Streszczenie pracy doktorskiej mgr inż. Donaty Zaczyńskiej Promotor pracy: dr hab. inż. Grażyna Budryn Promotor pomocniczy pracy: dr inż. Joanna Oracz Interakcje preparatów białkowych z kwasami chlorogenowymi ziarna kawy w badaniach modelowych i prozdrowotnych produktach żywnościowych W pracy podjęto nowatorskie badania dotyczące zastosowania kompleksów inkluzyjnych kwasów chlorogenowych i β-cyklodekstryny. Dotychczas tego typu kompleksy w technologii żywności były wykorzystywane gównie do utrwalania aromatów. Dalsze próby dotyczyły ograniczenia ciemnienia enzymatycznego soków owocowych i warzywnych. Inne badania sukcesywnie donosiły o konsekwencjach obecności polifenoli w żywności dla przyswajalności białek i samych polifenoli. Biorąc pod uwagę dane literaturowe, wskazujące na ograniczanie interakcji między białkami enzymatycznymi a inkludowanymi polifenolami zbadano, czy inkluzja będzie ograniczała także interakcje polifenoli z innymi białkami żywności. Celem projektu była charakterystyka interakcji, jakie zachodzą między białkami i hydrolizatami białkowymi a ekstraktami zawierającymi kwasy chlorogenowe o wysokiej aktywności antyoksydacyjnej. Otrzymano surowy ekstrakt wodny ziarna kawy zielonej (SEKZ), w którym zawartość kwasów chlorogenowych (KCH) wynosiła 32,37%. SEKZ został oczyszczony metodą przeciwprądowej chromatografii podziałowej, dzięki czemu zawartość KCH wzrosła do 56,35% i wyeliminowano kofeinę. Do oczyszczenia ekstraktu wybrano mieszaninę woda:etanol:octan etylu w proporcji 5:1:4. Wyznaczono stężenia poszczególnych KCH w EKZ metodą LC-MS n. Około 90% stanowiły monoestry, w tym 75% kwasy kawoilochinowe (KCh) i 15% kwasy feruloilochinowe (FCh), natomiast 10% stanowiły diestry w postaci kwasów dikawoilochinowych (dikch). EKZ poddano nanokapsułkowaniu poprzez utworzenie kompleksów inkluzyjnych z β-cyklodekstryną (β-cd:ekz). Maksymalną wydajność kompleksowania uzyskano przy stosunku molowym 1:2 (β-cd:kch). Uzyskane stężenie KCH w kompleksie inkluzyjnym wynosiło 24%, gdzie zdecydowaną większość stanowiły KCh 17%, następnie FCh 4% i dikch 3%, podobnie jak w wyjściowym EKZ. W badaniach interakcji KCH z preparatami białkowymi zastosowano koncentrat i hydrolizat białek serwatkowych (KBSe i HBSe), proteiny białka jaja i hydrolizat albuminy jaja (KBJ i HBJ) oraz izolat i hydrolizat białek sojowych (IBSo i HBSo). Zawartość białka oznaczona
metodą Kjeldahla wynosiła od 87 do 90% w preparatach białkowych i ponad 96% w ich hydrolizatach. Wszystkie białka i hydrolizaty cechowała bardzo dobra rozpuszczalność w wodzie poza IBSo, gdzie wynosiła ona jedynie 67%. Wyznaczono skład aminokwasowy białek i ich hydrolizatów metodą HPLC-VIS z derywatyzacją ninhydryną. Największą zawartość aminokwasów zdolnych do interakcji z KCH, tj. proliny, argininy, leucyny, fenyloalaniny i tyrozyny wykazywały KBSe, IBSo i ich hydrolizaty. Zawartość wspomnianych aminokwasów w badanych preparatach białkowych wynosiła od 23 do 28%, przy czym hydrolizaty zawierały większe ich stężenie niż białka, z których były otrzymywane. Średnie masy cząsteczkowe badanych preparatów wynosiły: 50 kda dla KBJ, 29 kda dla KBSe i 191 kda dla IBSo, natomiast dla ich hydrolizatów 3 kda dla HBJ, 11 kda dla HBSe i 15 kda dla HBSo. Preparaty te poddano trawieniu kolejno pepsyną, trypsyną i chymotrypsyna, w wyniku czego średnie masy cząsteczkowe zmniejszyły się do 3 kda dla KBJ i KBSe oraz 6 kda dla IBSo, a także 0,5 kda dla HBJ, 