Dr hab. Paweł Bednarek, prof. IChB PAN Instytut Chemii Bioorganicznej PAN ul. Noskowskiego 12/14 61-704 Poznań Ocena rozprawy doktorskiej mgr Justyny Kowalczyk Identyfikacja i charakterystyka nowego regulatora genu DOG1 u Arabidopsis thaliana oraz wpływu wyboru miejsca poliadenylacji mrna DOG1 na antysensowną transkrypcję w jego locus Ocena merytoryczna rozprawy Omawiana rozprawa doktorska skupia się na molekularnych mechanizmach kontroli stanu spoczynku nasion. Poszczególne gatunki roślin uzyskały na drodze ewolucji stan spoczynku nasion, który zazwyczaj zapewnia kiełkowanie w czasie optymalnym dla wzrostu danego gatunku. Stan spoczynku nasion jest nie tylko ważny dla przetrwania i rozprzestrzeniania się poszczególnych gatunków w warunkach naturalnych, ale jest również istotny z ekonomicznego punktu widzenia. Nasiona roślin uprawnych powinny charakteryzować się stosunkowo płytkim stanem spoczynku, który umożliwia wysiew nasion krótko po zbiorze zapewniając równocześnie ich zsynchronizowane kiełkowanie. Z drugiej jednak strony zbyt płytki stan spoczynku może prowadzić do tzw. porastania nasion (kiełkowanie nasion przed zbiorem), które czyni nasiona niezdatne do dalszego wykorzystania w produkcji żywności lub jako materiał siewny. Biorąc to pod uwagę tematyka pracy jest nie tylko ciekawa z punktu widzenia badań podstawowych, ale może również mieć wpływ na badania stosowane. Jako obiekt swoich badań Doktorantka wybrała gen DELAY OF GERMINATION 1 (DOG1), którego znaczenie dla kontroli stanu spoczynku nasion, jak również kwitnienia, u Arabidpospis thaliana zostało już wcześniej potwierdzone, głównie w badaniach prowadzonych przez promotora pomocniczego tej rozprawy doktorskiej dr Szymona Świeżewskiego. Jednak mechanizmy kontroli ekspresji DOG1 oraz sam funkcja kodowanego 1
prze ten gen białka nie zostały dokładnie poznane. Eksperymenty przeprowadzane w ramach omawianej pracy skupiły się na identyfikacji mechanizmów kontroli transkrypcji genu DOG1. W celu zidentyfikowania genów/białek, które mogą brać udział w tym procesie wykorzystano podejście genetyki klasycznej (forward genetic screen). Przeprowadzona w ramach omawianej pracy analiza zmutagenizowanej populacji linii Arabidopsis wyrażającej konstrukt pdog1-luc::dog1 doprowadziła do identyfikacji genu C-TERMINAL DOMAIN- PHOSPHATESE-LIKE 1 (CPL1) kodującego jedną z fosfataz C-końcowej domeny (CTD) DNA-zależnej RNA polimerazy II (RNA POLII) jako negatywnego regulatora ekspresji DOG1. Analizy serii allelicznych mutantów cpl1 wykazała, że charakteryzują się one zwiększonym poziomem transkryptu DOG1 oraz wydłużonym czasem spoczynku. Dodatkowo Autorka wykazała, że zwiększona ilość transkryptu DOG1 w mutantach cpl1 dotyczy tylko krótkiej formy poliadenylacyjnej shdog1, która według wyników wcześniejszych badań jest związana z fenotypem stanu spoczynku nasion, a nie długiej formy poliadenylacyjnej lgdog1. Wyniki eksperymentów, w których Autorka zatrzymywała transkrypcję za pomocą kordycepiny wykazały, że wzrost poziomu shdog1 w mutantach cpl1 nie wynika ze zwiększonej stabilności transkryptu, a raczej z częstszego wyboru bliższego miejsca poliadenylacji w tych liniach. W dalszej części pracy poprzez analizę transkrypcji wybranych genów Autorka wykazała, że CPL1 może kontrolować alternatywną poliadenylację genów innych niż DOG1. Co ciekawe, przeprowadzone analizy wykazały, że mutacja cpl1 w zależności od genu może promować wybór dłuższej lub krótszej formy poliadenylacyjnej. W dalszej części pracy Autorka wykazała, że mutanty cpl1 charakteryzują się dodatkowo zwiększonym poziomem antysensownego transkryptu asdog1. Wyniki analiz linii wyrażających konstrukty zawierające różne fragmenty regionu promotorowego i genu DOG1 w fuzji translacyjnej z genem kodującym lucyferazę zasugerowały, że aktywność promotora asdog1 jest kontrolowana przez alternatywną poliadenylację transkryptu sensownego. Na tej podstawie Autorka postuluje, że podwyższony poziom antysensownego transkryptu asdog1 w mutancie cpl1 jest konsekwencją rzadszej transkrypcji przez promotor antysensu. W celu potwierdzenia tej hipotezy Autorka przeprowadziła analizy ilościowe poszczególnych wariantów transkryptu DOG1 w mutancie fy, który posiada defekt w składniku kompleksu poliadenylacyjnego CPSF (Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor). W tym wypadku zaobserwowano spadek ilości shdog1 i wzrost ilości lgdog, co zgodnie z oczekiwaniami korelowało ze zmniejszoną ekspresją asdog1. Na podstawie wyników immunoprecypitacji chromatyny przeciwciałami przeciwko ubikwitynowanemu histonowi H2B (H2Bubq) Autorka wywnioskowała, że H2Bubq bierze udział w represji asdog1. Jest to 2
