biofilm, oporność, antybiotyki, dezynfekcja Monika LEGINOWICZ * MECHANIZMY OBRONNE BIOFILMU PRZED ŚRODKAMI BAKTERIOBÓJCZYMI Biofilm, czyli błona biologiczna stanowiąca rezerwuar różnych mikroorganizmów to powszechny problem nie tylko w inżynierii środowiska, ale także w medycynie oraz przemyśle. W inżynierii środowiska stanowi on duży problem ze względu na to, że obrasta rury wodociągowe przez co odbiorcy wody użytkowej są narażeni na kontakt z być może występującymi tam drobnoustrojami chorobotwórczymi. To z kolei przekłada się na zwiększoną zachorowalność, a tym samym problemy w lecznictwie. Bofilm może tworzyć się praktycznie na każdej powierzchni. Zróżnicowane warunki środowiskowe oraz różnorodność gatunkowa drobnoustrojów występujących w obrostach mikrobiologicznych może sprzyjać dostatecznej ochronie przed środkami bakteriobójczymi, takimi jak dezynfektanty czy antybiotyki. Dlatego też zwalczanie powstałej błony biologicznej jest dużym problemem. Okazuje się bowiem, że mikroorganizmy występujące w formie zawieszonej są blisko 1000 razy bardziej wrażliwe na działanie substancji toksycznych niż te występujące w biofilmie. W artykule zamieszczono opis powstawania biofilmu oraz przedstawiono mechanizmy jakie błona biologiczna wykorzystuje do obrony przed środkami bakteriobójczymi, takimi jak dezynfektanty czy antybiotyki. 1. WSTĘP Biofilm to bardzo popularne zjawisko występujące w środowisku. Tworzy się on na różnego rodzaju materiałach i praktycznie na każdej powierzchni, gdzie tylko drobnoustroje mają dostęp do wody. Składa się z wielu gatunków bakterii tworzących błonę biologiczną w postaci hydrożelu. Struktura biofilmu stabilizowana jest dzięki substancjom polimerowym wydzielanym pozakomórkowo (EPS - extracellular polymeric substances). Drobnoustroje wchodzące w skład obrostu mikrobiologicznego wykazują odmienne cechy oraz specjalizują się w pełnieniu innych funkcji niż komórki występujące w postaci wolnej. Skupiska mikroorganizmów są mniej narażone * Politechnika Wrocławska, Wydział Inżynierii Środowiska, Instytut Inżynierii Ochrony Środowiska, Pl. Grunwaldzki 9, 50-377 Wrocław.
332 M. LEGINOWICZ na działanie niekorzystnych czynników zewnętrznych oraz mają lepszy dostęp do substancji odżywczych. Wynika z tego, że biofilm w przeciwieństwie do wolnych komórek bakteryjnych może funkcjonować w warunkach, w których tamte by nie przeżyły [10, 13, 15, 17, 18]. Zjawisko obrostów mikrobiologicznych może mieć zarówno pozytywne jak i negatywne skutki. Do pozytywów można zaliczyć czynny udział biofilmu w samooczyszczaniu się wód powierzchniowych, podziemnych oraz gruntowych. Błonę biologiczną wykorzystuje się także w procesach oczyszczania ścieków, gazów, gruntów oraz wody. Jednakże powstawanie takich skupisk mikroorganizmów ma wady w innych aspektach, takich jak gospodarka czy medycyna. Spadek stabilności biologicznej wody w sieci dystrybucji powoduje zasiedlanie rur przez różne gatunki drobnoustrojów tworzących biofilm. Jest to zagrożeniem dla odbiorców wody, ponieważ mogą tam występować mikroorganizmy chorobotwórcze. Zjawisko to może być skutkiem zmniejszenia przepływu wody w wodociągach z powodu zwiększenia szorstkości powierzchni oraz wzmożonej korozji mikrobiologicznej. W medycynie błona biologczna tworzy się na przykład na cewnikach, implantach chirurgicznych. Mikroorganizmy, które występują w obrostach mikrobiologicznych przez większą inwazyjność są zdolne do wywoływania groźnych zakażeń. W przemyśle biofilm tworzy się na produktach żywnościowych, co powoduje ich psucie się oraz zakażenia konsumentów [5, 16, 17, 18]. Mikroorganizmy tworzące biofilm charakteryzują się zwolnionym metabolizmem oraz podlegają zmianom fenotypowym co skutkuję tym, że są one bardziej odporne na działanie środków bakteriobójczych takich jak dezynfektanty, surfaktanty oraz antybiotyki [2, 11, 14, 19]. 