Aleksandra Safianowska, Renata Walkiewicz, Patrycja Nejman-Gryz, Ryszarda Chazan, Hanna Grubek-Jaworska

PRACA ORYGINALNA Aleksandra Safianowska, Renata Walkiewicz, Patrycja Nejman-Gryz, Ryszarda Chazan, Hanna Grubek-Jaworska Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. n. med. R. Chazan Porównanie dwóch technik typowania prątków niegruźliczych: cieczowej chromatografii wysokociśnieniowej i molekularnego systemu GenoType Mycobacterium CM/AS The comparison between two methods for typing of nontuberculous mycobacteria: high pressure liquid chromatography and molecular assay GenoType Mycobacterium CM/AS Praca finansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego, grant nr R1301002 Abstract Introduction: The GenoType Mycobacterium CM and the GenoType Mycobacterium AS (HAIN Lifescience, Germany) were evaluated for the ability to differentiate mycobacterial species of clinical isolates. Serial use of the both assays is aimed to identify 38 different molecular patterns, of which 24 patterns can be assigned to single species, 10 patterns are allocated to two or more Mycobacterium species, and 4 patterns correspond to Mycobacterium species and gram-positive bacteria with a high G + C content. The analysis of mycolic acids by high pressure liquid chromatography (HPLC) was the reference method. Material and methods: A set of 127 nontuberculous mycobacterial isolates on Loewenstein-Jensen slants, derived from different patients between 1999 and 2007, was analyzed. The strains were primary classified by HPLC following the diagnostic procedure, and retyped by GenoType Mycobacterium CM/AS. Results: In total, results obtained by both methods were interpretable for 113 strains. Concordant results were obtained for 105 (93%) mycobacterial strains. One out of 8 inconcordant classified strains, which was classified as M. abscessus/m. chelonae by HPLC, displayed a pattern of M. tuberculosis complex by a molecular method. Eleven clinical strains were differentiated only by one of used methods, either by HPLC (6 strains) or by GenoType CM/ AS (5 strains). Three strains were not classified at all. Conclusions: Our results show that the GenoType Mycobacterium CM/AS system represents a useful tool to identify mycobacterial clinical isolates. The molecular system is as rapid and reliable as the HPLC, but much easier to perform and more friendly for the environment. Key words: GenoType Mycobacterium CM/AS, high pressure liquid chromatography (HPLC), nontuberculous mykobacteria (NTM) Pneumonol. Alergol. Pol. 2010; 78, 5: 363 368 Streszczenie Wstęp: W pracy oceniano przydatność diagnostyczną molekularnego systemu GenoType Mycobacterium CM/AS (HAIN Lifescience, Niemcy) w różnicowaniu izolatów klinicznych mykobakterii w porównaniu z analizą kwasów mykolowych z zastosowaniem cieczowej chromatografii wysokociśnieniowej. Zastosowanie obydwu testów umożliwia wyróżnienie 38 wzorów molekularnych, z których 24 można przypisać do poszczególnych gatunków mykobakterii, 10 wzorów odpowiada Adres do korespondencji: dr n. med. A. Safianowska, Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii WUM, ul. Banacha 1a, 02 097 Warszawa, tel.: 22 599 28 56, faks: 22 599 15 60, e-mail: asafianowska@wum.edu.pl Praca wpłynęła do Redakcji: 04.01.2010 r. Copyright 2010 Via Medica ISSN 0867 7077 www.pneumonologia.viamedica.pl 363

