Analiza właściwości fizycznych i biologicznych powierzchni maszynowej i modyfikowanej stopu tytanu Ti6Al4V. Część 2. Badania biologiczne

PRACe ORYGINALNe Dent. Med. Probl. 2014, 51, 2, 212 217 ISSN 1644-387X Copyright by Wroclaw Medical University and Polish Dental Society Magdalena Łukaszewska-Kuska 1, A F, Barbara Dorocka-Bobkowska 2, A F, Jana Skrzypczak 3, A F 1, B F, Bartosz Leda Analiza właściwości fizycznych i biologicznych powierzchni maszynowej i modyfikowanej stopu tytanu Ti6Al4V. Część 2. Badania biologiczne Assessment of Physical and Biological Properties of Machined and Modified Titanium Alloy Ti6Al4V Surfaces. Part 2. Biological Analysis 1 Klinika Protetyki, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Poznań, Polska 2 Klinika Chorób Błony Śluzowej Jamy Ustnej, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Poznań, Polska 3 Klinika Rozrodczości, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Poznań, Polska A koncepcja i projekt badania; B gromadzenie i/lub zestawianie danych; C analiza i interpretacja danych; D napisanie artykułu; E krytyczne zrecenzowanie artykułu; F zatwierdzenie ostatecznej wersji artykułu Streszczenie Wprowadzenie. Ocenę prognozowanego przebiegu osteointegracji materiałów planowanych jako implanty śródkostne można przeprowadzić m.in. za pomocą badania in vitro z zastosowaniem hodowli komórkowych. Stosując tę technikę, można precyzyjnie ocenić odpowiedź komórkową. Przy ocenie reakcji komórkowej na stop tytanu poddany obróbce typowej dla wszczepów Osteoplant byłaby możliwa prognoza odpowiedzi tkanki kostnej na wszczep wykonany z tego stopu. Cel pracy. Ocena odpowiedzi biologicznej osteoblastów na stop tytanu ELI o modyfikowanej powierzchni i porównanie jej z odpowiedzią na czysty tytan z zastosowaniem metod obróbki materiału stosowanych w przypadku wszczepów Osteoplant. Materiał i metody. Do badań użyto dyski ze stopu tytanu Ti6Al4V oraz z czystego tytanu. Powierzchnia dysków była maszynowa bądź modyfikowana za pomocą piaskowania Al 2 O 3. Odpowiedź biologiczna badano z zastosowaniem linii komórkowej ludzkich osteoblastów. Oceniano żywotność komórek, syntezę białka, a także aktywność fosfatazy alkalicznej. Wyniki. Stwierdzono większą żywotność osteoblastów hodowanych na materiałach piaskowanych w porównaniu z materiałami o powierzchniach maszynowych. Zaobserwowano większą względną żywotność osteoblastów hodowanych na czystym tytanie o powierzchni piaskowanej w porównaniu z hodowlami prowadzonymi na piaskowanym stopie tytanu. Oceniając syntezę białka, zauważono większą jego zawartość w przypadku hodowli osteoblastów prowadzonych na materiałach piaskowanych w stosunku do materiałów o powierzchni maszynowej. Badając aktywność fosfatazy alkalicznej, również stwierdzono większą aktywność enzymatyczną w przypadku osteoblastów hodowanych na materiałach piaskowanych w porównaniu z materiałami o powierzchni maszynowej. Wnioski. Na podstawie uzyskanych wyników zaobserwowano, że odpowiedź biologiczna na czysty tytan i na stop tytanu typu ELI jest podobna. Największy wpływ na reakcje osteoblastów ma chropowatość powierzchni, a nie jej skład chemiczny. Zastosowanie metod obróbki wykorzystywanych w komercyjnie dostępnych implantach w przypadku implantów wykonanych ze stopu tytanu ELI powinno skutkować pozytywną odpowiedzią tkanki kostnej (Dent. Med. Probl. 2014, 51, 2, 212 217). Słowa kluczowe: stop tytanu (TiAl6V4), właściwości powierzchni, osteoblasty, hodowle komórkowe.

