Kolorymetryczne oznaczanie stężenia Fe 3+ metodą rodankową (opracowanie: Barbara Krajewska) Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z podstawami spektrofotometrii absorpcyjnej w świetle widzialnym (kolorymetrią) i jej zastosowaniami analitycznymi. W ćwiczeniu wykonamy oznaczenie ilościowe jonów Fe 3+ w roztworze metodą rodankową (tiocyjanianową). 1. Podstawy teoretyczne Spektrofotometria absorpcyjna w świetle widzialnym (kolorymetria) jest techniką instrumentalną wykorzystującą istnienie barw substancji. Substancje są barwne z powodu tego, że absorbują światło z zakresu widzialnego w sposób selektywny. Badamy więc jaki kolor ma substancja (długość absorbowanej fali świetlnej max ) i jaka jest wielkość absorpcji tej fali (absorbancja A). Światło to promieniowanie elektromagnetyczne, zbiór fal elektromagnetycznych o różnych długościach (Rys. 1). Światło widzialne (białe) stanowi niewielką część promieniowania elektromagnetycznego, na którą reaguje siatkówka oka człowieka w procesie widzenia. Obejmuje ono zakres długości fal w przybliżeniu 380-780 nm. Rys. 1. Widmo promieniowania elektromagnetycznego Fale z zakresu światła widzialnego w zależności od swojej długości wywołują w naszym oku różne wrażenia kolorystyczne (Rys. 1), np. kolor fioletowy to fale o między ok. 380 i 420 nm, kolor żółty, między ok. 550 i 580 nm, itd., ale wszystkie te fale razem zmieszane dają wrażenie światła białego. Jeśli jednak z tej mieszaniny fal o różnych długościach stanowiących światło białe, zostaną usunięte jakieś wybrane fale, to do naszego oka trafią wszystkie pozostałe, wywołując wrażenie barwne inne niż białe. Tak się dzieje, gdy światło białe padając na substancję ulegnie selektywnej absorpcji, tzn. część fal o wybranych 1
długościach zostaje przez tę substancję zatrzymana, a reszta nie, wobec czego do naszego oka dostarczony zostanie zbiór fal, które pozostały niezatrzymane. Odpowiedzialne za tę selektywną absorpcję światła są oddziaływania fal elektromagnetycznych z zakresu widzialnego z materią. Fale o tych długościach są mianowicie zdolne do wywołania wzbudzeń elektronowych, które to wzbudzenia, żeby zaszły muszą mieć dostarczoną właściwą porcję energii. Wymaga to, by w cząsteczce takiego związku występowały ugrupowania atomów, których elektronowe poziomy energetyczne odpowiadają kwantom promieniowania niesionego przez fale światła białego (grupy chromoforowe). Jeśli dla wybranej substancji zmierzyć, w jakim stopniu absorbuje ona fale o kolejnych długościach z zakresu widzialnego, to otrzymamy zależność absorbancji A od długości fali. Zależność ta nosi nazwę widma absorpcyjnego i jest charakterystyczna dla danej substancji. Jeśli ta substancja w ogóle nie absorbuje światła (A = 0 dla wszystkich ), to jej widmo powinno być linią prostą położoną na osi x; jeśliby absorbowała fale o wszystkich w jednakowym stopniu, to jej widmo byłoby prostą równoległą do osi x; lecz jeśli ta substancja pochłania fale tylko o niektórych długościach (selektywnie), to otrzymujemy wówczas charakterystyczne widmo, które pokazuje, które fale ( ) i w jakim stopniu (A) zostały pochłonięte przez tę substancję. Widma absorpcyjne substancji barwnych w świetle widzialnym mają zwykle nieskomplikowany kształt krzywych