klebsiella pneumoniae infections in two Sicilian hospitals. Clin Microbiol Infect 2011; 17: 1444 7. 21. Monstein HJ, Östholm-Balkhed Å, Nilsson M V., et al. Multiplex PCR amplification assay for the detection of bla SHV, bla TEM and bla CTX-M genes in Enterobacteriaceae. Apmis 2007; 115: 1400 8. 22. Neilands JB. Microbial Iron Compounds. Annu Rev Biochem 2003; 50: 715 31. 23. Novović K, Trudić A, Brkić S, et al. Molecular epidemiology of colistin-resistant, carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Serbia from 2013 to 2016. Antimicrob Agents Chemother 2017; 61. 24. Olaitan AO, Morand S, Rolain JM. Mechanisms of polymyxin resistance: Acquired and intrinsic resistance in bacteria. Front Microbiol 2014; 5. 25. Di Pilato V, Arena F, Tascini C, et al. mcr-1.2, a new mcr variant carried on a transferable plasmid from a colistin-resistant KPC carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae strain of sequence type 512. Antimicrob Agents Chemother 2016; 60: 5612 5. 26. Poirel L, Jayol A, Nordmanna P. Polymyxins: Antibacterial activity, susceptibility testing, and resistance mechanisms encoded by plasmids or chromosomes. Clin Microbiol Rev 2017; 30: 557 96. 27. Rebelo AR, Bortolaia V, Kjeldgaard JS, et al. Multiplex PCR for detection of plasmidmediated colistin resistance determinants, mcr-1, mcr-2, mcr-3, mcr-4 and mcr-5 for surveillance purposes. Eurosurveillance 2018; 23. 28. Regué M, Hita B, Piqué N, et al. A gene, uge, is essential for Klebsiella pneumoniae virulence. Infect Immun 2004; 72: 54 61. 29. Sahly H, Navon-Venezia S, Roesler L, et al. Extended-spectrum β-lactamase production is associated with an increase in cell invasion and expression of fimbrial adhesins in Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52:3029 3034. 30. Schechner V, Straus-Robinson K, Schwartz D, et al. Evaluation of PCR-based testing for surveillance of KPC-producing carbapenem-resistant members of the Enterobacteriaceae family. J Clin Microbiol 2009; 47: 3261 5. 31. Shon AS, Bajwa RPS, Russo TA. Hypervirulent (hypermucoviscous) Klebsiella pneumoniae: A new and dangerous breed. Virulence 2013; 4: 107 18. 32. Sorbera M, Chung E, Ho CW, et al. Ceftolozane/Tazobactam: a new option in the treatment of complicated gram-negative infections. P T 2014; 39: 825 32.

Charakterystyka K. pneumoniae opornych na kolistynę 79 33. Turton JF, Baklan H, Siu LK, et al. Evaluation of a multiplex PCR for detection of serotypes K1, K2 and K5 in Klebsiella sp. and comparison of isolates within these serotypes. FEMS Microbiol Lett 2008; 284: 247 52. 34. Turton JF, Perry C, Elgohari S, et al. PCR characterization and typing of Klebsiella pneumoniae using capsular type-specific, variable number tandem repeat and virulence gene targets. J Med Microbiol 2010; 59: 541 7. 35. Wasfi R, Elkhatib WF, Ashour HM. Molecular typing and virulence analysis of multidrug resistant Klebsiella pneumoniae clinical isolates recovered from Egyptian hospitals. Sci Rep 2016; 6: 38929. 36. Yeh K, Lin J, Yin F, et al. Revisiting the Importance of Virulence Determinant maga and Its Surrounding Genes in Klebsiella pneumoniae Causing Pyogenic Liver Abscesses: Exact Role in Serotype K1 Capsule Formation. J Infect Dis 2009; 201: 1259 67. 37. Yu W-L, Ko W-C, Cheng K-C, et al. Association between rmpa and maga Genes and Clinical Syndromes Caused by Klebsiella pneumoniae in Taiwan. Clin. Infect. Dis. 2006; 42: 1351 8. 38. Yu WL, Ko WC, Cheng KC, et al. Comparison of prevalence of virulence factors for Klebsiella pneumoniae liver abscesses between isolates with capsular K1/K2 and non- K1/K2 serotypes. Diagn Microbiol Infect Dis. 2008; 62: 1 6. Received: 4 VI 2019 Author`s Address: 31-546 Krakow, ul. Mogilska 40, Biophage Pharma SA, Poland. e-mail: monika.pobiega@gmail.com; tel. 0048 123769354

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2019, 71: 81-87 https://doi.org/10.32394/mdm.71.08 Długotrwała odpowiedź humoralna na antygeny Francisella tularensis w przebiegu tularemii u ludzi Waldemar Rastawicki Long-lasting humoral response to Francisella tularensis in human tularemia Zakład Bakteriologii i Zwalczania Skażeń Biologicznych, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie W pracy oceniono czas utrzymywania się odpowiedzi humoralnej na antygeny F. tularensis w przebiegu wybranych przypadków chorobowych. Wykazano, że u niektórych osób już po kilku - kilkunastu tygodniach od momentu wystąpienia objawów klinicznych można zaobserwować stopniowy spadek poziomu przeciwciał, zwłaszcza w klasie IgA i IgM. W przebiegu tularemii może dojść jednak do bardzo intensywnej i długotrwałej odpowiedzi humoralnej. U takich przypadkach wysoki, diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM może utrzymywać się w próbkach kontrolnych uzyskanych wiele miesięcy od początku objawów klinicznych. W celu oceny dynamiki spadku swoistych przeciwciał w przebiegu choroby u tych osób konieczne może być wykonanie szeregu rozcieńczeń badanych próbek surowicy. Słowa kluczowe: Francisella tularensis, tularemia, przeciwciała, odpowiedź humoralna ABSTRACT Introduction: Tularemia is a highly infectious zoonotic disease caused by Gram-negative bacterium Francisella tularensis. The present study was undertaken to determine the humoral response to F. tularensis in the course of human tularemia. Methods: Twenty eight serum samples obtained from 11 patients with tularaemia were tested by in-house ELISA. The age of the subjects was between 5 and 66 years. From one patient, five serum samples were taken, respectively after 0.5, 1.5, 3, 6 and 12 months from the beginning of the first clinical symptoms. Results: It has been shown that in some patients after a few to several weeks after the onset of disease, a gradual decrease in the level of antibodies can be observed, especially in the IgA and IgM class. In the course of tularemia, however, a very intense and long-lasting humoral response can occur. In such cases, a high, diagnostically significant level of IgA,

82 W. Rastawicki IgG and IgM antibodies may persist in control samples obtained several months after the onset of clinical symptoms. Conclusions: In order to analysis the dynamics of the decrease in specific antibodies in the course of the disease in some persons, it may be necessary to perform a two-fold series of dilutions of the serum samples tested. Key words: Francisella tularensis, tularemia, antibodies, humoral response Tularemia jest wysoce zakaźną chorobą odzwierzęcą wywoływaną przez pałeczki Francisella tularensis. W zależności od zjadliwości szczepu oraz drogi wniknięcia patogenu do organizmu ludzkiego, rozpoznaje się następujące postacie kliniczne tularemii: wrzodziejąco-węzłową, węzłową, oczno-węzłową, anginową, trzewną, duropodobną oraz płucną (2, 6, 9). Zakażenie może przebiegać w postaci ostrej, z wysoką gorączką, dreszczami, bólami mięśni oraz ogólnym osłabieniem lub w postaci łagodnej. Naturalny rezerwuar F. tularensis stanowią małe gryzonie, zającowate, dzikie ptactwo oraz stawonogi, między innymi: kleszcze, muchy oraz komary. Kleszcze, głównie Dermacentor retikulatus oraz Ixodes ricinus, odgrywają istotną rolę w przenoszeniu choroby. Do zakażenia dochodzi poprzez wtarcie w uszkodzoną skórę człowieka odchodów lub rozgniecionych tkanek kleszcza (2, 4, 5, 6, 9). W diagnostyce tularemii powszechnie poszukuje się swoistych przeciwciał dla pałeczek F. tularensis w surowicy osób chorych. Według danych piśmiennictwa, przeciwciała dla antygenów pałeczek F. tularensis pojawiają się u osób zakażonych po 1-14 dniach od wystąpienia objawów klinicznych, osiągając swój najwyższy poziom w 4-7 tygodniu choroby (3, 7). Z obserwacji własnych wynika jednak, że ten wysoki poziom przeciwciał może utrzymywać się jeszcze wiele tygodni czy nawet miesięcy po przebytej chorobie. Celem prezentowanej pracy było wykazanie, na wybranych przypadkach chorobowych, jak długo mogą utrzymywać się przeciwciała dla antygenów F. tularensis w surowicy osób po przebytej chorobie. Dodatkowo, na przykładzie 9-letniego dziecka z przebytą oczno-węzłową tularemią, podjęto się szczegółowej oceny dynamiki odpowiedzi humoralnej w poszczególnych klasach immunoglobulin w ciągu roku od wystąpienia zakażenia. MATERIAŁ I METODY Próbki surowicy. Przedmiotem badań było 28 próbek surowicy uzyskanych w różnych okresach choroby od 11 osób z tularemią. Najbardziej interesujący był materiał zebrany od 9-letniej dziewczynki z oczno-węzłową postacią tularemii. Próbki surowicy uzyskano od tej pacjentki pięciokrotnie, odpowiednio: 2 tygodnie (próbka nr 1), 6 tygodni (próbka nr 2), 3 miesiące (próbka nr 3), 6 miesięcy (próbka nr 4) oraz 12 miesięcy (próbka nr 5) od początku objawów klinicznych. Pozostałe próbki surowicy wykorzystane w badaniach uzyskano dwu lub trzy-krotnie od osób z różnymi postaciami tularemii. Niestety, w przypadku tych osób nie dysponowano dokładną datą wystąpienia pierwszych objawów klinicznych, należy przypuszczać jednak, że były to próbki uzyskane w ostrej fazie choroby. Wiek badanych osób wynosił od 5 do 66 lat. We wszystkich próbkach surowicy, we wcześniej prowadzonych rutynowych badaniach serologicznych prowadzonych przy

