Regulacja transkrypcji genów eukariotycznych

Regulacja transkrypcji genów eukariotycznych

Definicja genu GEN- podstawowa jednostka dziedziczenia Region DNA, który określa charakterystyczną dziedziczoną cechę organizmu; zwykle koduje pojedyncze białko lub RNA. Zawiera całą funkcjonalną podjednostkę wraz z sekwencją kodującą, niekodującymi sekwencjami regulatorowymi DNA oraz z intronami. Molecular Biology of the Cell Forth Edition

Współczesne definicje odnoszą się do produktu, jakim jest transkrypt, i nie biorą pod uwagę białka Jak zawsze w biologii, istnieją wyjątki. Oto lista genów, które nie pasują do definicji odnoszącej się do transkryptu. Geny kodujący rybosomowe RNA ( 18S; 5,8 S, 28S ) jest transkrybowany w postaci pre-rrna 45S, następnie zachodzi rozcinanie cząsteczki RNA na fragmenty odpowiadające poszczególnym rodzajom rrna. Czy jest więc sens w tej sytuacji odnosić się do ko-transkrybowanych genów, jako do pojedynczego genu. Zamiast tego, genami możemy nazwać odcinki DNA odpowiadające pojedynczym jednostkom funkcjonalnym Trans-splicing: Istnieją geny w kawałkach. Transkrypt pochodzący z jednego fragmentu jest łączony z transkryptem z innego fragmentu, aby mógł powstać funkcjonalny RNA. Geny nakładające się: Niektóre geny nakładają się. Oznacza to, że pojedynczy fragment DNA może być częścią dwóch lub nawet trzech genów. Redagowanie RNA: Niekiedy pierwotny transkrypt ulega intensywnemu redagowaniu zanim stanie się transkryptem funkcjonalnym. W najbardziej skrajnych przypadkach dochodzi do wstawiania lub usuwania nukleotydów. Oznacza to, że zawartość informacyjna genu jest niepełna dla zapewnienia jego funkcjonalności i musi być uzupełniona z udziałem innych genów

Klasyczne wyobrażenie genu fragment DNA, który koduje funkcjonalny mrna Wszystkie transkrypty mrna mają niekodujące fragmenty 5 i 3 końcowe

Geny eukariotyczne Proces ekspresji genu składa się z wielu etapów Na każdym z etapów możliwe działanie regulacyjne Procesy transkrypcji i translacji są rozdzielone w przestrzeni i czasie Informacja kierująca syntezą białka może być modyfikowana po transkrypcji (alternatywne składanie, redagowanie) złożoność proteomu przekracza złożoność genomu

Etapy ekspresji/poziomy regulacji struktura chromatyny transkrypcja obróbka i kontrola jakości RNA transport RNA degradacja RNA translacja modyfikacje post-translacyjne degradacja białka

Transkrypcja Kluczowym etapem regulacyjnym większości genów jest transkrypcja Regulacja z reguły na poziomie inicjacji transkrypcji Czynniki cis sekwencje regulatorowe w obrębie promotorów i enhancerów (wzmacniaczy) Czynniki trans białka wiążące się z sekwencjami regulatorowymi (elementami cis)

Czynniki cis Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc.

Czynniki trans Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc.

3 (+1) główne polimerazy RNA Eukaryota polimeraza produkty wrażliwość na α-amanitynę Polimeraza I geny rrna (18S; 28S; 5,8S) Polimeraza II Polimeraza III hn/mrna, większość snrna (U1, U2, U4, U5), mirna małe RNA: trna, snorna, 5S rrna, U6 snrna nie wrażliwa bardzo wrażliwa umiarkowanie wrażliwa Polimeraza mitochondrialna

Skład podjednostkowy 3 głównych polimeraz RNA Eukaryota Polimeraza RNA E.coli Eukariotyczne polimerazy RNA Podjednostki typu β i β Podjednostki typu α Podjednostki wspólne Podjednostki specyficzne dla danej polimerazy CTD- C końcowa domena Pol II, o krytycznym znaczeniu dla transkrypcji

Polimeraza II Polimeraza II RNA rozplata nici DNA, syntetyzuje RNA i łączy ponownie obie nici DNA. Samodzielnie nie jest w stanie rozpoznać promotora genu i zainicjować transkrypcji. Do tego celu niezbędna jest obecność OGÓLNYCH CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc. U prokariontów geny są ciągłe, tj. kolinearne z ich mrna. U wyższych eukariontów geny są nieciągłe, tj. niekolinearne z ich mrna. Części genu ulegające ekspresji noszą nazwę eksonów, zaś sekwencje przedzielające eksony intronów.

