DEGRADACJA NIEPRAWID OWYCH TRANSKRYPTÓW W KOMÓRKACH EUKARIOTYCZNYCH I PROKARIOTYCZNYCH

DEGRADACJA NIEPRAWID OWYCH TRANSKRYPTÓW 299 POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 34 2007 NR 2 (299 316) DEGRADACJA NIEPRAWID OWYCH TRANSKRYPTÓW W KOMÓRKACH EUKARIOTYCZNYCH I PROKARIOTYCZNYCH DEGRADATION OF TRUNCATED mrna IN EUKARYOTIC AND PROKARYOTIC CELLS Katarzyna Dorota RACZYÑSKA 1,2, Halina AUGUSTYNIAK 1 1 Zak³ad Biologii Molekularnej i Komórkowej oraz 2 Zak³ad Ekspresji Genów, Instytut Biologii Molekularnej i Biotechnologii UAM Streszczenie: Procesy degraduj¹ce transkrypty zawieraj¹ce przedwczesny kodon stop lub w ogóle pozbawione kodonu stop chroni¹ komórki przed powstaniem niefunkcjonalnych, a czasem toksycznych bia³ek. Szlaki degradacji takich mrna opisano u ssaków, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, dro d y i roœlin. Etapy degradacji, jak i uczestnicz¹ce w tym procesie czynniki bia³kowe nie zawsze s¹ identyczne u ró nych organizmów. Rozpoznanie nieprawid³owych mrna zale y od przestrzennego oddzia³ywania pomiêdzy sk³adnikami rybosomu zatrzymanego na kodonie stop a bia³kami wi¹ ¹cymi siê w rejonie 3 UTR transkryptu. Poszczególne czynniki bia³kowe zaanga owane w degradacjê mog¹ te uczestniczyæ w innych procesach, takich jak: cykl komórkowy, replikacja czy wyciszanie genów. W komórkach prokariotycznych na stra y jakoœci mrna stoj¹ cz¹steczki tmrna, które zachowuj¹ siê jak trna i mrna. Funkcj¹ tmrna jest rozpoznanie transkryptu bez kodonu stop na rybosomie, dokoñczenie syntezy wadliwego bia³ka w procesie trans-translacji i przywrócenie rybosomom stanu aktywnoœci. tmrna naznacza jednoczeœnie wadliwe mrna i bia³ko do degradacji. S³owa kluczowe: transkrypty, kodon stop, translacja, degradacja, NMD, tmrna. Summary: Cells have evolved mechanism to get rid of nonfunctional or potentially deleterious proteins that are coded by mrna with premature translation termination or mrna without stop codon. The pathway of degradation of such mrna have been described in mammals, flies, nematodes, yeast and plants. The degradation steps as well as factors involved in are not identical in different species. The general way of recognition of aberrant transcripts depends on spatial relationship between ribosome components and ribonucleoproteins bound to the 3 UTR sequence. Moreover, protein factors involved in degradation can participate in additional processes like cell cycle regulation, replication or RNA interference. The control of mrna quality in prokaryotes is performed by tmrna that works both as trna and mrna. tmrna recognizes ribosomes stalled by transcripts without stop codon and continues the synthesis of truncated proteins in trans-translation process. In consequence ribosomes are reactivated and aberrant transcript and protein are triggered for decay. Key words: transcripts, stop codon, translation, degradation, NMD, tmrna.

300 K. D. RACZYÑSKA, H. AUGUSTYNIAK WPROWADZENIE Poziom stabilnych transkryptów w komórce jest regulowany przez szybkoœæ zarówno syntezy, jak i degradacji mrna. Niestabilnoœæ mrna wywo³uje wiele czynników. Nale ¹ do nich, miêdzy innymi, destabilizuj¹ce motywy sekwencji i aktywnoœæ kompleksów degradacyjnych. Te ostatnie odgrywaj¹ istotn¹ rolê zw³aszcza w przypadku degradacji nieprawid³owych mrna, takich jak: transkrypty z przedwczesnym kodonem stop lub w ogóle pozbawione sygna³u terminacji translacji. Blokowanie translacji tych mrna jest wa nym mechanizmem zapobiegaj¹cym powstawaniu wadliwych bia³ek zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Pomimo e wiele sk³adników kompleksów degradacyjnych jest wysoce zachowawczych, mechanizmy rozpoznawania i degradacji nieprawid³owych mrna s¹ odmienne w ró nych organizmach. W komórkach eukariotycznych degradacja transkryptów z przedwczesnym kodonem stop odbywa siê najczêœciej w procesie NMD (ang. Nonsense-Mediated mrna Decay), a transkryptów pozbawionych kodonu stop w procesie NSD (ang. Nonstopmediated mrna Decay). Komórki bakteryjne natomiast wytworzy³y specyficzn¹ cz¹steczkê tmrna (ang. transfer-messanger RNA), która naznacza do degradacji zarówno transkrypty pozbawione kodonu stop, jak i produkty ich translacji. DEGRADACJA PRAWID OWYCH TRANSKRYPTÓW Transkrypty eukariotyczne chroni przed degradacj¹ struktura czapeczki na 5 koñcu i sekwencja polia na 3 koñcu oraz, odpowiednio, zwi¹zany z nimi kompleks CBC (ang. Cap Binding Complex) i bia³ko wi¹ ¹ce polia PABP (ang. PoliA Binding Protein). Degradacja naturalnych mrna w komórkach ssaków rozpoczyna siê w wiêkszoœci przypadków deadenylacj¹, po której nastêpuje egzonukleolityczne ciêcie w kierunku 3 5. W mniejszym stopniu RNA jest trawiony przez 5 3 egzonukleazê po usuniêciu z 5 koñca czapeczki [4, 58, 65]. Degradacja naturalnych mrna w komórkach dro d y przebiega w cytoplazmie, g³ównie w kierunku 5 3 i jest poprzedzona czêœciow¹ deadenylacj¹ (por. ryc. 3A). Skrócenie ogona polia o d³ugoœci 55 75 nt do oko³o 10 nt wi¹ e siê z oddysocjowaniem bia³ka Pab1p, co z kolei przyspiesza usuniêcie czapeczki z udzia³em enzymów Dcp1p/ Dcp2p. W oddzia³ywaniu mrna i kompleksu usuwaj¹cego czapeczkê poœrednicz¹ koaktywatory Lsm1-7 [73]. Nastêpnie mrna jest ca³kowicie trawiony przez 5 3 egzonukleazê Xrn1p. Trawienie od koñca 3 z udzia³em cytoplazmatycznego egzosomu zawieraj¹cego kompleks bia³ek Ski2p, Ski3p, Ski8p oraz bia³ko Ski7p przebiega rzadziej. Trawienie od 3 koñca poprzedza ca³kowita deadenylacja transkryptu [2, 4, 19, 65]. W komórkach Arabidopsis thaliana degradacja prawid³owych transkryptów przebiega ró nymi drogami. Czêœæ transkryptów podlega najpierw endonukleolitycznemu ciêciu na rybosomach, a nastêpnie powsta³y fragment 3 jest degradowany w kierunku

