UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNO-PRZYRODNICZY IM. JANA I JĘDRZEJA ŚNIADECKICH W BYDGOSZCZY Wydział Rolnictwa i Biotechnologii Pracownia Fitopatologii i Mykologii Molekularnej mgr inż. Katarzyna Koczwara STRESZCZENIE ROZPRAWY DOKTORSKIEJ NA TEMAT: Rola białek odpornościowych w mechanizmie wyższej aktywności przeciwgrzybowej życicy trwałej zasiedlonej przez Epichloë festucae var. lolii Promotor: dr hab. inż. Dariusz Pańka, prof. nadzw. UTP Promotor pomocniczy: dr inż. Małgorzata Jeske Bydgoszcz 2019
WSTĘP Życica trwała należy do traw o dużym znaczeniu w Polsce i na świecie. Podczas jej uprawy dużym zagrożeniem mogą być patogeny grzybowe. Narażone są na nie zarówno nadziemne, jak i podziemne części rośliny. Choroby prowadzą do obniżenia walorów użytkowych i estetycznych. Mogą prowadzić nawet do zniszczenia całego pastwiska lub trawnika. Obecnie Unia Europejska nakłada na kraje członkowskie obowiązek stosowania integrowanej ochrony roślin (Rozporządzenie (EC) No 1107/2009, Dyrektywa 2009/128/EC), rośnie też świadomość społeczna i coraz większą uwagę przywiązuje się do stosowania dostępnych metod biologicznej ochrony roślin. Stąd też, wskazane jest poszukiwanie możliwości wykorzystania naturalnego układu symbiotycznego, jaki zawiązuje życica trwała z endofitem E. festucae var. lolii do ochrony tej rośliny. Endofity to mikroorganizmy, najczęściej grzyby lub bakterie, które bezobjawowo zasiedlają roślinę przynajmniej przez część swojego cyklu życiowego. Asocjacja uznawana jest za korzystną dla obu stron. Dla endofita roślina stanowi źródło substancji odżywczych. Dla rośliny korzyścią jest zwiększenie odporności przeciwko patogenom, a także lepszy wzrost i odporność na stres. Endofity traw należą do tych o największym znaczeniu gospodarczym. Typowe endofity traw z rodzaju Epichloë nie powodują u roślin żadnych objawów chorobowych i nie występują poza rośliną. Wpływają pozytywnie na zasiedlane rośliny poprawiając ich wzrost i rozwój, a także na odporność na stresy biotyczne i abiotyczne. Epichloë festucae var. lolii (wcześniej Neotyphodium lolii) nawiązuje trwałe asocjacje z życicą trwałą. Trawa ta może zarówno naturalnie, jak i sztucznie zostać zasiedlona przez endofita, a poziom zasiedlenia jest zróżnicowany dla różnych siedlisk i zbiorowisk. Najwyższe poziomy obserwowane są w zbiorowiskach naturalnych, na terenach silnie zurbanizowanych oraz na siedliskach ciepłych i suchych. Dokładny mechanizm pozytywnego wpływu endofita na zasiedlaną roślinę nie został jeszcze dokładnie poznany, można jednak przypuszczać, że istotne znaczenie mają w nim białka odpornościowe i związki fenolowe. Białka odpornościowe aktywowane są w roślinie w odpowiedzi na atak patogenów, szkodników bądź czynniki abiotyczne. Mogą także konstytutywnie występować w komórce. Ich ekspresja i akumulacja związana jest z rodzajem patogena, ale także typem komórki roślinnej i obecnością cząsteczek sygnałowych. Ich przeciwgrzybowe właściwości związane są przede wszystkim ze zdolnością do rozkładu ściany komórkowej grzybów. Związki fenolowe należą do najbardziej rozpowszechnionych w przyrodzie metabolitów wtórnych. Mogą być obecne w komórce konstytutywnie, ale ich synteza może być także indukowana przez infekcję. Cechuje je aktywność przeciwgrzybowa, przeciwbakteryjna i przeciwwirusowa. Do związków fenolowych cechujących się aktywnością przeciwgrzybową należą: kwas cynamonowy, kwas benzoesowy, kwas salicylowy i tymol. Związki fenolowe mogą zwiększać także odporność rośliny na ataki patogenów poprzez udział we wzmacnianiu ściany komórkowej. Izolaty E. festucae var. lolii występujące naturalnie w środowisku, nieprodukujące szkodliwych dla zwierząt substancji (lolitremu B) i warunkujące wyższą odporność przeciwgrzybową zasiedlonych roślin mogą zostać wykorzystane w biologicznej ochronie życicy trwałej. CEL BADAŃ Celem przeprowadzonych badań było poznanie mechanizmów wyższej odporności przeciwgrzybowej asocjacji symbiotycznej E. festucae var. lolii z życicą trwałą warunkowanych obecnością wybranych białek odpornościowych i związków fenolowych oraz wyselekcjonowanie izolatów endofita możliwych do wykorzystania w biologicznej ochronie życicy trwałej. Realizacja badań pozwoliła na osiągnięcie następujących celów szczegółowych:
zebrano kolekcję ekotypów życicy trwałej i potwierdzono zasiedlenie przez endofity z rodzaju Epichloë, dokonano identyfikacji E. festucae var. lolii w badanych ekotypach, wyizolowano i zidentyfikowano grzyby endobiotyczne zasiedlające ekotypy życicy trwałej, dokonano oceny aktywności antygrzybowej wybranych endofitów in vitro, dokonano oceny aktywności antygrzybowej wybranych asocjacji życicy trwałej i E. festucae var. lolii in vivo, zbadano wpływ obecności E. festucae var. lolii w wybranych ekotypach życicy trwałej na zawartość wolnych związków fenolowych i białka ogólnego oraz aktywność chitynaz, β-1,3-glukanaz i peroksydazy gwajakolowej w roślinach pod wpływem porażenia przez patogeny grzybowe. MATERIAŁ I METODY Kolekcja prób życicy trwałej wykorzystanej w badaniach W badaniach wykorzystano próby życicy trwałej zgromadzone w kolekcji Polskiego Centrum Roślinnych Zasobów Genowych oraz kolekcję własną złożoną z traw zebranych w różnych rejonach województwa kujawsko-pomorskiego. Składało się na nią 67 prób. Detekcja endofitów z wykorzystaniem Phytoscreen Immunoblot Kit Neotyphodium FIELD TILLER firmy AGRINOSTICS, Ltd. Co. Rośliny przebadane zostały pod kątem obecności endofita z wykorzystaniem testu