Inicjacja transkrypcji Ogólne czynniki transkrypcyjne (podstawowe) wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora GTF ang. general transcription factor TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH

Podstawowe elementy cis Promotor rdzeniowy wiąże czynniki ogólne (podstawowe) kompleksu polimerazy II element TATA (wiązanie TBP) miejsce inicjacji Elementy promotora podstawowego wiążą czynniki wspólne dla wielu różnych promotorów i zapewniające podstawowy poziom transkrypcji element CAAT czynniki NF-1 i NF-Y element GC czynnik Sp1 oktamer czynnik Oct1

Pierwszy etap inicjacji transkrypcji przyłączenie ogólnego czynnika transkrypcyjnego TFIID TATA binding protein (TBP) w kompleksie z DNA w rejonie TATA-box TBP- składnik ogólnego czynnika transkrypcyjnego TFIID Molecular Biology of the Cell Forth Edition

Sekwencyjny model składania Kompleksu Preinicjacyjnego (PIC preinitiation complex) Aktywność transkrypcyjna na poziomie podstawowym, jeszcze nie regulatorowym CTD TBP RNA IIF polimerazapol II IIa -30 +1 TATA Inr TAFs } TFIIDor TBP IIA helicase IIH protein kinase IIB IIE IIE IIF IIB IIA Pol IIa TATA Inr IIH Kompleks preinicjacyjny ATP - hydroliza PIC IIE IIF IIB IIA Pol IIa TATA Inr IIH Kompleks inicjacyjny, DNA na I nukl. stopiony Aktywowany PIC TFII A, B, D,E, H, F Ogólne Czynniki Transkrypcyjne (GTF) Czynniki TAF składowe TFIID (ang. TBP Associated Factors) TATA TATA box sekwencja TATAAA rozpoznawana przez białko TBP Inr sekwencja inicjatorowa rozpoznawana przez białka TAF Polimeryzacja pierwszych kilku nukleozydotrifosforanów i fosforylacja CTD prowadzą do uwolnienia promotora.

Regulacja inicjacji transkrypcji Czynniki transkrypcyjne i koaktywatory Podstawowe wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora Specyficzne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej części promotora i w enhancerach

Specyficzne elementy cis promotorów i enhancerów Moduły odpowiedzi na sygnał np. moduł CRE odpowiedź na camp (czynnik transkrypcyjny CREB) Moduły specyficzne dla komórek i tkanek np. moduł mioblastowy rozpoznawany przez czynnik MyoD; moduł limfoblastoidalny czynnik NF-κB Moduły rozwojowe np. moduły Bicoid i Antennapedia D. melanogaster

Sekwencje wzmacjniajace i wyciszające Enhancery i Silencery Enhancery stsymulują transkrypcję, silencery hamują transkrypcję. Jedne i drugie działają niezależnie od orientacji, tj. odwrócenie ich sekwencji nie wpływa na efekt. Jedne i drugie działają niezależnie od miejsca położenia w genomie. Mogą działać na odległość w stosunku do promotora Enhancery wykrywa się nieomal wszędzie Jedne i drugie stanowią miejsce wiązania dla specyficznie regulowanych czynników transkrypcyjnych.

Regulacja kombinatoryczna W sekwencjach regulatorowych występują różne kombinacje elementów cis wiążących różne czynniki trans, co daje bardzo wiele możliwości regulacji przy udziale stosunkowo niewielkiej liczby regulatorów kombinatoryka Promotor ludzkiego genu insuliny

Alternatywny start transkrypcji Wiele genów wyższych eukariontów posiada wiele alternatywnych miejsc startu transkrypcji (promotorów), specyficznych tkankowo Dzięki temu z jednego genu powstają różne transkrypty i białka w różnych komórkach i tkankach móżdżek mięśnie siatkówka kom. Schwanna pozostałe tkanki kora Gen dystrofiny człowieka

Specyficzne czynniki transkrypcyjne

Struktura domenowa aktywatorów transkrypcji domena wiążąca DNA domena odpowiedzialna za dimeryzację domena aktywująca domena regulatorowa Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc.