DEGRADACJA NIEPRAWID OWYCH TRANSKRYPTÓW 301 5 3, a fragment 5 w kierunku 3 5, niezale nie od usuniêcia czapeczki i deadenylacji. Degradacja czêœci transkryptów (na przyk³ad transkryptu genu PHYA owsa) przebiega z obu koñców, ale po uprzednim usuniêciu czapeczki lub ogona polia [22]. Inaczej degradowane s¹ transkrypty, które posiadaj¹ przedwczesny kodon stop lub w ogóle nie maj¹ kodonu stop. Przedwczesny kodon stop mo e powstaæ na skutek mutacji punktowych lub te delecji czy insercji, które zmieniaj¹ ramkê odczytu, na przyk³ad w wyniku alternatywnego splicingu. Wadliwe transkrypty bez kodonu stop mog¹ te powstaæ na skutek wystêpowania przedwczesnych sygna³ów endonukleolitycznego ciêcia i poliadenylacji, wówczas ich 3 koniec znajduje siê obrêbie sekwencji koduj¹cej. ROZPOZNANIE WADLIWEGO TRANSKRYPTU Czynnikiem uruchamiaj¹cym proces degradacji transkryptów z przedwczesnym kodonem stop lub pozbawionych kodonów stop na drodze, odpowiednio, NMD lub NSD jest zwi¹zanie transkryptu z rybosomami. U wszystkich organizmów proces degradacji NMD jest zale ny od translacji, a u ssaków, z pewnymi wyj¹tkami, równie od splicingu [49]. Wykazano, e zarówno zablokowanie translacji czy mutacja w kodonie start, jak równie obecnoœæ supresorowych trna wp³ywa na stabilizacjê wadliwych mrna [27]. Degradacji podlegaj¹ przewa nie mrna z przedwczesnym kodonem stop lub wyd³u onym rejonem 3 UTR, co ma zwi¹zek z zaburzeniem odleg³oœci miêdzy kodonem stop a 3 koñcem transkryptu (ryc. 1). Podczas translacji prawid³owego mrna czynniki bia³kowe RNP (ang. Ribonucleoproteins) uczestnicz¹ce w dojrzewaniu 3 koñca mrna prawdopodobnie oddzia³uj¹ ze sk³adnikami rybosomu zatrzymanego na kodonie stop. Taka interakcja wywo³uje zmiany konformacyjne RNPs, które stabilizuj¹ transkrypt i kieruj¹ go do kolejnych rund translacji [26, 27]. Stwierdzono, e w komórkach ssaków kodon stop powinien znajdowaæ siê do 50 nukleotydów powy ej ostatniego egzonu lub w obrêbie ostatniego egzonu (ryc. 1B). W transkryptach dro d y natomiast istotna jest d³ugoœæ rejonu 3 UTR, który zawiera œrednio 100 nukleotydów. Prawdopodobnie tylko taka odleg³oœæ umo liwia w³aœciwe oddzia³ywanie zatrzymanych na kodonie stop sk³adników rybosomów z RNPs, gdy jej skrócenie lub wyd³u enie indukuje NMD [1, 26, 27, 53, 62]. W transkryptach dro d y wystêpuje ponadto specyficzna sekwencja DSE (ang. Downstream Sequence Element), która wi¹ e bia³ko Hrp1p/Nab4 (ryc. 1A) [20]. Jeœli sekwencja DSE jest po³o ona poni ej przedwczesnego kodonu stop PTC (ang. Premature Termination Codon) (do 150 nt), sk³adniki rybosomu zatrzymanego na przedwczesnym kodonie stop oddzia³uj¹ z bia³kiem Hrp1p/Nab4. Bia³ko to wi¹ e siê nastêpnie z bia³kami Upf1p i Upf2p i prawdopodobnie w ten sposób uruchamia proces NMD [19]. Wykazano, e zarówno mutacje w genie bia³ka Hrp1p/Nab4, jak i brak motywu DSE lub jego wystêpowanie powy ej kodonu stop stabilizuj¹ transkrypty z PTC [19, 20]. Istotn¹ rolê w oddzia³ywaniu ze sk³adnikami rybosomu zatrzymanego na prawid³owym kodonie stop odgrywa bia³ko PABP. PABP oddzia³uje z czynnikiem uwalniaj¹cym erf3

302 K. D. RACZYÑSKA, H. AUGUSTYNIAK RYCINA 1. Mechanizm rozpoznania nieprawid³owego kodonu stop w komórkach dro d y (A) i ssaków (B). W³aœciwy kodon stop umo liwia oddzia³ywanie sk³adników rybosomu z bia³kami obecnymi w rejonie 3 UTR. Trójk¹t wskazuje kodon start. Kierunek ruchu rybosomów pokazano kropkowan¹ strza³k¹. EJ miejsce po³¹czenia egzon-egzon; EJC kompleks wi¹ ¹cy siê z po³¹czeniem egzon-egzon; PTC przedwczesny kodon stop; PABP bia³ka wi¹ ¹ce polia; DSE motyw sekwencji wi¹ ¹cy bia³ko Hrp1p/Nab4 (ang. eukaryotic Release Factor) i mo e indukowaæ terminacjê translacji oraz powrót rybosomów do stanu aktywnego. W transkryptach ze skróconym rejonem 3 UTR lub pozbawionych sygna³u terminacji w³aœciwa odleg³oœæ miêdzy kodonem stop a bia³kiem PABP zostaje zaburzona. Odczytywanie na rybosomie 3 koñca takich transkryptów powoduje oddysocjowanie PABP i wp³ywa na destabilizacjê nieprawid³owych mrna [34]. Wykazano, e w komórkach dro d y wprowadzenie w³aœciwego rejonu 3 UTR w rejonie przedwczesnego kodonu stop wywo³ywa³o w³aœciw¹ terminacjê translacji i inaktywacjê procesu NMD [1]. CZYNNIKI UCZESTNICZ CE W PROCESIE NMD W procesie degradacji transkryptów z przedwczesnym kodonem stop na drodze NMD bierze udzia³ szereg czynników bia³kowych. U wszystkich organizmów, u których proces ten zidentyfikowano, istotn¹ rolê odgrywaj¹ bia³ka UPF1, UPF2 i UPF3. Kluczowym enzymem procesu NMD jest helikaza UPF1 [10, 49]. Bia³ko UPF1 u ró nych eukariotów wykazuje oko³o 50% identycznoœci; mniejsz¹ homologiê, bo tylko oko³o 20 30%, wykazuj¹ bia³ka UPF2 i UPF3. Mniejsza konserwatywnoœæ dwóch ostatnich czynników mo e wynikaæ z tego, e oddzia³uj¹ one równie z innymi bia³kami, które nie s¹ wysoce zachowawcze w ró nych organizmach [11].

DEGRADACJA NIEPRAWID OWYCH TRANSKRYPTÓW 303 W procesie NMD przebiegaj¹cym w komórkach dro d y degradacja transkryptów z przedwczesnym kodonem stop wymaga aktywnoœci bia³ek UPF1, UPF2 i UPF3, chocia do degradacji transkryptów bez kodonu stop czynniki te nie s¹ ju wymagane. Z kolei, w komórkach C. elegans zidentyfikowano a siedem bia³ek SMG bior¹cych udzia³ w degradacji poprzez NMD: SMG1-7 [66]. Okaza³o siê, e trzy spoœród nich: SMG2, SMG3 i SMG4 s¹ homologami bia³ek UPF1-3 [11]. W komórkach ludzkich natomiast w przebiegu NMD bior¹ udzia³ bia³ka UPF1-3 oraz SMG1, SMG5-7, przy czym bia³ko UPF3 wystêpuje w postaci dwóch paralogów: UPF3a i UPF3b [16, 76]. Poszczególne czynniki bia³kowe nie zawsze wystêpuj¹ u wszystkich organizmów. I tak u D. melanogaster nie zidentyfikowano bia³ka SMG7 [16], a w komórkach dro d y stwierdzono brak ortologów bia³ek SMG1, SMG5-7 [11, 66]. Okaza³o siê tak e, e dwa czynniki kompleksu EJC (ang. Exon-exon Junction Complex), który wi¹ e siê po splicingu z ka dym po³¹czeniem egzon-egzon, bia³ka RNPS1 i Y14 maj¹ zdolnoœæ wywo³ywania procesu NMD, kiedy przy³¹cz¹ siê poni ej kodonu stop [76]. U roœlin dotychczas potwierdzono udzia³ w procesie NMD jedynie bia³ka UPF1 i UPF3 [3, 32]. Istotn¹ rolê podczas uruchamiania degradacji w procesie NMD odgrywa cykliczna fosforylacja i defosforylacja bia³ka UPF1, które na N- i C-koñcu ma wielokrotnie powtórzone reszty seryny. U ludzi i C. elegans fosforylacja jest katalizowana przez kinazê SMG1, a defosforylacja przez bia³ka SMG5-7; te ostatnie, same nie bêd¹c fosfatazami, aktywuj¹ fosfatazê 2A (PP2A). PP2A ma zdolnoœæ oddzia³ywania z czynnikiem erf1, co sugeruje, e fosforylacja ma miejsce na etapie terminacji translacji [10, 11, 16, 52]. Przypuszcza siê, e ufosforylowane bia³ko UPF1 wi¹ e siê z N-koñcem bia³ka SMG7, zawieraj¹cym domenê charakterystyczn¹ dla bia³ek z rodziny 14-3-3 [14]. Domena C-koñcowa bia³ka SMG7 naznacza mrna do degradacji. Bia³ko SMG7 oddzia³uje ponadto z bia³kami SMG5 i PP2A [75]. Sugeruje siê tak e, e czynnikiem sygnalnym dla zapocz¹tkowania NMD mo e byæ zdolnoœæ bia³ka UPF1 do hydrolizy ATP [26, 27]. U S. cerevisiae, pomimo braku bia³ek SMG1, SMG5, SMG6 i SMG7, bia³ko UPF1 jest równie fosforylowane i co wiêcej, do w³aœciwego przebiegu procesu NMD wymagana jest równie fosforylacja bia³ka UPF2. Ufosforylowana domena N-koñcowa UPF2 oddzia³uje nastêpnie z bia³kiem Hrp1p, co wywo³uje degradacjê na drodze NMD [77]. Oprócz wy ej wymienionych bia³ek, w degradacji transkryptów drog¹ NMD uczestnicz¹ enzymy usuwaj¹ce czapeczkê: DCP1/DCP2 oraz deadenylazy i egzonukleazy prowadz¹ce degradacjê mrna w kierunku 3 5 [7, 48, 51, 72]. 1. Proces NMD w komórkach ssaków i D. melanogaster Przebieg procesu NMD u ssaków i u muszki owocowej wykazuje pewne ró nice. Na przyk³ad, u muszki owocowej, w odró nieniu od ssaków, proces NMD jest niezale ny od splicingu i rozpoczyna siê od endonukleolitycznego przeciêcia wadliwego transkryptu. Do degradacji wadliwych transkryptów w procesie NMD u ssaków kierowane s¹ takie mrna, których sygna³ terminacji translacji znajduje siê w odleg³oœci wiêkszej ni 50 55 nukleotydów powy ej ostatniego z 3 koñca po³¹czenia egzon-egzon, powsta³ego po usuniêciu intronu. Kodony stop po³o one w mniejszej odleg³oœci lub w obrêbie ostatniego egzonu s¹ rozpoznawane jako w³aœciwe [53].