Neotyphodium FIELD TILLER AGRINOSTICS. Badanie przeprowadzono zgodnie z zaleceniami producenta zestawu. Na podstawie wystąpienia reakcji barwnej możliwe było sprawdzenie, czy badane rośliny zasiedlone są przez endofity z rodzaju Epichloë. Identyfikacja grzybów endofitycznych z wykorzystaniem metody molekularnej Izolację DNA przeprowadzono z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody Doyle a i Doyle (1990). Detekcja E. festucae var lolii przeprowadzona została z wykorzystaniem reakcji PCR. Amplifikacja została przeprowadzona z wykorzystaniem starterów zaprojektowanych przez Rasmussen i in. (2007) do wykrywania dwóch genów specyficznych dla tego gatunku endofita kodujących chitynazę (Chit A) i nierybosomalną syntetazę peptydów (NRPS-1). Produkty reakcji PCR rozdzielono na żelu agarozowym, a wyniki odczytano z wykorzystaniem systemu dokumentacji żeli. Izolacja i identyfikacja grzybów endobiotycznych występujących w próbach życicy trwałej Izolacja grzybów endobiotycznych została przeprowadzona z roślin po czterech tygodniach wzrostu w fitotronie. Fragmenty tkanki pobrano z najstarszych części rośliny. Zostały one oczyszczone i pocięte na fragmenty o długości 5 mm, a następnie przecięte wzdłuż osi. Przeprowadzono odkażanie powierzchniowe z wykorzystaniem alkoholu etylowego i podchlorynu sodu. Następnie trzykrotnie wypłukano materiał roślinny w wodzie destylowanej. Fragmenty przeniesiono na płytki Petriego z pożywką PDA. Oznaczenie występujących grzybów przeprowadzono z wykorzystaniem ogólnodostępnych kluczy mikologicznych po 4 tygodniach inkubacji w ciemności, w temperaturze 22 C. Ocena aktywności antygrzybowej wybranych endofitów in vitro Ocenę aktywności antygrzybowej endofitów z rodzaju Epichloë przeciwko Fusarium poae, Rhizoctonia solani, Bipolaris sorokiniana i Drechslera sp. przeprowadzono w oparciu o testy laboratoryjne według zmodyfikowanej metody Pańki i in. (2013). Na płytkach z pożywką PDA umieszczono krążki o średnicy 5 mm wyizolowanych endofitów oraz badanych grzybów patogenicznych. Odczytano wielkość strefy inhibicji pomiędzy kolonią endofita a kolonią patogena i oznaczono indywidualny efekt biotyczny.
Ocena aktywności antygrzybowej asocjacji życicy trwałej i E. festucae var. lolii in vivo Wybrane asocjacje zostały poddane ocenie aktywności przeciwgrzybowej w stosunku do Fusarium poae, Rhizoctonia solani, Bipolaris sorokiniana i Drechslera sp. z wykorzystaniem testów wazonowych ze sztuczną inokulacją zgodnie z metodyką podaną przez Pańkę i in. (2011). Sześć dni po inokulacji wykonano ocenę stopnia porażenia 10 liści i obliczono indeks porażenia. Analiza aktywności białek odpornościowych Oznaczenie aktywności białek odpornościowych przeprowadzono w roślinach zdrowych, a następnie w 3, 6 i 9 dniu po inokulacji patogenem grzybowym. Ekstrakcję przeprowadzono z wykorzystaniem buforu fosforanowego z dodatkiem EDTA i nierozpuszczalnego PVP. Homogenizację przeprowadzono w mocno schłodzonych moździerzach ceramicznych. Następnie przeprowadzono podwójną ekstrakcję. W ekstrakcie oznaczono aktywności chitynaz, β-1,3-glukanaz, peroksydazy gwajakolowej i zawartość białka ogólnego. Aktywność chitynaz i β-1,3-glukanaz oznaczono z wykorzystaniem reakcji barwnej z kwasem 3,5 dinitrosalicylowym (DNS) (Miller 1959). Aktywność peroksydazy gwajakolowej oznaczono z wykorzystaniem metody Chance i Maehly (1954) zmodyfikowanej przez Patykowskiego i in. (2007). Zawartość białka ogólnego oznaczona została metodą Bradforda (1976). Analiza zawartości wolnych związków fenolowych Oznaczenie zawartości związków fenolowych przeprowadzono w roślinach zdrowych, a następnie w 3, 6 i 9 dniu po inokulacji patogenem grzybowym. Ekstrakcja przeprowadzona zostatała w zmrożonych moździerzach z wykorzystaniem mieszaniny ekstrakcyjnej złożonej z alkoholu etylowego (95%) i wody. Oznaczenie zawartości wolnych związków fenolowych przeprowadzono niezwłocznie po zakończeniu ekstrakcji. Analizę przeprowadzono z wykorzystaniem odczynnika Folin-Ciocalteau. Zawartość związków fenolowych odczytano na podstawie krzywej wzorcowej wyznaczonej z wykorzystaniem kwasu galusowego. Opracowanie wyników i analizy statystyczne Opracowanie wyników przeprowadzono z wykorzystaniem programów komputerowych MS Excel i R. Dla wyników opisujących porażenie roślin, aktywność chitynaz, β-1,3-glukanaz, peroksydazy gwajakolowej, zawartości białka ogólnego i wolnych związków fenolowych przeprowadzono dwuczynnikową analizę wariancji ANOVA. Istotność zróżnicowania średnich wielkości badanych cech w poszczególnych kombinacjach oceniono z wykorzystaniem testu post hoc HSD Tukey a przy α=0,05. Zależności pomiędzy indeksem porażenia badanych ekotypów życicy trwałej przez patogeny a aktywnością enzymów odpornościowych oraz zawartością białka ogólnego i wolnych związków fenolowych określono wyznaczając współczynniki korelacji liniowej Pearsona. Istotność współczynników korelacji określono na podstawie testu t-studenta. WYNIKI Detekcja endofitów z wykorzystaniem metody immunologicznej i molekularnej Obecność endofitów z rodzaju Epichloë wykrywano w zgromadzonej kolekcji 67 prób życicy trwałej za pomocą testu Phytoscreen Immunoblot Kit Neotyphodium FIELD TILLER firmy AGRINOSTICS, Ltd. Co. (Fot. 1) oraz z wykorzystaniem metody PCR przy użyciu dwóch różnych par starterów. Obie wykorzystane metody w prowadzonych badaniach cechowały się podobną skutecznością. Obecność endofitów z rodzaju Epichloë wykazano w 58 z badanych prób. Pozostałe 9 prób było niezasiedlonych.