15 kda dla HBSe oraz 1,7 kda dla HBSo. Zatem największą podatność na proteolizę wykazały IBSo i HBSo. Zbadano aktywność antyoksydacyjną (AA) preparatów białkowych, jako zdolność zmiatania rodników DPPH i OH. W przypadku KBJ wynosiły one odpowiednio 14 i 16%, dla KBSe 10 i 12%, a dla IBSo 8 i 13%. AA była wyższa dla hydrolizatów, w porównaniu do badanych białek. AA wynosiła 22 i 47% dla HBJ (DPPH i OH ), 24 i 53% dla HBSe oraz 27 i 49% dla HBSo, przy zastosowaniu jednakowych stężeń białek i ich hydrolizatów w testach. Do badań interakcji KCH z białkami i w dalszej części z hydrolizatami białkowymi wykorzystano EKZ i kompleksy inkluzyjne, uzyskane z udziałem EKZ. KBJ, KBSe i IBSo. Poddano je interakcjom przez 1,5 h w ph 3,20 i 6,45 w 25 i 90 o C z EKZ i β-cd:ekz oraz z substancjami wzorcowymi kwasem kawowym (KK), ferulowym (KF) i 5-KCh. W otrzymanych produktach interakcji oznaczono stopień związania KCH z białkami, jako różnicę między wprowadzonymi do interakcji i niezwiązanymi metodą LC-MS n. KCH wprowadzone do interakcji stanowiły 15% masy białek. Przy takiej proporcji masowej, która odpowiadała przeciętnym proporcjom w produktach żywnościowych, stopień interakcji był bardzo wysoki i wynosił 9,4 12,2; 11,8 13,1 i 12,1 14,4 g/100 g odpowiednio dla IBSo, KBSe i PBJ. Wzrost ph i temperatury powodowały wzrost zawartości związanych KCH w KBSe. W pozostałych dwóch białkach wzrost ph osłabiał interakcje. Diestry KCH, mimo najmniejszego udziału w EKZ, ulegały związaniu z białkami średnio w 98%, natomiast monoestry w 94%.Znacznie mniejszy stopień interakcji obserwowano w przypadku wprowadzenia β-cd:ekz, który mieścił się zaledwie w zakresie 0,03-0,07 g/100 g białek. Potwierdzono oddziaływania białko-ligand metodą UHPLC/DAD-ESI-UHR-Q-TOF-MS/MS,
gdzie po fragmentacji pojawiały się jony charakterystyczne dla KCH o m/z [H - ] 353, 367 i 515, które nie były obecne wśród widma jonów prekursorów. W badaniach kalorymetrycznych (termodynamicznych) metodą izotermicznego miareczkowania kalorymetrycznego (ITC) wyznaczono liczbę miejsc przyłączających wzorce KCH w każdym z białek, stałą wiązania (KA), zmianę entalpii (ΔH) i entropi (ΔS) interakcji oraz powinowactwo substratów (ΔG). Badania te potwierdziły dane uzyskane metodą LC-MS n, iż w największym stopniu masowym KCH wiązały się z KBJ. Pod względem stosunku molowego najwięcej KCH wiązało się do IBSo, następnie KBJ, a najmniej do KBSe. Największą ΔH odnotowano podczas interakcji KK z KBSe i w tym przypadku ΔS miała wartość ujemną, co wskazuje na kowalencyjny charakter interakcji, w przeciwieństwie do pozostałych par białek i KCH, gdzie ΔS były dodatnie, co z kolei wskazuje na niekowalencyjny charakter interakcji. ΔG było największe w przypadku interakcji 5-KCh z KBSe i IBSo. Wyniki analizy ITC zostały skonfrontowane z wynikami modelowania molekularnego metodą symulacji dokowania. Wyznaczono w nim ΔG par białkoligand, które wykazywały tendencję zgodną z analizą ITC. Dodatkowo modelowanie molekularne pozwoliło ustalić miejsca przyłączenia KCH do poszczególnych białek. W badaniu tym przyjęto reprezentatywne białka dla każdego z preparatów białkowych, tj. owoalbuminę, proglicyninę i α-laktoalbuminę i wyznaczono miejsca przyłączenia ligandów: w α- laktoalbuminie były to ILE33, VAL42, GLU49, PHE53, GLN54, TYR103, TRP104 i ALA106, w owoalbuminie ALA197, PHE198, LYS199, ASP202, TYR222, GLN223, ILE224, GLU346, VAL347, VAL348 i ALA353, a w proglicyninie