Zgodnie z ogólnie przyjętą konwencją, geny na schematach przedstawia się od lewej do prawej, w kierunku transkrypcji. Nić DNA z taką samą sekwencją nukleotydów jak RNA, tzw. nić kodującą, pokazuje się u góry, 5 końcem po lewej i 3 końcem po prawej; dla wygody pokazuje się często tylko ją. Nić DNA komplementarną do mrna nazywa się nicią matrycową, bo służy jako matryca w procesie transkrypcji. Termin odcinek (sekwencja) po stronie 5 lub 3 - odnosi się do sekwencji nukleotydowych, odpowiednio, poprzedzających i następujących po regionie kodującym.
geny mają różną orientację
holoenzym prokariotycznej pol RNA, RNAP, 465 kda: rdzeń zdolny do elongacji transkrypcji, α 2 ββ α 40 kd gen rpoa składanie enzymu β 155 kda gen rpob wiązanie nukleotydu β 160 kda, gen rpoc wiązanie matrycy podjednostka σ niezbędna do inicjacji transkrypcji (32-90 kda, σ 70 gen rpod), rozpoznaje i specyficznie wiąże elementy promotora : elem. -10 i -35
C-terminalna domena (CTD) podjednostki α prokariotycznej pol RNA oddziałuje zarówno z wyżej położonymi specyficznymi sekwencjami regulatorowymi (UP) w DNA jak i białkowymi aktywatorami
rodzaje podjednostek σ gen specyficzność sekw. -35 odstęp sekw. -10 σ 70 rpod ogólna TTGACA 16-19 pz TATAAT σ 32 rpoh szok cieplny CCCTTGAA 13-15 pz CCCGATNT σ 28 flia wić CTAAA 15 pz GCCGATAA σ 54 rpon głód azotowy CTGGNA 6 pz TTGCA http://www.faculty.biol.ttu.edu/densmore/mb06pdfs/mb.06.lect26.%20chap%2016.pdf
aktywatory podjedn. σ 54 wiążą się daleko (nawet ³kb) powyżej m-sca +1 dla genu syntetazy glutaminy (glna) aktywatorem σ 54 jest NtrC!!! http://departments.oxy.edu/biology/ Stillman/bi221/102700/notes.htm
pol RNA E. coli z lewej rdzeń po prawej holoenzym Images from analysis by Seth Darst. http://oregonstate.edu/instruct/bb492/lectures/transcription.html
terminacja transkrypcji u Prokariota niezależna zależna od rho http://www.stat.berkeley.edu/users/terry/classes/ s260.1998/week12/week12/img5.gif http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/microbialgenetics/topics /chroms-genes-prots/rho-polarity.html
NEGATYWNA I POZYTYWNA REGULACJA OPERONU LAC CRP i represor lac są białkami HTH http://departments.oxy.edu/biology/stillman/bi221/102700/notes.htm CRP-cAMP i RNAP działają kooperatywnie w wiązaniu do promotora
Podwójna regulacja operonu trp - represja przez represor aktywowany korepresorem (trp) Lehninger, Biochemistry, 2000
Podwójna regulacja operonu trp - represja przez represor aktywowany korepresorem (trp) - atenuacja transkrypcji Lehninger, Biochemistry, 2000
w operonie ara to samo białko AraC działa jako represor lub aktywator zależnie od obecności arabinozy, która zmienia jego konformację http://departments.oxy.edu/biology/stillman/bi221/102700/notes.htm
obecność białek antyterminatorowych pozwala RNAP kontynuować transkrypcję poza terminator tak regulowana jest kaskada wczesnych, opóźnionych i późnych genów w cyklu litycznym faga λ
obecność białek antyterminatorowych pozwala RNAP kontynuować transkrypcję poza terminator tak regulowana jest kaskada wczesnych, opóźnionych i późnych genów w cyklu litycznym faga λ
porównanie transkrypcji pro- i eukariotycznej BAKTERIE ZWIERZĘTA jednostka transkrypcyjna policistronowa monocistronowa (?!) inicjacja pol RNA wiąże się do DNA szybkość elongacji ~ 40 nt/s ~ 40 nt/s 5 koniec ppp metylowana czapeczka tworzenie 3 końca terminacja uwalnia RNA cięcie uwalnia RNA 3 koniec ostatni kodowany nukleotyd poly(a) transport niepotrzebny niezbędny translacja ~ 45 nt/s ~ 20 nt/s półokres trwania mrna <5 min >4 godz ilość rybosomów/mrna >20 >10