Stopy tytanu badania biologiczne 213 Abstract Background. Evaluation of expected osseointegration process for materials planed as endoosseous implants may be performed with help of in vitro methods such as cell cultures. With this technique precise evaluation of cell reaction is possible. By assessing cell reaction on the titanium alloy processed with typical for Osteoplant surface preparation prognosis of bone tissue, answer to endoosseous implant prepared from such material might be possible. Objectives. The aim of presented study was to evaluate osteoblasts biological reaction to titanium alloy with modified surface and compare this answer to reaction to pure titanium with application of surfaces processing procedures used for Osteoplant implants. Material and Methods. Discs made from titanium alloy Ti6Al4V and pure titanium were used. Surface of examined discs was machined or modified by sandblasting with Al 2 O 3. Biological reaction was assessed with use of human osteoblasts cell line. Osteoblasts viability, protein synthesis and alkaline phosphate activity were measured. Results. Increased osteoblasts activity on sandblasted surfaces in comparison with machined surfaces was noted. Moreover, increased osteoblasts activity was found for cultures conducted on the surface of pure titanium in comparison with cultures conducted on titanium alloy surface. Also increased protein synthesis and alkaline phosphate activity was found for cultures conducted on sandblasted surfaces in comparison with machined surfaces. Conclusions. Biological response to cemmecialy pure titanium and titanium alloy is simmilar. Surfaces roughness, not its chemical composition, mainly influences osteoblasts reactions. Applying surfaces preparation techniques used for Osteoplant implants in case of implants made from titanium alloy should effect in positive bone tissue reaction (Dent. Med. Probl. 2014, 51, 2, 212 217). Key words: titanium alloy (TiAl6V4), surface properties, osteoblasts, cell cultures. Ocenę prognozowanego przebiegu osteointegracji materiałów stosowanych do produkcji implantów śródkostnych można przeprowadzić za pomocą badań in vivo bądź in vitro. W badaniach in vivo można korzystać z modeli ludzkich bądź zwierzęcych, stosując metody inwazyjne lub nieinwazyjne. Stosowane są badania zmierzające do oceny jakości kontaktu tkanki kostnej ze wszczepem na preparatach histologicznych, testy typu pull-out, push-out oraz pomiar momentu obrotowego przy usuwaniu implantu po jego osteointegracji, zdjęcia rentgenowskie, ocena stabilności wszczepionego implantu z użyciem pomiaru częstotliwości drgań z użyciem urządzenia Osstell lub mechanicznie z wykorzystaniem urządzenia Periotest [1 6]. W badaniach in vitro można posłużyć się pomiarem adsorpcji białek, tworzeniem kryształów hydroksyapatytu na powierzchni materiału lub stosować eksperymenty z wykorzystaniem hodowli komórkowych. W przypadku badań z zastosowaniem hodowli komórkowych jest możliwa ocena odpowiedzi biologicznej na badany materiał dzięki symulacji warunków panujących in vivo. Linie komórkowe stanowią homogenne, dobrze zdefiniowane, relatywnie łatwo dostępne i łatwe w hodowli populacje komórkowe, które umożliwiają badanie wielu różnych próbek materiału, dając powtarzalne wyniki [7]. Są one swego rodzaju układami modelowymi pozwalającymi na ocenę reakcji komórek na materiał. Wyniki badań z użyciem linii komórkowych uzyskuje się w sposób znacznie szybszy i prostszy w porównaniu z badaniami na zwierzętach. Stosując technikę hodowli komórkowych, można ocenić prawie każdy aspekt czynności komórki, jest