Odpowiedź humoralna na antygeny Francisella tularensis 83 rozcieńczeniu badanej próbki 1/100, wykryto bardzo wysoki, diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM dla antygenów F. tularensis. Zestaw ELISA opracowany we własnym zakresie (ELISA NIZP-PZH). Odczyn wykonywano na polistyrenowych płytkach Maxi Sorp firmy Nunc, wg metody opisanej uprzednio, poszukując przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM (8, 10). Jako antygenu użyto inaktywowanej zawiesiny pałeczek F. tularensis rozbitych ultradźwiękami. W odróżnieniu jednak od rutynowo wykonywanego odczynu ELISA, w którym bada się próbkę surowicy wyłącznie w rozcieńczeniu 1/100, w prezentowanej pracy wykonywano także kolejne, dwukrotne rozcieńczenia wybranych próbek surowicy (od rozcieńczenia 1/100 do rozcieńczenia 1/12800). Pozwoliło to na bardziej precyzyjne określenie stężenia poszczególnych immunoglobulin w badanych próbkach surowicy. Oznaczenie poziomu swoistych przeciwciał we wszystkich pięciu próbkach surowicy przeprowadzono w jednej serii doświadczenia. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W tabeli I przedstawiono poziom przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM (OD 450 ) oznaczony w rutynowych badaniach diagnostycznych prowadzonych w NIZP-PZH w próbkach surowicy rozcieńczonych 1/100, uzyskanych kilkakrotnie w różnych odstępach czasowych od 11 osób z tularemią. W każdym przypadku, już w pierwszej próbce surowicy uzyskanej w ostrej fazie choroby wykryto wysoki, diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał, we wszystkich trzech klasach immunoglobulin, dla pałeczek F. tularensis. Najbardziej istotnym spostrzeżeniem jest jednak to, że ten diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał utrzymywał się w próbkach kontrolnych wszystkich 11 pacjentów (poza jednym wyjątkiem w klasie IgM u pacjenta nr 5) uzyskanych od 23 dni do nawet jednego roku od początku objawów klinicznych. U niektórych osób, poziom ten określony wartością OD 450 w próbkach kontrolnych zasadniczo nie różnił się od wartości uzyskanej w pierwszej próbce (np. pacjenci nr 1 i 2). U innych, wraz z upływem czasu, można zaobserwować mniejszy lub większy stopniowy spadek poziomu przeciwciał, dobrze widoczny zwłaszcza w klasie IgA i IgM (przykładem takiej dynamiki przeciwciał są wyniki uzyskane u pacjentów nr 6 i 7).W pojedynczych przypadkach (pacjent nr 8) w drugiej próbce zaobserwowano nawet lekki wzrost poziomu przeciwciał, co było zapewne spowodowane uzyskaniem pierwszej próbki surowicy w bardzo wczesnym okresie choroby, kiedy na narósł jeszcze maksymalny poziom przeciwciał. Wszystkie wyniki przedstawione w tabeli I uzyskano w badaniach prowadzonych przy rutynowym rozcieńczeniu próbki surowicy 1/100. Jak można zaobserwować na kilku przykładach przedstawionych powyżej, takie rozcieńczenie próbki nie umożliwia precyzyjnego prześledzenia dynamiki odpowiedzi humoralnej w przebiegu tularemii. Odpowiedzialna za to jest intensywna produkcja przeciwciał przez układ immunologiczny skutkująca bardzo wysokim ich poziomem w surowicy. Tak więc, przy rutynowo stosowanym rozcieńczeniu 1/100 z powodu ograniczeń odczytu spektrofotometru otrzymujemy niejako spłaszczenie uzyskanych wyników. Prześledzenie ewentualnych, czasami subtelnych różnic w poziomie przeciwciał w przebiegu tularemii wymaga wykonania kolejnych rozcieńczeń badanych próbek surowicy. Tak więc, w celu określenia jakie rozcieńczenie próbki surowicy w odczynie ELISA byłoby optymalne do prześledzenia dynamiki odpowiedzi humoralnej

84 W. Rastawicki w przebiegu tularemii wykonano szereg rozcieńczeń (od 1/100 do 1/12800) czwartej próbki surowicy uzyskanej 6 miesięcy od początku objawów klinicznych od 9-letniego dziecka z węzłowo-oczną postacią tularemii (pacjent nr 11). Uzyskane wyniki wyraźnie pokazują, że w przypadku tego dziecka nie stwierdzono istotnych różnic w poziomie przeciwciał wyrażonym wartością OD 450 w próbkach surowicy rozcieńczonych w zakresie od 1/100 do 1/800. Nieznaczny spadek poziomu przeciwciał da się zauważyć dopiero w próbkach surowicy rozcieńczonych w zakresie 1/1600 1/3200 i dalszy, wyraźny spadek, w próbkach rozcieńczonych w zakresie 1/6400 1/12800. Tabela I. Poziom przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM (OD 450 ) w próbkach surowicy uzyskanych kilkakrotnie w różnych odstępach czasowych od 11 osób z tularemią. Oznaczenie wykonano przy rutynowym rozcieńczeniu próbki surowicy 1/100. Pacjent (wiek, płeć) Nr 1 (34 lata, M) Nr 2 (53 lat, M) Nr 3 (1 rok, M) Nr 4 (36 lat, M) Nr 5 (66 lat, M) Nr 6 (5 lat, K) Nr 7 (7 lat, M) Nr 8 (21 lat, M) Nr 9 (58 lat, K) Nr 10 (41 lat, K) Nr 11 (9 lat, K) Kolejna próbka Odstęp czasu Poziom cut-off (OD 450 ): IgA i IgG = 1,00; IgM= 0,8. Przeciwciała klasy IgA Przeciwciała klasy IgG Przeciwciała klasy IgM 1-2,21 1,98 2,10 2 23 dni 2,20 1,97 1,97 1-1,89 1,71 1,87 2 30 dni 1,89 1,74 1,83 1-1,63 1,78 1,89 2 50 dni 1,56 1,98 2,00 1-1,90 1,68 1,80 2 53 dni 1,66 1,56 1,67 1-1,99 1,88 1,38 2 62 dni 1,96 1,76 0,73 1-1,57 1,70 2,02 2 36 dni 1,39 1,69 1,78 3 70 dni 1,10 1,62 1,34 1-1,87 1,90 2,07 2 36 dni 1,52 1,74 1,77 3 70 dni 1,14 1,75 1,29 1-1,36 1,39 1,49 2 5 mc 1,85 1,58 1,62 1-1,99 1,84 1,39 2 7 mc 1,91 1,73 1,24 1-1,94 1,72 1,81 2 3 mc 1,82 1,59 1,64 3 15 mc 1,76 1,57 1,52 1-1,54 1,21 1,02 2 6 tyg. 1,81 1,51 1,68 3 3 mc 1,86 1,57 1,70 4 6 mc 1,88 1,62 1,67 5 12 mc 1,88 1,59 1,68