Pneumonologia i Alergologia Polska 2010, tom 78, nr 5, strony 363 368 W ostatnim dziesięcioleciu, równolegle z rozwojem technik molekularnych, jesteśmy świadkami znaczącego postępu w dziedzinie taksonomii mykobakterii. Rodzaj Mycobacterium obejmuje już obecnie 148 gatunków i 11 podgatunków, a liczby te stale rosną. Na bieżąco aktualizowana lista opisanych taksonów jest dostępna w Internecie [1]. Spośród nich M. leprae i M. tuberculosis to obligatoryjne patogeny, zaś pozostałe, zwane prątkami niegruźliczymi (NTM, nontuberculous mycobacteria), to saprofity powszechnie występujące w środowisku. Jednak około 1/3 gatunków NTM może powodować zakażenia oportunistyczne, najczęściej wiążące się z dysfunkcją układu odpornościowego. Do rozwoju zakażeń NTM predysponuje leczenie immunosupresyjne, podeszły wiek, przebyte lub współwystępujące inne choroby; w przypadku płucnej manifestacji mykobakteriozy może to być gruźlica, przewlekła obturacyjna choroba płuc lub mukowiscydoza, a w przypadku mykobakteryjnego zakażenia skóry uszkodzenia skóry lub błon śluzowych [2 4]. Jednak najczęstszą kliniczną manifestacją mykobakteriozy jest przewlekła choroba płuc [4 7]. W Polsce wśród gatunków najczęściej izolowanych z próbek od chorych na mykobakteriozę płuc wymienić należy: M. kansasii, M. avium/m. intracellulare i M. xenopi. W odróżnieniu od gruźlicy mykobakterioza nie transmituje się na osoby zdrowe, zatem nie podlega obowiązkowi rejestracji, a dane epidemiologiczne są jedynie orientacyjne i najczęściej dotyczą określonych regionów kraju lub jedynie wybranego gatunku NTM. Trzeba przy tym podkreślić, że mykobaktedwóm, czasem kilku gatunkom, a 4 wzory odpowiadają Mycobacterium sp. lub Gram-dodatnim bakteriom z dużą zawartością par G-C w genomie. Materiał i metody: Badanie miało charakter retrospektywny i obejmowało 127 szczepów mykobakterii wyizolowanych na podłożu stałym Loewensteina-Jensena od pacjentów szpitala klinicznego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w latach 1999 2007. Prątki identyfikowano metodą analizy kwasów mykolowych cieczową chromatografią wysokociśnieniową (HPLC) w ramach rutynowego postępowania diagnostycznego. Szczepy typowano powtórnie testami molekularnymi, najpierw GenoType Mycobacterium CM, a następnie jeśli uzyskanego wzoru molekularnego nie można było przypisać do żadnego z wzorców testem GenoType Mycobacterium AS. Wyniki: Spośród 127 badanych szczepów porównanie obu technik było możliwe dla 113 izolatów. Dla 105 ze 113 (93%) szczepów uzyskano wyniki zgodne. Należy podkreślić, że spośród 8 izolatów rozbieżnie typowanych w jednym przypadku w systemie GenoType Mycobacterium CM/AS stwierdzono obecność genomu M. tuberculosis complex. Szczep ten w typowaniu HPLC określono jako szybkorosnący gatunek M. abscessus/m. chelonae. Spośród pozostałych 14 ze 127 izolatów klinicznych 11 wytypowano tylko jedną z metod: 6 szczepów techniką HPLC i 5 szczepów w systemie molekularnym. W przypadku 3 szczepów identyfikacja nie powiodła się żadną z metod. Wnioski: System GenoType Mycobacterium CM/AS pozwala na szybką i rzetelną identyfikację gatunkową izolatów klinicznych mykobakterii. W porównaniu z obecnie stosowaną metodą HPLC system molekularny jest przyjazny dla środowiska i prostszy w wykonaniu. Słowa kluczowe: cieczowa chromatografia wysokociśnieniowa, GenoType Mycobacterium CM/ AS, mykobakteria Pneumonol. Alergol. Pol. 2010; 78, 5: 363 368 Wstęp rioza jest chorobą występującą rzadko, aczkolwiek nieco częściej niż można się było spodziewać przed kilkunastoma laty. Autorki niniejszej pracy na podstawie własnych doświadczeń sądzą, że choroby płuc, w których czynnikiem etiologicznym są NTM, stanowią do kilkunastu procent wszystkich zakażeń prątkowych [8]. Podobne dane dotyczą wielu regionów świata [9 12]. Zauważalny jest także wzrost notowanych przypadków mykobakteriozy w krajach rozwiniętych, czemu jednocześnie towarzyszy spadek zachorowań na gruźlicę. Trudno ocenić, w jakim stopniu wiąże się to ze wzrostem