zgodne z faktem, że enzym HUB1 ubikwitynujący histon H2B jest znanym regulatorem ekspresji genu DOG1. Przeprowadzone w ramach omawianej pracy analizy podwójnego mutanta cpl1 hub1 wykazały, że oba białka regulują ekspresję asdog1 na tej samej ścieżce. W końcowej części pracy Autorka zajęła się wyjaśnieniem roli białka CPL1 w procesie translacji w kontekście sprzecznych doniesień literaturowych na temat jego aktywności. W przeprowadzonych analizach Western Blot wykazała, że w mutancie cpl1 następuje wzrost ilości RNA POL II, przy jednoczesnym spadku względnej ilości form tej polimerazy fosforylowanych na serynach 2 domeny CTD, które są związane z elongacją transkrypcji. Wynik ten sugeruje, że w mutancie cpl1 dochodzi do nagromadzenia na chromatynie zatrzymanej polimerazy niezdolnej do kontynuowania syntezy RNA. Kończące część eksperymenalną analizy Western Blot wykazały spadek ilości poliubikwitynowanej RNA POLII w mutancie cpl1, co sugeruje, że białko CPL1 wspomaga elongację transkrypcji poprzez usuwanie nieodwracalnie zatrzymanej RNA POL II. Podsumowując część doświadczalną chciałbym zaznaczyć, że szeroki zakres zaprojektowanych eksperymentów, różnorodność stosowych technik doświadczalnych i analitycznych jak również ilość uzyskanych danych robi duże wrażenie. Co prawda, nie wszystkie opisane w rozprawie doświadczenia zostały przeprowadzone własnoręcznie przez Doktorantkę, ale w takich przypadkach jest to jednoznacznie stwierdzone w opisie doświadczenia. Co istotne, wszystkie eksperymenty układają się w logiczny ciąg i zostały przeprowadzone z zachowaniem odpowiedniej staranności badawczej (np. uwzględnienie odpowiednich kontroli). Logiczna sekwencja kolejnych eksperymentów jest z pewnością w dużej mierze rezultatem bardzo głębokiej i szczegółową wiedzy Doktorantki na temat stanu spoczynku nasion jak również przebiegu i kontroli procesu transkrypcji. Wiedza ta z pewnością była nie tylko istotna dla projektowania kolejnych doświadczeń i doboru odpowiednich obiektów eksperymentalnych, ale również dla przedyskutowania otrzymanych wyników. W dyskusji rezultaty wszystkich przeprowadzonych doświadczeń zostały w jasny sposób odniesione do aktualnej wiedzy literaturowej na temat stanu spoczynku nasion i procesu transkrypcji. Autorka stara się zbudować możliwie zwięzły model funkcji białka CPL1 w elongacji RNA i wpływu tego procesu na transkrypcję genu DOG1, co w konsekwencji ma wpływ na stan spoczynku nasion. Stworzony przez autorkę model wydaje się dość logiczny, jednak pewne jego elementy nie do końca pasują do siebie. W większości przypadków Autorka zdaje sobie z tego sprawę i stwierdza, że pewne wyniki nie dają się zinterpretować w jasny sposób lub wręcz nie pasują do prezentowanego modelu. Takim przykładem są wyniki uzyskane na mutancie cpl1-7. Profil ekspresji transkryptów DOG1 w tym mutancie jest 3
podobny do pozostałych alleli cpl1, jednakże nasiona tego mutanta kiełkują tak, jak nasiona typu dzikiego. Według autorki Sugeruje to, że zmienione białko CPL1 w tym mutancie wpływa na dodatkowe procesy w roślinie, które maskują dodatni wpływ nadekspresji DOG1 na stan spoczynku nasion. (str. 59). Zagdzam się z Autorką, że nie można wykluczyć takiej możliwości, jednak w tej chwili jest to jedynie czysta spekulacja. Podobnie niełatwa w interpretacji jest obserwacja, że CPL1 może promować tworzenie zarówno dłuższych jak i krótszych form poliadenylacyjnych. Jednakże biorąc pod uwagę tematykę rozprawy, która skupia się na stanie spoczynku nasion, a nie procesie translacji ten problem, w przeciwieństwie do fenotypu mutanta cpl1-7, nie wydaje się być bardzo istotnym. Jedną ze słabszych stron stworzonego przez Autorkę modelu, który