Dr hab. Michał Kwiatek Katedra Genetyki i Hodowli Roślin Wydział Rolnictwa i Bioinżynierii Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu ul. Dojazd 11, 60-637 Poznań Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Joanny Łusińskiej pt.: Analiza struktury i ewolucji kariotypów u gatunków rodzaju Brachypodium metodą porównawczej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z wykorzystaniem sond specyficznych chromosomowo Rozprawa doktorska przygotowana przez panią mgr Joannę Łusińską zawiera opis badań struktury i ewolucji kariotypów wybranych przedstawicieli rodzaju Brachypodium. Analizy struktury chromosomów wykonane zostały przy użyciu porównawczej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z wykorzystaniem specyficznych chromosomowo klonów BAC pochodzących z genomu jądrowego gatunku referencyjnego kłosownicy dwukłoskowej (Brachypodium distachyon; 2n=10). Relacje filogenetyczne badano za pomocą narzędzi bioinformatycznych. Badania finansowane były z następujących projektów: Projekt badawczy MAESTRO-2 nr 2012/04/A/NZ3/00572 Struktura, dynamika i ewolucja roślinnego genomu jądrowego z perspektywy badań cytomolekularnych, finansowany w latach 2012-2018 przez Narodowe Centrum Nauki. Kierownik projektu: prof. zw. dr hab. Robert Hasterok; Projekt badawczy HARMONIA-6 nr 2014/14/M/NZ2/00519 CDKG/Ph1: czy istnieje uniwersalny mechanizm regulujący stabilność genomu u traw?, finansowany w latach 2015-2019 przez Narodowe Centrum Nauki. Kierownik projektu: prof. zw. dr hab. Robert Hasterok. Dotacja przyznana w ramach Konkursu dla Młodych Naukowców i Doktorantów Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach. Część wyników prezentowanych w niniejszej pracy została przedstawiona w publikacji: Lusinska J, Majka J, Betekhtin A, Susek K, Wolny E, Hasterok R. 2018. Chromosome identification and reconstruction of evolutionary rearrangements in Brachypodium distachyon, B. stacei and B. hybridum. Annals of Botany: 122: 445 459. Pani mgr Joanna Łusińska należy do zespołu kierowanego przez prof. Roberta Hasteroka. Ta grupa badawcza od lat, z sukcesami, zajmuje się analizą struktury genomu jądrowego traw, a w szczególności Brachypodium distachyon. Kłosownica podobnie jak ryż (Oryza sativa L.) obecnie traktowana jest jako tzw. roślina modelowa, tj. organizm, który pozwala na łatwiejsze 1
i dokładniejsze badania fundamentalnych procesów biologicznych. Na uwagę zasługuje fakt, iż w porównaniu do rodzaju Oryza (plemię Oryzae), rodzaj Brachypodium, należący do plemienia Brachypodieae, jest bliżej spokrewniony z najważniejszą grupą roślin uprawnych, jaką stanowią zboża wchodzące w skład plemienia Triticeae, takie jak: pszenica (Triticum aestivum L.), jęczmień (Hordeum vulgare L.), żyto (Secale cereale L.). B. distachyon posiada stosunkowo mały genom jądrowy (272 Mpz) oraz zespół cech wymaganych u organizmu modelowego, tj.: krótki cykl życiowy, samopylność, niewielki pokrój dojrzałych osobników, łatwa i wydajna hodowla w warunkach laboratoryjnych oraz możliwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych. Gatunek ten został szeroko przeanalizowany pod względem cytogenetycznym, molekularnym oraz fenotypowym. Badania te przyczyniły się między innymi do wyodrębnienia trzech gatunków: B. distachyon, B. stacei i B. hybridum. W niniejszej pracy autorka podjęła się analizy organizacji genomów pozostałych przedstawicieli rodzaju