Domeny wiążące DNA Palce cynkowe Helisa-skręt-helisa (H-T-H) np. homeodomena, domena HMG, domena PAU Helisa-pętla-helisa (H-L-H) i wiele innych

Domeny wiążące DNA Palec cynkowy Homeodomena zawiera domenę HTH (helisa-skręt-helisa) atlasgeneticsoncology.org/deep/images/tffig2.jpg Czynnik transkrypcyjny SP1

Dimeryzacja czynników transkrypcyjnych Suwak leucynowy Np. protoonkogeny rodziny c-fos i c-jun Rodzina CREB (camp response element binding protein)

Represory Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc.

Regulacja inicjacji transkrypcji Czynniki transkrypcyjne i koaktywatory Podstawowe wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora Specyficzne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej części promotora i w enhancerach Koaktywatory uczestniczą w aktywacji transkrypcji, ale nie wiążą się z DNA. Działają przez oddziaływania z białkami kompleksu transkrypcyjnego Kompleks mediatora jest ogólnym koaktywatorem polimerazy II

Mediator kompleks białkowy Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961 2007 by National Academy of Sciences

Polimeraza II RNA wraz z Mediatorem niezbędny do regulowanej transkrypcji absolutnie wymagany do transkrypcji większości genów eukariotycznych oddziałuje bezpośrednio z aktywatorami transkrypcji i polimerazą II RNA ważny zarówno dla pozytywnej jak i negatywnej regulacji transkrypcji Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961 2007 by National Academy of Sciences

Elongacja transkrypcji genów eukariotycznych jest ściśle związana z obróbką RNA Molecular Biology of the Cell Forth Edition

Domena CTD polimerazy II RNA koordynuje wydarzenia transkrypcyjne Domena CTD zawiera powtarzającą się sekwencję aminokwasową (YSPTSPS) Hyperfosforylacja domeny CTD determinuje nowy zestaw regulatorów przyłączających się do pol II i zaznacza przejście od inicjacji do elongacji transkrypcji. Zatrzymanie w pobliżu promotora i uwolnienie promotora; przejście do fazy produktywnej transkrypcji jest zależne od fosforylacji CTD Saunders et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 557 567 (August 2006) doi:10.1038/nrm1981

Terminacja i poliadenylacja CPSF- kompleks białkowy, czynnik specyficzności cięcia i poliadenylacji

Terminacja i poliadenylacja

Poliadenylacja Kontroluje (zwiększa) stabilność mrna Dotyczy większości mrna, wyjątkiem są mrna kodujące histony

Chromatyna - ważny element regulacji transkrypcji genów eukariotycznych http://www.accessexcellence.org/ab/gg/nucleosome.html

Proces transkrypcji genów eukariotycznych zachodzi w chromatynie. Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961 2007 by National Academy of Sciences

KOLEJNE STOPNIE KONDENSACJI CHROMATYNY http://www.us.elsevierhealth.com/simon/pollard/favoritefigs/w_earnshaw_favorite_figures.html

Dwa podstawowe stany chromatyny Heterochromatyna konstytutywna jest obecna stale w komórce, DNA wchodzący w jej skład nie zawiera genów, dzięki czemu zachowuje zwartą strukturę (obszary centromerów i telomerów) fakultatywna ta forma chromatyny pojawia się w jądrze okresowo i tylko w niektórych komórkach, prawdopodobnie zawiera geny nieaktywne w czasie niektórych faz cyklu komórkowego, W mitozie cały DNA występuje jako heterochromatyna Euchromatyna to luźno upakowana forma chromatyny, zawierająca geny aktywne transkrypcyjnie

Domeny funkcjonalne i izolatory Izolatory oddzielają domeny funkcjonalne w chromatynie Białka wiążące się z izolatorami uniemożliwiają interferencję regulatorów z sąsiedniej domeny (innych genów) Izolator Izolator

Obszary kontrolujące loci LCR (locus control regions) utrzymują domeny funkcjonalne otwarte, czyli aktywne transkrypcyjnie

Chromatyna preparaty mikroskopowe http://cellbio.utmb.edu/cellbio/nucleus2.htm

Struktura chromatyny DNA + związane białka 1. Histony (małe, zasadowe) 2. Niehistonowe białka regulatorowe We wszystkich stanach chromatyny białka są związane z DNA, a różnice strukturalne wynikają z różnego stopnia upakowania