304 K. D. RACZYÑSKA, H. AUGUSTYNIAK RYCINA 2. Schemat degradacji transkryptów drog¹ NMD w komórkach ssaków (A) i D. melanogaster (B). Trójk¹t wskazuje kodon start. Wyjaœnienia skrótów podano w opisie do ryciny 1

DEGRADACJA NIEPRAWID OWYCH TRANSKRYPTÓW 305 Rozpoznanie przedwczesnego kodonu stop odbywa siê podczas pierwszej rundy translacji, której poddawana jest dojrza³a cz¹steczka mrna. Po splicingu, z cz¹steczk¹ mrna w odleg³oœci 20 24 nukleotydów przed ka dym po³¹czeniem egzon-egzon wi¹ e siê bia³kowy kompleks EJC. W jego sk³ad wchodz¹ miêdzy innymi bia³ka UPF3a lub UPF3b [76]. Pierwsza runda translacji ma miejsce w cytoplazmie lub zachodzi podczas eksportu mrna z j¹dra do cytoplazmy, co sugeruje jej powi¹zanie z b³on¹ j¹drow¹. Jeœli kodon stop jest ulokowany w³aœciwie, nastêpuje seria procesów kieruj¹cych transkrypt do nastêpnych rund translacji, tj. czynnik UPF3 i kompleks EJC oddysocjowuj¹, czynnik translacji eif4e zajmuje pozycjê kompleksu CBC, a j¹drowe bia³ko PABP zostaje zast¹pione przez cytoplazmatyczny odpowiednik. Jeœli natomiast rybosomy zatrzymaj¹ siê na przedwczesnym kodonie stop, proces przemodelowania bia³ek zostaje zablokowany, a cz¹steczkê wadliwego mrna rozpoznaje kompleks terminacyjny, tj. bia³ko UPF3 wi¹ e siê z bia³kiem UPF2, a nastêpnie z UPF1, które oddzia³uje z czynnikami terminacji translacji erf1 i erf3 (ryc. 2A) [4, 48, 53]. U ssaków w oddzia³ywaniach kompleksu terminacyjnego z kompleksem EJC uczestniczy równie bia³ko CBP80, które wi¹ e siê z czynnikiem UPF1, co z kolei wzmaga jego oddzia³ywanie z bia³kiem UPF2 [9, 33, 35, 47]. Ostatnio wykazano, e do uruchomienia procesu NMD nie jest wymagana bezpoœrednia interakcja rybosomów z kompleksem CBC podczas inicjacji translacji; translacja mo e rozpocz¹æ siê równie w obrêbie sekwencji koduj¹cej nieprawid³owy mrna. Wynika st¹d, e translacja sama w sobie jest czynnikiem wywo³uj¹cym NMD [29]. Przyjmuje siê, e degradacja mo e przebiegaæ dwiema drogami: a) poprzez usuniêcie czapeczki z 5 koñca z udzia³em bia³ek DCP1/DCP2 oraz koaktywatorów LSm1-7 i nastêpnie trawienie przez 5 3 egzonukleazê XRN1; b) deadenylacjê i trawienie egzonukleolityczne w kierunku 3 5 przez egzosom i kompleks bia³ek Ski [4, 48] (ryc. 2A). Proces degradacji transkryptów zarówno z przedwczesnym kodonem stop, jak i prawid³owych mrna mo e przebiegaæ równie na drodze SMD (ang. Staufen Mediated Decay). W degradacji typu SMD bierze udzia³ bia³ko Staufen1, wi¹ ¹ce w komórkach ssaków dsrna. Degradacja w procesie SMD nie jest zale na ani od splicingu, ani od obecnoœci kompleksu EJC, ale wymaga obecnoœci czynnika UPF1. Bia³ko Staufen1 wi¹ e siê z czynnikiem UPF1 oraz z rejonem 3 UTR transkryptu poni ej kodonu stop i naznacza go do degradacji [46]. Wykazano równie, e proces degradacji SMD nie wymaga obecnoœci bia³ek UPF2, UPF3 i CBP80 [33, 46]. U Drosophila melanogaster degradacja transkryptów z przedwczesnym kodonem stop jest niezale na od splicingu [16]. Proces NMD rozpoczyna siê od endonukleolitycznego przeciêcia w pobli u PTC, a nastêpnie fragment 5 transkryptu jest trawiony w kierunku 3 5 przez egzosom z udzia³em bia³ek Ski, a fragment 3 przez 5 3 egzonukleazê XRN1 (ryc. 2B). Oba procesy przebiegaj¹ wiêc niezale nie od usuniêcia czapeczki i deadenylacji. Endonukleaza uczestnicz¹ca w tym procesie nie zosta³a jeszcze zidentyfikowana [15].