ma wyjaśniać fenotyp mutanta cpl1, jest proponowany mechanizm prowadzący do zwiększonego poziomu antysensownego transkryptu asdog1, który ma być oparty na zmniejszonej transkrypcji przez promotor antysensu. Według Doktorantki CPL1 wpływa na ilość obu form poliadenylacyjnych mrna DOG1 promując wybór dalszego miejsca poliadenylacji. Nie jest to jednak do końca zgodne z uzyskanymi wynikami. Jeśli porówna się stosunek obu form poliadenylacyjnych w roślinach typu dzikiego i w mutancie (Fig. 4.12C) to rzeczywiście można mówić o promocji dalszego miejsca poliadenylacji przez CPL1. Należy jednak zwrócić uwagę na fakt, że ilość lgdog1 nie zmienia się w mutantach cpl1 (za wyjątkiem cpl1-7) w porównaniu do roślin typu dzikiego (Fig. 4.12B). Równocześnie, jak wykazały przeprowadzone doświadczenia, mutacja cpl1 nie zmienia stabilności transkryptów shdog1 i lgdog1 (Fig. 4.13). Niezmieniona akumulacja i stabilność lgdog1 sugerują, że transkrypcja przez promotor asdog1 w mutantach cpl1 jest tak samo częsta jak w typie dzikim, a nie rzadsza jak sugeruje Autorka (strona 69). Dodatkowo, jeśli CPL1 wspomaga transkrypcję poprzez usuwanie nieodwracalnie zatrzymanej RNA POL II to należałoby przyjąć, że proces syntezy lgdog1 będzie trwał dłużej w mutancie cpl1 niż w roślinach typu dzikiego. Jeśli więc rzeczywiście transkrypcja wpływa negatywnie na aktywność promotora antysensu (jak Autorka sugeruje na str. 69) wówczas poziom asdog1 w cpl1 powinien być taki sam, lub nawet niższy niż w roślinach typu dzikiego. W celu potwierdzenia swojej hipotezy dotyczącej mechanizmu odpowiedzialnego za zwiększoną ekspresję asdog1 w mutantach cpl1 Doktorantka przeprowadzała doświadczenie, w którym analizowała poziom poszczególnych transkryptów DOG1 w mutancie fy. Ze względu na to, że w tym wypadku zaobserwowano negatywną zależność pomiędzy ilością transkryptu lgdog1 i asdog1 (Fig. 4.15ABC) stwierdzenie Autorki Zgodnie z naszą hipotezą, zwiększonej transkrypcji przez promotor antysensu w mutancie fy-2 towarzyszy spadek ilości asdog1 jest jak najbardziej 4
poprawne. Biorąc jednak pod uwagę, że ilość lgdog1 nie zmienia się w mutancie cpl1, trudno jest raczej twierdzić, że w obu mutantach chodzi o ten sam mechanizm regulacji transkrypcji antysensu. Uwzględniając różnice we wpływie (lub barku wpływu) mutacji fy i cpl1 na poziom akumulacji lgdog1 należałoby się również zastanowić, czy uzasadnionym było zastosowanie mutanta fy w doświadczeniu mającym określić stopień monoubikwitynacji histonu H2B na genie DOG1 (Fig. 4.16A). W moim odczuciu bardziej poprawnym byłoby raczej wykorzystanie mutanta cpl1 w tym eksperymencie. Ocena formalna rozprawy Również pod względem formalnym rozprawa doktorska mgr Justyny Kowalczyk nie budzi poważnych zastrzeżeń. Obejmuje ona łącznie 116 tekstu i zawiera 33 ryciny. Lista cytowanej literatury zawiera prawie 300 pozycji, co odzwierciedla wspomnianą powyżej bardzo dobrą znajomość aktualnej wiedzy zarówno na temat mechanizmu spoczynku nasion jak i molekularnych podstaw procesu translacji. Z drobniejszych problemów chciałbym zwrócić uwagę, na jakość zamieszczonych w pracy ilustracji. W niektórych przypadkach mogłyby one być nieco większe, co poprawiłoby ich czytelność. Np. na Fig. 4.8B raczej trudno jest zauważyć, czy mutanty cpl1 mają rzeczywiście bardziej mięsiste liście (str. 57). Należałoby się może też zastanowić, czy używany często w pracy angielskojęzyczny termin forward genetic screen można było zastąpić przed polski odpowiednik. Autorka nie ustrzegła się też pewnych błędów edycyjnych, które mogą sugerować o braku czasu na dopracowanie ostatecznej wersji rozprawy. Przykłady: Cytowania np. RNA było izolowane według zmodyfikowanej procedury opisanej w (Shirzadegan et al., 1991) lub (Nguyen et al., 2014) w swojej pracy na drożdżach pokazują,. Powinno być raczej RNA było izolowane według zmodyfikowanej procedury opisanej w Shirzadegan et al. (1991) i Nguyen et al. (2014) w swojej pracy na drożdżach pokazują,. Literówki np. gpdz. lub ubikiwitynacja Brakujące słowa CPL1 hamuje poprzez promowanie wyboru dalszego miejsca poliadenylacji Dwukrotne powtórzenie ostatniego zdania w ostaniem paragrafie Wyników (str. 77-78). 5