Fot. 1. Wyniki analizy zasiedlenia roślin przeprowadzonej z wykorzystaniem testu Neotyphodium FIELD TILLER AGRINOSTICS Izolacja i identyfikacja grzybów endobiotycznych występujących w próbach życicy trwałej W wyniku przeprowadzonych izolacji wykryto obecność różnych gatunków grzybów, zarówno saprotroficznych, jak i potencjalnie patogenicznych. Spośród patogenów najliczniej występowały grzyby z rozaju Drechslera. Wyizolowano także Fusarium spp. i Gaeumannomyces spp. Na badanych roślinach nie zaobserwowano jednak żadnych objawów chorobowych związanych z występującymi patogenami. Najczęściej notowanymi saprotrofami były z kolei grzyby z rodzaju Acremonium. Wyizolowano ich najwięcej spośród wszystkich grzybów. Wyizolowano także saprotrofy z rodzajów Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Epicoccum, Penicillium i Trichoderma oraz kolonie bakterii. Ocena aktywności antygrzybowej wybranych endofitów in vitro Aktywność przeciwgrzybową endofitów określono z wykorzystaniem indywidualnego efektu biotycznego oraz strefy zahamowania wzrostu patogena. Przybierały one zróżnicowane wartości w zależności od ekotypu endofita i gatunku patogena (Rys. 1, 2). Największe strefy zahamowania wzrostu obserwowano w przypadku B. sorokiniana. Najsłabszy ograniczający wpływ izolatów endofita notowano w przypadku F. poae. Rys. 1. Średnia strefa inhibicji pomiędzy patogenem a endofitem [mm]
Rys. 2. Średni indywidualny efekt biotyczny dla poszczególnych patogenów Ocena aktywności przeciwgrzybowej asocjacji życicy trwałej i E. festucae var. lolii in vivo Przeprowadzona ocena porażenia badanych ekotypów życicy trwałej wykazała istotny wpływ ekotypu, patogena oraz ich interakcji na stopień zainfekowania roślin. Indeksy porażenia przybierały zróżnicowane wartości - od 27,5 (MAZ 801/08, B. sorokiniana) do 85,0 (MAZ 873/08, F. poae). Analiza wartości średnich potwierdziła najsilniejsze porażenie w kombinacji E nie zasiedlonej przez endofita (Tab. 1). Na zbliżonym poziomie porażony był także ekotyp MAZ 1343/08. Istotnie słabiej były porażone ekotypy MAZ 801/08 i MAZ 873/08 w porównaniu do kombinacji bez endofita. Wszystkie ekotypy z endofitem tworzyły grupę jednorodną. Najmniej podatnym ekotypem na porażenie przez testowane patogeny był MAZ 801/08. Ekotyp MAZ 801/08 był istotnie najsłabiej porażany przez B. sorokiniana i F. poae w stosunku do kombinacji bez endofita. Nie wystąpiło istotne zróżnicowanie w porażeniu przez Drechslera sp. pomiędzy badanymi ekotypami. W kombinacji z R. solani obecność endofita w ekotypie MAZ 1343/08 zapewniła istotnie niższe porażenie w stosunku do ekotypu E bez endofita. Pozostałe ekotypy z endofitem były infekowane przez tego patogena na zbliżonym statystycznie poziomie. Zaobserwowano także zróżnicowanie w poziomie porażenia przez testowane patogeny. Istotnie najsłabiej były porażane rośliny przez B. sorokiniana i Drechslera sp. Najsilniejsze porażenie zaobserwowano w kombinacji z F. poae. Zbliżone statystycznie porażenie wystąpiło także przy porażeniu przez R. solani. Ekotyp E bez endofita był porażany przez wszystkie patogeny na zbliżonym statystycznie poziomie. Ekotyp MAZ 801/08 był istotnie najsłabiej porażany przez B. sorokiniana, a najbardziej podatny na zainfekowanie przez R. solani. Z kolei ekotyp MAZ 873/08 był najbardziej podatny na porażenie przez F. poae, a następnie R. solani i Drechslera sp. Istotnie najsłabszą infekcję tego ekotypu zaobserwowano w przypadku B. sorokiniana. Ekotyp MAZ 873/08 był z kolei istotnie najmniej podatny na porażenie przez R. solani. Na pozostałe patogeny był stosunkowo podatny. Tabela 1. Indeks porażenia [%] badanych ekotypów życicy trwałej przez patogeny Ekotyp Fusarium poae Bipolaris sorokiniana Patogen Drechslera spp. Rhizoctonia solani Średnia MAZ 801/08 40,0 31,3 42,5 57,5 42,8 MAZ 873/08 58,8 37,5 40,0 55,0 47,8 MAZ 1343/08 58,8 50,0 57,5 35,0 50,3 E 67,5 57,5 48,8 57,5 57,8 Średnia 56,3 44,1 47,2 51,3 I 1 =7,713; II=7,713; I/II=20,939; II/I=20,939 1 Czynnik I Gatunek/rodzaj patogena, czynnik II ekotyp życicy trwałej