Odpowiedź humoralna na antygeny Francisella tularensis 85 Rycina 1. Poziom przeciwciał dla antygenów F. tularensis oznaczony odczynem ELISA (OD 450 ) w kolejnej, czwartej próbce surowicy rozcieńczonej w zakresie od 1/100 do 1/12800, uzyskanej 6 miesięcy od początku objawów klinicznych od 9-letniego dziecka z węzłowooczną postacią tularemii. Mając do dyspozycji pięć próbek surowicy uzyskanych w przeciągu roku od jednej osoby postanowiono prześledzić u niej dynamikę odpowiedzi humoralnej w przebiegu tularemii. Za optymalne przyjęto rozcieńczeniu próbki surowicy 1/3200. I tak, na rycinie 2 przedstawiono poziom przeciwciał dla antygenów F. tularensis oznaczony odczynem ELISA (OD 450 ) w kolejnych pięciu próbkach surowicy rozcieńczonych 1/3200, uzyskanych w różnych okresach od początku objawów klinicznych od 9-letniego dziecka z węzłowo- -oczną postacią tularemii. W pierwszej próbce surowicy, uzyskanej około 2 tygodnie od ekspozycji pacjenta na kleszcza, poziom przeciwciał był stosunkowo niski, aczkolwiek diagnostycznie znamienny i wynosił dla przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM około 0,2. W drugiej próbce surowicy, uzyskanej po kolejnym 1 miesiącu, poziom przeciwciał klasy IgA gwałtownie wzrósł do wartości około 1,3, przeciwciał klasy IgM do wartości 1, natomiast poziom przeciwciał klasy IgG do wartości OD 450 około 0,75. W trzeciej próbce surowicy, uzyskanej po 3 miesiącach od początku objawów klinicznych, stwierdzono dalszy wzrost poziomu przeciwciał we wszystkich trzech klasach immunoglobulin, przy czym najwyższe poziomy osiągnęły przeciwciała klasy IgA. W czwartej próbce surowicy, uzyskanej mniej więcej po 6 miesiącach od ekspozycji dziecka na kleszcza, obserwowano niewielki ale konsekwentny wzrost poziomu przeciwciał klasy IgA (OD 450 równe 1,8), utrzymywanie się poziomu przeciwciał klasy IgG i spadek poziomu przeciwciał klasy IgM. W piątej próbce surowicy obserwowano już niewielki spadek poziomu przeciwciał klasy IgA i IgG oraz dalszy, gwałtowny spadek poziomu przeciwciał klasy IgM. Trzeba jednak podkreślić, że nawet w piątej, ostatniej próbce surowicy, uzyskanej po 12 miesiącach od zakażenia, w surowicy badanego dziecka nadal wykrywano na bardzo wysokim, diagnostycznie znamiennym poziomie, wszystkie trzy klasy przeciwciał dla antygenów F. tularensis. Przyjmuje się, że przeciwciała dla antygenów F. tularensis pojawiają się we krwi zazwyczaj już po 10-14 dniach od początku objawów klinicznych, osiągając najwyższy poziom w 4-7 tygodniu choroby (3, 7). Jednakże, jak wynika z przeprowadzonych badań, przeciwciała we wszystkich trzech klasach immunoglobulin dla antygenów F. tularensis

86 W. Rastawicki utrzymują się czasami długo na bardzo wysokim poziomie, uniemożliwiając prześledzenie dynamiki przeciwciał w kolejnych, kontrolnych próbkach surowicy uzyskanych po ustąpieniu objawów klinicznych. W rutynowo prowadzonej diagnostyce tularemii prowadzonej odczynem ELISA przy rozcieńczeniu badanych próbek 1/100 właściwość ta może powodować problemy z prawidłową interpretacją wyników badań serologicznych. Nie wiadomo bowiem, czy wykryty diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał związany jest z aktualnym zakażeniem pałeczkami F. tularensis czy też świadczy jedynie o przechorowaniu tularemii w przeszłości. Co więcej, wykrywanie w kontrolnych próbkach surowicy, uzyskanych po kolejnych tygodniach od początku objawów klinicznych, niezmienionego poziomu przeciwciał może wprowadzić w błąd zarówno lekarzy jak i pacjentów, którzy oczekują spadku poziomu przeciwciał dla F. tularensis po przeprowadzonej kuracji antybiotykowej. Rycina 2. Poziom przeciwciał dla antygenów F. tularensis oznaczony odczynem ELISA (OD450) w kolejnych pięciu próbkach surowicy rozcieńczonych 1/3200, uzyskanych w różnych okresach od początku objawów klinicznych od 9-letniego dziecka z węzłowo-oczną postacią tularemii. Wartość cut off przeciwciał < 0,1 (OD 450 ). Rutynowo w naszym laboratorium stosujemy rozcieńczenie próbki surowicy 1/100 w badaniach diagnostycznych prowadzonych w różnych kierunkach. Ze względu na bardzo niski poziom przeciwciał dla pałeczek F. tularensis w polskiej populacji rozcieńczenie to jest wystarczające do jakościowego badania próbek surowicy uzyskanych od osób z podejrzeniem tularemii. Należy się jednak liczyć, że w niektórych przypadkach, kiedy doszło do intensywnej produkcji przeciwciał, rutynowe rozcieńczenie 1/100 może okazać się zbyt niskie do określenia dynamiki spadku przeciwciał. Niemożliwe jest jednakże określenie, jakie inne pojedyncze rozcieńczenie próbki surowicy byłoby uniwersalne dla wszystkich osób z tularemią. Dlatego też, w przypadku konieczności precyzyjnej analizy dynamiki odpowiedzi humoralnej w przebiegu tularemii, należałoby przeprowadzić oznaczenie poziomu przeciwciał w kolejnych rozcieńczeniach (np. od 1/100 do 1/12800) wszystkich próbek surowicy uzyska-

Odpowiedź humoralna na antygeny Francisella tularensis 87 nych w różnych okresach choroby od osób z tularemią, najlepiej w jednej serii badania. Pozwoliłoby to na ustalenie optymalnego rozcieńczenia przy którym można by przeanalizować ewentualne różnice w poziomie przeciwciał dla poszczególnych immunoglobulin w danym przypadku chorobowym. Oczywiście, taki sposób postępowania spowodował by znaczny wzrost zarówno czasochłonności badań jak i przede wszystkim ich ceny. Z przeprowadzonej analizy wynika, że najdłużej na wysokim poziomie po zakażeniu wywołanym przez pałeczki F. tularensis utrzymują się przeciwciała klasy IgG. Bavanger i wsp. (1) wykazali, że lipopolisacharydy odgrywają główną rolę w stymulowaniu produkcji przeciwciał w ostrej fazie zakażenia wywołanego pałeczkami F. tularensis. Tak więc, w próbkach surowicy osób z tularemią należałoby spodziewać się przede wszystkim przeciwciał podklasy IgG 2. Faktycznie, w przeprowadzonych uprzednio w NIZP-PZH badaniach, przeciwciała tej podklasy zdecydowanie dominowały w badanych próbkach surowicy osób z tularemią, osiągając z reguły 2-3 krotnie wyższe poziomy niż przeciwciała podklasy IgG 1 i IgG 3 (11) PIŚMIENNICTWO 1. Bevanger L, Maeland JA, Kvam AI. Comparative analysis of antibodies to Francisella tularensis antigens during the acute phase of tularemia and eight years later. Clin Diagn Lab Immunol 1994; 1: 238-40. 2. Ellis J, Oyston PCF, Green M, Titball RW. Tularemia. Clin Microbiol Rev 2002; 15: 631-46. 3. Erricsson M. Persistence of Cell-Mediated Immunity and Decline of Humoral Immunity to the Intracellular Bacterium Francisella tularensis 25 years after natural infection. J Infect Dis 1994; 170: 110-4. 4. Esmaeili S, Gooya MM, Shirzadi MR i inni. Seroepidemiological survey of tularemia among different groups in western Iran. Int J Infect Dis 2013; 13: 273-7 5. Evans ME, Gregory DW, Schaffner W, McGee ZA. Tularemia: a 30 year experience with 88 cases. Medicine (Baltimore) 1985; 64: 251-69. 6. Foley JE, Nieto NC. Tularemia. Vet Microbiol 2010; 140: 332-8. 7. Koskela P, Salminen A. Humoral immunity against Francisella tularensis after natural infection. J Clin Microbiol 1985; 22: 973 9. 8. Rastawicki W, Jagielski M, Gierczyński R. Wykorzystanie odczynu ELISA w serologicznej diagnostyce tularemii. Med Dośw Mikrobiol 2005; 57: 425-9. 9. Rastawicki W, Jagielski M. Tularemia. Post Microbiol 2005; 44: 265-73. 10. Rastawicki W, Kurowska J, Hermanowska-Szpakowicz T i inni. Występowanie przeciwciał dla antygenów Francisella tularensis u pracowników leśnych w wybranych regionach Polski 2006; 58: 207-15. 11. Rastawicki W, Rokosz-Chudziak N, Wolaniuk N. Występowanie przeciwciał dla pałeczek Francisella tularensis w poszczególnych podklasach IgG u osób z tularemią. Med Dośw Mikrobiol 2014, 66: 11-15 Otrzymano: 21 VIII 2019 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii i Zwalczania Skażeń Biologicznych, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2019, 71: 89-95 https://doi.org/10.32394/mdm.71.09 Oporność na imipenem wśród beztlenowych pałeczek Bacteroides sp. i Parabacteroides sp. izolowanych od pacjentów hospitalizowanych w Klinikach Szpitala Klinicznego Dzieciątka Jezus w Warszawie Resistance to imipenem among anaerobic bacilli of the genus Bacteroides and Parabacteroides isolated from patients hospitalized in clinics of The Infant Jesus Teaching Hospital in Warsaw Martyna Paśnik 1, Marta Kierzkowska 1,2*, Anna Majewska 1,2, Anna Sawicka-Grzelak 1,2, Andrzej Młynarczyk 2, Grażyna Młynarczyk 1,2 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w Warszawie 2 Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Szpital Kliniczny Dzieciątka Jezus Uniwersyteckie Centrum Kliniczne Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w Warszawie Gatunki rodzajów Bacteroides i Parabacteroides posiadają największą liczbę determinant oporności na antybiotyki spośród bakterii beztlenowych. Istotne jest oznaczanie lekowrażliwości i zastosowanie terapii celowanej w przypadku zakażeń mikroflorą beztlenową. Spektrum przeciwbakteryjne beztlenowych pałeczek Gram-ujemnych obejmuje: klindamycynę, metronidazol, karbapenemy, β-laktamy w połączeniu z inhibitorami β-laktamaz, czy też chloramfenikol. Niepokojący staje się fakt narastania oporności na karbapenemy. Słowa kluczowe: Bacteroides, beztlenowce, imipenem, oporność, gen cfia ABSTRACT Introduction: The aim of this study was to estimate prevalence of carbapenem-resistant strains among Gram-negative obligate anaerobic bacilli Bacteroides sp. and P. distasonis, as well as the frequency of their isolation from samples of different clinical materials from patients hospitalized in clinics of The Infant Jesus Teaching Hospital in Warsaw, and the presence of genes and insertion sequences responsible for exhibiting phenotypic resistance to carbapenems. Materials and Methods: In the study, 57 bacterial isolates including 54 isolates of Bacteroides fragilis group and 3 strains of P. distasonis, were analyzed. The strains were isolated from 47 samples of clinical materials from 41 patients hospitalized in The Infant Jesus