również możliwa kontrola środowiska życia komórek i ich kontaktu z badanym materiałem oraz precyzyjna ocena odpowiedzi komórkowej. Reakcja komórkowa może być oceniana m.in. pod względem morfologii komórek, ich podziałów, metabolizmu (aktywności mitochondrialnej), funkcji (sekrecja białek) lub integralności błony komórkowej [8]. Badane materiały są zwykle testowane w warunkach in vitro na hodowlach komórkowych, po czym przystępuje się do testów in vivo na zwierzętach. Ostatnim etapem są zwykle badania prowadzone na ludziach [8]. Celem przeprowadzonych badań była ocena odpowiedzi biologicznej osteoblastów na stop tytanu ELI o powierzchni maszynowej i powierzchni piaskowanej Al 2 O 3 i porównanie jej z odpowiedzią na czysty tytan klasy 4b. Materiał i metody Do badań użyto dyski o wymiarach 8 mm średnicy i 1 mm grubości wykonanych ze stopu tytanu Ti6Al4V, a także z komercyjnie czystego tytanu klasy 4b. Powierzchnię dysków poddano obróbce chemomechanicznej. Do badań użyto 4 rodzaje dysków: tytanowe o powierzchni maszynowej Ti MA, tytanowe o powierzchni piaskowanej Al 2 O 3 Ti Al 2 O 3, ze stopu tytanu o powierzchni maszynowej ELI MA, ze stopu tytanu o powierzchni piaskowanej Al 2 O 3 ELI Al 2 O 3. Dyski przygotowano w Wytwórni Implantów Osteoplant w Poznaniu. Były one frezowane z prętów tytanu i stopu tytanu. Tak otrzymano powierzchnię maszynową.

214 M. Łukaszewska-Kuska et al. Modyfikowaną powierzchnię uzyskano metodą piaskowania, które prowadzono pod ciśnieniem 6 atmosfer proszkiem Al 2 O 3 składającym się ziaren o wielkości 53 75 µm. Jego skład chemiczny stanowił w 98,5% Al 2 O 3. Wszystkie dyski przeszły przez proces mycia i sterylizacji radiacyjnej zgodnie z procedurą stosowaną dla powszechnie dostępnych implantów. Dodatkowo jako materiał referencyjny do badań biologicznych użyto Thermanox film poliestrowy o modyfikowanej powierzchni hydrofilnej, adhezyjnej dla komórek (Thermo Scientific, Dania). Hodowla komórek na powierzchniach próbek miała na celu ocenę reakcji osteoblastów na badane materiały i modyfikacje ich powierzchni. Oceniano żywotność komórek, syntezę białka, a także aktywność fosfatazy alkalicznej. Badania wykonano w Pracowni Hodowli Tkanek Kliniki Rozrodczości Uniwersytetu Medycznego im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu. Do badań użyto linii komórkowej ludzkich osteoblastów NHOst (NHOst-Osteoblasts OGM, cryo amp), medium hodowlanego, suplementów, czynników wzrostu i różnicowania (Osteoblast Basal Medium, Osteobast Growth Medium SingleQuots, Differentiation SingleQuots) wyprodukowanych przez LON- ZA USA. Ocenę żywotności przeprowadzono z zastosowaniem testu MTS. Jest to test biochemiczny, mający na celu ocenę aktywności metabolicznej komórek i ich degradacji. Do badania użyto po 6 próbek z każdego rodzaju. Hodowlę prowadzono w 24-dołkowych naczyniach hodowlanych Multidish 24 #144530 (Roskilde, Dania) przez 14 dni, codziennie zmieniając pożywkę. Po inkubacji 24-dołkowe płytki hodowlane z insertami były trzykrotnie płukane świeżą pożywką. Bezpośrednio przed badaniem przygotowano roztwór MTS (Promega, USA) (20 obj.) i PMS (Promega, USA) (1 obj.). Przygotowany roztwór podawano do medium w proporcji 1 : 10, a następnie inkubowano przez maksymalnie 60 min w 37 C w atmosferze 5% CO 2. Co 15 min naczynia były lekko wstrząsane, aby wymieszać barwny produkt reakcji oraz w celu kontroli stopnia zaawansowania reakcji, aby nie doszło do wysycenia produktem. Otrzymany barwny roztwór przeniesiono do 96-dołkowej płytki ELISA #167008 TC MICROWELL NUNCLON (Roksdile, Dania). Zbadano absorbancję przy λ = 490 nm