Zawartość białka ogólnego Przeprowadzone analizy zawartości białka ogólnego w tkance roślinnej badanych ekotypów po 0, 3, 6 i 9 dniach od inokulacji B. sorokiniana, Drechslera sp., F. poae i R. solani wykazały istotny wpływ ekotypu, liczby dni po inokulacji oraz ich interakcji na zawartość białka w roślinach. (Tabela 2). Najniższe wartości tej cechy zanotowano w przypadku zainfekowania roślin przez F. poae, a najwyższe w roślinach porażonych R. solani. Obecność endofita spowodowała wzrost zawartości białka w roślinach nie inokulowanych patogenami tylko w przypadku ekotypu MAZ 1343/08 w stosunku do kombinacji E. W pozostałych ekotypach zawartość białka była niższa. Analiza korelacji wskazuje na brak jednoznacznej zależności pomiędzy indeksem porażenia badanych ekotypów życicy trwałej przez patogeny a zawartością białka w roślinach (Tab. 3). Zależność testowanych zmiennych kształtowała się na niskim poziomie we wszystkich okresach po inokulacji patogenami i miała charakter ujemny. Tabela 2. Zawartość białka ogólnego w tkance roślinnej [mg g -1 ś.m.] badanych ekotypów życicy trwałej po inokulacji testowanymi patogenami Ekotyp 0 3 6 9 Średnia Bipolaris sorokiniana MAZ 801/08 7,3 11,2 16,0 12,8 11,8 MAZ 873/08 5,6 9,9 12,7 14,0 10,5 MAZ 1343/08 10,6 12,9 14,5 12,3 12,6 E- 8,2 15,0 14,6 13,0 12,7 Średnia 7,9 12,3 14,4 13,0 11,9 I1=0,2216; II=0,2216; I/II=0,6017; II/I=0,6017 Drechslera sp. MAZ 801/08 7,3 16,0 18,3 12,7 13,6 MAZ 873/08 5,6 13,9 15,7 14,3 12,4 MAZ 1343/08 10,6 15,9 16,9 15,6 14,7 E- 8,2 14,8 15,5 12,0 12,6 Średnia 7,9 15,1 16,6 13,7 13,3 I 1 =0,1737; II=0,1737 I/II=0,4717; II/I=0,4717 Fusarium poae MAZ 801/08 7,3 8,8 8,5 14,2 9,7 MAZ 873/08 5,6 7,0 8,4 14,6 8,9 MAZ 1343/08 10,6 4,8 8,0 14,1 9,4 E- 8,2 8,3 11,5 8,4 9,1 Średnia 7,9 7,2 9,1 12,8 9,3 I 1 =0,4113; II=0,4113; I/II=1,117; II/I=1,117 Rhizoctonia solani MAZ 801/08 7,3 11,3 13,9 24,9 14,3 MAZ 873/08 5,6 23,8 16,1 20,2 16,4 MAZ 1343/08 10,6 22,8 21,7 21,4 19,1 E- 8,2 18,3 22,8 25,5 18,7 Średnia 7,9 19,0 18,6 23,0 17,1 I 1 =0,1479; II=0,1479; I/II=0,4016; II/I=0,4016 1 Czynnik I ekotyp życicy trwałej, czynnik II liczba dni po inokulacji patogenem
Tabela 3. Współczynniki korelacji Pearsona pomiędzy indeksem porażenia badanych ekotypów życicy trwałej przez patogeny a zawartością białka ogólnego w tkance roślinnej Rodzaj korelacji 3 6 9 Korelacja wywołana przez patogeny i ekotypy Patogeny i Ekotypy 0,18 0,25 0,05 Korelacja wywołana przez ekotypy w obecności patogenów Bipolaris sorokiniana 0,89 0,12 0,31 Drechslera sp. 0,52 0,03 0,45 Fusarium poae 0,33 0,59 0,62 Rhizoctonia solani 0,52 0,45 0,50 Korelacja wywołana przez patogeny na badanych ekotypach MAZ 801/08 0,06 0,08 0,90* MAZ 873/08 0,15 0,40 0,52 MAZ 1343/08 0,81 0,80 0,78 E- 0,67 0,37 0,23 ** Istotność na poziomie α=0,05; * Istotność na poziomie α=0,1 Aktywność chitynaz Przeprowadzone analizy aktywności chitynaz w tkance roślinnej badanych ekotypów po 3, 6 i 9 dniach od inokulacji B. sorokiniana, F. poae i R. solani wykazały istotny wpływ ekotypu, liczby dni po inokulacji oraz ich interakcji na aktywność chitynaz w roślinach. (Tabela 5). Nie zaobserwowano istotnego wpływu endofita na aktywność chitynaz w przypadku porażenia przez Drechslera sp. Zasiedlenie badanych asocjacji życicy trwałej przez Epichloë festucae var. lolii nie wpływało także istotnie na aktywność chitynaz w roślinach nie zainfekowanych w porównaniu do ekotypu nie zasiedlonego przez endofita. Analiza zależności pomiędzy indeksem porażenia badanych ekotypów życicy trwałej przez patogeny a aktywnością chitynaz w tkance roślinnej wykazała dodatni charakter korelacji w/w zmiennych we wszystkich trzech okresach po inokulacji patogenami (Tabela 4). W 6. i 9. dniu zanotowano istotne zależności odpowiednio w stopniu wysokim (α=0,05) i średnim (α=0,1). Tabela 4. Współczynniki korelacji Pearsona pomiędzy indeksem porażenia badanych ekotypów życicy trwałej przez patogeny a aktywnością chitynaz w tkance roślinnej Rodzaj korelacji 3 6 9 Korelacja wywołana przez patogeny i ekotypy Patogeny i Ekotypy 0,33 0,60** 0,43* Korelacja wywołana przez ekotypy w obecności patogenów Bipolaris sorokiniana 0,66 0,11 0,95** Drechslera sp. 0,53 0,99** 0,67 Fusarium poae 0,35 0,97** 0,11 Rhizoctonia solani 0,33 0,47 0,74 Korelacja wywołana przez patogeny na badanych ekotypach MAZ 801/08 0,41 0,72 0,52 MAZ 873/08 0,65 0,92* 0,98** MAZ 1343/08 0,72 0,51 0,88 E- 0,49 0,86 0,76 ** Istotność na poziomie α=0,05; * Istotność na poziomie α=0,1