Brachypodium. Do badań porównawczych wybrano: 3 gatunki jednoroczne: diploidalne B. distachyon i B. stacei oraz tetraploidalne B. hybridum 3 diploidalne gatunki wieloletnie: B. sylvaticum, B. pinnatum i B. glaucovirens 3 allotetraploidalne gatunki wieloletnie: B. pinnatum i B. phoenicoides oraz B. mexicanum Celem omawianej rozprawy doktorskiej było także określenie ich wzajemnych powiązań filogenetycznych. Analizy opisanie w niniejszej pracy wpisują się w jeden z najważniejszych nurtów badawczych określanym niekiedy mianem paleogenomiki. Ta dziedzina nauki umożliwia poznanie procesów biologicznych mających wpływ na kształtowanie genomów roślinnych. Do tych mechanizmów można między innymi zaliczyć: poliploidyzację, tj. zwielokrotnienie całego zestawu chromosomów w organizmie, aneuploidyzację tj. eliminacja jednego lub pary chromosomów z zestawu chromosomów, który jest charakterystyczny dla danego organizmu, oraz dysploiyzację, czyli zmianę liczby chromosomów, która nie ma wpływu na zmianę zawartości jądrowego DNA. Tego typu badania pozwalają wnioskować o strukturze genomów gatunków roślin, które dawno wymarły oraz śledzić kierunki ewolucji i specjacji gatunków nam współczesnych. Co więcej, wiedza ta wykorzystywana jest w badaniach aplikacyjnych, mających na celu ulepszenie roślin uprawnych. Oceniana praca doktorska ma formę manuskryptu liczącego 124 strony, którego struktura jest typowa dla prac o charakterze eksperymentalnym. Kolejne rozdziały to: Wykaz skrótów, Wstęp, Cel pracy, Materiał i metody, Wyniki, Dyskusja, Wnioski, Streszczenia w języku polskim i angielskim, Literatura i Aneks. Tytuł rozprawy bardzo dobrze informuje o tematyce badań oraz charakterze analiz pod względem metodycznym. 2
Pani mgr Joanna Łusińska na początku pracy zdecydowała się umieścić Wykaz skrótów, który z racji licznie używanych abrewiacji i symboli w pracy, w szczególności terminów filogenetycznych jest znacznym udogodnieniem dla czytelnika. Wstęp pracy jest dość obszerny liczy 33 strony. Rozdział ten jest logicznie podzielony na cztery podrozdziały, które są dodatkowo złożone z podsekcji. Można w nim znaleźć wszystkie istotne informacje potrzebne do zrozumienia i przeanalizowania badań opisanych w pracy. Co więcej, Wstęp zawiera też informacje o charakterze ogólnym, dzięki którym niniejsza rozprawa powinna być zrozumiała dla osób mniej zorientowanych w poruszonej tematyce badawczej. W mojej ocenie jest to duża zaleta tej części pracy. Autorka rozpoczęła od wprowadzenia, które dotyczy bioróżnorodności gatunków należących do rodziny Wiechlinowatych (Poaceae) oraz ich znaczenia ekonomicznego. W tym miejscu przedstawione zostały najważniejsze gatunki zbóż i traw. Raził mnie brak pełnych nazw rodzajowych i epitetów gatunkowych (w języku polskim i łacińskim) wraz z nazwiskiem lub skrótem nazwiska autora opisu gatunku. Ogólnie przyjętą normą jest podanie pełnej nazwy botanicznej, kiedy ta po raz pierwszy się pojawia w tekście publikacji naukowej. W podrozdziale 1.2. Autorka opisuje strukturę i mechanizmy ewolucji chromosomów traw ze szczególnym uwzględnieniem gatunków poliploidalnych, którym poświęcona jest sekcja 1.2.2. Zastanowiło mnie użycie terminu cecha w odniesieniu do liczby chromosomów w zdaniu, cyt.: Dla podrodzin Bambusoideae i Aristidoideae liczba x=11 jest cechą synapomorficzną (str. 4, wers 14). Autorka używając potocznego znaczenia określenia cecha zapewne chciała