z użyciem spektrofotometru Dynex MRX (Dynex Technologies, USA). Następnie obliczono względny wskaźnik żywotności komórek (Relative Viability of Cells RVC) ze wzoru: RVC (%) = [(a b)/(c b)] 100, gdzie: a wartość absorbancji próbki, b absorbancja kontroli zerowej (reakcja bez komórek), c absorbancja kontroli Thermanox. Ocena zawartości białka w badanych próbkach pozwala na ocenę liczby namnożonych na badanym podłożu komórek. Do badania użyto po 6 próbek z każdego rodzaju. Hodowlę prowadzono w 24-dołkowych naczyniach hodowlanych Multidish 24 #144530 (Roskilde, Dania), codziennie zmieniając pożywkę. Hodowlę zakończono po 14 dniach. Do analizy stężenia białka użyto zestawu Micro BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, USA). Warstwę komórek na insertach umieszczonych w 0,5 ml podwójnie destylowanej wody poddano homogenacji przez trzykrotne zamrożenie w ciekłym azocie i odmrożenie w temperaturze pokojowej, po czym pozostałość zdrapano z insertu i dodano do zawiesiny, w której odbywało się mrożenie próbek. W celu oceny stężenia białka w próbce przygotowano szereg dziewięciu rozcieńczeń albuminy wołowej (Sigma Aldrich, USA). Wykonano roztwór roboczy według instrukcji producenta zestawu. Na 96-dołkową płytkę ELISA #167008 TC MICROWELL NUNC- LON (Roksdile, Dania) podano po 150 µm każdej badanej próbki oraz każdego rozcieńczenia serum wołowego, a następnie do każdego dołka podano 150 µl uzyskanej mieszaniny roztworu roboczego i inkubowano w 37 C przez 2 godziny. Po ochłodzeniu roztworu roboczego do temperatury pokojowej poddano go analizie spektrofotometrycznej przy długości fali λ = 570 nm z użyciem spektrofotometru Dynex MRX (Dynex Technologies USA). Odczyt wykonano wobec próby ślepej, tzn. roztworu roboczego połączonego z podwójnie destylowaną wodą. Wykonano krzywą standardową, odnosząc wyniki absorbancji rozcieńczeń albuminy wołowej w stosunku do oznaczonych wartości stężenia białka w µg/ml. Wykorzystując standardową krzywa, określono stężenie białka w badanych próbkach. Aktywność fosfatazy alkalicznej jest wskaźnikiem różnicowania osteogenicznego komórek, formowania kości i mineralizacji matriksu. Jest wczesnym markerem różnicowania i osiąga maksymalne wartości w chwili rozpoczęcia mineralizacji. Jest to marker związany z dojrzałymi komórkami osteoblastycznymi. W celu określenia jej aktywności należy ocenić ją względem stężenia białka w badanym materiale. Do badania użyto po 6 próbek z każdego rodzaju. Hodowlę prowadzono w 24-dołkowych naczyniach hodowlanych Multidish 24 #144530 (Roskilde, Dania), codziennie zmieniając pożywkę. Hodowlę zakończono po 14 dniach. Warstwę komórek na insercie umieszczonym w 0,5 ml podwójnie destylowanej wody poddawano homogenacji przez trzykrotne zamro-

Stopy tytanu badania biologiczne 215 żenie w ciekłym azocie i odmrożenie w temperaturze pokojowej, po czym pozostałość zdrapano z insertu i dodawano do zawiesiny, w której odbywało się mrożenie próbki. Stężenie białka w próbkach oznaczono za pomocą Micro BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, USA). Następnie określono objętość, w której znajdowało się 5 µg białka. Otrzymaną objętość każdej próbki dopełniono do 100 µl destylowaną wodą. Na 96-dołkową płytkę ELISA #167008 TC MICROWELL NUNCLON (Roksdile, Dania) nanoszono 50 µl homogenatu i 125 µl p-nitrophenyl Phosphate Liquid Substrate System #N7653 (Sigma Aldrich) w duplikacji. Płytkę inkubowano w temperaturze 37 C przez 120 min. Reakcję przerwano 50 µl 0,3M NaOH i z użyciem spektrofotometru Dynex MRX (Dynex Technologies USA) wykonywano odczyt przy λ = 405 nm. Uzyskane wyniki