Tabela 5. Aktywność chitynaz w tkance roślinnej [µmol min -1 mg białka -1 ] badanych ekotypów życicy trwałej po inokulacji testowanymi patogenami Ekotyp 0 3 6 9 Średnia Bipolaris sorokiniana MAZ 801/08 0,922 0,345 0,241 0,151 0,415 MAZ 873/08 0,380 0,144 0,351 0,124 0,250 MAZ 1343/08 0,125 0,207 0,197 0,112 0,160 E- 0,863 0,997 0,336 0,101 0,574 Średnia 0,572 0,423 0,281 0,122 0,350 I 1 =0,2983; II=0,2983; I/II=0,8099; II/I=0,8099 Drechslera sp. MAZ 801/08 0,922 0,023 0,128 0,277 0,338 MAZ 873/08 0,380 0,075 0,158 0,279 0,223 MAZ 1343/08 0,125 0,118 0,055 0,141 0,109 E- 0,863 0,166 0,105 0,339 0,368 Średnia 0,572 0,095 0,111 0,259 0,260 I 1 =n.i.; II=0,2705; I/II=n.i.; II/I=0,7990 Fusarium poae MAZ 801/08 0,922 0,744 0,117 0,880 0,666 MAZ 873/08 0,380 0,320 0,739 1,471 0,727 MAZ 1343/08 0,125 0,359 0,604 0,080 0,292 E- 0,863 0,690 1,190 1,124 0,967 Średnia 0,572 0,528 0,662 0,889 0,663 I 1 =0,4129; II=n.i.; I/II=1,1210; II/I=1,1210 Rhizoctonia solani MAZ 801/08 0,922 0,121 0,500 0,688 0,558 MAZ 873/08 0,380 0,959 0,665 0,985 0,747 MAZ 1343/08 0,125 0,017 0,074 0,225 0,110 E- 0,863 0,100 0,052 0,538 0,388 Średnia 0,572 0,300 0,322 0,609 0,451 I 1 =0,3205; II=n.i.; I/II=0,8000; II/I=0,8000 1 Czynnik I ekotyp życicy trwałej, czynnik II liczba dni po inokulacji patogenem; n.i. różnica statystycznie nieistotna. Aktywność β-1,3-glukanaz Przeprowadzone analizy aktywności β-1,3-glukanaz w tkance roślinnej badanych ekotypów po 0, 3, 6 i 9 dniach od inokulacji B. sorokiniana, Drechslera sp., F. poae i R. solani wykazały istotny wpływ ekotypu, liczby dni po inokulacji oraz ich interakcji na aktywność β-1,3-glukanaz w roślinach. (Tabela 6). Najniższe wartości tej cechy zanotowano w przypadku zainfekowania roślin przez Drechslera sp., a najwyższe w roślinach porażonych B. sorokiniana. Obecność endofita wpłynęła istotnie na aktywność β-1,3-glukanaz w roślinach nie inokulowanych testowanymi patogenami. Analiza zależności pomiędzy indeksem porażenia badanych ekotypów życicy trwałej przez patogeny a aktywnością β-1,3-glukanaz w tkance roślinnej wykazała ujemny charakter korelacji w/w zmiennych w 3. i 6. dniu po inokulacji patogenami (Tabela 7). W 9. dniu wystąpiła korelacja dodatnia. Zależność kształtowała się na niskim poziomie. W kilku przypadkach zaobserwowano istotną korelację badanych zmiennych.
Tabela 6. Aktywność β-1,3-glukanaz w tkance roślinnej [µmol min -1 mg białka -1 ] badanych ekotypów życicy trwałej po inokulacji testowanymi patogenami Ekotyp 0 3 6 9 Średnia Bipolaris sorokiniana MAZ 801/08 3,56 3,00 2,33 1,47 2,59 MAZ 873/08 2,25 2,47 2,51 1,85 2,27 MAZ 1343/08 1,37 1,98 2,13 2,98 2,12 E- 2,07 2,39 3,12 3,52 2,77 Średnia 2,31 2,46 2,52 2,46 2,44 I 1 =0,7084; II=0,7084; I/II=1,9231; II/I=1,9231 Drechslera sp. MAZ 801/08 3,56 2,23 1,43 1,84 2,26 MAZ 873/08 2,25 1,37 1,44 1,93 1,75 MAZ 1343/08 1,37 1,94 1,46 1,57 1,58 E- 2,07 1,78 1,18 2,54 1,89 Średnia 2,31 1,83 1,38 1,97 1,87 I 1 =0,4240; II=0,4240; I/II=1.1512; II/I=1,1512 Fusarium poae MAZ 801/08 3,56 2,53 2,64 2,36 2,77 MAZ 873/08 2,25 3,03 1,13 2,18 2,14 MAZ 1343/08 1,37 4,11 2,76 1,41 2,41 E- 2,07 1,11 1,43 2,58 1,80 Średnia 2,31 2,70 1,99 2,13 2,28 I 1 =0,5863; II=0,5863; I/II=1,5918; II/I=1,5918 Rhizoctonia solani MAZ 801/08 3,56 1,34 0,87 3,77 2,39 MAZ 873/08 2,25 1,69 2,26 3,10 2,32 MAZ 1343/08 1,37 1,18 2,07 1,93 1,64 E- 2,07 2,12 1,59 1,68 1,86 Średnia 2,31 1,58 1,70 2,62 2,05 I 1 =0,5344; II=0,5344; I/II=1,4508; II/I=1,4508 1 Czynnik I ekotyp życicy trwałej, czynnik II liczba dni po inokulacji patogenem; n.i. różnica statystycznie nieistotna.