90 M. Paśnik i inni Teaching Hospital in Warsaw, in 2017. Identification of strains confirmed by MALDI-TOF MS (biomérieux S.A, France). The MIC values of imipenem were detected by E-test (biomérieux S.A, France). The bacterial DNA was extracted using a commercial column set Genomic Mini (A&A Biotechnology, Poland). Amplification of cfia genes and insertion sequences (IS942, IS1186, IS1187, IS1188) fragments were performed by polymerase chain reaction with using Thermal Cycler C-1000 (BioRad, USA). After amplification, agarose gel electrophoresis was performed. The PCR products were visualized with using Imager Gel Doc TM XR+ (BioRad, USA). Results: Among all tested isolates, the prevalence of strains from Bacteroides fragilis group was 94.7%, while the P. distasonis strains was 5.3%. 8 species of anaerobic bacilli were identified within the bacteria of genus Bacteroides. Most frequently isolated species were: B. fragilis (31.6%), B. thetaiotaomicron (29.8%) and B. vulgatus (14.0%). The strains were isolated from 47 samples of clinical materials. These were swabs from wounds/abscesses (n = 36), fluids from the peritoneal cavity (n = 16) and the others, in less quantity. The rate of resistance to imipenem was 5.26%. Furthermore, 3.51% strains were intermediate to imipenem. The cfia gene was detected only in B. stercoris strain (1.8%; 1). However, this strain was sensitive to imipenem (MIC = 0.75 mg/l). Insertion sequences weren t detected among cfia-positive strain. Conclusions: The most frequently isolated anaerobic Gram-negative bacilli from samples taken from patients was B. fragilis. The clinical samples were the most common from Department of General and Transplant Surgery. This study show how important is monitoring of anaerobic infections. The cfia-positive strain was detected which may indicate the possibility the transmission of resistance determinants. The rate of transfer of resistance patterns between different, phylogenetically distant species of anaerobic bacteria is very high. Also, the use of an increasing number of antibiotics contributes to the development of resistance. Furthermore, genetic factors and environmental conditions favor the emergence of multidrug resistant strains that generate therapeutic problems with failure of treatment. Key words: Bacteroides, anaerobes, imipenem, resistance, gene cfia WSTĘP Bakterie z rodzajów Bacteroides i Parabacteroides fizjologicznie kolonizują górne drogi oddechowe, układ moczowo-płciowy oraz skórę. Wchodzą w skład naturalnej mikroflory przewodu pokarmowego. Zasiedlają obszar jelita w ilości 1000-krotnie wyższej w stosunku do występującej tam liczby drobnoustrojów tlenowych (1, 2). Beztlenowe pałeczki Gram-ujemne często izolowane są z mikroflory jelita grubego, głównie okrężnicy. Stanowią wówczas ogromny rezerwuar genów oporności na antybiotyki i mają zdolność do przekazywania tychże determinant innym drobnoustrojom. Są to patogeny oportunistyczne. Rozwój zakażenia związany jest z przedostaniem się bakterii do jałowych tkanek. Na świecie obserwuje się coraz większą antybiotykooporność wśród bakterii beztlenowych (3). Pałeczki z grupy B. fragilis posiadają największą liczbę mechanizmów odpowiedzialnych za oporność na antybiotyki, a determinanty tych oporności są najbardziej

Oporność Bacteroides sp. i Parabacteroides sp. na imipenem 91 rozpowszechnionymi wśród wszystkich beztlenowców o potencjale patogennym. Z racji specjalnych wymagań środowiskowych i trudności w hodowli tego typu drobnoustrojów, zalecane na całym świecie jest prowadzenie rejestrów i statystyk dotyczących liczby izolatów, u których wykryto konkretne mechanizmy lekooporności. Kombinacja wielu determinant oporności znajdowanych u B. fragilis w połączeniu z płynnością genomu bakteryjnego wskazuje na możliwość nabywania przez B. fragilis pozachromosomalnych determinant oporności, które skutkują występowaniem dość nietypowych i niepokojących wzorców oporności na kombinacje wielu antybiotyków. Badanie ekspresji wielu genów ma zatem istotne znaczenie kliniczne, a zdobywanie informacji na temat ich pochodzenia jest niezwykle ważne, gdyż może stanowić źródło wiedzy, jak walczyć z narastającym problemem wielolekooporności. Celem pracy było określenie częstości występowania szczepów opornych na imipenem wśród bezwzględnie beztlenowych Gram-ujemnych pałeczek Bacteroides sp. i P. distasonis, a także ocena częstotliwości ich izolacji z próbek różnych materiałów klinicznych pochodzących od pacjentów hospitalizowanych w Klinikach Szpitala Klinicznego Dzieciątka Jezus w Warszawie oraz obecności genów i sekwencji insercyjnych odpowiadających za ujawnienie się fenotypowej oporności na karbapenemy. MATERIAŁ I METODY W roku 2017 z próbek różnego rodzaju materiału klinicznego (wymazy z ran/ropni, płyny z jamy otrzewnej, mocz z nefrostomii, krew, żółć, wymaz z kości żuchwy), pochodzących ze Szpitala Klinicznego Dzieciątka Jezus w Warszawie, zostało wyizolowanych 57 szczepów bezwzględnie beztlenowych pałeczek Bacteroides sp. i P. distasonis. Wszystkie szczepy uzyskano w wyniku rutynowo prowadzonej diagnostyki laboratoryjnej. Od jednego pacjenta pochodził jeden izolat. Wyjątkiem było 11 pacjentów, od których pobierano próbki różnego materiału klinicznego. Niektórzy pacjenci byli wielokrotnie hospitalizowani lub też zdiagnozowano u nich zakażenia mieszane i z jednego materiału zostało wyizolowanych kilka gatunków bakterii. Próbki materiałów były wysiewane na podłoże Schaedler agar z dodatkiem 5% krwi baraniej, witaminy K i heminy (biomérieux S.A, Francja). Płytki następnie inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37ᵒC w warunkach beztlenowych (85% N 2, 10% H 2, 5% CO 2 ). Oceniano morfologię kolonii oraz komórek w preparatach mikroskopowych barwionych metodą Grama. Następnie dokonywano identyfikacji do gatunku przy użyciu systemu MALDI-TOF MS - matrix-assisted laser desorption/ionisation - time of flight mass spectrometry (biomérieux S.A, Francja). Oznaczenie lekowrażliwości na imipenem wykonano gradientowo-dyfuzyjną metodą E-test (biomérieux S.A, Francja). Do określenia wartości najmniejszego stężenia hamującego wzrost bakterii (MIC) wykorzystane zostały paski z gradientem piętnastu różnych, podwójnych stężeń imipenemu, w zakresie 0,002-32 mg/l. Umieszczono je na płytce Brucella agar z dodatkiem 5% krwi końskiej (Graso BIOTECH, Polska). Odczytu dokonywano po trwającej 48 godzin inkubacji w temperaturze 37ᵒC w środowisku beztlenowym. Wynik interpretowano według zaleceń Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST). Z podłoża Schaedler agar (biomérieux S.A, Francja) pobierano pojedynczą kolonię bakteryjną i umieszczano w probówce zawierającej płynne podłoże BHI (biomérieux S.A, Francja). Inkubowano