ASN116, PHE117, ARG118, TYR134, ASN135, ASN136, i GLU137. Następnie wyznaczono rodzaj i energię interakcji w miejscach aktywnych, składające się na całkowitą ΔG białko-ligand. W większości par białko-ligand największy udział miały oddziaływania typu energia solwatacji, następnie oddziaływania van der Waalsa, powierzchniowa energia kontaktowa, oddziaływania elektrostatyczne i wiązania wodorowe. Te ostatnie miały największy udział w energii wiązania α-laktoalbuminy i 5-KCh. Zbadano zmiany masy cząsteczkowej białek spowodowane interakcjami. W KBJ wzrost średniej masy cząsteczkowej był największy, bo maksymalnie do 1684 kda, w IBSo do 1431 kda, a w KBSe do 487 kda, przy czym wzrost temperatury przyczyniał się do większego sieciowania białek. Natomiast interakcje z β-cd:ekz prowadziły do relatywnie niewielkiego wzrostu masy cząsteczkowej, do 302, 1080 i 209 kda w białkach jak wyżej w porównaniu z kontrolą. Wzrost masy cząsteczkowej wpływał na zmniejszenie rozpuszczalności produktów interakcji, która w KBJ zmalała maksymalnie do 19%, w IBSo do 11% i w KBSe do 22%. Wykonano pomiar barwy w systemie CIEL*a*b* produktów interakcji białek i KCH, który wykazał, że interakcje powodowały spadek jasności i wzrost wskaźnika
pigmentów czerwonych. Interakcje z β-cd:ekz prowadziły do znacznie mniejszych zmian wskaźników barwy. Zanalizowano zdolność zmiatania rodników DPPH i OH, która wzrastała po interakcjach z KCH w porównaniu do prób kontrolnych samych białek, a im większy był stopień związania z KCH tym wyższa zdolność zmiatania rodników. Dlatego po interakcjach z β-cd:ekz AA produktów interakcji była mniejsza niż z EKZ, choć był tu brany pod uwagę układ, w którym oddzielono niezwiązane kompleksy inkluzyjne. Oznaczono skład aminokwasowy białek poddanych interakcjom z KCH. Całkowita zawartość aminokwasów zmalała w wyniku interakcji na skutek utleniania, wiązania z KCH oraz innych zmian degradacyjnych. Interakcje z EKZ w 90 o C przyczyniały się do strat aminokwasów w wysokości 30% w KBJ, 48% w KBSe i 33% w IBSo. W analogicznych warunkach, w wyniku interakcji z β-cd:ekz straty aminokwasów wyniosły w tych białkach odpowiednio 8, 20 i 21%. Największe straty aminokwasów egzogennych dotyczyły metioniny, a następnie walinyi izoleucyny. Modelowanie molekularne wykazało zaangażowanie tych aminokwasów w interakcje z KCH. W dalszym etapie, produkty interakcji białek i KCH poddano proteolizie w celu ewentualnego uwolnienia KCH z różnego typu oddziaływań. Zastosowano kolejno pepsynę, trypsynę i chymotrypsynę. Stężenie KCH uwolnionych po proteolizie mieściło się w zakresie 0,3 2,7 g/100 g białka i było największe w IBSo po interakcjach w ph 6,45. Wyznaczono następnie ilość KCH biodostępnych do absorpcji w organizmie jako sumę KCH niezwiązanych z białkami i uwolnionych po proteolizie. W IBSo wynosiła ona 4,5-6,1 g/100 g białka, w KBSe 2,5-3,8 g/100 g, a w KBJ 1,1-3,4 g/100 g, a wyższa temperatura podczas interakcji skutkowała mniejszą biodostępnością KCH. Ze względu na zastosowany model hydrolizy enzymatycznej, tj. oczyszczanie produktów interakcji z niezwiązanych KCH, nie obserwowano obniżenia aktywności enzymów proteolitycznych, które również mogłyby oddziaływać z KCH. Hydrolizaty białkowe poddawano interakcjom z KCH w warunkach analogicznych jak w przypadku białek, stosując takie same proporcje substratów. Stopień związania KCH w formie EKZ z hydrolizatami białkowymi oznaczony metodą LC-MS n był