306 K. D. RACZYÑSKA, H. AUGUSTYNIAK 2. Proces NMD w komórkach dro d y Degradacja transkryptów dro d owych z przedwczesnym kodonem stop przebiega inaczej ni u ssaków i chocia wymaga równie obecnoœci czynników UPF1-3, nie zale y od splicingu. Pierwsza runda translacji przebiega w cytoplazmie, a proces NMD jest najczêœciej niezale ny od deadenylacji. Degradacja rozpoczyna siê od usuniêcia czapeczki przez enzymy Dcp1p/Dcp2p z udzia³em bia³ek Lsm1-7, a nastêpnie mrna, który wci¹ ma nienaruszony ogon polia, jest trawiony w kierunku 5 3 przez egzonukleazê Xrn1p (ryc. 3B) [19]. T¹ sam¹ drog¹ usuwane s¹ transkrypty z wyd³u onym rejonem 3 UTR, który powsta³ na skutek mutacji w miejscach poliadenylacji [62]. Alternatywna droga degradacji transkryptów z PTC przebiega niezale nie od usuniêcia czapeczki w kierunku 3 5 z udzia³em egzosomu [59]. Degradacjê aktywuje oddzia³ywanie N-koñcowej domeny bia³ka Ski7p z czynnikiem UPF1; wymagany jest równie czynnik UPF2 [72]. Podobnie jak podczas generalnej degradacji mrna, droga ta rozpoczyna siê czêœciow¹ deadenylacj¹ (do ogona d³ugoœci 7 20 adenin) [59] (ryc. 3B). Zarówno w komórkach dro d y, jak i ssaków problemem s¹ równie mrna, których 3 -koniec znajduje siê w obrêbie sekwencji koduj¹cej na skutek wystêpowania przedwczesnych sygna³ów endonukleolitycznego ciêcia i poliadenylacji [13]. Transkrypty te s¹ pozbawione kodonu stop i mog¹ prowadziæ nie tylko do syntezy wadliwego bia³ka, ale równie unieruchamiaj¹ rybosomy, gdy nie s¹ rozpoznawane przez czynniki terminacji RF. Degradacja transkryptów pozbawionych kodonu stop zosta³a dobrze poznana w komórkach dro d y. Proces NSD nie jest zwi¹zany z procesem NMD i nie wymaga udzia³u czynnika UPF1 ani deadenylacji, pomimo e równie zale y od translacji. Sekwencja wadliwego mrna jest odczytywana do koñca 3, a nastêpnie utyka na rybosomie (ryc. 3C). Czêœæ takich transkryptów jest rozpoznawana przez C-koñcow¹ domenê bia³ka Ski7p, która wykazuje homologiê z czynnikiem terminacji erf3. Ski7p wchodzi na wolne miejsce A na rybosomie i inicjuje degradacjê wadliwego transkryptu, wi¹ ¹c domen¹ aminow¹ cytoplazmatyczny egzosom. Degradacja przebiega w kierunku 3 5 i nie zale y od usuniêcia czapeczki [13]. Taki egzosom wykazuje równie w³aœciwoœci deadenylazy, gdy degradacja rozpoczyna siê bez uprzedniego usuniêcia ogona polia [31]. Degradacja nonsensownych transkryptów mo e te przebiegaæ w kierunku 5 3 z udzia³em egzonukleazy Xrn1p [34]. Podobnie degradowane s¹ transkrypty ze skróconym rejonem 3 UTR [34]. Z uwagi na obecnoœæ homologów bia³ek Ski w ludzkich komórkach sugeruje siê, e mechanizm degradacji transkryptów pozbawionych kodonów stop jest tam podobny [31]. 3. Proces NMD w komórkach roœlinnych W odró nieniu od ssaków i dro d y, proces NMD u roœlin nie jest jeszcze do koñca poznany. Wiadomo, e roœlinne transkrypty z przedwczesnym kodonem stop s¹ degradowane w procesie NMD w cytoplazmie. Jak wspomniano, potwierdzono w nim udzia³ jedynie bia³ek UPF1 i UPF3 [3, 32]. Wiadomo równie, e degradacji na drodze NMD podlegaæ mog¹ zarówno transkrypty po splicingu, jak i niezawieraj¹ce intronów. Co wiêcej, okaza³o siê, e transkrypty z PTC, które uleg³y czêœciowemu splicingowi, nie s¹ degradowane, a degradacja transkryptu genu waxy ry u jest zale na od wyciêcia intronu po³o onego powy ej

DEGRADACJA NIEPRAWID OWYCH TRANSKRYPTÓW 307 RYCINA 3. Drogi degradacji transkryptów w komórkach dro d y: A degradacja naturalnych transkryptów, B degradacja mrna z przedwczesnym kodonem stop, C degradacja transkryptów bez kodonu stop. Trójk¹t wskazuje kodon start. Kierunek ruchu rybosomów pokazano kropkowan¹ strza³k¹. G³ówne drogi degradacji wskazuj¹ grubsze strza³ki. Wyjaœnienia skrótów podano w opisie do ryciny 1

308 K. D. RACZYÑSKA, H. AUGUSTYNIAK PTC [36]. Sugeruje siê wiêc, e splicing nie jest procesem bezpoœrednio wywo³uj¹cym NMD, ale jest niezbêdny do transportu mrna z j¹dra do cytoplazmy [36]. UDZIA NMD W INNYCH PROCESACH W procesie NMD mog¹ byæ degradowane mrna maj¹ce dodatkow¹ otwart¹ ramkê odczytu z kodonem stop w rejonie 5 UTR, tak e mrna, które maj¹ introny w obrêbie rejonu 3 UTR, niektóre mrna bia³ek wi¹ ¹cych selen, oko³o jedna trzecia produktów alternatywnego splicingu, który generuje przedwczesny kodon stop, oraz transkrypty transpozonów, retrowirusów i pseudogenów [25, 28, 50, 56, 60, 61]. Okaza³o siê równie, e alternatywny splicing mo e s³u yæ do celowego wytworzenia niestabilnych transkryptów. W procesie okreœlanym jako RUST (ang. Regulated Unproductive Splicing and Translation) nadmiar danego bia³ka indukuje splicing w³asnego pre-mrna w kierunku wytworzenia izoform z PTC, które nastêpnie zostaj¹ zdegradowane w procesie NMD. Taka regulacja na etapie potranskrypcyjnym mo e zapewniaæ kontrolê w sytuacji, kiedy na przyk³ad nie mog¹ jej regulowaæ czynniki transkrypcyjne [49, 50, 64]. Transkrypty, które podlegaj¹ kontroli w procesie NMD, s¹ zwi¹zane z ró nymi szlakami metabolicznymi. Proces NMD zachodzi na przyk³ad podczas syntezy receptorów komórek T i immunoglobulin oraz zapobiega pewnym chorobom genetycznym u ludzi. Okaza³o siê, e jedna trzecia tych chorób jest spowodowana powstaniem transkryptów z przedwczesnym kodonem stop. S¹ to, miêdzy innymi, dystrofia miêœniowa Duchenna oraz β-talasemia [26, 78]. Ciekawe, e zablokowanie degradacji w procesie NMD zmienia stabilnoœæ oko³o 10% transkryptomu w komórkach dro d y, Drosophila melanogaster i ludzi [25, 56, 67]. Liczba i ró norodnoœæ transkryptów oraz zachowawczoœæ tego procesu wœród badanych eukariotów œwiadczy o tym, e NMD nie powsta³ jedynie do degradacji wadliwych mrna, ale jest szeroko rozpowszechnionym mechanizmem potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów [28, 50]. Z³o onoœæ i istotê procesu NMD ilustruje odpowiedÿ komórki na jego dysfunkcjê. Wykazano eksperymentalnie, e w komórkach Drosophila proces NMD jest niezbêdny podczas podzia³ów komórkowych. Mutanty pozbawione czynników UPF1 lub UPF2 zatrzymuj¹ siê w fazie G 2 /M cyklu komórkowego [67]. Brak UPF1 jest tak e letalny dla zarodków mysich i ludzkich linii komórkowych [5, 55]. Z kolei, w S. cerevisiae zablokowanie procesu NMD powoduje tylko niewielki defekt oddechowy, a u C. elegans zmiany morfologiczne narz¹dów p³ciowych [66]. Niezbêdnoœæ procesu NMD dla ywotnoœci jedynie wy szych eukariotów mo e wynikaæ z faktu, i podstawowe geny regulowane w procesie NMD nie s¹ zachowawcze w ró nych gatunkach, co potwierdzi³y badania z u yciem mikromacierzy [25, 56, 67]. Na przyk³ad, wiêkszoœæ mrna z PTC u Drosophila nie ma ortologów u dro d y i cz³owieka regulowanych w ten sam sposób [67]. Byæ mo e wiêc proces NMD reguluje ekspresjê genów istotnych dla myszy i cz³owieka, a mniej istotnych, na przyk³ad, dla dro d y czy nicieni. U roœlin proces NMD jest zaanga owany w regulacjê genów niezbêdnych do ich funkcjonowania i rozwoju. Mutanty UPF1 i UPF3 charakteryzuj¹

