Bazy danych jako źródło informacji o strukturze i funkcji biomolekuł Przed ćwiczeniami należy zapoznać się z proponowaną literaturą, zwracając szczególną uwagę na zagadnienia: 1. Aminokwasy białkowe: wzory strukturalne, nazwy, skróty jedno- i trzyliterowe. Sposoby klasyfikacji aminokwasów. Wiązania peptydowe. Sekwencja białka. 2. Oddziaływania stabilizujące strukturę białek. Struktura pierwszo-, drugo-, trzecioi czwartorzędowa białka oraz oddziaływania stabilizujące każdą ze struktur. 3. Typy układów krystalograficznych, grupy przestrzenne symbolika międzynarodowa elementów symetrii oraz typów sieci Bravais ego. 4. Typy struktur zdeponowane w bazie PDB. Metody wyznaczania struktur makromolekuł. Typy informacji o strukturach dostępne w bazie PDB. Na ocenę z ćwiczenia (maksymalnie 10 punktów), składają się: 1) 0 3 punktów uzyskane w trakcie, krótkiego (15-minutowego) pisemnego kolokwium (3-4 krótkie pytania opisowe lub testowe) dotyczącego zagadnień, z którymi należało zapoznać się przed przystąpieniem do ćwiczenia, 2) 0 7 punktów uzyskane za opracowanie sprawozdania/raportu. Szablon raportu znajduje się na końcu instrukcji. Ćwiczenie wykonywane jest w parach. Przynajmniej jedna osoba z pary powinna mieć wydrukowaną instrukcję. Część 1. Organizacja bazy PDB Przejdź do strony głównej Protein Data Bank (www.pdb.org). 1. Odszukaj i podaj aktualną liczbę struktur zdeponowanych w PDB oraz datę ostatniej aktualizacji bazy. Odszukaj też informacje na temat tzw. cząsteczki miesiąca. Krótko opisz jaka to jest makrocząsteczka i jakie pełni funkcje. 2. Jakie rodzaje statystyk udostępnione są na stronach PDB? Analizując dostępne statystki (Search PDB Statistics) określ: a) jakie są trzy najpopularniejsze grupy przestrzenne obserwowane dla struktur makromolekuł? Do jakich układów krystalograficznych należą te grupy? b) do jakiego zakresu maksymalnej rozdzielczości należy najwięcej struktur zdeponowanych w PDB? c) ile struktur makrocząsteczek pochodzących z organizmu człowieka dostępnych jest obecnie bazie PDB? 3. Zwróć uwagę na zakładki znajdujące się z lewej strony na stronie głównej PDB: a) Deposit b) Search c) Visualize d) Analyze e) Download f) Learn Opisz krótko jakie informacje można znaleźć w każdej zakładce. Prowadzący: dr Joanna Loch, Zespół Biokrystalografii, pok. 109 Zespół Biokrystalografii, Wydział Chemii UJ 1
4. W zakładce Learn Understanding PDB Data Looking at Structures/Resolution, znajduje się wiele użytecznych informacji dotyczących struktur zdeponowanych w PDB. Zapoznaj się z nimi i krótko wyjaśnij (w języku polskim): a) jaka jest różnica pomiędzy jednostką asymetryczną a cząsteczką biologiczną, b) o czym mówi rozdzielczość podawana dla struktur wyznaczonych za pomocą dyfrakcji promieni X? c) co to są i o czym mówią wskaźniki udokładniania R oraz R free Część 2. Informacje strukturalne zawarte w PDB 1. Korzystając z opcji prostego wyszukiwania (okienko wyszukiwarki na górze strony) odszukaj wszystkie struktury arylosulfataz (arylsulfatase). Podaj symbol (PDB ID) najstarszej wyznaczonej struktury arylosulfatazy oraz rozdzielczość, z jaką została ona wyznaczona. 