czas PROKARIOTA EUKARIOTA 0 pol RNA wiąże się do DNA i rozpoczyna transkrypcję 0,5 ukazuje się wolny koniec 5 rybosomy łączą się z mrna rozpoczyna się translacja <1 modyfikacja 5 końca hnrna natychmiast po jego powstaniu 1,5 rybosomy podążają za pol RNA z podobną szybkością, za nimi postępuje degradacja 5 końca mrna 2 terminacja transkrypcji, uwolnienie mrna z bąbelka transkrypcyjnego 3 degradacja postępuje w kierunku 3 końca w miarę jak rybosomy kończą 5 polrna nie terminuje, lecz kontynuuje transkrypcję poza koniec genu 6 w wyniku cięcia endonukleolitycznego powstaje 3 koniec hnrna 25 dodanie poly(a) do 3 końca, usuwanie intronów (o ile nie zostały usunięte podczas transkrypcji) >4 h transport do cytoplazmy, translacja na rybosomach
procesy transkrypcji i dojrzewania transkryptu są sprzężone Orphanides i Reinberg 2002 Cell 108: 439-451
porównanie homologii podjednostek pol RNA pro- i eukariotycznych Lodish i in., 2000 Molecular Cell Biology, 4th ed. New York: W. H. Freeman
inicjacja transkrypcji u Eukariota wymaga * odpowiedniej pol RNA * jej ogólnych czynników transkrypcyjnych (TFI, II, III) * specyficznych czynników transkrypcyjnych (np. SRB) * oddziałujących z nimi i pol RNA mediatorów, kompleksów HAT (np. SAGA) i kompleksów remodelujących (np. SWI/SNF) Adapted from: Holstege et al. 1998 Cell 95: 717-728
http://www.bx.psu.edu/~ross/workmg/txnpromotersch11.htm
http://www.bx.psu.edu/~ross/workmg/txnpromotersch11.htm wiązanie ogólnych czynników transkrypcyjnych UBF i SL1 do promotora dla pol I RNA
terminacja transkrypcji przez pol I RNA 4-etapowy proces: (i) (ii) (iii) (iv) czynnik TTF-I wiąże element Sal Box na matrycy to powoduje pauzowanie pol I RNA co umożliwia czynnikowi PTRF (ang. Polymerase I and transcript release factor) oddziaływanie z potrójnym kompleksem i powoduje uwolnienie pre-rrna, pol I RNA i TTF-I http://www.reactome.org/cgi-bin/eventbrowser?db=gk_current&focus_species=homo%20sapiens&id=73863&
pol III RNA największa jądrowa pol RNA 600-700 kd typy promotorów dla po III RNA 5S rrna trna U6 snrna, 7SK RNA http://oregonstate.edu/instruction/bb492/figletters/figaz2.html PSE ang. proximal sequence element ICR ang. internal control region wiązanie TFIIIA, B, C i pol III RNA do promotorów Schramm & Hernandez 2002 Genes & Dev 16: 2593-2620
dir2.nichd.nih.gov/.../maraia%20page2.html terminacja transkrypcji przez pol III RNA
dwie ogólne części promotora dla pol II RNA http://www.bx.psu.edu/~ross/workmg/txnpromotersch11.htm sekwencja konsensusowa elem. TATA (Lodish et al., 2000).
m-sca wiązania tych samych czynników transkrypcyjnych występują w różnych kombinacjach w promotorach i enhancerach różnych genów zachowywaniu sekwencji kodujących nie towarzyszy konserwowanie promotorów Levin Genes VIII Pericuesta i in. 2006 Reprod Biol & Endocrinol 4:5
CTD (domena C-końcowa, ang. C-terminal domain) największej podjedn. pol II RNA koordynuje transkrypcję i dojrzewanie pre-mrna zawiera powtórzenia (drożdże 26, ssaki 52) heptapeptydu (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser) Ser i Thr są substratami dla kinaz m.in. TFIIH, ich fosforylacja aktywuje pol II RNA, CTD jest też miejscem wiązania licznych białek zw. srb lub mediatorami Orphanides, Reinberg 2002 Cell 108: 439-451
etapy inicjacji transkrycji przez pol II RNA Lodish i in. 2000 Molecular Cell Biology. WH Freeman & Co
Orphanides, Reinberg 2002 Cell 108: 439-451 NELF (ang. negative elongation factor) i DSIF (ang. 5,6-dichloro-1-D-ribofuranosylbenzimidazole sensitivity-inducing factor) są składnikami N-TEF (ang. negative transcription elongation factor). Enzymy dodające czapeczkę wiążą się poprzez oddziaływanie z P Ser5 CTD i DSIF. P-TEFb (ang. positive transcription elongation factor b) złożony z kinazy Cdk9 i jednej z cyklin CycT1, CycT2 lub CycK fosforyluje DSIF (N-TEF się odłącza) i Ser2 CTD.