92 M. Paśnik i inni założone hodowle przez 24 godziny w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 C. W ten sposób pozyskano hodowle bakteryjne do izolacji genomowego DNA, który uzyskano za pomocą zestawu przeznaczonego do izolacji materiału genetycznego - Genomic Mini (A&A Biotechnology, Polska). Przeprowadzono reakcję łańcuchowej polimerazy (PCR) na 57 próbkach wyizolowanego genomowego DNA bakterii. Zastosowano pary starterów odpowiednie do wykrycia genu cfia, kodującego oporność na karbapenemy oraz sekwencji insercyjnych (IS), takich jak: IS942, IS1186, IS1187, IS1188, aktywujących wystąpienie fenotypowej oporności. Wszystkie primery zostały zsyntetyzowane w Pracowni Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydów IBB, PAN w Warszawie. Otrzymane produkty PCR zostały rozdzielone za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a uzyskany rozdział oceniano przy użyciu aparatu z systemem Gel Doc TM XR+ (BioRad, USA). WYNIKI W przeprowadzonym badaniu wykorzystano 47 próbek materiału klinicznego, pochodzącego od 41 pacjentów hospitalizowanych w Szpitalu Klinicznym Dzieciątka Jezus w Warszawie w roku 2017. Łącznie przebadano 57 izolatów bezwzględnie beztlenowych pałeczek Bacteroides sp. i P. distasonis. Wśród wyhodowanych szczepów dominowały pałeczki z grupy B. fragilis (94,7%; 54 szczepy). Pałeczki gatunku P. distasonis stanowiły niewielką część izolatów (5,3%; 3 szczepy). W obrębie rodzaju Bacteroides zostało zidentyfikowanych 8 gatunków drobnoustrojów. Dominującym gatunkiem był B. fragilis (31,6%; 18 szczepów), kolejno: B. thetaiotaomicron (29,8%; 17 szczepów), B. vulgatus (14,0%; 8 szczepów), B. ovatus/xylanisolvens (10,5%; 6 szczepów), B. pyogenes (3,5%; 2 szczepy), B. uniformis (1,8%; 1 szczep), B. stercoris (1,8%; 1 szczep) i B. egghertii (1,8%, 1 szczep). Uzyskane szczepy wyizolowano z wymazów z ran/ropni (29), płynów z jamy otrzewnej (13), moczów z nefrostomii (2), krwi (1), żółci (1) i wymazu z kości żuchwy (1). Największa liczba próbek materiałów klinicznych pochodziła z Kliniki Chirurgii Ogólnej i Transplantacyjnej SKDJW (74,5%; 35 materiałów klinicznych). W mniejszej liczbie z Kliniki Urologii Ogólnej, Onkologicznej i Czynnościowej (14,9%; 7), Kliniki Medycyny Transplantacyjnej i Nefrologii (6,4%; 3), Kliniki Ortopedii i Traumatologii Narządu Ruchu (2,1%; 1) oraz Kliniki Anestezjologii i Intensywnej Terapii (2,1%; 1). Badane szczepy należące do Bacteroides sp. i P. distasonis cechowały się wrażliwością na imipenem w 91,23%. Spośród przebadanych szczepów 5,26% było opornych, zaś 3,51% izolatów było średniowrażliwych na imipenem (Tabela I).Oporność na imipenem wykazały 2 izolaty B. thetaiotaomicron (wartości MIC = 6 mg/l dla obydwu szczepów) oraz 1 izolat B. vulgatus (MIC = 32 mg/l). Wszystkie szczepy oporne na imipenem wyizolowano z próbek materiałów klinicznych pochodzących z Kliniki Chirurgii Ogólnej i Transplantacyjnej. Wyizolowano także 2 szczepy średniowrażliwe na imipenem: 1 izolat B. thetaiotaomicron (MIC = 3 mg/l) pochodzący z Kliniki Chirurgii Ogólnej i Transplantacyjnej oraz 1 izolat B. ovatus/xylanisolvens (MIC = 3 mg/l) wyhodowany z próbki pochodzącej z Kliniki Anestezjologii i Intensywnej Terapii. Największa liczba izolatów opornych oraz średniowrażliwych na imipenem pochodziła od pacjentów hospitalizowanych na oddziałach chirurgicznych SKDJW.

Oporność Bacteroides sp. i Parabacteroides sp. na imipenem 93 Tabela I. Zakresy wartości MIC, MIC 50, MIC 90 imipenemu dla Bacteroides sp. i P. distasonis. Imipenem Zakres MIC MIC 50 MIC 90 % R % I 2017 B. fragilis group (54) 0,002-32 0,125 1,5 5,56 3,70 B. fragilis (18) 0,032-0,38 0,047 0,32 0,00 0,00 B. thetaiotaomicron (17) 0,094-6 0,25 3 11,76 5,88 B. vulgatus (8) 0,032-32 0,19 32 12,50 0,00 B. ovatus/xylanisolvens (6) 0,026-3 0,19 3 0,00 16,67 B. pyogenes (2) 0,002-0,016 0,002 0,016 0,00 0,00 B. uniformis (1) 0,25 0,25 0,25 0,00 0,00 B. stercoris (1) 0,75 0,75 0,75 0,00 0,00 B. eggherti (1) 1,5 1,5 1,5 0,00 0,00 P. distasonis (3) 0,25-1,5 0,38 1,5 0,00 0,00 RAZEM (57) 0,002-32 0,19 1,5 5,26 3,51 R - oporny I - średniowrażliwy Wśród badanych 57 izolatów bakteryjnych wykrywano obecność genu cfia, kodującego oporność na karbapenemy. Poszukiwany gen został wykryty u szczepu B. stercoris (1,8%; 1) wyizolowanego z wymazu z rany/ropnia pochodzącego od pacjenta hospitalizowanego w Klinice Chirurgii Ogólnej i Transplantacyjnej SKDJW. Szczep ten był wrażliwy na imipenem (MIC = 0,75 mg/l). Natomiast wśród szczepów opornych na imipenem nie wykryto obecności genu cfia. Nie stwierdzono zależności pomiędzy obecnością genu cfia, a wartościami MIC imipenemu. Szczep cfia-pozytywny został również przebadany pod kątem obecności sekwencji insercyjnych: IS942, IS1186, IS1187, IS1188, których obecność może mieć związek z aktywacją genu i ujawnieniem się fenotypowej oporności na karbapenemy. Jednak u badanego szczepu nie wykryto żadnej z poszukiwanych sekwencji. DYSKUSJA Najczęściej izolowanym z próbek materiałów klinicznych patogenem był B. fragilis, podobnie jak w badaniach innych autorów (4, 5). Materiały, z których wyhodowano ten gatunek pałeczki beztlenowej pochodziły głównie z kliniki chirurgicznej. Wyniki te są potwierdzeniem badania przeprowadzonego na próbkach materiałów pobranych od pacjentów przebywających na oddziałach chirurgicznych, z których to najczęściej izolowanymi patogenami były szczepy B. fragilis (6). Potencjalną przyczyną tego typu infekcji mogą być zakażenia endogenne na skutek naruszenia ciągłości tkanek w wyniku przebytych zabiegów operacyjnych. Czynnikami sprzyjającymi tego typu zakażeniom na oddziałach chirurgicznych są słabe ukrwienie i martwica tkanek w wyniku obniżonego dopływu krwi do potencjalnego obszaru infekcji. Szczepy