2. Kliknij w ID tej struktury i sprawdź według jakich kryteriów zostały podzielone wszystkie dostępne informacje na temat danej struktury? Sprawdź jakie informacje zawarte są w kolejnych zakładkach, które pojawiają się gdy wyświetlamy konkretną strukturę. Analizując informacje dla wybranej wcześniej struktury arylosulfatazy, podaj: a) metodę wyznaczenia tej struktury, b) odnośnik literaturowy do publikacji, w której opisana jest struktura, c) datę zdeponowania i udostępnienia struktury, d) grupę przestrzenną, parametry sieciowe, wskaźniki R i R free, e) jakie ligandy można znaleźć w strukturze tego białka, f) z jakiego organizmu źródłowego pochodzi białko? g) czy jest to białko naturalne czy rekombinowane? h) masę cząsteczkową białka. W jakich jednostkach została ona podana? i) liczbę aminokwasów w białku, j) warunki i metodę krystalizacji wykorzystaną do otrzymania kryształów tego białka, k) do jakiej klasy struktur, według klasyfikacji baz SCOP i CATH, należy ta struktura? Część 3. Tworzenie raportów wyszukiwań Białka często tworzą różne formy krystaliczne. Wyszukaj, jakie są znane formy krystaliczne dla albuminy (albumin). W tym celu: 1. Wybierz opcję Advanced Search Query type Macromolecule name i wpisz albumin. Wyszukaj odpowiednie struktury, klikając Result Count. Ile struktur zostało znalezionych? 2. Definiowanie dodatkowych kryteriów wyszukiwań (Add Search Criteria). Zmodyfikuj wyszukiwanie albumin tak, aby zostały znalezione tylko struktury ludzkiej albuminy osocza (serum albumin) wyznaczone przy pomocy dyfrakcji promieni X. Ile struktur zostało znalezionych? Prowadzący: dr Joanna Loch, Zespół Biokrystalografii, pok. 109 Zespół Biokrystalografii, Wydział Chemii UJ 2
3. Utwórz raport z wyników tego wyszukiwania Reports Customizable Table, uwzględniający tylko grupy przestrzenne, w których krystalizuje ludzka albumina i rozdzielczość wyszukanych struktur. Wykorzystując utworzony raport, odpowiedz Ile różnych grup przestrzennych zostało znalezionych? Wypisz ich symbole. Do jakich układów krystalograficznych należą? 4. Jaka jest najwyższa rozdzielczość, z którą wyznaczono strukturę ludzkiej albuminy? Wypisz PDB ID tej struktury. Kiedy została zdeponowana ta struktura? Czy białko to przyłącza ligandy? Jeśli tak to wypisz ich 3-literowe kody i podaj nazwy. Część 4. Baza PDBsum 1. Bazą powiązaną tematycznie z PDB jest PDBsum, dostępna pod adresem: http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/. Odszukaj w PDBsum strukturę o PDB ID: 1HXW. Struktura jakiego białka kryje się pod podanym PDB ID? 2. Jaki ligand jest związany do tego białka? Z jakimi resztami aminokwasowymi oddziałuje? 3. Odszukaj w PDBsum strukturę arylosulfatazy analizowaną w części 1 i 2 ćwiczenia. Podaj ile aminokwasów zawiera najdłuższa i najkrótsza helisa alfa w cząsteczce tego białka. Podaj sekwencję aminokwasową helisy nr 17 (skróty jedno- i trzyliterowe nazw aminokwasów) Podaj ile mostków disiarczkowych zawiera ta cząsteczka. Wypisz numery reszt cysteiny pomiędzy którymi tworzą się wiązania S-S. 4. Odszukaj także numer EC klasy enzymów, do których należy arylosulfataza. Wyjaśnij jakiego typu reakcja jest katalizowana przez enzymy tej klasy. Część 5. Bazy sekwencji białkowych Obok PDB, który jest najpopularniejszym bankiem gromadzącym struktury makrocząsteczek, istnieją także bazy danych gromadzące sekwencje białek. Najpopularniejsze z nich to UniProt (www.uniprot.org) i NCBI protein (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein). Podczas ćwiczenia wykorzystamy bazę UniProt. 