większy niż białek i wynosił w zależności od temperatury interakcji 12,9 13,4; 13,2 13,3 i 14,9 15,2 g/100 g HBJ, HBSe i HBSe. Wzrost temperatury powodował wzrost zawartości związanych KCH. Znacznie mniejszy stopień interakcji obserwowano w przypadku β-cd:ekz, który mieścił się w zakresie zaledwie 0,5-1,3 g/100 g hydrolizatu. W badaniach metodą ITC wyznaczono KA, ΔH, ΔS oraz ΔG. W największym stopniu masowym KCH wiązały się z HBJ, a następnie z HBSo. Pod względem stosunku molowego, najwięcej KCH wiązało się do HBJ, następnie do HBSe. KA była największa dla interakcji z HBSe średnio ponad 2000 1/M, podczas gdy
dwóch pozostałych hydrolizatów wynosiła od 1 do 12 1/M. Największą ΔH odnotowano podczas interakcji 5-KCh z HBSo. W tym i pozostałych parach interakcji hydrolizat białkowystandard KCH ΔS miała wartość dodatnią, co wskazuje na niekowalencyjny charakter interakcji. Wysokie ΔG wykazywały pary: 5-KCh z HBSe, KF z HBJ i HBSo. Wyniki analizy ITC zostały następnie skonfrontowane z wynikami modelowania molekularnego. Wyznaczono w nim ΔG dla par peptyd-ligand, w którym zastosowano przykładowe peptydy zidentyfikowane przez innych autorów w badanych hydrolizatach białkowych. W HBJ był to peptyd YPILPEYLQCVK, w HBSe SQSKVLPVPQ, a w HBSo AIPSEVLAHSYNLR. Symulacja dokowania wykazała największą ΔG dla 5-KCh oddziaływującego z trzema badanymi hydrolizatami, w porównaniu do KK i KF. Ponadto, na całkowitą energie oddziaływań w największym stopniu składała się energia solwatacji, następnie oddziaływania van der Waalsa, a w mniejszym stopniu wiązania wodorowe i oddziaływania elektrostatyczne. Natomiast energia wewnętrzna peptydu i rotacyjność wiązania osłabiały interakcje. W interakcji peptydu reprezentującego HBSe z 5-KCh, zaangażowane były aminokwasy: GLY, VAL i LYS, dla interakcji tego samego peptydu z KF: GLY, SER i LYS, natomiast dla peptydu reprezentującego HBJ, w interakcji z 5-KCh: LYS, TYR i ILE, z dla interakcji tego samego peptydu KF: VAL, ILE i TYR, z kolei dla peptyu reprezentującego HBSo w interakcji z 5-KCh: VAL, HIS i ASN, a w interakcji z KF: VAL, GLU, SER, HIS, z KK: SER, GLU. Wzrost średniej masy cząsteczkowej w wyniku interakcji był największy w HBSe, bo maksymalnie do 86 kda, w HBSo do 59 kda i w HBJ do 16 kda, przy czym wzrost temperatury przyczyniał się do większego sieciowania hydrolizatów. Natomiast interakcje z β- CD:EKZ przyczyniały się do relatywnie niewielkiego wzrostu masy cząsteczkowej, do 40, 29 i 15 kda w hydrolizatach białek jak wyżej. Interakcje powodowały spadek jasności i wskaźnika zawartości pigmentów czerwonych oraz kwasowości hydrolizatów białkowych, a w postaci kompleksów inkluzyjnych powodowały zwiększenie AA, w porównaniu z interakcjami z EKZ. Interakcje z EKZ w 90 o C przyczyniały się do strat aminokwasów w wysokości 49% w HBJ, 60% w HBSe i 59% w HBSo. W analogicznych warunkach, w wyniku interakcji z β-cd:ekz, straty aminokwasów wyniosły w tych hydrolizatach odpowiednio 45, 53 i 58%. Największe straty dotyczyły metioniny. Stężenie KCH uwolnionych po proteolizie mieściło się w zakresie 0,6 1,1 g/100 g hydrolizatu białka. Wyznaczono następnie ilość KCH biodostępnych do absorpcji w organizmie jako sumę niezwiązanych z hydrolizatami białek i uwolnionych po proteolizie. W HBSo ilość białek dostępnych do absorpcji wynosiła od 1,3-1,8 g/100 g białka, w HBSe 3,6 g/100 g, a w HBJ 3,2-4,1 g/100 g, natomiast w β-cd:ekz blisko 15 g/100g hydrolizatów białkowych.