2. POWSTAWANIE BIOFILMU Formowanie się biofilmu to proces wieloetapowy, który zależy od budowy i właściwości materiału skolonizowanego, a także od właściwości mikroorganizmów. Tylko niektóre drobnoustroje wykazują zdolności adhezyjne. Ogólnie tworzenie się błony biologicznej podzielone jest na cztery etapy, z czego faza dojrzewania podzielona jest na dwa (rys.1) [3, 12, 16, 17]. W pierwszym etapie bakterie wiążą się wstępnie z powierzchnią słabymi wiązaniami van der Waalsa, pozostając w stałym kontakcie z wodą. Jest to proces odwracalny i jeśli szybko usunie się osadzone drobnoustroje, nie przylgną one do powierzchni na stałe. W przypadku pozostawienia ich na danym materiale, przy pomocy elementów komórkowych takich jak np. rzęski, pile, przyczepią się na trwałe umożliwiając gromadzenie się innym bakteriom. Jest to kolejny etap zwany adhezją nieodwracalną. Podstawową rolę odgrywają w tym procesie zewnątrzkomórkowe polimery
Mechanizmy obronne biofilmu przed środkami bakteriobójczymi 333 (EPS), tworząc zręby matrycy, która nadaje określoną strukturę powstającej błonie biologicznej [1, 5, 7, 11, 12]. Rys. 1. Etapy powstawania biofilmu: 1. adhezja odwracalna; 2. adhezja nieodwracalna; 3. pierwszy etap dojrzewania; 4. drugi etap dojrzewania; 5. dyspersja pojedynczych komórek W trzecim etapie następuje namnażanie oraz stopniowe różnicowanie drobnoustrojów. Mikroorganizmy niezdolne do adhezji są przyczepiane do podłoża. Zaczyna się tworzyć trójwymiarowa struktura biofilmu. Zmieniają się cechy fenotypowe bakterii, dostosowane do warunków i potrzeb tworzącej się kolonii, co powoduje, że komórki bakteryjne żyjące w błonie biologicznej różnią się od ich form planktonowych [1, 5, 7, 11, 12]. W ostatnim etapie błona biologiczna ma na tyle rozbudowaną strukturę, że traci istniejącą formę. Jej elementy, na skutek działania sił ścinających, są odrywane i następuje migracja komórek bakteryjnych do otoczenia. Przy sprzyjających warunkach cały proces tworzenia błony biologicznej może zacząć się od początku w dalszych odcinkach sieci [1, 5, 7, 11, 12]. 3. MECHANIZMY OBRONNE BIOFILMU PRZED ŚRODKAMI BAKTERIOBÓJCZYMI Struktura biofilmu sprawia, że komórki bakteryjne w niej żyjąca są bardziej oporne na działanie środków bakteriobójczych, ponieważ wolniej dyfundują one do głębszych warstw błony bakteryjnej. Do zwiększonej oporności przyczynia się także materiał otoczki (głównie EPS), która jest bezpośrednią ochroną przed środkami antymikrobiologicznymi. Chroni ona również biofilm przed zmianami ciśnienia osmotycznego, ph środowiska, przed wysuszeniem oraz fagocytozą. Matryca EPS odpowiedzialna jest również za dezaktywację działania promieniowania UV. Otoczki bakterii żyjących w zawiesinie, a tych z obrostów mikrobiologicznych różnią się właściwościami. Należy także pamiętać, że zawieszone mikroorganizmy w przeci-
334 M. LEGINOWICZ wieństwie do komórek błony biologicznej mają styczność z bakteriocydami całą powierzchnią komórki. Na oporność wpływa także aktywność białek o właściwościach pomp (drug efflux pumps), które u bakterii gramujemnych rozpoznają np. różnego typu antybiotyki usuwając je z cytoplazmy [5, 6, 7, 14, 15]. Niedobór źródeł pokarmowych to kolejny czynnik zwiększonej oporności biofilmu. Aktywne drobnoustroje, w przypadku braku pożywienie wykorzystują jako pokarm składniki obumarłych komórek. Dlatego po działaniu na błonę biologiczną np. dezynfektantem może ona powrócić do poprzedniego stanu nawet w ciągu kilku godzin. Mniejsza zawartość tlenu w głębszych warstwach biofilmu powoduje zwolnienia tempa wzrostu mikroorganizmów. Wolnorosnące drobnoustroje są mniej wrażliwe na czynniki szkodliwe niż te szybkorosnące. Toksyczne związki nie są w stanie szybko