94 M. Paśnik i inni należące do grupy B. fragilis dominują w zakażeniach wewnątrzotrzewnowych, gdyż stanowią fizjologiczną mikroflorę przewodu pokarmowego (7, 8). Zaś w wyniku rozerwania ściany jelita, uchyłków lub innego rodzaju perforacji spowodowanych ranami chirurgicznymi dochodzi do przenikania naturalnej flory przewodu pokarmowego do fizjologicznie jałowej jamy otrzewnej, co skutkuje rozwojem ognisk zakażenia (9). Spośród przebadanych izolatów bakteryjnych tylko jeden szczep (wrażliwy na imipenem) posiadał gen cfia. Nie wykryto u niego obecności żadnej z poszukiwanych sekwencji insercyjnych. Wykrycie elementów insercyjnych u szczepów cfia-pozytywnych jest niezwykle rzadkie, co ma potwierdzenie, w wielu przeprowadzonych na szczepach posiadających gen cfia, badaniach (10, 11). Co więcej, można zauważyć zbliżony stopień oporności szczepów Bacteroides sp. na karbapenemy w różnych regionach świata, o czym świadczą doniesienia i publikacje naukowe opisujące ten rozwijający się problem. Sekwencje insercyjne są wykrywane jedynie u 1% szczepów nieposiadających genu cfia. Sugeruje się, że niska częstość występowania genu cfia w izolatach B. fragilis wskazuje na niedawne nabycie przez szczepy genu (12, 13, 14, 15). Infekcje monobakteryjne lub mieszane z udziałem beztlenowej flory bakteryjnej są zwykle leczone empirycznie. Niegdyś zastosowanie antybiotyku o szerokim spektrum działania dawało niemal stuprocentową gwarancją wyleczenia chorego. Obecnie, wiele drobnoustrojów wykształciło różnorodne mechanizmy oporności na terapeutyki, przez co powszechnie przyjęte schematy leczenia okazały się nieskuteczne. Istnieją wyraźne przesłanki przemawiające za tym, że częstość izolacji szczepów opornych może mieć wraz z upływem lat tendencję wzrostową. Pomimo pojawiania się coraz liczniejszych badań dotyczących sekwencji insercyjnych mogących odpowiadać za występującą oporność na karbapenemy, temat ten nie został jeszcze dogłębnie zbadany. Już teraz wiadomo, na podstawie danych literaturowych, jaki rodzaj sekwencji insercyjnej może wpływać na promocję genu cfia. Jednakże zależność ta nie jest silnie skorelowana, a wykrycie określonej sekwencji u danego szczepu nie musi świadczyć o oporności tego izolatu na karbapenemy. Co więcej wykrycie samego genu cfia nie musi być ściśle związane z wystąpieniem oporności na karbapenemy, tak jak ma to miejsce w przypadku wykrywania genów oporności na antybiotyki u bakterii tlenowych (16, 17, 18). W Polsce statystyki dotyczące wrażliwości beztlenowców na antybiotyki są raczej niedoszacowane. Monitorowanie narastania oporności na karbapenemy jest zatem niezwykle istotne. Pomimo narastającej w ostatnich latach lekooporności, karbapenemy nadal jednak pozostają dobrą opcją terapeutyczną w przypadku leczenia zakażeń, gdyż cechuje je wysoki procent skuteczności zwalczania infekcji mieszanych (19). PIŚMIENNICTWO 1. Wexler H. Bacteroides: the good, the bad, and the nitty-gritty. Clin Microbiol Rev 2007; 4: 593-621. 2. Nagy E. Anaerobic infections: update on treatment considerations. Drugs 2010; 7: 841-58. 3. Schuetz A. Antimicrobial resistance and susceptibility testing of anaerobic bacteria. Clin Infect Dis 2014; 5: 698-705. 4. Székely E, Eitel Z, Molnár S i inni. Analysis of Romanian Bacteroides isolates for antibiotics resistance levels and the corresponding antibiotics resistance genes. Anaerobe 2015; 31: 11-4.

Oporność Bacteroides sp. i Parabacteroides sp. na imipenem 95 5. Ferløv-Schwensen S, Sydenham T, Hansen K i inni. Prevalence of antimicrobial resistance and the cfia resistance gene in Danish Bacteroides fragilis group isolates since 1973. International Journal of Antimicrobial Agents 2017; 50: 552-6. 6. Kierzkowska M, Majewska A, Sawicka-Grzelak A, Młynarczyk A i inni. Specyfika zakażeń bakteriami beztlenowymi na oddziałach chirurgicznych i ortopedycznych. Med Dośw Mikrobiol 2012; 64: 29-34. 7. Kayser F, Bienz K, Eckert J, Zinkernagel R. Mikrobiologia lekarska. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Heczko P, Pietrzyk A. Warszawa 2007; 288-91. 8. Tang Y, Sussmann M, Liu D i inni. Molecular Medical Microbiology. Academic Press 2015; 2: 917-9. 9. Brook I. Spectrum and treatment of anaerobic infections. J Infect Chemother 2016; 1: 1-13. 10. Cordovana M, Kostrzewa M, Sóki J i inni. Bacteroides fragilis: A whole MALDI-based workflow from identification to confirmation of carbapenemase production for routine laboratories. Anaerobe 2018; 54: 246-53. 11. Sárvári K, Sóki J, Krisóf K i inni. Molecular characterization of Multidrug Resistant Bacteroides isolates from Hungarian clinical samples. Journal of Global Antimicrobial Resistance 2017; 13: 65-9. 12. Sóki J. Extended role for insertion sequence elements in the antibiotics resistance of Bacteroides. World J Clin Infect Dis 2013; 1: 1-12. 13. Podglajen I, Breuil J, Collatz E. Insertion of a novel DNA sequence, 1S1186, upstream of the silent carbapenemase gene cfia, promotes expression of carbapenem resistance in clinical isolates of Bacteroides fragilis. Mol Microbiol 1994; 1: 105-14. 14. Ruimy R, Podglajen I, Breuil J i inni. A Recent fixation of cfia genes in a monophyletic cluster of Bacteroides fragilis is correlated with the presence of multiple insertion elements. J Bacteriol 1996; 7: 1914-8. 15. Sóki J. Extended role for insertion sequence elements in the antibiotics resistance of Bacteroides. World J Clin Infect Dis 2013; 1: 1-12. 16. Hansen K, Schwensen S, Henriksen D i inni. Antimicrobial resistance in the Bacteroides fragilis group in faecal samples from patients receiving broad-spectrum antibiotics. Anaerobe 2017; 47: 79-85. 17. Nakamura I, Aoki K, Miura Y i inni. Fatal sepsis caused by multidrug-resistant Bacteroides fragilis, harboring a cfia gene and an upstream insertion sequence element, in Japan. Anaerobe 2017; 44: 36-9. 18. Kangaba A, Saglam F, Tokman H i inni. The prevalence of enterotoxin and antibiotic resistance genes in clinical and intestinal Bacteroides fragilis group isolates in Turkey. Anaerobe 2015; 35: 72-6. 19. Niestępski S, Harnisz M, Korzeniewska E i inni. Bacteroides spp. znaczenie kliniczne, lekooporność i metody jej oznaczania. Post. Mikrobiol. 2017; 1: 67-76. Otrzymano: 10 VI 2019 Adres autora: ul. Chałubińskiego 5, 02-004 Warszawa, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego *Autor do korespondencji: mkierzkowska@wum.edu.pl

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2019, 71: 97-108 https://doi.org/10.32394/mdm.71.10 Molekularna diagnostyka preparatów histopatologicznych jako uzupełnienie badań mikrobiologicznych gruźlicy Molecular diagnostics of histopathological samples as a complement to microbiological diagnosis of tuberculosis Sylwia Brzezińska¹, Joanna Dziadura², Anna Zabost¹, Magdalena Klatt¹, Małgorzata Szołkowska 3, Ewa Augustynowicz- Kopeć¹ 1 Zakład Mikrobiologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, Warszawa 2 Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, Wydział Rolnictwa i Biologii, Warszawa 3 Zakład Patomorfologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, Warszawa Molekularne techniki wykorzystujące hybrydyzację kwasów nukleinowych są coraz częściej stosowane w diagnostyce gruźlicy. Charakteryzują się one wysoką czułością i swoistością. Celem podjętych badań była ocena przydatności metod molekularnych w diagnostyce gruźlicy w oparciu o badania próbek materiału klinicznego utrwalonych w parafinie. Przeprowadzona została genetyczna analiza DNA izolowanego z próbek materiałów tkankowych uzyskanych od 45 chorych z podejrzeniem gruźlicy. Określono korelację pomiędzy wynikiem uzyskanym w badaniu genetycznym a wynikami badania mikrobiologicznego przeprowadzonego na próbkach uzyskanych od tej grupy chorych. Słowa kluczowe: Mycobacterium tuberculosis complex, gruźlica, diagnostyka molekularna, ProbeTec, IS6110 ABSTRACT Introduction: Methods of conventional microbiology, which constitute the gold standard of diagnostics, are necessary in case of detection of mycobacteria in fresh materials. The limited scope of the traditional methods analytical capabilities does not allow for retrospective diagnosis. Molecular methods, based on techniques involving nucleic acid hybridization are becoming widely used in the diagnosis of tuberculosis. These techniques provide the opportunity to perform a quick analysis of the material without the time-consuming stage of culture. Systems using molecular biology techniques in diagnostics show high sensitivity and specificity. The aim of the dissertation is to assess the usefulness of diagnostic molecular methods based on the detection of nucleic acids in paraffin fixed histopathological probes, taken from patients with suspected tuberculosis. Materials and Methods: This dissertation presents the results of an analysis of tissue materials obtained from 45 patients with suspected tuberculosis. In histopathological ex-