Tabela 7. Współczynniki korelacji Pearsona pomiędzy indeksem porażenia badanych ekotypów życicy trwałej przez patogeny a aktywnością β-1,3-glukanaz w tkance roślinnej Rodzaj korelacji 3 6 9 Korelacja wywołana przez patogeny i ekotypy Patogeny i Ekotypy 0,03 0,25 0,37 Korelacja wywołana przez ekotypy w obecności patogenów Bipolaris sorokiniana 0,72 0,54 1,00** Drechslera sp. 0,29 0,06 0,24 Fusarium poae 0,25 0,59 0,02 Rhizoctonia solani 0,64 0,48 0,45 Korelacja wywołana przez patogeny na badanych ekotypach MAZ 801/08 1,00** 0,82 0,94* MAZ 873/08 0,38 0,41 0,65 MAZ 1343/08 0,72 0,08 0,31 E- 0,53 0,08 0,02 ** Istotność na poziomie α=0,05; * Istotność na poziomie α=0,1 Aktywność peroksydazy gwajakolowej Przeprowadzone analizy aktywności peroksydazy gwajakolowej w tkance roślinnej badanych ekotypów po 0, 3, 6 i 9 dniach od inokulacji B. sorokiniana, Drechslera sp., F. poae i R. solani wykazały istotny wpływ ekotypu, liczby dni po inokulacji oraz ich interakcji na aktywność peroksydazy gwajakolowej w roślinach. (Tabela 9). Najniższe wartości tej cechy zanotowano w przypadku zainfekowania roślin przez R. solani, a najwyższe w roślinach porażonych F. poae. Obecność endofita wpłynęła istotnie na aktywność peroksydazy gwajakolowej w roślinach nie inokulowanych testowanymi patogenami. Analiza zależności pomiędzy indeksem porażenia badanych ekotypów życicy trwałej przez patogeny a aktywnością peroksydazy gwajakolowej w tkance roślinnej wykazała bardzo słaby charakter korelacji w/w zmiennych we wszystkich trzech okresach po inokulacji patogenami (Tabela 8). W dwóch przypadkach zaobserwowano istotną korelację badanych zmiennych. Tabela 8. Współczynniki korelacji Pearsona pomiędzy indeksem porażenia badanych ekotypów życicy trwałej przez patogeny a aktywnością peroksydazy gwajakolowej w tkance roślinnej Rodzaj korelacji * Istotność na poziomie α=0,1 3 6 9 Korelacja wywołana przez patogeny i ekotypy Patogeny i Ekotypy 0,09 0,05 0,27 Korelacja wywołana przez ekotypy w obecności patogenów Bipolaris sorokiniana 0,46 0,31 0,42 Drechslera sp. 0,41 0,62 0,21 Fusarium poae 0,05 0,69 0,29 Rhizoctonia solani 0,52 0,67 0,92* Korelacja wywołana przez patogeny na badanych ekotypach MAZ 801/08 0,42 0,28 0,87 MAZ 873/08 0,01 0,44 0,42 MAZ 1343/08 0,61 0,68 0,76 E- 0,93* 0,70 0,58
Tabela 9. Aktywność peroksydazy gwajakolowej w tkance roślinnej [µmol min -1 mg białka -1 ] badanych ekotypów życicy trwałej po inokulacji testowanymi patogenami Ekotyp 0 3 6 9 Średnia Bipolaris sorokiniana MAZ 801/08 1,71 1,67 1,57 1,74 1,67 MAZ 873/08 1,96 1,67 0,97 1,06 1,41 MAZ 1343/08 1,24 2,02 1,81 1,64 1,68 E- 0,95 0,99 0,75 1,04 0,93 Średnia 1,46 1,59 1,27 1,37 1,42 I 1 =0,2216; II=0,2216; I/II=0,6017; II/I=0,6017 Drechslera sp. MAZ 801/08 1,71 0,87 1,03 1,82 1,35 MAZ 873/08 1,96 1,16 1,13 1,28 1,38 MAZ 1343/08 1,24 1,58 1,80 1,84 1,62 E- 0,95 0,43 0,70 0,79 0,72 Średnia 1,46 1,01 1,16 1,43 1,27 I 1 =0,1737; II=0,1737; I/II=0,4717; II/I=0,4717 Fusarium poae MAZ 801/08 1,71 1,96 2,77 1,62 2,01 MAZ 873/08 1,96 1,90 1,95 1,15 1,74 MAZ 1343/08 1,24 4,54 2,95 2,33 2,76 E- 0,95 1,15 1,14 1,05 1,07 Średnia 1,46 2,39 2,20 1,54 1,90 I 1 =0,4113; II=0,4113; I/II=1,1167; II/I=1,1167 Rhizoctonia solani MAZ 801/08 1,71 1,26 1,30 0,92 1,30 MAZ 873/08 1,96 0,74 0,70 0,60 1,00 MAZ 1343/08 1,24 1,25 1,50 1,55 1,38 E- 0,95 0,75 0,51 0,67 0,72 Średnia 1,46 1,00 1,00 0,93 1,10 I 1 =0,1479; II=0,1479; I/II=0,4016; II/I=0,4016 1 Czynnik I ekotyp życicy trwałej, czynnik II liczba dni po inokulacji patogenem; n.i. różnica statystycznie nieistotna. Zawartość wolnych związków fenolowych Przeprowadzone analizy zawartości wolnych związków fenolowych w tkance roślinnej badanych ekotypów po 0, 3, 6 i 9 dniach od inokulacji B. sorokiniana, Drechslera sp., F. poae i R. solani wykazały istotny wpływ ekotypu, liczby dni po inokulacji oraz ich interakcji na zawartość związków fenolowych w roślinach (Tabela 10). Najwyższe wartości tej cechy zanotowano w przypadku zainfekowania roślin przez R. solani. Obecność endofita wpłynęła istotnie na zawartość fenoli w roślinach nie inokulowanych testowanymi patogenami. Analiza zależności pomiędzy indeksem porażenia badanych ekotypów życicy trwałej przez patogeny a zawartością związków fenolowych w tkance roślinnej wykazała bardzo słaby charakter korelacji w/w zmiennych we wszystkich trzech okresach po inokulacji patogenami (Tabela 11). W dwóch przypadkach zaobserwowano istotną korelację badanych zmiennych.