dzwonowych, których maksimum występuje przy długości fali max odpowiedzialnej za obserwowaną barwę. A A max 400 500 600 700 800, nm widmo w świetle widzialnym (a) c krzywa wzorcowa (b) Rys. 2. (a) Przykładowe widmo w świetle widzialnym i (b) przykładowa krzywa wzorcowa (krzywymi przerywanymi zaznaczono odstępstwa absorbancji od prawa Lamberta-Beera) Przykład takiego widma przedstawiono na Rys. 2a dla roztworu o kolorze niebieskim. Widmo to pokazuje, że w zakresie światła widzialnego fale o różnych długościach 2
absorbowane są przez tę substancję w różnym stopniu, lecz w największym stopniu absorbowana jest fala o długości 630 nm ( max ) leżąca w obszarze koloru pomarańczowego (Rys. 1). Oznacza to, że w największym stopniu przepuszczana jest przez ten roztwór fala o długości odpowiadającej barwie dopełniającej do pomarańczowej, w rozważanym przypadku, barwie niebieskiej, którą widzi nasze oko. Reguła ta stosuje się do wszystkich substancji barwnych, tzn. substancje wykazują określoną barwę wskutek absorpcji fal, z których najbardziej absorbowana jest fala o długości odpowiadającej barwie dopełniającej ( max ) do barwy widocznej. W sposób przybliżony barwy dopełniające pokazuje znany ze szkoły krążek barw (Rys. 3), w którym barwy te znajdują się naprzeciw siebie. Z uwagi na fakt, że max daje najwyraźniejsze zmiany absorbancji zależne od stężenia tej substancji, to właśnie tę długość wykorzystuje się w analitycznych oznaczeniach spektrofotometrycznych. Rys. 3. Krążek barw (po obwodzie koła rozciągnięte jest widmo światła białego (Rys. 1); barwy dopełniające znajdują się w krążku naprzeciw siebie 1.2. Prawo Lamberta-Beera Jeżeli na próbkę o grubości l pada promieniowanie monochromatyczne (o jednej długości fali) o natężeniu I o, to część promieniowania zostanie rozproszona I r, część zostanie zaabsorbowana I a, a część zostanie przepuszczona przez tę próbkę I t, więc: I o = I r + I a + I t (1) W oznaczeniach analitycznych dbamy o to, by rozproszona część promieniowania I r była jak najmniejsza, wobec tego w dalszych rozważaniach można ją zaniedbać: I o = I a + I t (2) Stosunek natężenia promieniowania przepuszczonego przez ośrodek absorbujący światło I t do natężenia padającego I o, wyrażony w procentach nosi nazwę transmitancji: 3
T = I I t o (3) Natomiast absorbancja (użyta wcześniej na Rys. 2a) zdefiniowana jest jako: A = log T 1 = log I I o t (4) Absorpcję światła przez jednoskładnikowy ośrodek homogeniczny (np. roztwór wodny substancji barwnej) opisuje prawo Lamberta-Beera. Mówi ono, że absorbancja ośrodka absorbującego jest proporcjonalna do stężenia substancji absorbującej i do grubości warstwy, przez którą przechodzi promień: A = l c (5) gdzie jest współczynnikiem absorpcji, który jest wielkością charakterystyczną dla danej substancji (niezależną od stężenia, grubości warstwy absorbującej i natężenia promieniowania); l jest grubością warstwy, a c jest stężeniem substancji. Wymiar współczynnika jest skorelowany z wymiarem stężenia c. Zgodnie z równ. (5) graficzna zależność absorbancji A od stężenia c ma postać prostej o współczynniku kierunkowym równym l, przechodzącej przez początek układu współrzędnych (Rys. 2b). Prawo Lamberta-Beera jest podstawą zastosowań spektrofotometrii