98 S. Brzezińska i inni amination the probes show changes suggesting the possibility of an ongoing tuberculosis. The indications for diagnosis of tuberculosis infection include necrotic changes, granulation tissue, fibrosis and other changes indicating the development of the inflammatory process within the tissue from which the material was collected. Paraffin-fixed tissue probes are subjected to molecular diagnosis using the BD ProbeTec ET system. Clinical materials are analyzed by standard microbiological methods used in the diagnosis of tuberculosis. Results: Molecular analysis of 45 paraffin-fixed materials showed presence of Mycobacterium tuberculosis complex in 22 cases, in 12 of them Mycobacterium was detected in microbiological methods. Analysis showed 54% agreement between the positive results in the molecular methods of paraffin preparations and microbiological diagnostics of clinical samples. Conclusions: 1. The use of genetic methods enables quick and detailed diagnostics of infections caused by M. tuberculosis complex, which allows for the supplementation of microbiological and histopathological diagnostics. 2. Use of molecular methods to confirm the presence of Mycobacterium tuberculosis complex in paraffin-fixed materials is important also for patients whose diagnosis based solely on histopathology and were not microbiologically tested. Key words: Mycobacterium tuberculosis, Mtb, tuberculosis, molecular diagnostics, ProbeTec, IS6110 Mycobacterium tuberculosis stanowi czynnik etiologiczny gruźlicy - choroby, która poprzez łatwą transmisję w środowisku człowieka jest nadal bardzo powszechna. Aktualnie, mimo dostępności nowoczesnych metod diagnostyki TB wciąż występują regiony dotknięte wysokim poziomem zachorowań i śmiertelności. Według raportu WHO gruźlica jest jedną z dziesięciu głównych przyczyn zgonów na świecie (5). Choroba dotyka przede wszystkim osoby w wieku produkcyjnym, pomiędzy 45 a 54 rokiem życia. Na gruźlicę częściej chorują mężczyźni niż kobiety (średnio w stosunku 3:1), a największy odsetek zgonów, ponad 90%, odnotowuje się w krajach rozwijających się (3). W najnowszym raporcie WHO, zawierającym dane epidemiologiczne TB za 2018 rok, opublikowano listę 20 krajów o najwyższych wskaźnikach zapadalności na TB. Wśród nich są głównie kraje Azji i Afryki ale także Brazylia i Rosja (17). Stwierdzono, że zapadalność na gruźlicę wzrasta w grupach podwyższonego ryzyka, czyli wśród imigrantów, więźniów oraz osób z wrodzonymi lub nabytymi niedoborami odporności. Choroba jest szczególnie niebezpieczna dla osób zakażonych wirusem HIV, u których stanowi jedną z głównych przyczyn śmiertelności, natomiast wzrost liczby osób HIV pozytywnych jest czynnikiem sprzyjającym rozprzestrzenianiu się choroby (13). Powodem trudności w realizacji światowych programów walki z gruźlicą jest między innymi wzrastająca liczba szczepów wielolekoopornych (multi drug - resistant (MDR)) i o rozszerzonej oporności (extensively drug - resistant (XDR)). Poza niepowodzeniami w leczeniu tych form TB wśród chorych rejestruje się również wysokie wskaźniki śmiertelności odpowiednio 30% vs 60% (2). W Polsce według ostatnich danych Centralnego Rejestru Gruźlicy prowadzonego przez Zakład Epidemiologii IGiChP w roku 2018 zaobserwowano poprawę sytuacji epidemiologicznej w stosunku do lat ubiegłych. Zarejestrowano 5487 przypadków zachorowań, to jest o 300 przypadków mniej niż w roku 2017 i 957 mniej niż w roku 2016 (11).

Metody molekularne w diagnostyce gruźlicy 99 Ogólne symptomy gruźlicy są mało charakterystyczne a zalicza się do nich: osłabienie, brak apetytu, chudnięcie, podwyższoną temperaturę oraz stany podgorączkowe. W przypadku choroby o ciężkim przebiegu może występować krwioplucie i duszności. Ze względu na powolny metabolizm prątków (czas generacji wynosi średnio 18 godzin) rozwój choroby jest mało dynamiczny a utrzymywanie się symptomów długotrwałe. W przypadku gruźlicy, która dotyczy zmian poza układem oddechowym czyli postaci pozapłucnej, występują również dolegliwości związane z narządem dotkniętym zmianami. Częste postaci gruźlicy pozapłucnej to: gruźlicze zapalenie opłucnej, węzłów chłonnych i skóry. Zmiany mogą pojawić się również w osierdziu, układzie kostno-stawowym, pokarmowym i nerwowym (14). Bakterie przenoszone są drogą kropelkową a źródłem transmisji M. tuberculosis są chorzy z aktywną postacią gruźlicy, znajdujący się w stadium prątkowania. Zarówno w przypadku postaci płucnej jak i pozapłucnej diagnostyce poddawane są m.in. materiały tkankowe pobierane technikami inwazyjnymi (materiały biopsyjne, pooperacyjne). Często są one kierowane jedynie do badania histopatologicznego z pominięciem diagnostyki mikrobiologicznej. W preparatach poszukiwane są zmiany charakterystyczne dla gruźlicy. Typowe są ziarniniaki zbudowane z komórek olbrzymich i nabłonkowych. Możemy wyróżnić trzy rodzaje ziarniniaków: stałe, martwicze i serowate. W przypadku pacjentów z obniżoną odpornością mogą występować nacieki i ogniska zapalne, bez typowych zmian ziarnistych (7). Utrudnieniem przy stawianiu diagnozy TB na podstawie cech morfologicznych tkanki jest fakt, że ziarniniaki występują również w innych jednostkach chorobowych, między innymi sarkoidozie i brucelozie. Opis badania histologicznego nie pozwala na jednoznaczne określenie gruźliczej etiologii zmian i wymaga uzupełnienia metodami molekularnymi. Wykorzystanie molekularnych metod diagnostycznych umożliwia potwierdzenie niewielkiej ilości prątków w preparacie histopatologicznym. Ze względu na wysoką czułość tego typu technik, są one szeroko stosowane w diagnostyce, zarówno u chorych z podejrzeniem płucnej jak i pozapłucnej postaci gruźlicy, mającej charakter skąpoprątkowy i stwarzającej trudności w przypadku diagnostyki metodami klasycznymi. Stosowane obecnie techniki molekularne pozwalają na wykrywanie M.tuberculosis complex zarówno w bezpośrednich materiałach od chorego, jak i w preparatach archiwalnych, utrwalonych w parafinie. Dzięki skuteczności tych metod możliwe jest wykonywanie badań retrospektywnych. Informacje na temat etiologii zmian tkankowych są pomocne również w ustaleniu, czy doszło do wznowy choroby. Dzięki dostępności metod biologii molekularnej możliwe jest nie tylko wykrywanie ale także różnicowanie prątków gruźlicy na poziomie szczepów. Najczęściej stosowanymi metodami genotypowania Mycobacterium tuberculosis complex są spoligotyping i MIRU-VNTR (Variable Numer Of Tandem Repeats). Techniki te wykrywają polimorfizm struktury i organizacji w obrębie DNA prątków. Umożliwiają określenie pokrewieństwa szczepów w dochodzeniach epidemiologicznych, przeprowadzanych często w obrębie grup wysokiego ryzyka zakażenia. W diagnostyce molekularnej M. tuberculosis stosowane są również systemy komercyjne, umożliwiające wykrywanie lekooporności typu MDR i XDR (testy GenoType MTB- DRplus i GenoType MTBDRsl) oraz pozwalające na różnicowanie gatunków w obrębie M. tuberculosis complex (test GenoType MTBC). Metody genetyczne dają więc możliwość szybkiej i precyzyjnej diagnostyki gruźlicy.