DEGRADACJA NIEPRAWID OWYCH TRANSKRYPTÓW 309 siê zaburzeniami w budowie organów wegetatywnych i kwiatowych, wykazuj¹ opóÿnione kwitnienie, a nawet brak ywotnoœci nasion [3, 82]. Okaza³o siê, e czynniki NMD mog¹ byæ tak e zaanga owane w inne ni NMD procesy. Stwierdzono, e u ssaków czynnik UPF1 bierze udzia³ w regulacji cyklu komórkowego oraz replikacji i naprawie DNA. Œmieræ komórek ludzkich w odpowiedzi na brak bia³ka UPF1 mo e wiêc wi¹zaæ siê z zapobieganiem powstawania niestabilnej informacji genetycznej. Takiej funkcji UPF1 nie stwierdza siê natomiast u ni szych ewolucyjnie dro d y i nicieni [6]. Równie inne bia³ka uczestnicz¹ce w procesie degradacji NMD transkryptów mog¹ byæ zaanga owane w utrzymanie stabilnoœci DNA. Na przyk³ad bia³ko SMG1 wraz z bia³kiem UPF1 bierze udzia³ w naprawie ludzkiego DNA, a SMG6 uczestniczy w utrzymaniu w³aœciwej d³ugoœci telomerów [5]. W komórkach ludzkich bia³ko UPF1 uczestniczy równie w zale nej od replikacji degradacji histonowych mrna [44]. Ponadto, bia³ko UPF1 oprócz zaanga owania w degradacjê w procesie NMD jest tak e wymagane u ssaków do degradacji transkryptów drog¹ SMD [46]. Stwierdzono tak e, e czynniki UPF1, UPF2 i UPF3, podobnie jak sk³adniki kompleksu EJC, indukuj¹ wi¹zanie mrna z polisomami i przyspieszaj¹ inicjacjê translacji w komórkach ssaków [63, 79]. Natomiast bia³ka SMG2, SMG5 i SMG6 s¹ wymagane w procesie wyciszania genów u C. elegans. Sugeruje siê, e bia³ka te uczestnicz¹ w amplifikacji i rozprzestrzenianiu sygna³u wyciszenia [12]. Podobn¹ rolê pe³ni w roœlinach homolog bia³ka SMG2 bia³ko UPF1 [3]. Brak zaanga owania w proces interferencji pozosta³ych czynników NMD œwiadczy jednak, e nie wystêpuj¹ istotne powi¹zania procesu NMD i RNAi. Jak wspomniano, proces degradacji NMD dotyczy równie pseudogenów, które naby³y w toku ewolucji PTC [25, 56, 60]. Jest to o tyle istotne, e ich introny czêsto koduj¹ snorna lub mikrorna. W wyniku przebiegu procesu NMD transkrypty pseudogenów po splicingu ulegaj¹ degradacji, a sekwencje snorna i mikrorna mog¹ pe³niæ swoje funkcje [60]. Proces NMD uczestniczy te w regulacji homeostazy aminokwasowej komórek ludzkich. Niedobór aminokwasów hamuje translacjê, w tym równie proces NMD, a to z kolei pozwala na wydajniejsz¹ ekspresjê genów uczestnicz¹cych w metabolizmie aminokwasów lub zwi¹zanych z nimi czynników transkrypcyjnych. W normalnych warunkach transkrypty te pozostaj¹ na niskim poziomie lub s¹ degradowane w procesie NMD [56]. Regulacja homeostazy aminokwasowej przez NMD wystêpuje te prawdopodobnie u dro d y oraz w komórkach Drosophila [25, 67]. MECHANIZM DEGRADACJI TRANSKRYPTÓW BEZ KODONU STOP W KOMÓRKACH BAKTERII Komórki bakteryjne w celu degradacji transkryptów pozbawionych kodonów stop wytworzy³y cz¹steczkê tmrna (ang. transfer-messanger RNA). Cz¹steczkê tê, zwan¹ równie 10Sa lub SsrA RNA, zidentyfikowano po raz pierwszy w komórkach E. coli. tmrna ma d³ugoœæ œrednio 350 nukleotydów (od 250 do 425 nukleotydów) i ³¹czy w sobie funkcje zarówno trna, jak i mrna. Dojrzewanie 5 i 3 koñców tmrna

310 K. D. RACZYÑSKA, H. AUGUSTYNIAK przypomina dojrzewanie trna. Cz¹steczka tmrna ulega pofa³dowaniu w strukturê o kszta³cie litery L, która zawiera ramiê akceptorowe CCA rozpoznawane przez syntetazê alaninow¹. Ten fragment tmrna zwany jest domen¹ TLD (ang. trna- Like Domain). Sekwencja CCA jest kodowana u wiêkszoœci bakterii i tylko u niektórych dodawana przez transferazê nukleotydylow¹. W obrêbie sekwencji tmrna mo na równie zidentyfikowaæ otwart¹ ramkê odczytu, zwan¹ domen¹ MLD (ang. mrna- Like Domain). Sk³ada siê ona z 48 do 126 nukleotydów i zawiera od 9 do 28 kodonów, w tym kodony stop [42]. W strukturze przestrzennej tmrna E. coli mo na wyró niæ wystêpowanie 4 pseudowêz³ów i 12 helis. Liczba wêz³ów i helis w tmrna ró nych gatunków mo e byæ zmienna [8, 83]. Funkcj¹ tmrna jest rozpoznanie wadliwego transkryptu na rybosomie, dokoñczenie syntetyzowanego bia³ka i uaktywnienie rybosomów poprzez uwolnienie, a nastêpnie naznaczenie do degradacji wadliwego mrna i bia³ka. Przed przy³¹czeniem do rybosomów uwiêzionych przez pozbawiony kodonu stop transkrypt, cz¹steczka tmrna podlega aminoacylacji na 3 koñcu przez syntetazê aminoacylo-trna, która przy³¹cza alaninê. Nastêpnie, Ala-tmRNA w po³¹czeniu z czynnikiem elongacyjnym EF-Tu i GTP wi¹ e siê do rybosomów. W zwi¹zaniu tmrna na rybosomie uczestniczy równie bia³ko SmpB, które ju wczeœniej oddzia³uje z rybosomami [30, 38, 42]. Bia³ko to ma zdolnoœæ wi¹zania zarówno tmrna, ca³ych rybosomów, jak i poszczególnych podjednostek rybosomalnych. Wczesny etap tej translacji wymaga obecnoœci 2 cz¹steczek SmpB na rybosomie; tylko taki kompleks ma zdolnoœæ wi¹zania tmrna. W póÿniejszym etapie bia³ka te ulegaj¹ reorganizacji [23, 24, 38]. C-koñcowy fragment bia³ka SmpB zawiera wysoce konserwatywne reszty istotne w procesie przeniesienia wadliwego polipeptydu na alanylo-tmrna i odczytanie sekwencji koduj¹cej tmrna [71]. Bia³ko to mo e pe³niæ rolê stabilizatora kompleksu peptydylotmrna-smpb-rybosom, zastêpuj¹c oddzia³ywanie struktury kodon-antykodon [38, 57, 71]. W oddzia³ywaniu tmrna z rybosomem uczestniczy równie rybosomalne bia³ko S1. Z uwagi na to, e S1 ma zdolnoœæ rozplatania helis RNA, przypuszcza siê, e umo liwia ono zwi¹zanie tmrna z rybosomem poprzez rozplecenie helis RNA i wyeksponowanie odzyskanego kodonu. Chocia bia³ko to u wiêkszoœci bakterii ma budowê wysoce zachowawcz¹, to nie wystêpuje u wszystkich tych bakterii, które zawieraj¹ aktywn¹ cz¹steczkê tmrna; nie jest wiêc niezbêdne dla jej aktywnoœci [43, 54, 70]. Translacja uszkodzonego mrna mo e przebiegaæ a do ostatniego nukleotydu, a sygna³em rozpoznawanym przez tmrna jest puste miejsce A na rybosomie (ryc. 4) [80]. Poniewa po zwi¹zaniu tmrna rybosomy katalizuj¹ reakcjê przeniesienia niepe³nego polipeptydu na alaninê w tmrna, dojrza³e bia³ko zawsze zawiera niekodowan¹ alaninê, która rozgranicza peptyd kodowany przez wadliwy mrna i tmrna. Przeniesienie trna z miejsca P na miejsce E i jego uwolnienie jest skorelowane z oddysocjowaniem wadliwego mrna, który jest nastêpnie degradowany przez 3 5 RNAzê R [39, 43, 81]. Domena trna z tmrna jest przenoszona na miejsce P, a miejsce A zajmuje pierwszy kodon otwartej ramki odczytu domeny MLD, na bazie której przebiega nastêpnie synteza bia³ka a do osi¹gniêcia kodonu stop [17, 39]. Ca³y ten proces nazwano trans-translacj¹.