liczebności populacji z predyspozycjami do rozwoju zakażeń NTM, a w jakim wynika z postępu w technikach różnicowania prątków, który z natury rzeczy jest szybszy w krajach rozwiniętych [11]. Ze względu na konieczność rozróżnienia prątków NTM etiologicznie istotnych od przypadkowych zanieczyszczeń próbek klinicznych, potwierdzeniem mikrobiologicznym mykobakteriozy u objawowych chorych z wykluczoną gruźlicą jest co najmniej 2-krotne wyhodowanie prątków niegruźliczych tego samego gatunku [4]. Wymaga to niekiedy badania więcej niż trzech próbek klinicznych od pacjenta, co jest standardem w diagnostyce gruźlicy [8]. Jednak podstawowe trudności diagnostyczne w przypadku mykobakteriozy wynikają z faktu, że objawy kliniczne nie pozwalają na różnicowanie jej z gruźlicą, zaś metody mikrobiologiczne, nawet najczulsze molekularne nie wykrywają zakażenia M. tuberculosis u wszystkich osób chorych na gruźlicę. Zdarza się, że u objawowych chorych, uznanych za chorych na gruźlicę bez potwierdzenia mikrobiologicznego, podejmowane jest leczenie przeciwgruźlicze i dopiero nie- 364 www.pneumonologia.viamedica.pl

Aleksandra Safianowska i wsp., Molekularne typowanie prątków powodzenie takiej terapii skłania do poszukiwania innych niż M. tuberculosis etiologicznych czynników choroby. Wydaje się, że ze strony laboratoryjnej nierozpoznanie mykobakteriozy jest wynikiem w równej mierze arbitralnego uznawania izolatów NTM, bez określania gatunku, za zanieczyszczenia środowiskowe, jak również braku możliwości technicznych typowania. Autorki sądzą, że ważnym postępem w diagnostyce mykobakterioz będzie upowszechnienie szybkich i niekosztownych molekularnych metod różnicowania gatunków mykobakterii. Do niedawna metodą referencyjną w typowaniu prątków, stosowaną również w Polsce, była analiza kwasów mykolowych techniką cieczowej chromatografii wysokociśnieniowej (HPLC, high performance liquid chromatography) [13 15]. Zestaw kwasów mykolowych, a właściwie ich profil elucyjny w analizie HPLC różnicuje wiele gatunków mykobakterii, choć nie wszystkie. Wydaje się, że technika ta, chociaż znakomita w swoim czasie, odchodzi już do przeszłości, głównie ze względu na koszty aparaturowe i obciążenie środowiska rozpuszczalnikami organicznymi. Obecnie złotym standardem w pracach doświadczalnych jest sekwencjonowanie 16S rdna [16], ale nie jest to metoda dostępna dla diagnostyki rutynowej. Jednocześnie do diagnostyki wprowadzane są testy molekularne, certyfikowane dla potrzeb klinicznych. Jedną z propozycji są certyfikowane w Unii Europejskiej, wzajemnie uzupełniające się testy: GenoType Mycobacterium CM oraz GenoType Mycobacterium AS (HAIN Lifescience, Niemcy). W teście GenoType Mycobacterium CM (Common Mycobacteria) uzyskuje się 15 wzorów molekularnych różnicujących gatunki: M. avium, M. chelonae/m. immunogenum, M. abscessus/m. immunogenum, M. fortuitum 1, M. fortuitum 2/M. mageritense, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum/m. paraffinicum/m. parascrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense/ /M. haemophilum/m. palustre, M. marinum/m. ulcerans, M. tuberculosis complex, M. peregrinum/m. alvei/m. septicum oraz M. xenopi. W teście Geno- Type Mycobacterium AS (Additional Species) 19 wzorów molekularnych różnicuje gatunki: M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M. celatum, M. smegmatis, M. genavense/m. triplex, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai/m. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kansasii (4 subtypy), M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum, M. shimoidei. Ponadto w każdym teście możliwe jest uzyskanie wzoru molekularnego dla Mycobacterium sp. (Genus Control). Celem niniejszej pracy było porównanie precyzji w identyfikowaniu gatunku prątków przez system molekularny GenoType Mycobacterium CM/AS (HAIN Lifescience, Niemcy) ze stosowaną w rutynowej diagnostyce analizą kwasów mykolowych z użyciem HPLC. Materiał i metody Badane szczepy Badanie miało charakter retrospektywny i obejmowało szczepy NTM wyizolowane z materiałów klinicznych od 127 chorych w latach 1999 2007 w szpitalu klinicznym Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Szczepy wyhodowano z 64 plwocin, 38 popłuczyn oskrzelowych, 19 płynów oskrzelikowo-pęcherzykowych, 2 płynów opłucnowych oraz 4 innych próbek klinicznych. Próbki kliniczne upłynniano i dekontaminowano, stosując ług sodowy z N-acetylocysteiną i cytrynianem sodu (stężenie końcowe: 2% NaOH, 0,5% NAC, 1,3% C 6 H 5 O 7 Na 3 ) [17]. Następnie próby zagęszczano i posiewano na podłożu Loewensteina- Jensena (L-J). Do badania zakwalifikowano wyłącznie szczepy bakterii kwasoopornych w barwieniu Ziehla-Neelsena, których wzór elucyjny w metodzie HPLC potwierdzał przynależność do Mycobacterium sp. i był różny od M. tuberculosis complex. Typowanie gatunku metodą HPLC Typowanie wyizolowanych szczepów mykobakterii przeprowadzono zgodnie z wytycznymi CDC (Centers for Disease Control and Prevention) [18] metodą analizy kwasów mykolowych z zastosowaniem HPLC, którą rutynowo stosuje się w diagnostyce mikrobiologicznej gruźlicy i mykobakterioz w pracowni WUM [14, 15]. Typowanie molekularne Typowanie gatunku na poziomie molekularnym wykonano testami GenoType Mycobacterium CM/AS (HAIN Lifescience, Niemcy), w których przeprowadza się specyficzną hybrydyzację produktu amplifikacji w multiplex PCR (polymerase chain reaction) ze swoistymi sondami oligonukleotydowymi na pasku nitrocelulozowym. System ten nie obejmuje izolacji DNA prątkowego, które należy izolować dowolną techniką przewidzianą dla tego typu izolacji. Producent zestawów nie dostarcza także polimerazy DNA. W niniejszym badaniu matrycę DNA otrzymywano, stosując zestaw AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit (Roche Diagnostics, Stany Zjednoczone) i dalej amplifikację przeprowadzono tak, jak opisano w poprzedniej pracy [19]. Hybrydyzację i de- www.pneumonologia.viamedica.pl 365

Pneumonologia i Alergologia Polska 2010, tom 78, nr 5, strony 363 368 Tabela 1. Szczepy, dla których wyniki identyfikacji gatunkowej były zgodne w obu metodach Table 1. Mycobacterial strains concordant when typed by both methods Liczba szczepów/number of strains HPLC GenoType Mycobacterium CM/AS 35 M. kansasii M. kansasii 22 M. xenopi M. xenopi 16 M. avium/m. intracellulare 15 M. avium 1 M. intracellulare 11 M. gordonae M. gordonae 10 M. fortuitum M. fortuitum 10 M. abscessus/m. chelonae 9 M. chelonae 1 M. abscessus 1 M. fortuitum + M. kansasii M. fortuitum + M. kansasii tekcję prowadzono w automatycznym urządzeniu (TwinCubator, HAIN Lifescience, Niemcy) zgodnie z instrukcją producenta, przedstawioną dalej w skrócie: 20 µl produktu amplifikacji inkubowano przez 5 min w temperaturze pokojowej z 20 µl odczynnika do denaturacji (wszystkie odczynniki i paski dostępne w zestawie). Następnie dodano 1 ml buforu do hybrydyzacji o temperaturze 37 C i po włożeniu paska nitrocelulozowego z sondami prowadzono hybrydyzację przez 30 min w temperaturze 45 C. Po 2-krotnym płukaniu, 1 ml Stringent Wash Solution 45 C przez 15 min, a następnie 1 ml Rinse Solution (RIN) w temperaturze pokojowej przez 1 min, pasek inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej z 1 ml rozcieńczonej odpowiednim buforem fosfatazy alkalicznej sprzężonej ze streptawidyną. Pasek płukano 3-krotnie w temperaturze pokojowej: 