Tabela 10. Zawartość wolnych związków fenolowych w tkance roślinnej [mg g -1 ś.m.] badanych ekotypów życicy trwałej po inokulacji testowanymi patogenami Ekotyp 0 3 6 9 Średnia Bipolaris sorokiniana MAZ 801/08 0,318 0,370 0,407 0,370 0,366 MAZ 873/08 0,312 0,291 0,324 0,453 0,345 MAZ 1343/08 0,284 0,274 0,380 0,251 0,297 E- 0,442 0,392 0,476 0,479 0,447 Średnia 0,339 0,332 0,397 0,388 0,364 I 1 =0,0530; II=0,0530; I/II=0,144; II/I=0,144 Drechslera sp. MAZ 801/08 0,318 0,437 0,365 0,300 0,355 MAZ 873/08 0,312 0,269 0,393 0,260 0,308 MAZ 1343/08 0,284 0,240 0,324 0,268 0,279 E- 0,442 0,456 0,325 0,268 0,373 Średnia 0,339 0,350 0,352 0,274 0,329 I 1 =0,0430; II=0,0430; I/II=0,1168; II/I=0,1168 Fusarium poae MAZ 801/08 0,318 0,285 0,394 0,535 0,383 MAZ 873/08 0,312 0,277 0,474 0,553 0,404 MAZ 1343/08 0,284 0,277 0,288 0,378 0,307 E- 0,442 0,339 0,487 0,445 0,429 Średnia 0,339 0,295 0,411 0,478 0,381 I 1 =0,0315; II=0,0315; I/II=0,0855; II/I=0,0855 Rhizoctonia solani MAZ 801/08 0,318 0,287 0,372 0,764 0,435 MAZ 873/08 0,312 0,443 0,307 0,445 0,377 MAZ 1343/08 0,284 0,419 0,358 0,410 0,368 E- 0,442 0,409 0,461 0,574 0,472 Średnia 0,339 0,390 0,374 0,548 0,413 I 1 =0,0737; II=0,0737; I/II=0,2000; II/I=0,2000 1 Czynnik I ekotyp życicy trwałej, czynnik II liczba dni po inokulacji patogenem
Tabela 11. Współczynniki korelacji Pearsona pomiędzy indeksem porażenia badanych ekotypów życicy trwałej przez patogeny a zawartością wolnych związków fenolowych w tkance roślinnej Rodzaj korelacji 3 6 9 Korelacja wywołana przez patogeny i ekotypy Patogeny i Ekotypy 0,13 0,28 0,30 Korelacja wywołana przez ekotypy w obecności patogenów Bipolaris sorokiniana 0,11 0,59 0,06 Drechslera sp. 0,30 0,88 0,23 Fusarium poae 0,55 0,31 0,48 Rhizoctonia solani 0,35 0,26 0,65 Korelacja wywołana przez patogeny na badanych ekotypach MAZ 801/08 0,42 0,73 0,79 MAZ 873/08 0,42 0,40 0,66 MAZ 1343/08 0,94* 0,64 0,48 E- 0,99** 0,85 0,53 ** Istotność na poziomie α=0,05; * Istotność na poziomie α=0,1 WNIOSKI 1. Zasiedlenie zgromadzonej kolekcji ekotypów życicy trwałej przez endofita Epichloë festucae var. lolii kształtuje się na bardzo wysokim poziomie wynoszącym 87%. 2. W badanej kolekcji ekotypów życicy trwałej, najczęściej występującymi grzybami endobiotycznymi obok E. festucae var. lolii są Acremonium spp., szczególnie A. strictum i A. boreale, oraz Drechslera spp., Fusarium spp. i Penicillium spp. 3. Najsilniejsze oddziaływanie izolatów Epichloë festucae var. lolii o charakterze antygrzybowym występuje in vitro w przypadku Bipolaris sorokiniana. Wzrost Drechslera triseptata, Fusarium poae i Rhizoctonia solani jest hamowany przez endofita w znacznie mniejszym stopniu. 4. Stwierdzono istotne zróżnicowanie w podatności badanych ekotypów życicy trwałej MAZ 801/08, MAZ 873/08, MAZ 1343/08 i E na porażenie przez Bipolaris sorokiniana, Drechslera sp., Fusarium poae i Rhizoctonia solani. Obecność Epichloë festucae var. lolii może istotnie obniżać podatność asocjacji życicy trwałej z endofitem na porażenie przez B. sorokiniana, F. poae i R. solani. Zasiedlenie życicy trwałej przez badane endofity nie miało wpływu na porażenie roślin przez Drechslera sp. Poziom ochrony jaką zapewnia roślinie endofit zależy istotnie od gatunku patogena oraz izolatu endofita. 5. Obecność Epichloë festucae var. lolii w badanych asocjacjach życicy trwałej może istotnie podwyższać lub obniżać zawartość białka ogólnego w roślinach w porównaniu do ekotypu nie zasiedlonego przez endofita. Obecność endofita w badanych asocjacjach wpływa także istotnie na zawartość białka w roślinach po 3, 6 i 9 dniach od inokulacji testowanymi patogenami Bipolaris sorokiniana, Drechslera sp., Fusarium poae i Rhizoctonia solani. W zależności od patogena najwyższe poziomy zawartości białka ogólnego w tkance roślinnej występują po 6 (B. sorokiniana, Drechslera sp.) lub 9 (F. poae, R. solani) dniach od inokulacji.