100 S. Brzezińska i inni Celem pracy była ocena przydatności metod molekularnych w diagnostyce gruźlicy oraz określenie korelacji pomiędzy badaniem genetycznym materiałów utrwalonych w parafinie a wynikiem badania mikrobiologicznego. MATERIAŁ I METODY Analizie poddano preparaty utrwalone w parafinie (Tab. I) oraz materiały kliniczne (Tab. II), pochodzące od 45 chorych z podejrzeniem gruźlicy. W badaniu histopatologicznym wykazano zmiany sugerujące możliwość wystąpienia gruźlicy. W preparatach widoczne były: martwica, ziarnina, zwłóknienia lub inne elementy wskazujące na rozwój procesu zapalnego w obrębie badanej tkanki. Materiały kliniczne pobrane od pacjentów zostały poddane analizie mikrobiologicznej. Tabela I. Charakterystyka próbek materiału utrwalonych w parafinie. Rodzaj materiału Liczba próbek Fragment płuca 21 Fragment węzła chłonnego 6 Biopsja guza płuca 6 Wycinek skóry 4 Fragment najądrza 2 Płyn z opłucnej 2 Fragment oskrzela 1 Fragment opłucnej 1 Treść kanału kręgowego 1 Wydzielina oskrzelowa 1 Tabela II. Próbki materiału klinicznego Rodzaj materiałów klinicznych Liczba próbek Plwocina 15 Wydzielina oskrzelowa 15 Popłuczyny żołądkowe 3 Wycinek skóry 3 Fragment płuca 2 Płyn z opłucnej 2 PMR (płyn mózgowo-rdzeniowy) 2 BAL (popłuczyny oskrzelikowo-pęcherzykowe) 1 Opłucna 1 Guz płuca 1 Badania mikrobiologiczne. Metoda opracowywania materiałów do badań mikrobiologicznych. Do analizowanych próbek materiałów klinicznych dodano roztwór dekontaminujący N-acetylocysteinę w stosunku 1:1. Zawarty w nim 2,9% cytrynian sodu chelatował metale, natomiast 3% NaOH stanowił właściwy składnik dekontaminujący.

Metody molekularne w diagnostyce gruźlicy 101 Przebieg dekontaminacji: Etap z zastosowaniem N- acetylocysteiny i wytrząsaniem (17 minut) Neutralizacja (rozcieńczenie w buforze fosforanowym (Na 2 HPO 4 ) z dodatkiem 5% Tweenu Wirowanie (20 minut) przy prędkości 3500 rpm. Rozpuszczenie otrzymanego precypitatu w buforze fosforanowym (Na 2 HPO 4 ). Bakterioskopia. Bakterioskopia stanowiła pierwszy etap diagnostyki mikrobiologicznej. Mikroorganizmy po wybarwieniu odpowiednią metodą poddawane były obserwacji mikroskopowej. Metodą przesiewową stanowiło barwienie preparatów auraminą. W tym celu pobrano 2-3 krople uprzednio przygotowanego (dekontaminowanego) materiału klinicznego, który wybarwiano przez 15 minut barwnikiem fluorescencyjnym. Do dobarwienia tła preparatu stosowano nadmanganian potasu. Dodatni wynik barwienia auraminą weryfikowano metodą Ziehl- Neelsena. W przypadku metody Z-N preparat barwiony był fuksyną karbolową przez 15 minut i w tym czasie podgrzewany kilkukrotnie, w celu ułatwienia wniknięcia barwnika przez bogatą w lipidy ścianę komórkową prątków. Następnie preparat odbarwiany był kwaśnym alkoholem (3% roztwór HCl w etanolu), który wypłukiwał fuksynę z niekwasoopornych komórek bakterii. Dobarwianie wykonywano przez 10 minut, barwnikiem kontrastującym - błękitem metylenowym. Hodowla. Hodowla prątków z materiałów klinicznych jest procesem długotrwałym, trwającym kilka tygodni. Prowadzona była na standardowych podłożach dla mykobakterii: Löwensteina-Jensena (glicerol, jako źródło węgla), Stonebrink a (pirogronian, jako źródło węgla), oraz Middlebrooka 7H9 (w przypadku stosowania automatycznego systemu kontroli wzrostu BD BACTEC MGIT Mycobacterium Growth Indicator Tube Becton Dickinson). W systemie automatycznym stosowane są bezbarwne podłoża z dodatkiem związków, umożliwiających detekcję zmian zachodzących pod wpływem działania metabolizmu bakterii. Zestaw BBL MGIT wzbogacony jest o suplement BACTEC MGIT PANTA, zawierający zestaw antybiotyków. Badania genetyczne. Badanie genetyczne z zastosowaniem systemu GeneXpert MTB/RIF. Wstępnym etapem badania z zastosowaniem GeneXpert MTB/RIF było upłynnienie i inaktywacja próbek przy użyciu odpowiedniego buforu. Tak przygotowane materiały umieszczano w kartridżu, a następnie w aparacie. W systemie zamkniętym materiały poddane zostały filtracji, zagęszczeniu, a komórki bakteryjne rozbiciu ultradźwiękami. Ostatnim etapem była reakcja wykrywania DNA prątków Semi - Nested Real Time-PCR. Równolegle system wykrywał obecność genu (rpob), warunkującego oporność MTB na rifampicynę. Badanie genetyczne z zastosowaniem systemu BD ProbeTec. W pierwszym etapie badania komórki bakteryjne inaktywowano termicznie, w temperaturze 105 C, a następnie rozbijano w buforze lizującym, przy użyciu ultradźwięków. Kolejny etap wykrywania DNA prątków przeprowadzano w mikrostudzienkach płytki - Priming Microwell, zawierającej w postaci liofilizowanej startery do amplifikacji, znakowane fluorescencyjnie sondy i pozostałe odczynniki konieczne do przebiegu reakcji. Po inkubacji mieszaninę reakcyjną przenoszono do studzienek Amplification Microwell, zawierających dwa enzymy niezbędne w reakcji SDA polimerazę DNA i endonukleazę restrykcyjną. Otrzymane w wyniku procesu fragmenty (amplikony) poddawano hybrydyzacji z zastosowaniem specyficznych, znakowanych fluorescencyjnie sond, co pozwalało na wykrycie sygnału przez czytnik fluorescencyjny. W reakcji wykrywano charakterystyczną dla M. tuberculosis complex sekwencję inercyjną IS6110 (8, 18).

102 S. Brzezińska i inni Badania utrwalonych materiałów histopatologicznych. Pobieranie materiału tkankowego do badań histopatologicznych. Materiały utrwalone w parafinie pobrane zostały śródoperacyjnie, z wyjątkiem wydzielin oskrzelowych i płynu z opłucnej. Materiały poddawano standardowej procedurze stosowanej w celu wykonania preparatów histopatologicznych (Ryc. 1). Ryc. 1 Materiały utrwalone w parafinie - algorytm postępowania przy podejrzeniu gruźlicy. Utrwalenie materiału tkankowego. W celu uniknięcia powstawania nekroz i degradacji, materiał umieszczano w płynie utrwalającym. Najczęściej stosowanym, uniwersalnym medium utrwalającym tkanki, jest zobojętniony węglanem wapnia, 10% wodny roztwór formaldehydu (stosowanie wyższych stężeń odczynnika nie jest wskazane, ponieważ może on powodować twardnienie i obkurczanie tkanki). Odwadnianie preparatu i zatapianie w parafinie. Etap zatapiania w obojętnym biochemicznie medium, utwardzającym tkanki jest konieczny, gdyż umożliwia ich fragmentację na bardzo cienkie skrawki. Funkcję tę pełni parafina. By nasycenie preparatu parafiną było skuteczne należy odwodnić tkanki. Proces odwadniania odbywa się stopniowo, poprzez szereg kąpieli w roztworach etanolu o wzrastających stężeniach (szereg odwadniający: alkohol 50% - 99,8%), następnie w mieszaninie etanol- ksylen, na końcu w czystym ksylenie. Tak przygotowany materiał poddawany jest infiltracji mieszaniną parafiny z ksylenem a następnie ciekłą parafiną. (16). Przesyconą tkankę zatapiano w bloczku parafinowym i krojono przy pomocy mikrotomu na skrawki o grubości ok. 5µm. Fragmenty umieszczano na szkiełku podstawowym (silanizowanym lub nabiałkowanym) i utrwalano w temperaturze 50 C. Barwienie preparatów. Przygotowane, utrwalone w parafinie preparaty, poddano badaniu histopatologicznemu. Najczęściej stosowaną metodą barwienia preparatów histopatologicznych jest barwienie hematoksyliną i eozyną (16). W przypadku preparatów wykazujących obecność zmian sugerujących gruźlicę, w tym ziarninę, wykonywano dodatkowe barwienie metodą Z-N. Natomiast niebarwione preparaty poddawano badaniu molekularnemu.