w ten sposób przekazać, iż dana liczba chromosomów jest charakterystyczna dla gatunków należących do obu podrodzin. Z kolei w biologii termin cecha oznacza właściwość organizmu żywego, która została wykształcona w wyniku współdziałania genów zawartych w genotypie danego organizmu, oraz warunków środowiskowych. Kolejna moja uwaga dotyczy braku wzmianki o zsekencjonowaniu genomu pszenicy (IWGSC, 17 sierpnia 2018. Science 361: 6403) umieszczonej w akapicie dotyczącym zsekwencjonowanych całych genomów roślinnych (str. 5). Z racji istotności gatunku Triticum aestivum w światowej gospodarce jako jednej z najważniejszych roślin zbożowych brak takiej informacji jest pewnym niedopatrzeniem. W podrozdziale 1.2.1. przydałby się krótki opis poszczególnych rearanżacji chromosomowych (tj. insercji, delecji, duplikacji, inwersji, translokacji itd.), które są przyczyną ewolucji genomów roślinnych. Co więcej niektóre z nich są w dalszych częściach pracy omawiane i analizowane. Dopełnieniem mogłyby być schematy przedstawiające mechanizm powstawania tych zmian, podobne do ryciny 1 (str. 9). Idąc dalej, w sekcji 1.2.2 (str. 10, wers 21) w mojej ocenie niepoprawnie użyto termin gatunek w odniesieniu do formy mieszańcowej Aegilops tauschii Secale cereale. Na stronie 11 (wers 5) zaintrygowało mnie zdanie, cyt.: Negatywnymi skutkami poliploidyzacji są zaburzenia procesu mejozy, spowodowane dużym podobieństwem sekwencji DNA w chromosomach homeologicznych, jednak rozmnażanie wegetatywne umożliwia przetrwanie i rozmnażanie się poliploidów. Zgadzam się oczywiście z pierwszą częścią zdania, natomiast stwierdzenie mówiące, iż rozmnażanie wegetatywne 3
umożliwia przetrwanie i rozmnażanie poliploidów uważam za wymagające doprecyzowania i ustosunkowania się przez Autorkę. Bardzo ciekawą kwestią poruszoną w pracy jest proces wtórnej diploidyzacji obserwowany u poliploidów. Poliploidyzacje i następujące po nich wtórne diploidyzacje są ważnymi procesami specjacji, genetycznego zróżnicowania i adaptacji roślin do zmieniających się warunków środowiskowych. Genetyczne modyfikacje, takie jak mutacje, rearanżacje chromosomowe oraz mechanizmy epigenetyczne przyczyniły się do zmian w ekspresji zduplikowanych genów. Zakłada się, że te zmiany w funkcji zduplikowanych genów (sub- lub neofunkcjonalizacja) mogą powiększać plastyczność odpowiedzi poliploidów w stosunku do ich diploidalnych przodków. Innymi bardzo ważnymi kwestiami, poruszonymi przez Autorkę w sekcji 1.2.2. są: eliminacja lub nagromadzenie sekwencji powtarzalnych oraz dominacja jednego subgenomu allopoliploidów. Podane przez Autorkę przykłady wskazujące, że na ewolucje współczesnych gatunków roślin miały przemiennie procesy poliploidyzacji i wtórnej diploidyzacji są istotne z punktu widzenia specyfiki niniejszej pracy. W tym miejscu można postawić pytanie Autorce, co w jej opinii może być powodem takiego schematu procesów, który wizualnie można przedstawić jako sinusoidę, gdzie wartości na osi x to czas a wartości na osi y przedstawiają liczbę chromosomów lub poziom ploidalności? Czy można założyć, przyjmując odpowiednie ramy czasowe, że przymus przystosowania się do życia w nowych, trwale zmienionych warunkach bytowych lub zewnętrznego stresu wiąże się z procesem poliploidyzacji, a wtórna diploidyzacja odpowiada okresowi stablilizacji i braku przymusu adaptacji lub braku stresu? Idąc dalej, w sekcji 1.2.3 Autorka ciekawie