Otrzymano sześć produktów żywnościowych: ciastka kruche (CK), chleb (CH), serek karmelowy (SK), nadzienie orzechowe (NO), farsz grzybowy (FG) i farsz mięsny (FM) w pięciu wersjach: kontrolnej (-KON), z dodatkiem 1% KCH z EKZ (-EKZ), z dodatkiem 5% hydrolizatu białka jaj, serwatki lub soi, w zależności od właściwości i cech organoleptycznych produktu (-HBJ, -HBSe, -HBSo), z zastosowaniem obu dodatków (-EKZ-HB) i z dodatkiem 1% KCH w postaci kompleksu inkluzyjnego (-β-cd:ekz). Produkty żywnościowe poddano analizie aromatu. W CK stwierdzono największą liczbę, bo aż 53 związki znaczące dla aromatu. Dodatek EKZ wpływał na wzrost udziału w aromacie butanolu, etanolu i izomaltolu. W CH zidentyfikowano 48 związków aromatu. Dodatek EKZ powodował wzrost udziału furfuralu. Aromat SK zawierał 38 zidentyfikowanych składników. Dodatek EKZ przyczyniał się do pojawienia się w aromacie octanu etylu, kwasu octowego i 2-pentanolu. W NO zidentyfikowano 49 związków aromatycznych. Niezależnie od zastosowanego dodatku, w aromacie NO wzrastał udział etanolu i kwasu propionowego w porównaniu do KON. W FG zidentyfikowano 37 składników aromatu. Dodatek EKZ przyczyniał się do wzrostu udziału octanu etylu, 3-metylobutanolu i kwasu propionowego. W FM zidentyfikowano aż 46 składników aromatu. Dodatek EKZ wpłynął na wzrost udziału octanu etylu, 2-etyloheksanolu i 2-acetylo5-metylofuralu. Średnio największą zawartością lotnych składników aromatu charakteryzował się FM, a następnie CK, NO, SK, CH i FG. Biorąc pod uwagę wszystkie sześć produktów żywnościowych, można było zaobserwować duże różnice w zawartości składników lotnych, powodowane obecnością różnych dodatków, gdzie wzrost zawartości składników lotnych w warstwie nadpowierzchniowej następował przy zastosowaniu dodatków w porządku: kwasy chlorogenowe w postaci nanokapsułek<kontrolna<hydrolizat białkowy<kwasy chlorogenowe w postaci wolnej<kwasy chlorogenowe w postaci wolnej łącznie z hydrolizatem białkowym. Oznaczono zawartość wolnych polifenoli (WP) w produktach oraz w ich hydrolizatach po proteolizie i amylolizie. W CK zawartość WP wynosiła 64% dodanych w CK-EKZ, 51% w CK-EKZ-HBJ i 85% w CK-β-CD:EKZ, a po hydrolizie enzymatycznej odpowiednio 59, 43 i 87%. W CH zawartość WP wynosiła 67% w CH-EKZ, 56% w CH-EKZ-HBJ i 88% w CH-β- CD:EKZ, a po hydrolizie enzymatycznej odpowiednio 58, 53 i 90%. W SK zawartość WP wynosiła 82% w SK-EKZ i SK-EKZ-HBSe i 97% w SK-β-CD:EKZ, a po hydrolizie enzymatycznej odpowiednio 78, 76 i 100%. W NO zawartość WP wynosiła 83% w NO-EKZ, 76% w NO-EKZ-HBSe i 94% w NO-β-CD:EKZ, a po hydrolizie enzymatycznej odpowiednio 47, 35 i 61%. W tym produkcie, oprócz wprowadzonych 1% KCH z kawy znajdowało blisko 0,5% polifenoli pochodzących z kakao, nieuwzględnionych w WP. W FG zawartość WP