RYCINA 4. Mechanizm dzia³ania tmrna: I. Rybosom unieruchomiony przez mrna bez kodonu stop i niedokoñczone bia³ko, II. Ala-tmRNA z kompleksem bia³ek zajmuje miejsce A na rybosomie, III. Translokacja niedokoñczonego bia³ka na tmrna, IV. Trans-translacja na bazie sekwencji koduj¹cej tmrna (wed³ug http:// psyche.uthct.edu/dbs/tmrdb/strucfuncttmrna.html, zmodyfikowano) DEGRADACJA NIEPRAWID OWYCH TRANSKRYPTÓW 311

312 K. D. RACZYÑSKA, H. AUGUSTYNIAK W naturalnie wystêpuj¹cych tmrna w pozycji 86 zawsze wystêpuje adenina, a w pozycji 90, która stanowi pierwszy nukleotyd kodonu odzyskanego guanina [80]. Kodon odzyskany to w wiêkszoœci przypadków alanina. Zamiana kodonu odzyskanego z GCA (Ala) na inny powoduje jednak przy³¹czenie innego aminokwasu do uszkodzonego bia³ka, co wskazuje, e nie ma inicjatorowego trna, jak ma to miejsce w przypadku rozpoczêcia typowej translacji [80]. Istotn¹ funkcjê w rozpoznaniu kodonu odzyskanego pe³ni sekwencja po³o ona powy ej U(85)A(86)R(87) (gdzie R oznacza purynê), zw³aszcza adenina w pozycji 86. Eksperymentalnie wykazano, e zamiana adeniny w tej pozycji na inn¹ zasadê wp³ywa na dezaktywacjê cz¹steczki tmrna [80]. Kiedy zamieniono kodon odzyskany na kodon stop, aden aminokwas, nawet alanina, nie by³ do³¹czony do uszkodzonego peptydu. Gdy natomiast drugi kodon zamieniono na kodon stop, wówczas do bia³ka by³y do³¹czone dwa aminokwasy alanina oraz ten z kodonu odzyskanego. Tym samym wykazano, e takie rozpoznanie odbywa siê na bardzo wczesnym etapie trans-translacji, a kodon odzyskany jest odczytywany, zanim zwi¹ e siê z trna; mo e to nawet poprzedzaæ zwi¹zanie z rybosomami [18, 37, 80]. Kodon stop wystêpuje w wiêkszoœci tmrna pojedynczo, czasem jednak wystêpuj¹ dwa, a nawet trzy powtórzone po sobie kodony stop [8]. Po rozpoznaniu kodonu stop czynniki uwalniaj¹ce RF wi¹ ¹ siê do miejsca A, bia³ko oddysocjowuje, a rybosomy powracaj¹ do stanu aktywnego. Zawarty w nieprawid³owym bia³ku peptyd, œrednio d³ugoœci 11 aminokwasów, ma C-koniec z przewag¹ aminokwasów hydrofobowych i aromatycznych. Taka sekwencja rozpoznawana jest jako sygna³ kieruj¹cy wadliwe bia³ko do degradacji przez cytoplazmatyczne i periplazmatyczne proteazy zale ne od ATP [17, 42, 80]. Wykazano, e w przypadku translacji na polisomach aktywacja tmrna nastêpuje ju na pierwszym rybosomie po rozpoznaniu braku kodonu stop [39]. Dotychczas zidentyfikowano oko³o 560 sekwencji tmrna w oko³o 480 gatunkach bakteryjnych [83]. Nawet tak ma³a bakteria jak Mycoplasma genitalium, która ma mniej ni 500 genów, ma gen SsrA, co œwiadczy o istotnej roli tej cz¹steczki. Niekiedy struktura tmrna powstaje z dwuczêœciowego transkryptu, jak u α-proteobakterii Caulobacter crescentus. Wynika to st¹d, e czêœæ transkryptu tmrna zostaje wyciêta, a dwa powsta³e fragmenty tworz¹ strukturê funkcjonalnej cz¹steczki tmrna [45]. tmrna zidentyfikowano równie w organellach komórkowych. Najmniejszy tmrna wystêpuje w mitochondriach Reclinomonas americana i ma d³ugoœæ tylko 189 pz. Zaanga owanie tmrna w degradacjê w mitochondriach nie zosta³o jeszcze potwierdzone doœwiadczalnie [40]. Z kolei chloroplastowe tmrna pozbawione s¹ innej ni w mitochondriach czêœci. W tym przypadku brak jest równie dowodów na ich zaanga owanie w degradacjê [21]. Ostatnio doniesiono o zidentyfikowaniu w plastydach dwóch roœlin bia³ka SmpB, zwi¹zanego z aktywnoœci¹ tmrna [41]. Cz¹steczek tmrna nie zidentyfikowano do tej pory u archeobakterii ani w genomie j¹drowym eukariotów, gdzie wytworzy³y siê inne mechanizmy degradacji nieprawid³owych mrna [83]. Zaanga owanie tmrna w translacjê wykazano równie w innych przypadkach: na przyk³ad gdy rybosomy s¹ uwiêzione w wyniku pojawiania siê skupieñ rzadkich kodonów argininowych AGA lub stabilnych struktur drugorzêdowych w obrêbie sekwencji mrna [69]. W dwóch przypadkach aktywnoœæ tmrna stwierdzono podczas odczytania kodonu stop w prawid³owych mrna [68] lub gdy rybosomy, dziêki supresorowym

DEGRADACJA NIEPRAWID OWYCH TRANSKRYPTÓW 313 trna, odczytywa³y mrna bez zatrzymania na kanonicznym kodonie stop syntetyzuj¹c wyd³u ony peptyd [17, 74]. PODSUMOWANIE Transkrypty pozbawione kodonu stop lub maj¹ce przedwczesny kodon stop mog¹ prowadziæ do syntezy niefunkcjonalnych, w tym równie toksycznych bia³ek. Procesy zapobiegaj¹ce szkodliwym skutkom wynikaj¹cym z ich wystêpowania s¹ wiêc istotne dla w³aœciwego funkcjonowania komórek. Œwiadczy o tym ich rozpowszechnienie oraz szeroka gama genów, których produkty reguluj¹. W komórkach eukariotycznych nieprawid³owe transkrypty s¹ degradowane w procesie NMD; jego przebieg jest ró ny u ró nych organizmów. Na przyk³ad, NMD w komórkach ssaków, w odró nieniu od NMD w komórkach D. melanogaster, roœlin czy dro d y, zale y od splicingu. Z kolei u C. elegans degradacja poprzez NMD rozpoczyna siê od endonukleolitycznego przeciêcia transkryptu. Ssaki wytworzy³y ponadto dodatkow¹ drogê degradacji SMD, a w komórkach dro d y za degradacjê transkryptów pozbawionych kodonu stop odpowiedzialny jest inny proces. Bia³ka uczestnicz¹ce w procesie NMD nie s¹ zachowawcze, czêœæ z nich uczestniczy równie w innych, istotnych procesach komórkowych. Poznanie roli okreœlonych bia³ek w tych procesach wci¹ wymaga dalszych badañ. Komórki prokariotyczne oraz organelle komórkowe znalaz³y inny sposób na degradacjê nieprawid³owych transkryptów cz¹steczkê tmrna. tmrna naznacza do degradacji zarówno mrna bez kodonu stop, jak i niew³aœciwe bia³ko oraz przywraca aktywnoœæ rybosomom. LITERATURA [1] AMRANI N, GANESAN R, KERVESTIN S, MANGUS DA, GHOSH S, JACOBSON A. A faux 3'-UTR promotes aberrant termination and triggers nonsense-mediated mrna decay. Nature 2004; 432: 112 118. [2] ANDERSON JS, PARKER RP. The 3' to 5' degradation of yeast mrnas is a general mechanism for mrna turnover that requires the SKI2 DEVH box protein and 3' to 5' exonucleases of the exosome complex. EMBO J 1998; 17: 1497 1506. [3] ARCIGA-REYES L, WOOTTON L, KIEFFER M, DAVIES B. UPF1 is required for nonsense-mediated mrna decay (NMD) and RNAi in Arabidopsis. Plant J 2006; 47: 480 489. [4] ARRAIANO CM, MAQUAT LE. Post-transcriptional control of gene expression: effectors of mrna decay. Mol Microbiol 2003; 49: 267 276. [5] AZZALIN CM, LINGNER J. The Double Life of UPF1 in RNA and DNA Stability Pathways. Cell Cycle 2006b; 5: 1496 1498. [6] AZZALIN CM, LINGNER J. The human RNA surveillance factor UPF1 is required for S phase progression and genome stability. Curr Biol 2006a; 16: 433 439. [7] BAKER KE, PARKER R. Nonsense-mediated mrna decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol 2004; 16: 293 299. [8] BURKS J, ZWIEB C, MULLER F, WOWER I, WOWER J. Comparative 3-D modeling of tmrna. BMC Mol Biol 2005; 6: 14. [9] CHIU SY, LEJEUNE F, RANGANATHAN AC, MAQUAT LE. The pioneer translation initiation complex is functionally distinct from but structurally overlaps with the steady-state translation initiation complex. Genes Dev 2004; 18: 745 754. [10] CONTI E, IZAURRALDE E. Nonsense-mediated mrna decay: molecular insights and mechanistic variations across species. Curr Opin Cell Biol 2005; 17: 316 325. [11] CULBERTSON MR, LEEDS PF. Looking at mrna decay pathways through the window of molecular evolution. Curr Opin Genet Dev 2003; 13: 207 214.