przedstawiano jako średnią z sześciu hodowli. W celu oceny istotności różnic między badanymi grupami zastosowano test ANOVA Kruskala-Wallisa. Istotność statystyczną stwierdzano dla p < 0,05. Wyniki Uzyskane wyniki względnego wskaźnika żywotności osteoblastów hodowanych na badanych materiałach przedstawia ryc. 1. Zauważalna jest większa żywotność osteoblastów hodowanych na materiałach piaskowanych w porównaniu z materiałami o powierzchni maszynowej. Zaobserwowano ponadto większą żywotność osteoblastów hodowanych na czystym tytanie o powierzchni piaskowanej w porównaniu z hodowlami prowadzonymi na piaskowanym stopie tytanu. Istotne statystycznie różnice stwierdzono jedynie między wskaźnikami względnej żywotności osteoblastów hodowanych na czystym tytanie o powierzchni piaskowanej a stopem tytanu o powierzchni maszynowej (p = 0,01). Uzyskane wyniki stężenia białka otrzymanego z hodowli osteoblastów prowadzonych na badanych materiałach przedstawia ryc. 2. Uwagę zwraca większa zawartość białka w przypadku hodowli osteoblastów na materiałach piaskowanych w stosunku do materiałów o powierzchni maszynowej. Większe wartości w przypadku obu modyfikacji powierzchni osiągnęły hodowle prowadzone na czystym tytanie. Statystycznie istotne różnice stwierdzono między wynikami osiągniętymi z hodowli prowadzonych na obu materiałach o powierzchni maszynowej a materiałem referencyjnym (dla czystego tytanu p = 0,007, dla stopu p = 0,001) oraz między wynikami osiągniętymi z hodowli prowadzonych na czystym tytanie o powierzchni piaskowanej a stopem tytanu o powierzchni maszynowej (p = 0,005). Aktywność fosfatazy alkalicznej osteoblastów hodowanych na badanych materiałach przedstawia ryc. 3. Zauważalna jest większa aktywność enzymatyczna w przypadku osteoblastów hodowanych na materiałach piaskowanych w porównaniu Ryc. 2. Ilość białka uzyskana z badanych materiałów wyrażona w µg/ml w 14. dniu hodowli Fig. 2. The amount of proteins obtained from examined materials in µg/ml after 14 days Ryc. 1. Żywotność komórek hodowanych na badanych materiałach wyrażona w RCV% w 14. dniu hodowli Fig. 1. The viability of cells cultured on examined materials in RCV% after 14 days Ryc. 3. Aktywność fosfatazy alkalicznej komórek hodowanych na badanych materiałach wyrażona w absorbancji przy długości fali λ = 405 nm w 14. dniu hodowli Fig. 3. Alkaline phosphate activity of cells cultured on examined materials in absorbance at λ = 405 nm after 14 days

216 M. Łukaszewska-Kuska et al. z materiałami o powierzchni maszynowej. W przypadku czystego tytanu o powierzchni piaskowanej aktywność fosfatazy alkalicznej jest większa również od wartości osiąganych z hodowli prowadzonych na materiale kontrolnym Thermanox. Aktywność fosfatazy alkalicznej jest ponadto większa w hodowlach prowadzonych na stopie tytanu o powierzchni maszynowej niż na powierzchni maszynowej czystego tytanu. W przypadku powierzchni piaskowanych jest przeciwnie. Aktywność fosfatazy alkalicznej jest około dwukrotnie większa dla hodowli prowadzonych na czystym tytanie w porównaniu ze stopem tytanu. Istotne różnice stwierdzono między wynikami osiągniętymi dla hodowli prowadzonych na czystym tytanie o powierzchni piaskowanej a wynikami osiągniętymi dla hodowli prowadzonych na obu materiałach o powierzchni maszynowej (dla czystego tytanu p = 0,001, dla stopu p = 0,016) oraz między hodowlami prowadzonymi na czystym tytanie o powierzchni maszynowej a hodowlami prowadzonymi na materiale kontrolnym (p = 0,001). Omówienie Uzyskane wyniki dotyczące zarówno względnej żywotności osteoblastów, syntezy białka, jak i aktywności