6. Zasiedlenie badanych asocjacji życicy trwałej przez Epichloë festucae var. lolii nie wpływa istotnie na aktywność chitynaz w roślinach w porównaniu do ekotypu nie zasiedlonego przez endofita. Obecność symbionta w badanych asocjacjach wpływa jednak istotnie na aktywność chitynaz w roślinach podczas rozwoju procesu chorobowego wywoływanego przez Bipolaris sorokiniana, Fusarium poae i Rhizoctonia solani, nie wpływa natomiast w przypadku porażenia przez Drechslera sp. Wskazuje to na duży wpływ charakteru przebiegu procesu infekcyjnego wywoływanego przez poszczególne patogeny na aktywność chitynaz. 7. Obecność Epichloë festucae var. lolii w badanych asocjacjach życicy trwałej może istotnie wpływać na aktywność β-1,3-glukanaz w roślinach w porównaniu do ekotypu nie zasiedlonego przez endofita. Zasiedlenie badanych asocjacji przez endofita wpływa również istotnie na aktywność β-1,3-glukanaz w roślinach podczas rozwoju procesu chorobowego (3, 6, 9 dni po inokulacji) wywoływanego przez testowane patogeny Bipolaris sorokiniana, Drechslera sp., Fusarium poae i Rhizoctonia solani. 8. Zasiedlenie badanych asocjacji życicy trwałej przez Epichloë festucae var. lolii może istotnie podwyższać lub obniżać aktywność peroksydazy gwajakolowej w roślinach w porównaniu do ekotypu nie zasiedlonego przez endofita. Obecność endofita w badanych asocjacjach wpływa także istotnie na aktywność peroksydazy gwajakolowej w roślinach podczas rozwoju procesu chorobowego, po 3, 6 i 9 dniach od inokulacji testowanymi patogenami Bipolaris sorokiniana, Drechslera sp., Fusarium poae i Rhizoctonia solani. W zależności od patogena najwyższe poziomy zawartości białka ogólnego w tkance roślinnej występują po 6 (B. sorokiniana, Drechslera sp.) lub 9 (F. poae, R. solani) dniach od inokulacji. 9. Obecność Epichloë festucae var. lolii w badanych asocjacjach życicy trwałej może istotnie wpływać na zawartość wolnych związków fenolowych w roślinach w porównaniu do ekotypu nie zasiedlonego przez endofita. Zasiedlenie badanych asocjacji przez endofita wpływa także istotnie na zawartość fenoli w roślinach podczas rozwoju procesu chorobowego, po 3, 6 i 9 dniach od inokulacji testowanymi patogenami Bipolaris sorokiniana, Drechslera sp., Fusarium poae i Rhizoctonia solani. 10. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują jednoznacznie na istotny wpływ obecności Epichloë festucae var. lolii w badanych asocjacjach życicy trwałej na aktywność chitynaz (z wyłączeniem Drechslera sp.), β-1,3-glukanaz i peroksydazy gwajakolowej oraz na zawartość związków fenolowych w badanych ekotypach pod wpływem infekcji przez patogeny Bipolaris sorokiniana, Drechslera sp., Fusarium poae i Rhizoctonia solani. Wpływ endofitów w badanych asocjacjach na produkcję analizowanych białek odpornościowych oraz związków fenolowych warunkuje istotnie mniejszą podatność badanych asocjacji na porażenie przez testowane patogeny. Duży wpływ na aktywność badanych enzymów i zawartość związków fenolowych miały także patogeny. Potwierdza to ścisły wpływ charakteru przebiegu procesu infekcyjnego u poszczególnych patogenów na procesy biochemiczne w roślinie i tym samym przebieg reakcji odpornościowej. 11. Ekotypy MAZ 801/08 i MAZ 873/08 należały do najmniej podatnych na porażenie przez testowane patogeny Bipolaris sorokiniana, Drechslera sp., Fusarium poae i Rhizoctonia solani. Izolaty Epichloë festucae var. lolii zasiedlające te ekotypy nie gwarantowały jednak istotnej ochrony asocjacji przed wszystkimi patogenami w porównaniu do ekotypu bez endofita. Jednakże, wymienione asocjacje nie zawierały toksycznego dla zwierząt Lolitremu B i charakteryzowały się bardzo dobrymi parametrami wzrostu i rozwoju na początkowym etapie badań, które zadecydowały o ich wyborze do kolejnych etapów. Mają więc potencjał, który pozwala na kontynuację prac nad ich wykorzystaniem do poprawy właściwości użytkowych odmian życicy trwałej.
LITERATURA 1. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 2. Chance B., Maehly A.C. 1955. Assay of Catalase and Peroxidase. Methods in Enzymology. 2: 764-775. 3. Doyle J.J., Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12: 13 15. 4. Miller G.L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. 31: 426-428. 5. Pańka D., Jeske M., Troczyński M. 2011. Wpływ Neotyphodium uncinatum na porażenie kostrzewy łąkowej (Festuca pratensis Huds.) przez wybrane patogeny. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych 562: 177-186. 6. Pańka D., Jeske M., Troczyński M. 2013. Occurrence of Neotyphidium and Epichloë fungi in meadow fescue and red fescue in Poland and screeining for endophyter isolates as potential biological control agents. Acta Sci. Pol., HortorumCultus 12(4): 67-83. 7. Patykowski J., Majczak A., Bergier K., Skłodowska M. 2007. Ascorbate content and peroxidase activities in apple fruits during storage. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research. 15: 21-33. 8. Rasmussen S., Parsons A.J., Bassett S., Christensen M.J., Hume D.E., Johnson L.J., Johnson, R.D., Simpson W.R., Stacke C., Voisey C.R., Xue H., Newman J.A. 2007. High nitrogen supply and carbohydrate content reduce fungal endophyte and alkaloid concentration in Lolium perenne. New Phytologist. 173(4):787-97.