absorpcyjnej w oznaczeniach ilościowych. W oznaczeniach tych najczęściej stosuje się metodę krzywej wzorcowej zgodnie z równ. (5) (Rys. 2b). W tym celu należy wykonać następujące czynności: (i) przygotować serię roztworów badanej substancji o znanych stężeniach, (ii) dla jednego z roztworów wyznaczyć widmo, A w funkcji (np. jak na Rys. 2a) i z widma odczytać max, (iii) dla długości fali max zmierzyć absorbancje roztworów wzorcowych i wyznaczyć krzywą wzorcową, A w funkcji c (np. jak na Rys. 2b), (iv) zmierzyć absorbancję próbki badanej (dla max ) i z krzywej wzorcowej odczytać oznaczane stężenie. Krzywe wzorcowe nadają się do zastosowania najlepiej, gdy absorpcja światła przez oznaczany związek spełnia prawo Lamberta-Beera, tzn. krzywa ma przebieg prostoliniowy. Dla wyższych stężeń substancji często obserwuje się odstępstwa od prostoliniowości (zaznaczone przykładowo krzywymi przerywanymi na Rys. 2b); wtedy do oznaczeń wybieramy tylko część prostoliniową krzywej. 4
Do kolorymetrycznych oznaczeń wykorzystuje się barwę własną oznaczanej substancji, lub związku, w który ta substancja, jeśli bezbarwna, została stechiometrycznie przeprowadzona. Zaletą metod kolorymetrycznych jest duża szybkość wykonania oraz możliwość oznaczania czasami bardzo małych ilości substancji ze stosunkowo dużą dokładnością. Metody te są wykorzystywane bardzo często np. w diagnostyce medycznej, kontroli przemysłowej itp. Pomiary absorbancji wykonuje się przy użyciu spektrofotometrów. Należy pamiętać, że metody spektrofotometryczne z zastosowaniem krzywej wzorcowej są metodami porównawczymi, wobec czego dokładność oznaczeń przy ich użyciu zależy od właściwego przygotowania roztworów wzorcowych i dokładności pomiarów. 2. Wykonanie ćwiczenia instrukcja Na ćwiczenia proszę przynieść: papier milimetrowy, linijkę, zaostrzony ołówek i gumkę. Odczynniki i sprzęt: roztwór podstawowy soli żelaza(iii) o stężeniu 0,10 mg Fe 3+ /cm 3, 2 M HNO 3, 10 % KSCN, kolbki na 100 cm 3, pipety automatyczne; spektrofotometr w świetle widzialnym (obsługę spektrofotometru wyjaśni prowadzący w czasie pomiaru). Zasada oznaczenia: W celu kolorymetrycznego oznaczenia ilościowego jonów Fe 3+ przeprowadza się te jony w krwisto-czerwony rodanek (tiocyjanian) żelaza: Fe 3+ + 3 SCN Fe(SCN) 3 (6) Reakcję przeprowadza się w środowisku słabo kwaśnym. W tych warunkach oprócz rodanku żelaza w reakcji tej tworzą się kompleksy Fe(III) o różnym składzie: od [Fe(SCN)] 2+ do [Fe(SCN) 6 ] 3, również czerwone. Do oznaczenia zastosujemy metodę krzywej wzorcowej. Uwaga: Pracujemy w grupach 4-6-osobowych; sprawozdanie piszą studenci jedno na taką grupę. Przygotowanie roztworów wzorcowych i próbki do analizy: 1. Przygotować 8 kolbek miarowych o pojemności 100 cm 3, ponumerowanych od 0 do 7. W kolbkach od 0 do 6 przygotujemy roztwory wzorcowe o określonych stężeniach Fe 3+ do wyznaczenia krzywej wzorcowej. Roztwór w kolbce 0 będzie miał stężenie Fe 3+ równe 0 (jest to pełnoprawny punkt krzywej wzorcowej); roztwór ten zastosujemy jako tzw. próbę ślepą (roztwór porównawczy). W kolbce 7 natomiast studenci przygotują otrzymane do oznaczenia zadanie Fe 3+. Oddać czystą kolbkę 7 prowadzącemu na zadanie. 5