dojrzewanie 5 końca transkryptów pol II RNA etapy dodawania 7mG czapeczki (ang. cap, capping) 5 pppnpnp Pi ppnpnp GTP PPi GpppNpNp CH 3 -GpppNpNp CH 3 -GpppNpNp CH 3 3 fosfataza transferaza guanylowa 7-metylo transferaza guaniny 2-O-metylo transferaza
rodzaje 7mG czapeczek czapeczkowanie zachodzi gdy transkrypt ma ok. 25 nt do struktury cap wiąże się CBC (ang. cap binding complex) złożony z białek CBP20 i CBP80 cap zabezpiecza przed 5 RNazami (dzięki wiązaniu 5-5 ), jest wymagana do eksportu z jądra i wiązania rybosomów w cytoplazmie, stymuluje poliadenylację i splicing Większość snrna jest syntetyzowana przez pol II RNA i standartowo czapeczkowana w jądrze. Po przejściu do cytoplazmy wiążą specyficzne białka, ich cap jest dodatkowo modyfikowana i staje się (2,2,7)m 3 G, po czym są reimportowane do jądra. 138.192.68.68/.../EukaryoticTranscription.html
dojrzewanie 3 końca transkryptów pol II RNA * cięcie i poliadenylacja * użycie alternatywnych miejsc poliadenylacji * dojrzewanie pre-mrna histonów przy udziale U7 snrnp * różnice dodawania poly(a) u drożdży
cięcie i poliadenylacja DNA 5'...AATAAA..(20 zasad)..ca...ttgtgtgttg..3' 3'...TTATTT...GT...AACACACAAC..5' RNA 5'...AAUAAA.(20 zasad)...ca...uuguguguug..3' sygnał poliadenylacji m-sce cięcia m-sce dodania poly (A) region bagaty w GU Lodish i in. 2000 Molecular Cell Biology. WH Freeman & Co CPSF (ang. cleavage and polyadenylation specificity factor) wiąże sekw. AAUAAA, 4 podjedn. (160, 100, 70, 30 kda), CstF (ang. cleavage stimulation factor) wiąże region bogaty w GU, 3 podjedn. (77, 64, 50 kda) CFI (ang. cleavage factor I) 3 podjedn. (68+59+25 kda albo 25 2 + (68 lub 59) kda) CFII (ang. cleavage factor II) wiąże CFI i CPSF, 2 podjedn. (200, 47 kda) PAP (ang. poly(a) polymerase) 82 kda, ma 3 formy wynikające z alternatywnego splicingu (PAP I, PAP II, PAP III), może działać powoli lub szybko, być może regulowana fosforylacją 33 kda PABPII (ang. poly(a) binding protein II), co indukuje szybkie działanie PAP ( w cytoplazmie PABPII jest zastępowane cytoplazmatycznym 70 kda PAB I)
CPSF 30 50 100 CstF 73 64 77 5'-GpppG AAUAAA G/U 3' 160 CPSF 30 100 73 50 CstF 64 5'-GpppG AAUAAA 77 G/U 3' 160 CPSF 30 100 73 50 CstF 64 5'-GpppGAAUAAA 77 G/U 3' 160 PAP 82 CFI CFII sphere.bioc.liv.ac.uk:8080/bio/studyweb/modules/biol402/lectures/dr_turner/lecture02
CPSF etap 1 - cięcie 30 100 73 50 CstF 64 5'-GpppG AAUAAA 77 G/U 3' 160 PAP 82 CFI CPSF CFII 30 cleavage 100 50 CstF 73 64 77 5'-GpppG AAUAAA G/U 3' 160 PAP 82 CFI CFII 5'-GpppG etap 2 - poliadenylacja sphere.bioc.liv.ac.uk:8080/bio/studyweb/modules/biol402/lectures/dr_turner/lecture02 PAB II AAAA A PAB II 30 A A A 100 73 A A PAB II A AAUAAA A AA PAB II 160 PAP 82 PAB II A AAAAA A A PAB II AAAAAA AA PAB IIPAB II
sprzężenie czynników transkrypcji i poliadenylacji od momentu tworzenia PIC udokumentowane interakcje białko-białko Calvo i in.2003 Genes Dev 17: 1321-1327
użycie alternatywnych miejsc poliadenylacji zróżnicowana ekspresja białek wiążących RNA gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) ma 7 m-sc poly(a) rozciągniętych na > 5 kb, transkrypcja zachodzi poprzez nie wszystkie i kończy się 1 kb poniżej ostatniego w przypadku genu kalcytoniny/cgrp użycie alternatywnych miejsc poliadenylacji jest ściśle powiązane z alternatywnym splicingiem http://departments.oxy.edu/biology/stillman/bi221/111300/processing_of_hnrnas.htm
Phillips i in. 2001 EMBO J 20: 6443 6452 alternatywny splicing & poliadenylacja są też powiązane ze sobą w przypadku dojrzewania transkryptów genu IgM w komórkach B jest wysoki poziom białka hnrnp F(H,H'), które wiąże się do (GU) n i jest negatywnym regulatorem użycia sec-pa poprzez blokowanie wiązania tam CstF64 w komórkach plazmatycznych poziom hnrnp F(H,H') jest niski a zdolność wiązania CstF64 wysoka Veraldi i in. 2001 Mol & Cell Biol 21: 1228-1238
dojrzewanie 3 końca pre-mrna histonów cięcie bez poliadenylacji pre-mrna histonów tworzy blisko 3 końca strukturę stem-loop, poniżej niej zawiera sekw. komplementarną do U7 snrna - parowanie pre-mrna z U7 snrnp wyznacza m-sce cięcia przez CPSF-73 poprzez kontakt pomiędzy białkami Sm proteins i podjedn. CstF Białka SM, wspólne z spliceosomalnymi snrnp, zaznaczono na niebieskozielono, a na niebiesko Lsm10 i Lsm11 specyficzne dla U7 Kolev i Steitz 2005 Genes Dev 19:2583-2592