Anna Litwiniec 1, Beata Choińska 1, Aleksander Łukanowski 2, Żaneta Świtalska 1, Maria Gośka 1 1 Zakład Genetyki i Hodowli Roślin Korzeniowych, Pracownia Biotechnologii, Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin Państwowy Instytut Badawczy Radzików, Powstańców Wielkopolskich 10, 85-090 Bydgoszcz, a.litwiniec@ihar.bydgoszcz.pl 2 Katedra Entomologii i Fitopatologii Molekularnej, Zakład Fitopatologii Molekularnej Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy im. Jana i Jędrzeja Śniadeckich w Bydgoszczy
Rizomania jest chorobą buraka powodowaną przez wirus nekrotycznego żółknięcia nerwów (Beet necrotic yellow vein virus - BNYVV), Beta vulgaris ssp. maritima którego wektorem jest Polymyxa betae. Skuteczna metoda genetycznej ochrony hodowla odpornościowa; źródła odporności pochodzą z materiałów buraka dzikiego. Dalsze badania poświęcone identyfikacji nowych źródeł odporności, P. betae w korzeniu buraka możliwości ich przeniesienia, kombinacji w jednej odmianie oraz rozumienia istniejących ograniczeń, poznania i modelowania mechanizmów odporności.
WSTĘP c.d. Identyfikacja polimorfizmów w genomie Wybór sekwencji starterowych wykazujących obecność polimorfizmów Identyfikacja odrębnych źródeł odporności
Zastosowanie markerów molekularnych segregujących z odpornością/podatnością na rizomanię, wyselekcjonowanych w toku uprzednio prowadzonych badań na materiałach dzikich buraków w celu oceny ich potencjalnej użyteczności w ocenie materiałów hodowlanych buraka cukrowego (reakcje PCR, HRM). Wdrożenie reakcji PCR na wcześniejszych etapach porażania materiału wirusem nekrotycznego żółknięcia nerwów buraka BNYVV zamiast standardowo stosowanego testu ELISA w celu skrócenia cyklu hodowlanego.
MATERIAŁ BADAWCZY Materiały badawczy do analiz obejmują materiały hodowlane dostarczone przez hodowców KHBC Sp. z o.o.: 1 Homo RR RWD11 18, 2 - Homo RR RWD11 10, 3 - Homo RR RWD10 143, 4 - Homo RR RWD11 28, 5 - Homo RR RWD10 121, 6 - Homo RR RWD10 125, 7 - Homo RR RWD11 8, 8 - Homozyg rr FMS 07 1, 9 - Homozyg rr FMS 08 4, 10 - Hetero Rr FMS 07 1 x RWD10 125, 11 - Hetero Rr FMS 084 x RWD 11 8, 12 - Hetero Rr FMS 071 x RWD 10 143, 13 - Hetero Rr FMS 084 x RWD11 28, 14 - Hetero Rr FMS 084 x RWD 11 18, 15 - Hetero Rr FMS 071 x RWD10 121, 16 - Hetero Rr FMS 084 x RWD11 10.
Z materiałów po pełnym okresie porażenia pobierano do analiz DNA oraz RNA liście oraz korzenie, odpowiednio. Izolacja DNA - metoda Davisa, RNA - metoda kolumienkowa. Odwrotna transkrypcja z zastosowaniem startera oligodt. Reakcje PCR z zastosowaniem wybranych uprzednio sekwencji prowadzono w następujących warunkach: 1ng/µl DNA, 2,5 mm MgCl 2 (Thermo Scientific), 0,2 mm dntp (Thermo Scientific), 1 µm specyficznych starterów (Genomed), 0,56 u DreamTaq Polymerase (Thermo Scientific), 1x Taq bufor z (NH 4 ) 2 SO 4 (Thermo Scientific) i woda PCR do 10 µl reakcji. Rozdział produktów reakcji na 1,5% żelu agarozowym wybarwionym bromkiem etydyny. Dokumentacja żeli, szacowanie wielkości produktów (system dokumentacji - Gel Doc TM 2000, BIO-RAD; oprogramowanie - Quantity One, wersja 4.0.3). Analiza real-time PCR z zastosowaniem modułu względnej analizy ilościowej z użyciem LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche Applied Science), względem genu aktyny. Analiza HRM była prowadzona w module skanowania genu (LightCycler 480) z użyciem Luminaris Color HRM Master Mix (Thermo Scientific). Z zastosowaniem programu RestrictionMapper wersja 3 dokonano projektowania cięcia restrykcyjnego wybranych produktów PCR celem weryfikacji obecności określonych wariantów sekwencyjnych (identyfikacja haplotypów wyodrębnionych w toku HRM). Produkty cięcia rozdzielano na 2,7% żelu agarozowym. Sekwencjonowanie wybranych produktów PCR. Celem detekcji BNYVV oraz P. betae po skróconym okresie porażenia pobierano korzenie roślin począwszy od 3 tygodnia wzrostu roślin w systemie imersyjnym zawierającym wirus i wektor. Następnie dokonano izolacji RNA oraz przeprowadzono odwrotną transkrypcję i PCR zgodnie z opisaną powyżej metodyką.