fosfatazy alkalicznej wskazują na korzystniejszy wpływ powierzchni piaskowanych na odpowiedź biologiczną osteoblastów w porównaniu z gładszymi powierzchniami maszynowymi. Jest to zgodne z wynikami otrzymanymi przez innych autorów [9 19]. Zwiększenie żywotności osteoblastów wraz ze zwiększeniem chropowatości podłoża obserwowali Zeredoist et al. [12] oraz Canabarro et al. [17]. Wielu autorów wskazuje na nasilenie procesu proliferacji komórek wyrażonej w ilości syntetyzowanego białka na powierzchniach chropowatych w porównaniu z powierzchniami gładkimi [10, 11, 13, 15, 20]. Również szeroko jest opisany stymulujący wpływ chropowatości powierzchni na zwiększenie aktywności fosfatazy alkalicznej, a więc na różnicowanie hodowanych na nich osteoblastów [9, 11, 13, 16, 18 22]. Zwiększenie badanych parametrów dla powierzchni bardziej chropowatych w porównaniu z gładszymi odnotowano niezależnie od rodzaju materiału, z którego było wykonane podłoże. Porównując natomiast badane parametry dla par materiałów o podobnej chropowatości między różnymi rodzajami materiałów, można zauważyć, że prawie wszystkie badane parametry są większe dla podłoży wykonanych z czystego tytanu w porównaniu ze stopem tytanu. Różnice te są jednak nieznaczne i nieistotne statystycznie. Największe różnice między parami różnych materiałów poddanych temu samemu procesowi obróbki są obecne w przypadku oceny aktywności fosfatazy alkalicznej wskazującej na poziom zróżnicowania osteoblastów. W przypadku oceny żywotności i stopnia namnożenia komórek różnice te są natomiast minimalne. Może być to związane z obecnością wanadu w składzie powierzchni próbek wykonanych ze stopu tytanu lub też z nieznacznie większym zanieczyszczeniem związkami węgla próbek wykonanych z tego materiału [23, 24]. Jednakowa ilość glinu w próbkach piaskowanych wykonanych z obu materiałów raczej wyklucza negatywny wpływ tego pierwiastka. Wyniki badań własnych wskazują na większą zależność wartości badanych parametrów od metody obróbki niż od składu chemicznego materiału, co potwierdzają badania innych naukowców [21, 25]. Szereg autorów wskazuje na negatywny wpływ jonów uwalnianych ze stopu tytanu na odpowiedź tkanki kostnej [26, 27]. W opisanych badaniach obserwowano istotną różnicę w przypadku wszystkich badanych parametrów pomiędzy stopem tytanu o powierzchni maszynowej a czystym tytanem o powierzchni piaskowanej. Różnice chropowatości obu próbek nie są większe niż w przypadku próbek Ti MA i Ti Al 2 O 3, a próbka Ti Al 2 O 3 zawiera więcej potencjalnie szkodliwego glinu niż próbka ELI MA. Prawdopodobnie ma to związek z rodzajem tlenków glinu, jakie powstają na powierzchni stopu tytanu w czasie obróbki mechanicznej, na co wskazuje Ask et al. [27]. Na podstawie uzyskanych wyników można wnioskować, że odpowiedź biologiczna na czysty tytan i na stop tytanu typu ELI jest podobna. Największy wpływ na reakcje osteoblastów ma chropowatość powierzchni, a nie jej skład chemiczny. Zastosowanie metod obróbki wykorzystywanych w komercyjnie dostępnych implantach w przypadku implantów wykonanych ze stopu tytanu ELI powinno skutkować pozytywną odpowiedzią tkanki kostnej. Piśmiennictwo [1] Stupka M., Majewski P.: Post implantation secondary stability of dental implants as one of the factors for evaluation conditions for prosthetic appliance placement possible complications. Implantoprotetyka 2009, 10, 4, 14 16 [in Polish]. [2] Meredith N.: A review of nondestructive test methods and their application to measure the stability and osseointegration of bone anchored endosseous implants. Crit. Rev. Biomed. Eng. 1998, 26, 275 291.