314 K. D. RACZYÑSKA, H. AUGUSTYNIAK [12] DOMEIER ME, MORSE DP, KNIGHT SW, PORTEREIKO M, BASS BL, MANGO SE. A link between RNA interference and nonsense-mediated decay in Caenorhabditis elegans. Science 2000; 289: 1928 1931. [13] FRISCHMEYER PA, VAN HOOF A, O DONNELL K, GUERRERIO AL, PARKER R, DIETZ HC. An mrna surveillance mechanism that eliminates transcripts lacking termination codons. Science 2002; 295: 2258 2261. [14] FUKUHARA N, EBERT J, UNTERHOLZNER L, LINDNER D, IZAURRALDE E, CONTI E. SMG7 is a 14-3-3-like adaptor in the nonsense-mediated mrna decay pathway. Mol Cell 2005; 17: 537 547. [15] GATFIELD D, IZAURRALDE E. Nonsense-mediated messenger RNA decay is initiated by endonucleolytic cleavage in Drosophila. Nature 2004; 429: 575 578. [16] GATFIELD D, UNTERHOLZNER L, CICCARELLI FD, BORK P, IZAURRALDE E. Nonsense-mediated mrna decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. EMBO J 2003; 22: 3960 3970. [17] GILLET R, FELDEN B. Emerging views on tmrna-mediated protein tagging and ribosome rescue. Mol Microbiol 2001a; 42: 879 885. [18] GILLET R, FELDEN B. Transfer RNA(Ala) recognizes transfer-messenger RNA with specificity; a functional complex prior to entering the ribosome? EMBO J 2001b; 20: 2966 2976. [19] GONZALEZ CI, BHATTACHARYA A, WANG W, PELTZ SW. Nonsense-mediated mrna decay in Saccharomyces cerevisiae. Gene 2001; 274: 15 25. [20] GONZALEZ CI, RUIZ-ECHEVARRIA MJ, VASUDEVAN S, HENRY MF, PELTZ SW. The yeast hnrnplike protein Hrp1/Nab4 marks a transcript for nonsense-mediated mrna decay. Mol Cell 2000; 5: 489 499. [21] GUENEAU DE NOVOA P, WILLIAMS KP. The tmrna website: reductive evolution of tmrna in plastids and other endosymbionts. Nucleic Acids Res 2004; 32: D104 108. [22] GUTIERREZ RA, MACINTOSH GC, GREEN PJ. Current perspectives on mrna stability in plants: multiple levels and mechanisms of control. Trends Plant Sci 1999; 4: 429 438. [23] HALLIER M, DESREAC J, FELDEN B. Small protein B interacts with the large and the small subunits of a stalled ribosome during trans-translation. Nucleic Acids Res 2006; 34: 1935 1943. [24] HALLIER M, IVANOVA N, RAMETTI A, PAVLOV M, EHRENBERG M, FELDEN B. Pre-binding of small protein B to a stalled ribosome triggers trans-translation. J Biol Chem 2004; 279: 25978 25985. [25] HE F, LI X, SPATRICK P, CASILLO R, DONG S, JACOBSON A. Genome-wide analysis of mrnas regulated by the nonsense-mediated and 5' to 3' mrna decay pathways in yeast. Mol Cell 2003; 12: 1439 1452. [26] HILLEREN P, PARKER R. Mechanisms of mrna surveillance in eukaryotes. Annu Rev Genet 1999b; 33: 229 260. [27] HILLEREN P, PARKER R. mrna surveillance in eukaryotes: kinetic proofreading of proper translation termination as assessed by mrnp domain organization? RNA 1999a; 5: 711 719. [28] HILLMAN RT, GREEN RE, BRENNER SE. An unappreciated role for RNA surveillance. Genome Biol 2004; 5: R8. [29] HOLBROOK JA, NEU-YILIK G, GEHRING NH, KULOZIK AE, HENTZE MW. Internal ribosome entry sequence-mediated translation initiation triggers nonsense-mediated decay. EMBO Rep 2006; 7: 722 726. [30] HONG SJ, TRAN QA, KEILER KC. Cell cycle-regulated degradation of tmrna is controlled by RNase R and SmpB. Mol Microbiol 2005; 57: 565 575. [31] Van HOOF A, FRISCHMEYER PA, DIETZ HC, PARKER R. Exosome-mediated recognition and degradation of mrnas lacking a termination codon. Science 2002; 295: 2262 2264. [32] HORI K, WATANABE Y. UPF3 suppresses aberrant spliced mrna in Arabidopsis. Plant J 2005; 43: 530 540. [33] HOSODA N, KIM YK, LEJEUNE F, MAQUAT LE. CBP80 promotes interaction of Upf1 with Upf2 during nonsense-mediated mrna decay in mammalian cells. Nat Struct Mol Biol 2005; 12: 893 901. [34] INADA T, AIBA H. Translation of aberrant mrnas lacking a termination codon or with a shortened 3'-UTR is repressed after initiation in yeast. EMBO J 2005; 24: 1584 1595. [35] ISHIGAKI Y, LI X, SERIN G, MAQUAT LE. Evidence for a pioneer round of mrna translation: mrnas subject to nonsense-mediated decay in mammalian cells are bound by CBP80 and CBP20. Cell 2001; 106: 607 617.