A) B1) Ryc.1. Ocena fenotypowa badanych materiałów po pełnym okresie porażenia z zastosowaniem real-time PCR analiza relatywna BNYVV względem genu aktyny.
Ryc.2. Ocena fenotypowa badanych materiałów po pełnym okresie porażenia z zastosowaniem real-time PCR analiza relatywna Polymyxa betae względem genu aktyny.
Ryc.3. Zróżnicowanie badanych materiałów - detekcja SNP towarzyszących Rz2.
Ryc.4. Zróżnicowanie badanych materiałów - detekcja SNP towarzyszących Rz1.
Ryc.5. Brak zróżnicowania badanych materiałów - detekcja SNP towarzyszących odporności.
A B Ryc.6. Brak zróżnicowania badanych materiałów - detekcja SNP towarzyszącego odporności, weryfikacja substytucji A-T z pomocą cięcia enzymami restrykcyjnymi. A brak produktu cięcia (99 pz), B) produkt cięcia typowy dla źródeł Rz1 Rz2 (80 pz oraz 19 pz).
Ryc.7. Zróżnicowanie badanych materiałów - detekcja SNP istotnego dla źródła Rz1.
A B Ryc.8. Zróżnicowanie badanych materiałów - detekcja SNP towarzyszącego odporności, weryfikacja substytucji C-T z pomocą cięcia enzymami restrykcyjnymi. Brak produktu cięcia (251 pz) w przypadku SNP typowego dla Rz1, produkty cięcia typowy dla Rz2 i S (177 pz oraz 74 pz).
A B Ryc.9. Zróżnicowanie poziomu BNYVV po skróconym okresie porażenia w badanych materiałach. A analiza po 1,5 miesiąca wzrostu roślin w warunkach porażenia, B analiza po miesiącu w warunkach porażenia.
Ryc.11. Obecność wybranych sekwencji specyficznych potencjalnie związanych z odpornością na rizomanię. Zgodnie z uprzednimi doniesieniami produkt o wielkości ok. 490 pz powstający w reakcji PCR może być związany z odpornością.
A B C Ryc.11. Względna analiza ilościowa BNYVV względem genu aktyny. A profil fluorescencja względem cyklu dla BNYVV, B profil fluorescencja względem cyklu dla aktyny, C wykresy słupkowe analizy względnej BNYVV/aktyna.
A B C Ryc.12. Względna analiza ilościowa Polymyxa betae względem genu aktyny. A profil fluorescencja względem cyklu dla P. betae, B profil fluorescencja względem cyklu dla aktyny, C wykresy słupkowe analizy względnej P. betae/aktyna.
Ryc.13. System prowadzenia doświadczeń umożliwiający wczesną ocenę fenotypową oraz badanie rozwoju symptomów infekcji w czasie w warunkach porażenia.
WYNIKI c.d. A B C Ryc.14. Zmiany poziomu produktu PCR w czasie porażenia odzwierciedlające zmiany ekspresji jednego z genów, którego aktywność może być istotna dla hamowania rozwoju infekcji oraz interakcji z patogenami BNYVV/P. betae. A detekcja wirusa i wektora po 3 i 4 tygodniach wzrostu w warunkach porażenia, B detekcja liść/korzeń cdna badanego genu po 4 tygodniach od momentu zainicjowania porażenia, B po 5 i 6 tygodniach.
A Ryc.15. Zróżnicowanie badanych materiałów detekcja SNP towarzyszącego Rz1. A z zastosowaniem HRM, B z zastosowaniem RFLP. B
Ryc.16. Zróżnicowanie badanych materiałów detekcja SNP towarzyszących Rz2.
Ryc.16. Zróżnicowanie badanych materiałów detekcja SNP towarzyszących Rz2.
Na podstawie przeprowadzonych analiz możliwe jest wyselekcjonowanie materiałów posiadających polimorfizmy istotne dla odporności na rizomanię. Opracowano i przetestowano markery SNP mające zastosowanie do detekcji polimorfizmów związanych z odpornością na rizomanię w badanych materiałach hodowlanych, dokonano molekularnej charakterystyki materiałów różniących się odpornością dostarczonych przez hodowców, m.in. wyselekcjonowano materiały homo- i heterozygotyczne. Potwierdzono skuteczność technik RFLP oraz HRM w identyfikacji wybranych polimorfizmów. Wykazano obecność opisywanych SNP, ale również dodatkowych dotychczas nieopisywanych, wykazujących segregację w badanych materiałach, w rejonie, w którym znajdują się również SNP opisywane jako towarzyszące Rz2. Przeprowadzone analizy fenotypowe i genotypowe wskazują na obecność różnych źródeł odporności w badanych populacjach. Konieczna dalsza weryfikacja.
Zastosowanie i dalsza optymalizacja wcześniejszej detekcji BNYVV oraz P. betae są istotne dla możliwości skrócenia cyklu selekcyjnego. Doskonalenie narzędzi fenotypowania ma znaczenie dla poszukiwania nowych źródeł odporności ze względu na możliwość selekcji szczególnie cennych obiektów. Badania zostały zrealizowane w 2015 i 2016 roku jako część zadania 2.4. Programu Wieloletniego IHAR-PIB na lata 2015-2020.