Stopy tytanu badania biologiczne 217 [3] Aparicio C., Lang N.P., Rangert B.: Validity and clinical significance of biomechanical testing of implant/bone interface. Clin. Oral Implants Res. 2006, 17, 2 7. [4] Sykaras N., Iacopino A.M., Marker V.A., Triplett R.G., Woody R.D.: Implant materials, designs, and surface topographies: their effect on osseointegration. A literature review. Int. J. Oral Maxillofac. Implants 2000, 15, 675 690. [5] Salvi G.E., Lang N.P.: Diagnostic parameters for monitoring peri-implant conditions. Int. J. Oral Maxillofac. Implants 2004, 19, 116 127. [6] Atsumi M., Park S.H., Wang H.L.: Methods used to assess implant stability: current status. Int. J. Oral Maxillofac. Implants 2007, 22, 743 754. [7] Vandrovcová M., Bačáková L.: Adhesion, growth and differentiation of osteoblasts on surface-modified materials developed for bone implants. Physiol. Res. 2011, 60, 403 417. [8] Wataha J.: Predicting clinical biological responses to dental materials. Dent. Mater. 2012, 28, 23 40. [9] Anselme K., Bigerelle M.: Topography effects of pure titanium substrates on human osteoblast long-term adhesion. Acta Biomaterial. 2005, 1, 211 222. [10] Schwartz Z., Lohmann C.H., Oefinger J., Bonewald L.F., Dean D.D., Boyan B.D.: Implant surface characteristics modulate differentiation behavior of cells in the osteoblastic lineage. Adv. Dent. Res. 1999, 13, 38 48. [11] Kim M.J., Kim C.W., Lim Y.J., Heo S.J.: Microrough titanium surface affects biologic response in MG63 osteoblastlike cells. J. Biomed. Mater. Res. 2006, 79, 1023 1032. [12] Zareidoost A., Yousefpour M., Ghaseme B., Amanzadeh A.: The relationship of surface roughness and cell response of chemical surface modification of titanium. J. Mater. Sci: Mater. Med. 2012, 23, 1479 1488. [13] Bachle M., Kohal R.J.: A systematic review of the influence of different titanium surfaces on proliferation, differentiation and protein synthesis of osteoblast-like MG63 cells. Clin. Oral Impl. Res. 2004, 15, 683 692. [14] Degasne I., Basl M.F., Demais V., Hure G., Lesourd M., Grolleau B., Mercier L., Chappard D.: Effects of roughness, fibronectin and vitronectin on attachment, spreading, and proliferation of human osteoblast-like cells (Saos-2) on titanium surfaces. Calcif. Tissue Int. 1999, 64, 499 507. [15] Bigerelle M., Anselme K., Noel B., Ruderman I., Hardouin P., Iost A.: Improvement in the morphology of Tibased surfaces: a new process to increase in vitro human osteoblast response. Biomaterials 2002, 23, 1563 1577. [16] Rausch-Fana X., Qu Z., Wieland M., Matejkaa M., Schedle A.: Differentiation and cytokine synthesis of human alveolar osteoblasts compared to osteoblast-like cells (MG63) in response to titanium surfaces. Dent. Mater. 