wynosiła 90% w FG-EKZ, 84% w FG-EKZ-HBSo i 92% w FG-β-CD:EKZ, a po hydrolizie enzymatycznej odpowiednio 87, 69 i 100%. W FM zawartość WP wynosiła 97% w FM-EKZ, 96% w FM-EKZ-HBSo i 100% w FM-β-CD:EKZ, a po hydrolizie enzymatycznej odpowiednio 86, 60 i 100%. Zatem obróbka produktu z wysokiej temperaturze powodowała większą degradację KCH, a ich inkluzja do β-cd ograniczała degradację. Hydroliza enzymatyczna przyczyniała się do dalszych strat KCH na skutek ich interakcji ze strawionymi białkami, jak również z samymi enzymami trawiennymi, poza dodatkiem KCH w postaci inkludowanej. Produkty poddano testom aktywności antyoksydacyjnej (AA), wykorzystując utlenianie LDL. Testy przeprowadzono z ekstraktami produktów oraz hydrolizatami tych ekstraktów, otrzymanymi w wyniku trawienia przez α-amylazę, proteazę i amyloglukozydazę. Obserwowano wysoką aktywność prób z EKZ i β-cd:ekz, najniższą natomiast KON. Po trawieniu AA wzrosła, przy czym wysoką aktywnością charakteryzowały się próby, do których dodawane były KCH. Zawartość białka w produktach była skorelowana z wprowadzanymi dodatkami, zatem największą zawartość białka oznaczono w próbach, do których dodawane były HB. Wśród produktów najwyższą zawartość białka wykazywały FM, TK i NO. W produktach poddanych działaniu enzymów trawiennych jw. oznaczono zawartość białka w części nierozpuszczalnej w wodzie po trawieniu. Analiza wykazała, że część białka pozostawała we frakcji niestrawionej. Spośród zastosowanych dodatków większą strawność uzyskano po zamknięciu KCH w β-cd, dzięki czemu w znacznie mniejszym stopniu oddziaływały z proteazą. Największy odsetek niestrawionego białka zaobserwowano w FG- EKZ-HBSo 37,9%, natomiast najmniejszy w SK-HBJ 0,96%. Przeprowadzono doświadczenie na szczurach, które były karmione dietą kontrolna (KON) prooksydacyjną wadliwą dietą aterogenną (PO) oraz wadliwą z dodatkiem EKZ (PO-EKZ) i wadliwą z dodatkiem kompleksu β-cd:ekz (PO-β-CD:EKZ) w ilości 0,5%. W wyniku skarmiania PO, masa ciała wzrosła o 16,3%, PO-EKZ o 12,3%, a PO- β-cd:ekz o 13,9%, przy czym tłuszczowa masa ciała wynosiła po zastosowaniu tych diet odpowiednio o 32,3%, 30,0% i 31,9. Zanalizowano dodatkowo wybrane parametry narządów i krwi szczurów. Po zastosowaniu ww. diet zawartość substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym wynosiła odpowiednio w wątrobie 860, 823 i 762 ng/g tkanki, w sercu 717, 665 i 716 ng/g, a w nerkach 1148, 1044 i 1088 ng/g. Zanalizowano także zawartość glutationu i jego formy utlenionej. Proporcje tych form po skarmianiu ww. dietami wynosiły odpowiednio 3,5; 15,0 i 3,8. Pojemność przeciwutleniająca pochodząca od hydrofilowych przeciwutleniaczy wynosiła odpowiednio 1,3; 1,3 i 1,8 μg/ml, natomiast od lipofilowych przeciwutleniaczy 1,3, 1,6 i 4,7 μg/ml. W badaniach na szczurach zastosowano także wzbogacone chleby: kontrolny CH, CH-
EKK i CH-β-CD:EKZ, gdzie chleb stanowił 73% diety. Wykazano, że w wyniku skarmiania dietą z chlebem zmniejszała się tłuszczowa masa ciała (33,9; 33,7 i 31,7% odpowiednio), proporcje formy zredukowanej do utlenionej glutationu wynosiły 2,9; 3,2 i 3,8. Zmniejszała się ilość związków reagujących z kwasem tiobarbiturowym w sercu (801, 705, 789 ng/g odpowiednio) i w nerkach (1154, 1125, 1167 ng/g), wzrastała natomiast w wątrobie (704, 756, 766 ng/g).