DEGRADACJA NIEPRAWID OWYCH TRANSKRYPTÓW 315 [36] ISSHIKI M, YAMAMOTO Y, SATOH H, SHIMAMOTO K. Nonsense-mediated decay of mutant waxy mrna in rice. Plant Physiol 2001; 125: 1388 1395. [37] IVANOV PV, ZVEREVA MI, SHPANCHENKO OV, DONTSOVA OA, BOGDANOV AA, AGLYAMOVA GV, LIM VI, TERAOKA Y, NIERHAUS KH. How does tmrna move through the ribosome? FEBS Lett 2002; 514: 55 59. [38] IVANOVA N, PAVLOV MY, BOUAKAZ E, EHRENBERG M, SCHIAVONE LH. Mapping the interaction of SmpB with ribosomes by footprinting of ribosomal RNA. Nucleic Acids Res 2005a; 33: 3529 3539. [39] IVANOVA N, PAVLOV MY, EHRENBERG M. tmrna-induced release of messenger RNA from stalled ribosomes. J Mol Biol 2005b; 350: 897 905. [40] JACOB Y, SEIF E, PAQUET PO, LANG BF. Loss of the mrna-like region in mitochondrial tmrnas of jakobids. RNA 2004; 10: 605 614. [41] JACOB Y, SHARKADY SM, BHARDWAJ K, SANDA A, WILLIAMS KP. Function of the SmpB tail in transfermessenger RNA translation revealed by a nucleus-encoded form. J Biol Chem 2005; 280: 5503 5509. [42] KARZAI AW, ROCHE ED, SAUER RT. The SsrA-SmpB system for protein tagging, directed degradation and ribosome rescue. Nat Struct Biol 2000; 7: 449 455. [43] KARZAI AW, SAUER RT. Protein factors associated with the SsrA:SmpB tagging and ribosome rescue complex. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 3040 3044. [44] KAYGUN H, MARZLUFF WF. Regulated degradation of replication-dependent histone mrnas requires both ATR and Upf1. Nat Struct Mol Biol 2005; 12: 794 800. [45] KEILER KC, SHAPIRO L, WILLIAMS KP. tmrnas that encode proteolysis-inducing tags are found in all known bacterial genomes: A two-piece tmrna functions in Caulobacter. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 7778 7783. [46] KIM YK, FURIC L, DESGROSEILLERS L, MAQUAT LE. Mammalian Staufen1 recruits Upf1 to specific mrna 3`UTRs so as to elicit mrna decay. Cell 2005; 120: 195 208. [47] LEJEUNE F, ISHIGAKI Y, LI X, MAQUAT LE. The exon junction complex is detected on CBP80-bound but not eif4e-bound mrna in mammalian cells: dynamics of mrnp remodeling. EMBO J 2002; 21: 3536 3545. [48] LEJEUNE F, LI X, MAQUAT LE. Nonsense-mediated mrna decay in mammalian cells involves decapping, deadenylating, and exonucleolytic activities. Mol Cell 2003; 12: 675 687. [49] LEJEUNE F, MAQUAT LE. Mechanistic links between nonsense-mediated mrna decay and pre-mrna splicing in mammalian cells. Curr Opin Cell Biol 2005; 17: 309 315. [50] LEWIS BP, GREEN RE, BRENNER SE. Evidence for the widespread coupling of alternative splicing and nonsense-mediated mrna decay in humans. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 189 192. [51] LYKKE-ANDERSEN J. Identification of a human decapping complex associated with hupf proteins in nonsense-mediated decay. Mol Cell Biol 2002; 22: 8114 8121. [52] MANGO SE. Stop making nonsense: the C. elegans smg genes. Trends Genet 2001; 17: 646 653. [53] MAQUAT LE. Nonsense-mediated mrna decay in mammals. J Cell Sci 2005; 118: 1773 1776. [54] MCGINNESS KE, SAUER RT. Ribosomal protein S1 binds mrna and tmrna similarly but plays distinct roles in translation of these molecules. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 13454 13459. [55] MEDGHALCHI SM, FRISCHMEYER PA, MENDELL JT, KELLY AG, LAWLER AM, DIETZ HC. Rent1, a trans-effector of nonsense-mediated mrna decay, is essential for mammalian embryonic viability. Hum Mol Genet 2001; 10: 99 105. [56] MENDELL JT, SHARIFI NA, MEYERS JL, MARTINEZ-MURILLO F, DIETZ HC. Nonsense surveillance regulates expression of diverse classes of mammalian transcripts and mutes genomic noise. Nat Genet 2004; 36: 1073 1078. [57] METZINGER L, HALLIER M, FELDEN B. Independent binding sites of small protein B onto transfermessenger RNA during trans-translation. Nucleic Acids Res 2005; 33: 2384 2394. [58] MEYER S, TEMME C, WAHLE E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Crit Rev Biochem Mol Biol 2004; 39: 197 216. [59] MITCHELL P, TOLLERVEY D. An NMD pathway in yeast involving accelerated deadenylation and exosome-mediated 3' >5' degradation. Mol Cell 2003; 11: 1405 1413. [60] MITROVICH QM, ANDERSON P. mrna surveillance of expressed pseudogenes in C. elegans. Curr Biol 2005; 15: 963 967. [61] MORIARTY PM, REDDY CC, MAQUAT LE. Selenium deficiency reduces the abundance of mrna for Se-dependent glutathione peroxidase 1 by a UGA-dependent mechanism likely to be nonsense codonmediated decay of cytoplasmic mrna. Mol Cell Biol 1998; 18: 2932 2939.

316 K. D. RACZYÑSKA, H. AUGUSTYNIAK [62] MUHLRAD D, PARKER R. Aberrant mrnas with extended 3' UTRs are substrates for rapid degradation by mrna surveillance. RNA 1999; 5: 1299 1307. [63] NOTT A, LE HIR H, MOORE MJ. Splicing enhances translation in mammalian cells: an additional function of the exon junction complex. Genes Dev 2004; 18: 210 222. [64] PAN Q, SALTZMAN AL, KIM YK, MISQUITTA C, SHAI O, MAQUAT LE, FREY BJ, BLENCOWE BJ. Quantitative microarray profiling provides evidence against widespread coupling of alternative splicing with nonsense-mediated mrna decay to control gene expression. Genes Dev 2006; 20: 153 158. [65] PARKER R, SONG H. The enzymes and control of eukaryotic mrna turnover. Nat Struct Mol Biol 2004; 11: 121 127. [66] PULAK R, ANDERSON P. mrna surveillance by the Caenorhabditis elegans smg genes. Genes Dev 1993; 7:1885 1897. [67] REHWINKEL J, LETUNIC I, RAES J, BORK P, IZAURRALDE E. Nonsense-mediated mrna decay factors act in concert to regulate common mrna targets. RNA 2005; 11: 1530 1544. [68] ROCHE ED, SAUER RT. Identification of endogenous SsrA-tagged proteins reveals tagging at positions corresponding to stop codons. J Biol Chem 2001; 276: 28509 28515. [69] ROCHE ED, SAUER RT. SsrA-mediated peptide tagging caused by rare codons and trna scarcity. EMBO J 1999; 18: 4579 4589. [70] SAGUY M, GILLET R, METZINGER L, FELDEN B. tmrna and associated ligands: a puzzling relationship. Biochimie 2005; 87: 897 903. [71] SUNDERMEIER TR, DULEBOHN DP, CHO HJ, KARZAI AW. A previously uncharacterized role for small protein B (SmpB) in transfer messenger RNA-mediated trans-translation. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: 2316 2321. [72] TAKAHASHI S, ARAKI Y, SAKUNO T, KATADA T. Interaction between Ski7p and Upf1p is required for nonsense-mediated 3'-to-5' mrna decay in yeast. EMBO J 2003; 22: 3951 3959. [73] THARUN S, HE W, MAYES AE, LENNERTZ P, BEGGS JD, PARKER R. Yeast Sm-like proteins function in mrna decapping and decay. Nature 2000; 404: 515 518. [74] UEDA K, YAMAMOTO Y, OGAWA K, ABO T, INOKUCHI H, AIBA H. Bacterial SsrA system plays a role in coping with unwanted translational readthrough caused by suppressor trnas. Genes Cells 2002; 7: 509 519. [75] UNTERHOLZNER L, IZAURRALDE E. SMG7 acts as a molecular link between mrna surveillance and mrna decay. Mol Cell 2004; 16: 587 596. [76] WAGNER E, LYKKE-ANDERSEN J. mrna surveillance: the perfect persist. J Cell Sci 2002; 115: 3033 3038. [77] WANG W, CAJIGAS IJ, PELTZ SW, WILKINSON MF, GONZALEZ CI. Role for Upf2p phosphorylation in Saccharomyces cerevisiae nonsense-mediated mrna decay. Mol Cell Biol 2006; 26: 3390 3400. [78] WEISCHENFELDT J, LYKKE-ANDERSEN J, PORSE B. Messenger RNA surveillance: neutralizing natural nonsense. Curr Biol 2005; 15: R559 562. [79] WILKINSON MF. A new function for nonsense-mediated mrna-decay factors. Trends Genet 2005; 21: 143 148. [80] WILLIAMS KP, MARTINDALE KA, BARTEL DP. Resuming translation on tmrna: a unique mode of determining a reading frame. EMBO J 1999; 18: 5423 5433; [81] YAMAMOTO Y, SUNOHARA T, JOJIMA K, INADA T, AIBA H. SsrA-mediated trans-translation plays a role in mrna quality control by facilitating degradation of truncated mrnas. RNA 2003; 9: 408 418. [82] YOINE M, NISHII T, NAKAMURA K. Arabidopsis UPF1 RNA helicase for nonsense-mediated mrna decay is involved in seed size control and is essential for growth. Plant Cell Physiol 2006; 47: 572 580. [83] ZWIEB C, GORODKIN J, KNUDSEN B, BURKS J, WOWER J. tmrdb (tmrna database). Nucleic Acids Res 2003; 31: 446 447. Redaktor prowadz¹cy Maria Olszewska Otrzymano:13.12. 2006 r. Przyjêto: 21.02. 2007 r. 60-371 Poznañ, ul. Miêdzychodzka 5 E-mail: doracz@amu.edu.pl