2008, 24, 102 110. [17] Canabarro A., Paiva C., Ferreira H., Tholt-De-Vasconcellos B., De-Deus G., Prioli R., Linhares A.B.R., Alves G.G., Granjeiro J.: Short-term response of human osteoblast-like cells on titanium surfaces with microand nano-sized features. Scanning Vol. 2012, 36, 378 386. [18] Boyan B.D., Bonewald L.F., Paschalis E.P., Lohmann C.H., Rosser J., Cochran D.L., Dean D.D., Schwartz Z., Boskey A.L.: Osteoblast-mediated mineral deposition in culture is dependent on surface microtopography. Calcif. Tissue Int. 2002, 71, 519 529. [19] Batzer R., Liu Y., Cochran D.L., Szmuckler-Moncler S., Dean D.D., Boyan B.D., Schwartz Z.: Prostaglandins mediate the effects of titanium surface roughness on MG63 osteoblast-like cells and alter cell responsiveness to 1 alpha,25-(oh)2d3. Biomed. Mater. Res. 1998, 41, 489 496. [20] Brett P.M., Harle J., Salih V., Mihoc R., Olsen I., Jones F.H., Tonetti M.: Roughness response genes in osteoblasts. Bone 2004, 35, 124 133. [21] Lincks J., Boyan B.D., Blanchard C.R., Lohmann C.H., Liu Y., Cochran D.L., Dean D.D., Schwartz Z.: Response of MG63 osteoblast-like cells to titanium and titanium alloy is dependent on surface roughness and composition. Biomaterials 1998, 19, 2219 2232. [22] Olivares-Navarrete R., Hyzy S.L., Gittens R.A. 1st, Schneider J.M., Haithcock D.A., Ullrich P.F., Slosar P.J., Schwartz Z., Boyan B.D.: Rough titanium alloys regulate osteoblast production of angiogenic factors. Spine J. 2013, 13, 1563 1570. [23] Challa V.S.. Mali S., Misara R.D.: Reduced toxicity and superior cellular response of preosteoblasts to Ti-6Al- 7Nb alloy and comparison with Ti-6Al-4V.J. Biomed. Mater. Res. 2013, 101, 2083 2089. [24] La Guehennec L., Lopez-Heredia M.A., Enkel B., Weiss P., Amouring Y., Layrolle P.: Osteoblastic cell behaviour on different titanium implant surfaces. Acta Biomater. 2008, 4, 535 543. [25] Giljean S., Ponche A., Bigerelle M., Anselme K.: Statistical approach of chemistry and topography effect on human osteoblast adhesion. J. Biomed. Mater. Res. 2010, 94, 1111 1123. [26] Thompson G.J., Puleo D.A.: Ti-6A1-4V ion solution inhibition of osteogenic cell phenotype as a function of differentiation time course in vitro. Biomaterials 1996, 17, 1949 1954. [27] Ask M., Lausmaa J. Kasemo B.: Preparation and surface spectroscopic characterization of oxidees on Ti6Al4V. Appl. Surf. Sci. 1988, 35, 283 301. Adres do korespondencji: Magdalena Łukaszewska-Kuska Klinika Protetyki Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego oś. Zwycięstwa 14/100 61-647 Poznań Polska e-mail: m.lukaszewska.kuska@gmail.com Konflikt interesów: nie występuje Praca wpłynęła do Redakcji: 21.01.2014 r. Po recenzji: 7.03.2014 r. Zaakceptowano do druku: 14.03.2014 r. Received: 21.01.2014 Revised: 7.03.2014 r. Accepted: 14.03.2014