2-krotnie 1 ml RIN przez 1 min, a następnie, również przez 1 min, 1 ml wody. Odpłukany pasek inkubowano w 1 ml substratu w temperaturze pokojowej, bez dostępu światła, przez 3 do 20 min, do wybarwienia prążka CC (Conjugate Control). Reakcję barwną hamowano, 2-krotnie przepłukując pasek wodą. Po wysuszeniu paska oceniano wzór wybarwionych prążków, odpowiadających swoistym sondom DNA, przez porównanie z wzorcem dostarczonym przez producenta. Ocenie podlegały tylko paski, w których wybarwione były prążki kontrolne. Wyniki Dla 113 szczepów mykobakterii spośród 127 badanych izolatów klinicznych uzyskano wiarygodne wyniki zarówno w systemie molekularnym GenoType Mycobacterium CM/AS, jak i w analizie HPLC. W 105 (93%) przypadkach wyniki typowania obydwiema metodami były zgodne. Dotyczyło to 35 szczepów M. kansasii, 22 M. xenopi, 16 M. avium/m. intracellulare, 11 M. gordonae, 10 M. fortuitum, 10 M. abscessus/m. chelonae oraz jednego izolatu mieszanego M. fortuitum + + M. kansasii. Metoda molekularna pozwoliła doprecyzować typowanie 16 szczepów rozpoznanych w HPLC jako M. avium/m. intracellulare, wśród których 15 izolatów okazało się M. avium i jeden M. intracellulare. Podobnie w przypadku 10 izolatów M. abscessus/m. chelonae (HPLC) było 9 szczepów M. chelonae i jeden M. abscesus (GenoType Mycobacterium CM) (tab. 1). Niezgodne wyniki typowania dotyczyły 8 szczepów (7%) (tab. 2). Oprócz omówionych powyżej 113 szczepów były też takie, których identyfikacja powiodła się tylko jedną z metod 6 chromatograficznie i 5 molekularnie (tab. 3) oraz 3 izolaty kliniczne, zgodnie zakwalifikowane jako NTM, których pełna identyfikacja nie powiodła się żadną ze stosowanych metod. Dyskusja Komentarza wymagają przede wszystkim przypadki rozbieżnego typowania prątków porównywanymi metodami. W niniejszym badaniu zdarzyło się tak w ośmiu przypadkach. W dwóch przypadkach szczepy ocenione techniką HPLC jako NTM według genotypowania były mikroorganizmami spoza rodzaju Mycobacterium. Wyjaśnieniem może być obecność kwasów mykolowych w ścianie komórkowej mikroorganizmów należących do innych niż Mycobacteria rodzajów systematycznych, na przykład Nocardia [20], które incydentalnie mogą wyrosnąć na pożywce L-J, a biblioteka wzorów elucyjnych obejmuje jedynie profile dla 29 gatunków prątków. 366 www.pneumonologia.viamedica.pl

Aleksandra Safianowska i wsp., Molekularne typowanie prątków Tabela 2. Szczepy, dla których wyniki identyfikacji gatunkowej nie były zgodne w obu metodach Table 2. Mycobacterial strains non-concordant when typed by HPLC and GenoType Mycobacterium CM/AS Liczba szczepów/number of strains HPLC GenoType Mycobacterium CM/AS 2 NTM Bakterie nienależące do Mycobacterium sp. 1 M. interjectum M. avium 1 M. interjectum M. xenopi 1 M. scrofulaceum M. gordonae 1 M. xenopi M. xenopi + M. intracellulare + M. scrofulaceum 1 M. gordonae M. gordonae + M. xenopi 1 M. abscessus/m. chelonae M. tuberculosis complex Tabela 3. Szczepy zidentyfikowane tylko jedną z metod Table 3. Mycobacterial strains typed only by one from two used methods Liczba szczepów/number of strains HPLC GenoType Mycobacterium CM/AS 1 M. flavescens NTM 1 M. neoaurum NTM 1 M. nonchromogenicum NTM 1 M. avium Inhibicja polimerazy 1 M. fortuitum Inhibicja polimerazy 1 M. kansasii Inhibicja polimerazy 1 NTM M. fortuitum 2/M. mageritense 1 NTM M. intermedium 1 NTM M. lentiflavum 1 NTM M. mucogenicum 1 NTM M. smegmatis Przy identyfikacji M. interjectum w HPLC typowanie molekularne dało w jednym przypadku wynik M. avium, a w drugim M. xenopi. Bez wykonania genotypowania metodą odniesienia, na przykład sekwencjonowania 16S rdna, przypadki te nie znajdują jednoznacznego uzasadnienia. Można