2. Do kolbek 1-6 odmierzyć pipetami automatycznymi kolejno 1,00; 2,00; 3,00; 4,00; 5,00 i 6,00 cm 3 roztworu podstawowego Fe 3+. Ponieważ roztwór podstawowy zawiera 0,10 mg Fe 3+ /cm 3, to po rozcieńczeniu odmierzonych objętości do 100 cm 3 otrzymamy następujące stężenia Fe 3+ wyrażone w mg/100 cm 3 : 0,10; 0,20; 0,30; 0,40; 0,50 i 0,60. 3. Do wszystkich kolbek 0-7 dodać pipetami automatycznymi po 2 cm 3 2 M HNO 3 i po 10 cm 3 10 % KSCN. Uważać, by pipetując nie przenosić roztworów z kolbki do kolbki (nawet mikro-ilości), zwłaszcza do kolbki 0, która ma nie zawierać Fe 3+ (nie może przyjąć koloru różowego). 4. Kolby dopełnić wodą destylowaną do kreski (pod kreskę z butli; do kreski, plastikową pipetką). Kolby zatkać korkami i roztwory dokładnie wymieszać. Pomiar widma absorpcyjnego dla kompleksu Fe-SCN i wyznaczenie max 5. Dla roztworu nr 4 zmierzyć absorbancje w zakresie długości fal od 400 do 600 nm w odstępach długości fal co 10 nm. Wyniki zanotować w Tabeli 1, a na papierze milimetrowym narysować widmo: A w funkcji. 6. Odczytać max, tj. długość fali, przy której występuje maksimum absorbancji dla kompleksów Fe-SCN. Wyznaczenie krzywej wzorcowej 8. Zmierzyć absorbancje roztworów wzorcowych 1-6 dla długości fali max wobec próby ślepej (roztwór 0). Wyniki zanotować w Tabeli 2, a na papierze milimetrowym narysować krzywą wzorcową, A w funkcji stężenia Fe 3+ (mg/100 cm 3 ); poprowadzić prostą (uwzględnić punkt zerowy krzywej wzorcowej). Uwaga: Do sprawozdania wyznaczyć równanie prostej metodą regresji liniowej (metodą najmniejszych kwadratów). Pomiar absorbancji dla próbki otrzymanej do analizy 9. Zmierzyć absorbancję próbki otrzymanej do analizy (kolba nr 7) dla długości fali max. Wynik zapisać w Tabeli 2. 10. Z prostej wzorcowej odczytać stężenie Fe 3+ (mg/100 cm 3 ) w próbce i sprawdzić u prowadzącego. Uwaga: W sprawozdaniu stężenie Fe 3+ obliczyć z równania prostej. Uwagi dotyczące bezpieczeństwa: HNO 3 jest substancją żrącą. Uważać, by nie zalać pipet automatycznych odmierzanymi roztworami. Postępowanie z odpadami: Wszystkie odpady wylać do zlewu. 6
Tabela 1. Widmo absorpcyjne kompleksu Fe-SCN w świetle widzialnym Długość fali, nm 400 410 420 430 440 450 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 Absorbancja Tabela 2. Krzywa wzorcowa Stężenie Fe 3+, mg/100 cm 3 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 analizowana próbka Absorbancja dla max 0,000 7
3. Sprawozdanie: 1. Krótko przedstawić zasadę wykonanego oznaczenia. 2. Krótko opisać wykonanie ćwiczenia. 3. Przedstawić wyniki pomiaru widmowego w postaci Tabeli 1 i wykresu A w funkcji. Podać wartość max. 4. Przedstawić wyniki pomiarów absorbancji do krzywej wzorcowej, w postaci Tabeli 2 i wykresu A w funkcji c Fe+3 (mg/100 cm 3 ). Do punktów eksperymentalnych dopasować prostą metodą regresji liniowej (metodą najmniejszych kwadratów) i podać jej równanie. 5. Z równania prostej wzorcowej obliczyć stężenie Fe 3+ 0,01 mg/100 cm 3 : prawo Lamberta-Beera: wyznaczona prosta: A = 0 + l c y = a + b x gdzie zmienna niezależna x = c, zmienna zależna y = A, a współczynniki prostej są następujące: punkt przecięcia z osią y, a 0, współczynnik kierunkowy prostej b = l. A Stąd c analizowanej próbki = _ próbki b a 6. Wynik analizy: Stężenie jonów Fe 3+ w otrzymanej próbce wynosiło.. mg/100 cm 3. 8