opisuje metody rekonstrukcji genomów ancestralnych wykorzystujące narzędzia genomiki porównawczej. W niektórych fragmentach brakuje wskazania źródeł prezentowanych danych. Na przykład informacja o tym, że rośliny okrytozalążkowe bardzo szybko zróżnicowały się w ponad 350 000 współcześnie występujących gatunków, podzielonych na główne grupy: jednoliścienne (20%) i dwuliścienne (75%) oraz Amborellowce (5%) nie jest opatrzona cytowaniem źródła. Za to bardzo pomocny w lekturze tej sekcji jest schemat modelu ewolucji kariotypów dla przedstawicieli trzech podrodzin traw: O. sativa (Ehrhartoideae), B. distachyon i Triticeae (Pooideae), S. bicolor, Setaria italica i Z. mays (Panicoideae). Podrozdział 1.3. zawiera bardzo dobrze usystematyzowane dane dotyczące charakterystyki rodzaju Brachypodium. Ogólna charakterystyka cytogenetyczna znanych gatunków została przedstawiona w Tabeli 1. Jednakże w mojej opinii jej usytuowanie dla wygody czytającego winno być w kolejnym akapicie po pojawieniu się odnośnika w tekście. Ten problem pojawia się też w innych fragmentach Wstępu. Na przykład odnośnik do Ryciny 2 pojawia się na stronie 16, więc naturalną koleją rzeczy powinno być umieszczenie ryciny na stronie następnej. Wracając do Tabeli 1, zastanawia mnie dlaczego w nagłówku pierwszej kolumny Autorka umieściła słowo takson a nie gatunek lub nazwa gatunkowa? W kolejnej sekcji 1.3.1. Autorka przybliżyła filogenezę rodzaju Brachypodium. Jest to wyczerpujący przegląd literatury dotyczącej badań nad pochodzeniem i wzajemnymi relacjami 4
pomiędzy gatunkami Brachypodium. Autorka cytując najnowsze publikacje naukowe dotyczące analiz filogenetycznych genów plastydowych (ndhf, trnlf) oraz jądrowych (ITS, ETS, CAL, GI, DGAT) opisuje ścieżki ewolucji o obrębie omawianego rodzaju. Dokładnie przedstawiony jest proces wyodrębnienia linii rozwojowych gatunków B. boissieri i B. stacei, które wyewoluowały 16,2 mln lat temu w miocenie. Autorka także wspomina o procesie dywergencji B. mexicanum, którą szacuje się na 14 mln lat temu oraz B. distachyon 10,6 mln lat temu. A następnie odróżnicowanie kladu, do którego zaliczane są pozostałe gatunki wieloletnie, stanowiące tzw. trzon rodzaju (ang. core-perennials), mające miejsce ok 6,1 mln lat temu w pliocenie. W tym miejscu z racji roli recenzenta muszę wskazać, iż nazwy epok (miocen, pliocen) rozpoczynamy od małej litery. W sekcji 1.3.2. Rodzaj Brachypodium jako system modelowy, Autorka stwierdziła, iż szerokie wykorzystanie Brachypodium jako systemu modelowego w różnych programach badawczych zapewnia ciągły rozwój zasobów i narzędzi badawczych wykorzystywanych do analiz różnorodnych zagadnień biologicznych. Pani mgr Łusińska między innymi opisuje genezę powstania International Brachypodium Initiative, którego głównym celem było zsekwencjonowanie i adnotacja genomu B. distachyon. W tym miejscu Autorka wspomina też, że stosunkowo niedawno ukończono i udostępniono sekwencje całych genomów jądrowych dla genotypów referencyjnych B. stacei (ABR114) i B. hybridum (ABR113), a cały kompleks B. distachyon - B. stacei - B. hybridum został poddany również nowoczesnym metodom sekwencjonowania BioNano. Niestety informacje te nie posiadają odnośników do źródeł. Ostatni podrozdział Wstępu jest bardzo dokładnym przeglądem dostępnej literatury opisującej metody wykorzystujące biblioteki klonów BAC do analizy różnych genomów roślinnych przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Tutaj ponowne czytelnik napotyka na brak jednolitej formy zapisu nazw botanicznych opisywanych gatunków roślin, które pojawiają się po raz pierwszy w tekście. Podsumowując, Wstęp w niniejszej pracy jest wyczerpujący i w pełni zaznajamia czytelnika z tematyką opisanych przez Autorkę badań. Cytowana literatura jest aktualna. W większości są to artykuły anglojęzyczne z renomowanych czasopism naukowych opublikowanych w ciągu ostatnich 20 lat. Ogólnie ten rozdział pracy oceniam bardzo pozytywnie. Cel pracy został sformułowany w sposób przejrzysty. Autorka informuje, że głównym cele badań było porównanie struktury kariotypów wybranych gatunków Brachypodium wraz ze szczegółową analizą występujących rearanżacji chromosomowych. Sformułowała także cel dodatkowy, jakim było poznanie procesów związanych z ewolucją chromosomów, które ukształtowały strukturę współczesnych kariotypów Brachypodium. Moją uwagę zwrócił sposób podziału badanego materiału, który został później zastosowany w opisie wyników. Jestem ciekawy jakie były przesłanki, aby badane gatunki podzielić na trzy grupy względem długości cyklu życiowego, tj.: gatunków jednorocznych: B. distachyon, B. stacei oraz B. hybridum 5
diploidalnych gatunków wieloletnich: B. sylvaticum, B. pinnatum i B. glaucovirens allotetraploidalnych gatunków wieloletnich B. pinnatum i B. phoenicoides oraz B. mexicanum. Rozdział Materiały i metody został podzielony na sześć podrozdziałów. Znajdują się tu informacje niezbędne do zrozumienia wykonanych eksperyment6w. Rozdział jest podzielony na sześć podrozdziałów poprawiających czytelność tekstu. Jest to uzasadnione złożonością wykonywanych czynności, wśród których należy wymienić: (3.1) Materiał badawczy i jego pochodzenie, (3.2) Preparatyka cytogenetyczna, (3.3) Przygotowanie sond molekularnych, (3.4) Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, (3.5) Przypisanie oznaczeń genomów i chromosomów poszczególnych gatunków oraz (3.6) Skład buforów wykorzystywanych w badaniach. Szczególnie cenię sobie pomysł autorki na wprowadzenie do rozdziału Materiały i metody podrozdziałów 3.5 i 3.6. Szczegółowo opisane informacje tam zawarte mogą być bardzo przydatne innym badaczom, którzy podejmą się podobnych analiz. We wszystkich podrozdziałach metody są opisane bardzo starannie. Mam kilka pytań technicznych dotyczących metod opisanych w tym rozdziale. Pierwsze pytanie dotyczy sposobu wykonania preparatów cytogenetycznych. Czy znane są Autorce inne metody preparatyki, ograniczające zjawisko nachodzenia na siebie chromosomów, które uniemożliwia tym samym dokładną analizę kariotypu? Drugie pytanie dotyczy znaczników fluorescencyjnych użytych do znakowania sekwencji klonów BAC. Autorka w pracy użyła dwa znaczniki (digoksygeninia i biotyna), które wymagają immunodetekcji za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych skoniugowanych odpowiednio z FITC oraz Alexa Fluor 647. Czy Autorka rozpatrywała możliwość zamiennego użycia tzw. znaczników bezpośrednich? Taka modyfikacja mogłaby skrócić czas eksperymentów oraz obniżyć ich koszty (redukcja kosztów zakupu przeciwciał oraz mniejsze zużycie buforów potrzebnych do płukań). Wspominam o tym będąc w pełni świadomy, iż w przeciwieństwie do typowych analiz molekularnych, badania cyto-molekularne są długotrwałe, żmudne i trudne na poziomie metodycznym. Ponadto, wykorzystywane metody cytogenetyczne charakteryzują się stosunkowo niską wydajnością. Opis wyników zajmuje 18 stron i jest najbardziej obszernym rozdziałem pracy wliczając 22 tablice z opisami. Został podzielony przez Autorkę na podrozdziały, które zasadniczo poprawiają czytelność tekstu. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki szeroko zakrojonych badań cyto-molekularnego mapowania porównawczego genomów wybranych gatunków Brachypodium z wykorzystaniem specyficznych chromosomowo klonów BAC, pochodzących z genomu Bd referencyjnego genotypu z B. distachyon Bd21. Zweryfikowano rozmieszczenie wszystkich wykorzystanych klonów BAC wzdłuż chromosomów badanych gatunków (tzw. chromosome walking ) oraz porównano ich lokalizacje z pozycją na mapie fizycznej B. distachyon. W tym miejscu chciałbym wyrazić uznanie dla Autorki za ogrom pracy, która musiała zostać wykonana aby przeprowadzić tego typu badania kariotypów, przygotować kariogramy oraz przeanalizować otrzymane dane wynikowe. Intrygują mnie dane przedstawione na grafikach map cytogenetycznych (zazwyczaj są to ryciny opisane punktem b w tablicach 1-6
22), ilustrujących lokalizację poszczególnych klonów BAC pochodzących z chromosomów B. distachyon (x=5), zmapowanych heterologicznie w chromosomach analizowanych gatunków. W Materiałach i metodach Autorka wspomniała, że syntenie chromosomów Brachypodium zwizualizowano bioinformatycznie za pomocą narzędzia do tworzenia map syntenii, dostępnego na portalu CoGe. Utworzone mapy syntenii chromosomów B. distachyon i B. stacei (Tablica A4a) oraz B. distachyon i B. sylvaticum (Tablica A4b) umożliwiły odnalezienie homologicznych loci w poszczególnych chromosomach porównywanych gatunków. Niestety nie ma informacji w jaki sposób analizowane chromosomy Brachypodium są porównywane z chromosomami Oryza sativa (Os) i na jakiej podstawie tworzone są schematy odpowiednich fragmentów chromosomów Brachypodium odnoszących się do obszarów homoeologicznych w chromosomach ryżu oraz w jaki sposób wyznaczono hipotetyczne punkty fuzji chromosomów Pośredniego Ancestralnego Kariotypu Traw. W analizach struktury chromosomów użyto także klon BAC BD_CBa0033J12, pochodzący z biblioteki BD_CBa genomowego DNA B. distachyon (Febrer i in., 2010), zawierający fragment przycentromerowej sekwencji powtarzalnej celem wizualizacji pozycji centromerów. Chciałbym prosić o ustosunkowanie się do faktu, iż w kilku przypadkach, np. Tablica 7a, w chromosomach Bp2 B. sylvaticum i Bp2 B. pinnatum sekwencja CEN nie została zmapowana. Czy może to świadczyć o rearanżacjach w sekwencjach centromerowych? Biorąc pod uwagę stopień konserwatywności sekwencji centromerowych, może być to kolejna wskazówka pomocna w określeniu powiązań filogenetycznych pomiędzy badanymi gatunkami. Bardzo cenne wyniki zostały przedstawione w sekcji 4.2.4. Mapowanie porównawcze B. mexicanum. Po raz pierwszy potwierdzono tetraploidalny charakter genomu tego gatunku oraz poznano jego skład genomowy x=10+10. Do szerszej oceny tego aspektu pracy wrócę w dalszej części recenzji. Uzyskane wyniki zostały przez Panią mgr Joannę Łusińską poddane szczegółowej analizie w rozdziale Dyskusja. Jest to zawsze ważny element pracy naukowej i został w mojej ocenie bardzo dobrze. Zostały tu przedyskutowane wszystkich istotne elementy pracy. Zastanawia mnie dlaczego Autorka w odniesieniu do chromosomów ryżu stosuje określenie ancestralne? Oczywiście znane są