jedynie przypuszczać, że profil elucyjny kwasów mykolowych w HPLC określony jako charakterystyczny dla M. interjectum mógł w rzeczywistości wynikać z obecności innych niż prątki mikroorganizmów dominujących w hodowli, z jednoczesną obecnością prątków M. avium za pierwszym i M. xenopi za drugim razem. W przypadku rozbieżności w identyfikacji M. scrofulaceum v. M. gordonae (odpowiednio chromatograficznie i molekularnie) wyjaśnienia można doszukiwać się w różnorodności profili elucyjnych M. gordonae w HPLC. W bibliotece wzorów elucyjnych, M. gordonae charakteryzuje się jedną grupą pików. Wykazano, że w obrębie gatunku M. gordonae istnieje inny podtyp, którego nie posiadamy w bazie wzorów elucyjnych, charakteryzujący się dwoma grupami pików [21], podobnie jak M. scrofulaceum [13]. W tym właśnie autorki upatrują możliwości pomyłki w typowaniu HPLC i, mimo że nie dysponują wynikami z innej metody genotypowania, skłaniają się jednak do uznania prawdziwości typowania metodą molekularną. W dwóch przypadkach analiza HPLC wykazała wzór elucyjny dla jednego gatunku, zaś analiza molekularna wykazała obecność genomów tego i jeszcze dodatkowych gatunków mykobakterii (tab. 2). Taka precyzja typowania molekularnego jest najistotniejszą przewagą systemu GenoType Mycobacterium CM/AS w porównaniu z techniką HPLC. Tę ważną zaletę testu podkreślają również inni autorzy [22]. Ważne, że test GenoType stwarza możliwość wykrycia prątków gruźlicy w hodowlach gatunkowo niejednorodnych, w których przeważają szyb- www.pneumonologia.viamedica.pl 367

Pneumonologia i Alergologia Polska 2010, tom 78, nr 5, strony 363 368 korosnące prątki środowiskowe maskujące obecność wolno replikujących prątków gruźlicy. W niniejszym badaniu miało to miejsce w jednym przypadku, potwierdzonym w innym teście molekularnym (AMPLICOR MTB, Roche Diagnostics, Stany Zjednoczone), w którym obecność prątków gruźlicy była maskowana przez prątki szybkorosnące (M. chelonae/m. abscessus). System GenoType Mycobacterium CM/AS pozwala na szybką i rzetelną identyfikację gatunkową izolatów klinicznych mykobakterii. Procedura testów GenoType jest stosunkowo prosta, wymaga jednak pewnego przygotowania w posługiwaniu się metodami molekularnymi, bowiem nie przewidziano w nich izolacji DNA i każda pracownia winna przeprowadzać to we własnym zakresie, jedną z ogólnie przyjętych technik. W przeciwieństwie do obecnie stosowanej metody HPLC system molekularny jest przyjazny dla środowiska. Uzyskane wyniki w pełni potwierdzają pozytywną ocenę innych autorów o przydatności dla diagnostyki rutynowej systemu GenoType Mycobacterium CM/AS [22 24]. Ta prosta metodyka molekularna może w znacznym stopniu usprawnić diagnostykę zakażeń prątkowych. Piśmiennictwo 1. Euzéby J.P. List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature Genus Mycobacterium. Last full update: 08. 07. 2010. http://www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.html 2. Falkinham J.O. III. Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria. Clin. Microbiol. Rev. 1996; 9: 177 215. 3. Katoch V.M. Infections due to non-tuberculous mycobacteria (NTM). Indian J. Med. Res. 2004; 120: 290 304. 4. American Thoracic Society Documents. Diagnosis, Treatment and Prevention of Nontuberculous Mycobacterial Diseases. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2007; 175: 367 416. 5. Management of opportunist mycobacterial infection. Joint Tuberculosis Committee guidelines 1999. Thorax 2000; 55: 210 218. 6. Shitrit D., Priess R., Peled N. i wsp. Differentiation of Mycobacterium kansasii infection from Mycobacterium tuberculosis infection: comparison of clinical features, radiological appearance, and outcome. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2007; 26: 679 684. 7. d Arminio Monforte A., Vago L., Gori A. i wsp. Clinical diagnosis of mycobacterial diseases versus autopsy findings in 350 patients with AIDS. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15: 453 458. 8. Grubek-Jaworska H., Walkiewicz R., Safianowska A. i wsp. Nontuberculous mycobacterial infections among patients suspected of pulmonary tuberculosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2009; 28: 739 744. 9. Debrunner M., Salfinger M., Brandli O., von Graevenitz A. Epidemiology and clinical significance of nontuberculous mycobacteria in patients negative for human immunodeficiency virus in Switzerland. Clin. Inf. Dis. 1992; 15: 330 345. 10. Henry M.T., Inamdar L., O Riordain D. i wsp. Nontuberculous mycobacteria in non-hiv patients: epidemiology, treatment and response. Eur. Respir. J. 2004; 23: 741 746. 11. Marras T.K., Daley C.L. Epidemiology of human pulmonary infection with nontuberculous mycobacteria. Clin. Chest Med. 2002; 23: 553 567. 12. Adle-Biassette H., Huerre M., Breton G. i wsp. Non tuberculous mycobacterial diseases. Ann. Pathol. 2003; 23: 216 235. 13. Butler W.R. i Guthertz L.S. Mycolic Acid Analysis by High- Performance Liquid Chromatography for Identification of Mycobacterium Species. Clin. Microbiol. Rev. 2001; 14: 704 726. 14. Safianowska A., Walkiewicz R., Grubek-Jaworska H. i wsp. Mycolic acids analysis from various species mycobacterium by high pressure liquid chromatography (HPLC). Pneumonol. Alergol. Pol. 2002; 70: 130 138. 15. Walkiewicz R., Safianowska A., Grubek-Jaworska H. i wsp. Zastosowanie analizy kwasów mikolowych w diagnostyce gruźlicy i mikobakterioz 3 lata doświadczeń. Pneumonol. Alergol. Pol. 2002; 70: 444 449. 16. Daley P., Petrich A., May K. i wsp. Comparison of in-house and commercial 16S rrna sequencing with high-performance liquid chromatography and Genotype AS and CM for identification of nontuberculous mycobacteria. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2008; 61: 284 293. 17. Przondo-Mordarska A. Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii klinicznej. Wyd. Lek. PZWL, Warszawa 2005; 86 87. 18. Standarized Method for HPLC Identification of Mycobacteria. U.S. Departament of Heath and Human Services, CDC 1996; http://www.cdc.gov/ncidod/publications/hplc.pdf 19. Safianowska A., Walkiewicz R., Nejman-Gryz P. i wsp. Przydatność diagnostyczna molekularnego testu GenoType MTBC (HAIN Lifescience, Niemcy) w identyfikacji prątków gruźlicy. Pneumonol. Alergol. Pol. 2009; 77: 517 520. 20. Butler W.R., Ahearn D.G. i Kilburn J.O. High-Performance Liquid Chromatography of Mycolic Acids as a Tool in the Identification of Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, and Mycobacterium Species. J. Clin. Microbiol. 1986; 23: 182 185. 21. Astola J., Muńoz M., Sempere M. i wsp. The HPLC-double-cluster pattern of some Mycobacterium gordonae strains is due to their dicarboxy-mycolate content. Microbiology 2002; 148: 3119 3127. 22. Gitti Z., Neonakis I., Fanti G. i wsp. Use of the GenoType Mycobacterium CM and AS Assays to Analyze 76 Nontuberculous Mycobacterial Isolates from Greece. Journal of Clin. Microbiol. 2006; 44: 2244 2246. 23. Richter E., Rüsch-Gerdes S., Hillemann D. Evaluation of the GenoType assay for Identification of mycobacterial Species from Cultures. J. Clin. Microbiol. 2006; 44: 1769 1775. 24. Sarkola A., Mäkinen J., Marjamäki M. i wsp. Prospective evaluation of the GenoType assay for routine identification of mycobacteria. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2004; 23: 642 645. 368 www.pneumonologia.viamedica.pl