penetrować do wnętrza obrostu mikrobiologicznego, a spowolniony wzrost bakterii ułatwia uruchomienie aparatu enzymatycznego do naprawy uszkodzeń wywołanych przez bakteriocydy. Dzięki temu rozkład toksyn przez enzymy jest znacznie szybszy niż ich dyfuzja do wnętrza biofilmu [4, 6, 7, 14, 15]. Kolejnym mechanizmem obronnym wytworzonym przez błonę biologiczną jest zmiana metabolizmu i ekspresja materiału genetycznego. Drobnoustroje uruchamiają różnorodne procesy genetyczne, które eliminują szkodliwy wpływ czynników bakteriobójczych lub naprawiają powstałe uszkodzenia. Może to być związane z obecnością bakteriocydu bądź ekspresją odpowiednich genów, odpowiedzialnych za neutralizację czynnika antymikrobiologicznego. Dzięki temu komórki potomne uwalniane do środowiska zewnętrznego posiadają już oporność na czynniki szkodliwe [1, 3, 4, 5, 19]. Stosowanie środków dezynfekcyjnych bądź długotrwałe działanie antybiotykami powoduje indukcję punktowych mutacji genów bakterii błony biologicznej, które przyczyniają się do zwiększenia oporności komórek i rozwoju szczepów opornych na te środki bakteriobójcze [5, 14, 16]. W oporności biofilmu a także jego tworzeniu dużą rolę odgrywa zjawisko quorum sensing (sygnalizacja zagęszczenia), czyli wzajemne porozumiewanie się mikroorganizmów. Zjawisko to oparte jest na tworzeniu autoinduktorów (sygnalizatorów zagęszczenia), czyli sygnałów chemicznych oraz obecności białek zdolnych do odbioru tych sygnałów. Dzięki autoinduktorom drobnoustroje wiedzą ile osobników danego gatunku znajduje się w środowisku. Quorum sensing może zachodzić miedzy jednym lub różnymi gatunkami mikroorganizmów. Procesy metaboliczne i fizjologiczne w strukturze obrostu mikrobiologicznego są harmonizowane przy udziale tego mechanizmu. Po wysłaniu sygnału następuje indukcja ekspresji genów i równocześnie we wszystkich komórkach danej populacji następuje efekt metaboliczny. Dzięki temu zjawisku regulowane są także takie procesy jak różnicowanie komórek, wirulencja, produkcja enzymów i toksyn, replikacja DNA, biosynteza metabolitów wtórnych, sporulacja. Procesy metaboliczne i fizjologiczne w strukturze biofilmu są harmonizowane przy udziale tego mechanizmu [1, 2, 8, 9, 14, 15].
Mechanizmy obronne biofilmu przed środkami bakteriobójczymi 335 4. PODSUMOWANIE Biofilm może zasiedlać praktycznie każdą powierzchnię. Do jego tworzenia się wystarczą mikroorganizmy posiadające zdolności adhezyjne oraz niewielka ilość wody. Twór ten wyspecjalizował wiele mechanizmów obronnych, dzięki którym jest oporny na czynniki szkodliwe. Konwencjonalne metody walki z błoną biologiczną, takie jak działanie antybiotykami czy dezynfetantami, są nieefektywne. A próba działania większymi dawkami mimo skuteczności może być szkodliwa dla środowiska bądź konsumentów. Dlatego też należy jak najlepiej poznać tworzenie się oraz funkcjonowanie obrostu mikrobiologicznego, aby znaleźć najbardziej efektywne metody walki z nim. LITERATURA [1] BAQUERO F., MARTINEZ J.L., CANTO R.: Antibiotics and antibiotic resistance in water environments. Current Opinion in Biotechnology, 2008, Vol. 19, 260 265. [2] BARTOSZEWICZ M., RYGIEL A., Biofilm jako podstawowy mechanizm zakażenia miejsca operowanego - metody prewencji w leczeniu miejscowym, Chirurgia Polska, 2006, Vol. 8, No. 3, 171-178. [3] BŁASZCZYK M.K.: Mikrobiologia środowisk. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2010. [4] GARBIŃSKA-ŁONIEWSKA A., Mikroorganizmy chorobotwórcze i potencjalnie chorobotwórcze w ekosystemach wodnych i sieci wodociągowej, Wyd. Seidel-Pzywecki, Warszawa 2010. [5] KOŁWZAN B., Analiza zjawiska biofilmu - warunki jego powstawania i funkcjonowania, Ochrona Środowiska, 2011, Vol. 33, No. 4, 1-12. [6] KOZIOŁ-MONTEWKA M., Mikrobiologiczne przyczyny niepowodzeń w antybiotykoterapii zakażeń układu oddechowego,dostępne pod adresem: http://pml.strefa.pl/epubli/179/18.pdf. [7] ŁEBKOWSKA M., Występowanie bakterii antybiotykoopornych w wodzie przeznaczonej do spożycia przez ludzi, Ochrona Środowiska, 2009, Vol. 31, Nr 2, 11-15. [8] MATEJCZYK M., SUCHOWIERSKA M., Charakterystyka zjawiska QUORUM SENSING i jego znaczenie w aspekcie formowania i funkcjonowania biofilmu w inżynierii środowiska, Civil and Environmental Engineering, 2011, Vol. 2, Budownictwo inżynieria środowiska, 71-75. [9] MYSZKA K., CZACZYK K., Mechanizm QUORUM SENSING jako czynnik regulujący wirulencję bakterii gam-ujemnych, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (online), 2010, Vol. 64, 582 589. [10] MYSZKA K., CZACZYK K., Rola egzopolisacharydów mikrobiologicznych w technologii żywności, ŻYWNOĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2004, Vol. 4, 18-29. [11] PIERŚCIENIAK M., TRZCIŃSKA N., SŁOMCZYŃSKI T., WĄSOWSKI J., Problemy wtórnego zanieczyszczenia wody wodociągowej, Ochrona Środowiska i Zasobów Naturalnych, 2009, No. 39, 28-39. [12] SAŁEK A., Powstawanie biofilmu w warunkach przemysłowych. CZ. 1. Mechanizm formowania biofilmu i jego struktura, http://www.international-bio-consulting.com/pdf/biofilm%20- %20Part%201.pdf. [13] SITARSKA M., TRACZEWSKA T., Wzrost mikroorganizmów na PE i PCW w środowisku wody wodociągowej, Ochrona przed Korozją. 2006, Vol. 49, No. 9s/A, 100-104.
336 M. LEGINOWICZ [14] STEWART P.S., COSTERTON J. W., Antibiotic resistance of bacteria in biofilms, dokument dostępny na stronie: http://instructional1.calstatela.edu/tsalmas/micr%20331/stewart%20and% 20Costerton%202001.pdf. [15] THIEN-FAH C., MAH and GEORGE A. O'TOOLE, Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents, TRENDS in Microbiology, 2001, Vol. 9, No. 1, 34-39. [16] TRACZEWSKA T., BIEDROŃ I., CIUPAK K., DŻUGAJ D., PIEKARSKA K., PIĘTA P., SITARSKA M., TRUSZ-ZDYBEK A., SZCZEPANIK Z., Biosensor do kontroli mikrobiologicznej stabilności wody wodociągowej, W: Czujniki i sensory do pomiarów czynników stanowiących zagrożenia w środowisku: monografia projektu POIG.01.03.01-02-002/08. Cz. 1 : Praca zbiorowa pod red. Waldemara E. Grzebyka, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2011. [17] TRACZEWSKA T., SZCZEPANIK Z., PIEKARSKA K., TRUSZ-ZDYBEK A., RUCKI Z., SITARSKA M., BIEDROŃ I., Deposition of tap water bacteria on conductive surfaces - measurement possibilities, In: Microorganisms in the environment andenvironmental engineering from ecology to technology, Krystyna Olańczuk-Neyman, Hanna Mazur-Marzec. Gdańsk; Gdynia: The Committee of Environmental Engineering Polish Academy of Science, 2010, No. 64, 203-215. [18] TRACZEWSKA T., SZCZEPANIK Z., PIEKARSKA K., RUCKI Z., TRUSZ-ZDYBEK A., SITARSKA M., BIEDROŃ I.: Metody elektryczne badania stanu bakteriologicznego wody. W: Metrologia dziś i jutro, pod red. Jerzego Jakubca, Zbigniewa Moronia, Henryka Juniewicza. Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2010, 281-290. [19] XI CH., ZHANG Y., MARRS C. F., YE W., SIMON C., FOXMAN B., NRIAGU J., Prevalence of Antibiotic Resistance in Drinking Water Treatment and Distribution Systems, Applied and environmental microbiology, 2009, 5714 5718. MECHANISMS OF DEFENSIVE BIOFILMS BEFORE BACTERICIDES Biofilm is a biological membrane where live varied microorganisms. Biofilm is a very big problem not only in environmental engineering, but also in medicine. In environmental engineering bifilm is a problem because it overgrow water conduits and consumers are exposed to contact with pathogenic microorganisms. That can be very big problem in treatment, because morbidity rate is bigger. Article describes how biofilm come into being and how it has mechanisms of defensive before bactericides (disinfectants and antibiotics).