mi badania wykazujące, że kariotyp ryżu pozostaje najmniej zmieniony ewolucyjnie, a zatem najbardziej przypomina przypuszczalny 12- chromosomowy Pośredni Ancestralny Kariotyp Traw (AGK). W moim odczuciu określenie ancestralny powinien być stosowany w odniesieniu do hipotetycznych dwunastu chromosomów AGK, natomiast ryż i jego chromosomy są na współczesne. Bardzo ciekawie i wnikliwie przedyskutowane są wyniki przedstawiające i weryfikujące fuzje chromosomowe, które są wyraźnym dowodem procesu dysploidii, mającego miejsce w ewolucji badanych gatunków. Podobnie, bardzo dobrze omówione są zjawiska fizji chromosomów, które w toku ewolucji przyczyniły się do powiększenia liczby chromosomów. Jako recenzent mam jednak zastrzeżenia dotyczące stosowania pewnych skrótów myślowych, 7
które mogą powodować trudności w zrozumieniu opisywanych zdarzeń ewolucyjnych. Na przykład, Autorka na stronie 73 napisała, iż wykryta translokacja Robertsonowska w genomie B. stacei jest odpowiedzialna za proces dysploidyzacji, skutkujący zwiększeniem podstawowej liczby chromosomów z x=9, występującej u wielu wieloletnich diploidalnych gatunków Brachypodium, do x=10 specyficznej dla B. stacei. Translokacja Robertsonowska nie może skutkować powiększeniem liczby chromosomów. Zjawisko to polega na tzw. fuzji centrycznej dwóch ramion pochodzących od różnych chromosomów. W wielu przypadkach ramiona dwóch rożnych chromosomów łączą się w rejonie centromeru natomiast pozostałe ramiona ulegają eliminacji w mejozie. W dyskutowanym przypadku Autorka na zapewne na myśli fizję centryczną chromosomu powstałego w skutek translokacji Robertsonowskiej, czego następstwem jest powstanie dwóch chromosomów. Z resztą Autorka dokładnie opisała mechanizm tego procesu we Wstępie na stronie 8 oraz zaprezentowała to zjawisko graficznie w postaci Ryciny 1c i d. Interesującym fragmentem Dyskusji jest omówienie wyników badań nad B. mexicanum biorąc pod uwagę pionierskie analizy cyto-molekularne nad tym wieloletnim gatunkiem wykonane przez Autorkę, które są częścią tej pracy. Jak podaje Autorka do tej pory B. mexicanum nie został poddany dokładnym analizom cytomolekularnym, jak również nie przedstawiono dowodów potwierdzających allotetraploidalny charakter tego gatunku. Wykonane w ramach niniejszej pracy badania umożliwiły poznanie szczegółowej struktury chromosomów tworzących kariotyp B. mexicanum. W pracy jednoznacznie stwierdzono, że kolejność i rozmieszczenie loci hybrydyzacyjnych wykorzystanych klonów BAC wskazuje na poliploidalny charakter B. mexicanum. Jednakże w dyskusji możnaby postawić pewne hipotezy i połączyć niektóre wyniki z danymi literaturowymi aby dodatkowo umocnić twierdzenie o poliploidalnym charakterze omawianego gatunku. Na przykład w wyniku badań Autorki chromosomy Bm9 oraz Bm9 B. mexicanum różnią się od chromosomu referencyjnego Bd5 brakiem locus 35S rdna. Ponadto, przeprowadzone analizy nie wykazały rearanżacji strukturalnych dotyczących chromosomów Bm9 oraz Bm9, względem chromosomu referencyjnego. W wielu przypadkach eliminacja loci rdna jest charakterystyczna dla ewolucji poliploidów. Z resztą Autorka wspomina we Wstępie niniejszej pracy, że na przykład w przypadku allotetraploidalnego pszenżyta obserwuje się supresję genomową w wyniku metylacji cytozyny i wyciszania genów rrna żyta w obecności genomu pszenicy (Houchins i in., 1997). Zjawisko dominacji jąderkowej występuje również