PODSTAWOWE BIAŁKA BUDUJĄCE CHROMATYNĘ TO HISTONY najbardziej konserwowane ewolucyjnie białka u Eucariota Histony H3 i H4 : bogate w argininy, najbardziej konserwowane ewolucyjnie sekwencje białkowe Histony H2A i H2B : wzbogacone w lizyny, sekwencje konserwowane ewolucyjnie Histon H1 : bardzo bogaty w lizyny, sekwencja białkowa słabo konserwowana ewolucyjnie, związany z nukleosomem poza jego rdzeniem

Struktura Krystaliczna Nukleosomu Luger K, Mader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ. Nature 1997 Sep18;389(6648):251-60

Nukleosom zbudowany jest z rdzenia białkowego, z około 147 bp DNA owiniętego wokół rdzenia oraz z 50 bp DNA łącznikowego Rdzeń składa się z dwóch kopii każdego z histonów H2A, H2B, H3 i H4 Poza rdzeniem nukleosomu dołączony jest histon H1 DNA histon H1 histon H2A histon H2B histon H3 histon H4 http://fermat-2.cer.jhu.edu/~as410610/lecture_pdf/what_is_the_organization_of_a_eukaryote_.pdf

Regulacja dostępności chromatyny Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc.

Modyfikacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji 1. Metylacja DNA

Mechanizm metylacji DNA O SAM-CH SAM NH 3 5 2 6 1 H DNMT Cytozyna O NH 3 5 2 6 1 CH 5-Metylocytozyna

Metylacja DNA przyłączenie grupy metylowej do cytozyny (u ssaków metylacji podlegają głównie sekwencje CpG, do 10% cytozyn jest metylowanych u ssaków ) powoduje zamknięcie danego obszaru chromatyny może być podtrzymywana podczas podziałów komórkowych może powstawać de novo metylacja DNA a struktura chromatyny podtrzymywanie wzoru metylacji DNA

Przykład ewolucyjnego efektu epimutacji (zmiany we wzorze metylacji DNA) Lcyc kontroluje symetrię góradół kwiatu; u mutanta nieaktywny z powodu silnej, dziedziczonej metylacji From Cubas et al 1999, Nature 401: 157-161

Metylacja DNA odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji genów oraz w dziedziczeniu epigenetycznym Epigenetyczna regulacja genów to zjawisko polegajace na dziedziczeniu zmian w ekspresji genów, które są niezależne od zmian w sekwencji DNA Metylacja DNA jest znacznikiem epigenetycznym decydującym o prawidłowym zachodzeniu piętna genomowego (ang. genetic imprinting), znacznik ten powstaje w rozwijającym się oocycie i jest niezbędny do utrzymania mono-allelicznej ekspresji piętnowanego genu (np. gen Igf2 koduje czynnik wzrostowy, wyłącznie allel od ojca jest aktywny) Proces ten jest niezbędny do właściwego rozwoju. Metylacja DNA odgrywa podstawową rolę w inaktywacji chromosomu X. Dzięki inaktywacji jednego z chromosomów X, u samic tak jak i u samców aktywna jest tylko jedna kopia genów sprzężonych z płcią. Metylacja DNA utrzymuje się podczas mitozy, u zwierząt w procesie mejozy jest usuwana

Zmiany wzoru metylacji DNA w procesie nowotworzenia Charakterystyczną cechą komórek nowotworowych jest obniżony poziom metylacji DNA w skali całego genomu (hipometylacja) i jednoczesna hipermetylacja niektórych obszarów DNA www.nature.com/reviews/genetics

W komórkach nowotworowych hipermetylacja DNA zachodzi z dużo większą częstością niż mutacje Metylacja (10 2 10 3 genów) Inaktywacja Genu Mutacje (10 1 genów) www.zymoresearch.com 1-888-882-9682

http://www.epigenome.org/

Modyfikacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji 2. Kowalencyjne modyfikacje histonów rdzeniowych

Nukleosom Nature Reviews Molecular Cell Biology 4, 809-814 (October 2003) Timeline: Chromatin history: our view from the bridge Donald E. Olins 1 & Ada L. Olins Zasadowe N- i C-końce histonowe wystają na zewnątrz nukleosomu, ponad DNA owinięty na oktamerze białkowym. Są miejscem wielu potranslacyjnych modyfikacji