1. Odszukaj w bazie UniPtor sekwencję ludzkiej arylosulfatazy B. Podaj ID tej sekwencji. 2. Wypisz numery reszt zaangażowanych w oddziaływanie z kofaktorem (jonem metalu). Jaki to metal? 3. Jakie choroby związane są z nieprawidłowym działaniem tego enzymu? Wyjaśnij jakie są źródła tego schorzenia(eń) i jakie są jego(ich) objawy? 4. Ile reszt aminokwasowych zawiera sekwencja arylosulfatazy? Ile reszt przypada na peptyd sygnałowy, a ile na "dojrzałą" cząsteczkę białka? Prowadzący: dr Joanna Loch, Zespół Biokrystalografii, pok. 109 Zespół Biokrystalografii, Wydział Chemii UJ 3
5. W cząsteczce arylosulfatazy występują modyfikacje post-translacyjne, są to m. in. gilozylowane reszty aminokwasowe. Wypisz numery reszt, które są glikozylowane w cząsteczce arylosulfatazy B. 6. Czy ludzka arylosulfataza B ma naturale warianty różniące się od siebie sekwencją? Jeśli tak, to wymień trzy dowolne warianty i miejsca oraz typy mutacji w nich występujące? 7. Co to jest format FASTA i co zawierają pliki zapisywane w tym formacie? Część 6. Samodzielna praca z bazami danych Wykonanie poleceń/zadań dostarczonych przez prowadzącego zajęcia. Część 6. Program PyMOL Istnieje wiele programów pozwalających na wyswietlanie trójwymiarowych struktur makrocząsteczek. Jednym z najpopularniejszych jest program PyMOL, który w stosunkowow prosty sposób pozwala na tworzenie wysokiej jakości kolorowych rysunków reprezentujących struktury makrocząsteczek. Aby wyświetlić cząsteczkę w programie, najpierw należy pobrać plik.pdb (lub.cif) ze strukturą, np. z PDB. 1. Odszukaj w PDB strukturę hemoglobiny o PDB ID: 3OZV. Z jakiego organizmu pochodzi to białko? 2. Pobierz plik PDB ze strukturą tej cząsteczki i zapisz na dysku: Download Files PDB file (text). 3. Otwórz plik w programie PyMOL. Zmień reprezentację, w której wyświetlana jest struktura (lines) na reprezentację cartoon, w tym celu, kliknij: 3OZV hide everything 3OZV show cartoon actions show 4. Pokoloruj na różne kolory łańcuchy A i B białka, wpisz w terminalu komendy: select chain_a, chain a select chain_b, chain b hide label color a następnie dla zdefiniowanych obiektów wybierz kolory: chain_a C reds red chain_b C blues blue 5. Jakie ligandy zostały wykrystalizowane razem z tym białkiem? Sprawdź z PDB, wypisz ich trójliterowe kody, a następnie spróbuj wyświetlić je w programie PyMOL. Użyj komendy typu: select DGG, resn DGG, dla każdego zidentyfikowanego liganda. Następnie każdy z ligandów, wyświetl w reprezentacji sticks, i pokoloruj według gotowych schematów kolorów dostępnych w PyMOLu, np. Prowadzący: dr Joanna Loch, Zespół Biokrystalografii, pok. 109 Zespół Biokrystalografii, Wydział Chemii UJ 4