u allotetraploidalnego gatunku B. hybridum, gdzie obserwuje się wyciszenie genów 35S rrna w genomie pochodzącym od B. stacei (Borowska-Zuchowska i Hasterok, 2017). Autorka stwierdza także, że analiza wyników wykazała istnienie znacznego podobieństwa pomiędzy subgenomami Bm i Bm, co nie pozwoliło udzielić jednoznacznej odpowiedzi na pytanie czy gatunek B. mexicanum powstał w wyniku allopoliploidyzacji dwóch gatunków ancestralnych o podobnych strukturalnie genomach czy też autoploidyzacji, z wystąpieniem późniejszych zmian strukturalnych w niektórych chromosomach (wniosek 8). 8
Ostatni podrozdział Dyskusji zatytułowany Kompleksowy model ewolucji genomów jądrowych Brachypodium na poziomie chromosomowym na charakter podsumowujący i stanowi należycie zredagowaną klamrę dla opisanych i przedyskutowanych badań Autorki. Cenne wydaje się być przypuszczenie Autorki, że linia rozwojowa tetraploidalnego gatunku B. mexicanum (2n=40), wyodrębniła się jako pierwsza, a jego kariotyp pochodzi bezpośrednio od hipotetycznego 10-chromosomowego Ancestralnego Kariotypu Brachypodium, gdyż nie obserwowano w tym przypadku fuzji insercyjnej Os12+Os9 z chromosomem Os11. Wnioski z pracy zostały poprawnie sformułowane w postaci 10 punktów. Mam jedynie drobną uwagę do wniosku nr 7. Ma on charakter hipotezy, a nie typowego wniosku. Oczywiście hipoteza ta jest istotna od strony naukowej i ma duże znaczenie dla postrzegania wyników opisanych w rozprawie, dlatego też w pełni popieram ten zabieg Autorki. Streszczenie pracy napisane jest w sposób wyczerpujący, choć brakuje w nim wzmianki o modelowym charakterze rodzaju Brachypodium. Co więcej, Autorka nie dość klarownie rozgranicza własne wyniki otrzymane w ramach pracy doktorskiej od wyników, które są wcześniej opublikowane. Od strony edytorskiej i językowej praca jest przygotowana bardzo starannie. Przy tak obszernym manuskrypcie nie można oczekiwać całkowitego braku błędów, ale te, które udało mi się znaleźć są naprawdę nieliczne, dlatego pozwolę pominąć ten komentarz. Na zakończenie muszę nadmienić, iż moja ogólna ocena pracy doktorskiej Pani mgr Joanny Łusińskiej jest w pełni pozytywna. Moje uwagi mają charakter dyskusyjny i wynikają ze złożoności badań podjętych przez Autorkę. Porównanie struktury kariotypów wybranych gatunków Brachypodium wraz ze szczegółową analizą występujących rearanżacji chromosomowych oraz określenie procesów związanych z ewolucją chromosomów, które ukształtowały strukturę współczesnych kariotypów tych gatunków było zadaniem bardzo ambitnym i trudnym do realizacji. W tym, kontekście należy podkreślić, że Pani mgr Joanna Łusińska opisała je w sposób zrozumiały i całościowy a sformułowane wnioski są merytorycznie poprawne. Oceniana rozprawa spełnia według mnie wymagania ustawowe wobec prac doktorskich [art. 179 ustawy z dnia 3 lipca 2018 r. Przepisy wprowadzające ustawę Prawo o szkolnictwie wyższym i nauce (Dz. U. z 30 sierpnia 2018 r. poz. 1669)]. Wnioskuję do Rady Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach o dopuszczenie mgr Joanny Łusińskiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Biorąc pod uwagę bardzo wysoki poziom badań opisanych przez Autorkę, który wyraźnie przewyższa przeciętne wymagania stawiane pracom doktorskim w zakresie nauk biologicznych, zwracam się z wnioskiem o wyróżnienie przedłożonej mi do recenzji rozprawy doktorskiej. Poznań, dnia 12 sierpnia 2019 roku 9