Enzymy modyfikujące histony rdzeniowe zależnie od ich aktywności mogą być aktywatorami bądź represorami transkrypcji S/T kinazy fosfatazy P S/T fosforylacja K Acetylotransferazy histonowe (HAT) Deacetylazy histonowe (HDAC) Ac K acetylacja K/R metylazy Me K/R metylacja demetylazy

Po-translacyjne modyfikacje histonów wg. B.Turner, Cell 2002

Ponad 60 miejsc modyfikowanych Możliwość mono-, di-, trimetylacji podnosi poziom skomplikowania systemu Nierównomierne rozmieszczenie na obszarze chromatyny Zależne od stanu komórki TEORIA KODU HISTONOWEGO

Mechanizm działania modyfikacji potranslacyjnych białek histonowych

Zmiana struktury chromatyny Hamowanie oddziaływania czynników białkowych Nowe miejsca wiązania dla czynników białkowych

Acetylacja histonów rdzeniowych rozluźnia strukturę chromatyny acetylacja deacetylacja Chromatyna staje się dostępna dla czynników transkrypcyjnych i polimeraz

Modyfikowane histony rekrutują specyficzne białka rozpoznających określone modyfikacje Tony Kozaurides, Cell 128 (2007) 693-705

Typowy wzór modyfikacji histonowych na aktywnym transkrypcyjnie genie Saunders et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 557 567 (August 2006) doi:10.1038/nrm1981

Wzór modyfikacji histonów rdzeniowych w komórkach niezmienionych i nowotworowych Komórka zdrowa Obszary bogate w geny Geny supresorowe Centromer Heterochromatyna Acetylacja Metylacja Komórka nowotworowa Obszary subtelomerowe Powtórzenia satelitarne Esteller, M., Nature 8:286-292, 2007

Metylacja DNA i potranslacyjne modyfikacje histonów rdzeniowych współzależą od siebie i mogą się wzajemnie indukować.

Modyfikacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji 3. Remodeling (przebudowywanie) struktury chromatyny

Regulacja struktury nukleosomowej chromatyny przesuwanie nukleosomów - zwalnianie dostępu do miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych

Aktywność wielopodjednostkowych kompleksów przebudowujących chromatynę zależy od ATP, w wyniku ich działania zmienia się sposób oddziaływania pomiędzy histonami, a DNA. Kompleksy remodelujące zaangażowane są zarówno w aktywację jak i represję transkrypcji (koaktywatory i korepresory transkrypcji)

SWI/SNF wielo-podjednostkowy kompleks remodelujący chromatynę

BSH BRM AtBRM SWI3 SWI3 SWP73A SWP73B Konserwowane funkcje biologiczne kompleksów SWI/SNF: Regulacja inicjacji oraz elongacji transkrypcji Rekombinacja homologiczna, naprawa DNA Regulacja cyklu komórkowego Regulacja procesów rozwojowych także u roślin Udział w szlakach sygnalizacyjnych uruchamianych przez hormony także u roślin

Przebudowa (remodelowanie) chromatyny Aktywność kompleksów przebudowujących chromatynę zależy od ATP, w wyniku ich działania zmienia się sposób oddziaływania pomiędzy histonami, a DNA. przesunięcie oktameru histonowego zmiana konformacji nukleosom ATP-zależna przebudowa chromatyny (remodeling) histony rdzeniowe usunięcie oktameru histonowego wymiana histonów w oktamerze Mohrmann & Verrijzer, Biochimica et Biophysica Acta 1681 (2005) 59-73

Zmiany w kompleksie SWI/SNF zidentyfikowane w różnych typach nowotworów człowieka Nowotwory Głowy i szyi Nowotwory ośrodkowego układu nerwowego Białaczki Nowotwory piersi Nowotwory płuc Nowotwory skóry Nowotwory nerek Neuroblastoma Nowotwory jelita grubego Nowotwory przewodu pokarmowego Nowotwory Jajników cervical Nowotwory prostaty Cancer Res 2009; 69: (21). November 1, 2009

Podstawowe modyfikacje zmieniające strukturę chromatyny Metylacja DNA (zamykanie obszarów chromatyny) Kowalencyjne modyfikacje histonów, np. acetylacja lub metylacja (kod histonowy) ATP-zależna przebudowa (remodeling) chromatyny- zmiana konformacji nukleosomów lub ich pozycji względem DNA, np. poprzez przesunięcie oktameru histonowego wzdłuż nici DNA