DGG S sticks DGG C by element CHNOS Ligand PO4 pokaż w reprezentacji spheres. Pamiętaj o regularnym zapisywaniu efektów swojej pracy, gdyż program nie zapisuje automatycznie zmian w trakcie pracy, nie pyta też o zapisanie zmian przez zamknięciem!!! 6. Definiowanie obiektów. Zdefiniuj obiekt dla łańcucha A, wpisz komendę: create obj chain_b_surface, chain b, a następnie wyświetl jego powierzchnię: chain_a_surface S surface 7. Zaznaczanie. Zaznacz reszty otaczające jon PO 4 3-. Zidentyfikuj i zmierz w strukturze oddziaływania, zaznaczone na rysunku poniższym rysunku. Wpisz komendę, wybierające odpowiednie reszty według rysunku: select PO4_env, resi 310+311+312+ 313 and chain a Aby aktywować funkcję mierzenia odległości, kliknij, w zakładkach: wizard measurement, a następnie kliknij na odpowiednie atomy oraz wyświetl je w reprezentacji sticks: S sticks, 8. Zmień, tło na białe, a następnie umieść w sprawozdaniu dowolny, rysunek struktury 3OZV, w tym celu: display background white 9. Naciśnij przycisk Ray na bocznym panelu i poczekaj aż program skończy renderowanie, jakość rysunku powinna się znacznie poprawić 10. Zapisz rysunek: file Save Image. Można też zapisać całą sesję: File Save Session Prowadzący: dr Joanna Loch, Zespół Biokrystalografii, pok. 109 Zespół Biokrystalografii, Wydział Chemii UJ 5
11. Sprawdź, też jaki funkcje programu, i rodzaje wyświetlania są ukryte w zakładce actions. Zwróć uwagę na możliwości szybkiej zmiany reprezentacji struktury oraz na możliwości szybkiego kolorowania, np. Preset Color simple b factor putty ligand sites by ss helix, sheet, loop Spectrum b-factors Literatura 1. Jeremy M. Berg, Lubert Stryer, John L. Tymoczko. Biochemia. PWN, wydanie 2003 i nowsze 2. Berman et al. The Protein Data Bank. Acta Cryst. (2002) D58:899-907 3. H. Weissig, P.E. Bourne. Protein structure resources. Acta Cryst. (2002) D58:908-915. 4. H.M. Berman, G.J. Kleywegt, H. Nakamura, J.L. Markley. The future of the protein data bank. Biopolymers (2013) 99(3): 218 222 5. P.W. Rose et al. The RCSB Protein Data Bank: new resources for research and education. Nucleic Acids Research (2013) 41:D475 D482. Prowadzący: dr Joanna Loch, Zespół Biokrystalografii, pok. 109 Zespół Biokrystalografii, Wydział Chemii UJ 6
Sprawozdanie z ćwiczenia: Bazy danych jako źródło informacji o strukturze i funkcji biomolekuł Osoby wykonujące: 1.... Data wykonania:... 2.... Ocena:... Części 1-5 należy wypełnić ręcznie podczas zajęć Część 1. Organizacja bazy PDB 5. Aktualna liczba struktur zdeponowanych w PDB:... Data ostatniej aktualizacji bazy:... Cząsteczka miesiąca, nazwa:... funkcja:............... 6. Statystyki w PDB: a)......... b)... c)... 7. Zwróć uwagę na zakładki znajdujące się z lewej strony na stronie głównej PDB: a) Deposit:...... Prowadzący: dr Joanna Loch, Zespół Biokrystalografii, pok. 109 Zespół Biokrystalografii, Wydział Chemii UJ 7
b) Search:...... c) Visualize:...... d) Analyze:...... e) Download:...... f) Learn:...... 8. Krótko wyjaśnij (w języku polskim): a) jaka jest różnica pomiędzy jednostką asymetryczną a cząsteczką biologiczną............ b) o czym mówi rozdzielczość podawana dla struktur wyznaczonych za pomocą dyfrakcji promieni X?............ Prowadzący: dr Joanna Loch, Zespół Biokrystalografii, pok. 109 Zespół Biokrystalografii, Wydział Chemii UJ 8
c) co to są i o czym mówią wskaźniki udokładniania R oraz R free :.................. Część 2. Informacje strukturalne zawarte w PDB 3. Podaj symbol (PDB ID) najstarszej wyznaczonej struktury arylosulfatazy oraz rozdzielczość, z jaką została ona wyznaczona.:...... 4. Analizując informacje dla wybranej wcześniej struktury arylosulfatazy, podaj: l) metodę wyznaczenia struktury:...... m) odnośnik literaturowy do publikacji, w której opisana jest struktura: n) datę zdeponowania i udostępnienia struktury: o) grupę przestrzenną, parametry sieciowe, wskaźniki R i R free : p) jakie ligandy można znaleźć w strukturze tego białka: Prowadzący: dr Joanna Loch, Zespół Biokrystalografii, pok. 109 Zespół Biokrystalografii, Wydział Chemii UJ 9
q) z jakiego organizmu źródłowego pochodzi białko? r) czy jest to białko naturalne czy rekombinowane:... s) masę cząsteczkową białka:... t) liczbę aminokwasów w białku:... u) warunki i metodę krystalizacji wykorzystaną do otrzymania kryształów: v) do jakiej klasy struktur, według klasyfikacji baz SCOP i CATH, należy ta struktura? Część 3. Tworzenie raportów wyszukiwań 5. Ile struktur zostało znalezionych?... 6. Ile struktur zostało znalezionych?... 7. Ile różnych grup przestrzennych zostało znalezionych?... Wypisz ich symbole. Do jakich układów krystalograficznych należą? Prowadzący: dr Joanna Loch, Zespół Biokrystalografii, pok. 109 Zespół Biokrystalografii, Wydział Chemii UJ 10
8. Jaka jest najwyższa rozdzielczość, z którą wyznaczono strukturę ludzkiej albuminy?... Wypisz PDB ID tej struktury.... Kiedy została zdeponowana ta struktura?... Czy białko to przyłącza ligandy? Jeśli tak to wypisz ich 3-literowe kody i podaj nazwy. Część 4. Baza PDBsum 5. Odszukaj w PDBsum strukturę o PDB ID: 1HXW. Struktura jakiego białka kryje się pod podanym PDB ID? 6. Jaki ligand jest związany do tego białka? Z jakimi resztami aminokwasowymi oddziałuje? 7. Ile aminokwasów zawiera najdłuższa i najkrótsza helisa alfa w cząsteczce tego białka: Podaj sekwencję aminokwasową helisy nr 17: Ile mostków disiarczkowych zawiera ta cząsteczka?... Wypisz numery reszt cysteiny pomiędzy którymi tworzą się wiązania S-S....... Prowadzący: dr Joanna Loch, Zespół Biokrystalografii, pok. 109 Zespół Biokrystalografii, Wydział Chemii UJ 11
8. Numer EC:... Wyjaśnij jakiego typu reakcja jest katalizowana przez enzymy tej klasy. Część 5. Bazy sekwencji białkowych 8. Podaj ID tej sekwencji:... 9. numery reszt zaangażowanych w oddziaływanie z kofaktorem: Jaki to metal?... 10. Jakie choroby związane są z nieprawidłowym działaniem tego enzymu? Wyjaśnij jakie są źródła tego schorzenia(eń) i jakie są jego(ich) objawy? 11. Ile reszt aminokwasowych zawiera sekwencja arylosulfatazy? Ile reszt przypada na peptyd sygnałowy, a ile na "dojrzałą" cząsteczkę białka?... 12. Wypisz numery reszt, które są glikozylowane w cząsteczce arylosulfatazy B. 13. Wymień trzy dowolne warianty i miejsca oraz typy mutacji w nich występujące: Prowadzący: dr Joanna Loch, Zespół Biokrystalografii, pok. 109 Zespół Biokrystalografii, Wydział Chemii UJ 12
14. Co to jest format FASTA i co zawierają pliki zapisywane w tym formacie? Część 6. Samodzielna praca z bazami danych Polecenia należy samodzielnie opracować i dołączyć do części wypełnianej ręcznie. Część 7. Program PyMOL Polecenia należy samodzielnie wykonać, a rysunek dołączyć do części wypełnianej ręcznie. Prowadzący: dr Joanna Loch, Zespół Biokrystalografii, pok. 109 Zespół Biokrystalografii, Wydział Chemii UJ 13