Problemy analiz GMO, niepewność i interpretacja wyników Sławomir Sowa Laboratorium Kontroli GMO IHAR-PIB 9.10.2017
Polityka zero tolerancji dla GMO? Zero tolerancji dla GMO w materiale siewnym (konwencjonalnym i ekologicznym) autoryzowane do uprawy GMO nieautoryzowe do uprawy GMO Zero tolerancji dla nieautoryzowanych GMO w żywności i paszy.???? 0,9% 0,1% Zero tolerancji w przypadku analiz części partii nasion nie jest możliwe. Asymetryczna autoryzacja Asynchroniczna autoryzacja
Dążenie do wyeliminowania domieszek GMO w produkcji ekologicznej Rozporządzenie 1829/2003/WE w sprawie genetycznie zmodyfikowanej żywności i paszy Próg znakowania żywności i paszy jako GM nie więcej niż 0,9 % składników rozpatrywanych odrębnie z zastrzeżeniem, że ich występowanie jest przypadkowe lub nieuniknione technicznie. Rozporządzenie 834/2007/WE w sprawie produkcji ekologicznej i znakowania produktów ekologicznych Cele i zasady produkcji ekologicznej Art. 4 a (iii) Wykluczają stosowanie GMO i produktów wytworzonych z GMO lub przy ich użyciu, z wyjątkiem produktów leczniczych weterynaryjnych Art.. 9 Zakaz stosowania GMO 1. GMO i produkty wytworzone z GMO lub przy ich użyciu nie są wykorzystywane w produkcji ekologicznej (żywność, pasza, nasiona etc) 2. podmioty gospodarcze mogą polegać na informacji dostarczanych zgodnie z dyrektywą 2001/18/WE, rozporządzeniem 1829/2003/WE
Dokładność próbobrania i metody Wybór odpowiedniego pobierania próbek (reprezentatywność dla oczekiwanej dokładności) Wybór odpowiedniej metody analitycznej Każda metoda musi mieć określoną w procesie walidacji granicę wykrywalności LOD (badania jakościowe) granicę oznaczalności LOQ (badania ilościowe)
Progi domieszek i metody analityczne Ustalenie progów domieszek GMO umożliwia Ustanowienie norm prawnych Praktyczne zastosowanie zasad współistnienia Odpowiednie znakowanie produktów Akceptację przez konsumentów Opracowanie metod próbobrania Opracowanie i zwalidowanie metod analiz GMO
Analizy GMO - jakie wymagania? Bez określenia wymagań wykonanie analizy niemożliwe Progi maksymalne (dozwolony poziom domieszek GM w produktach ekologicznych i w partii nasion) Jaka dokładność analizy jest konieczna? Niepewność pomiaru? (próbobranie, analiza) Jakie informacje są potrzebne do wykonania badania? Jakie koszty analizy jesteśmy w stanie zaakceptować?
Zero tolerancji dla GMO? Niemożliwe do spełnienia, każda metoda ma LOD Możliwe tylko w przypadku analizy pojedynczego nasiona Plan pobierania próbek zakłada dopuszczalną domieszkę Plan analiz zakłada zakres roboczy i dokładność metody Koszty analiz przydatność analiz
Wolne od GMO? Nie wykryto GMO nie oznacza brak GMO! Nie można wykryć czegoś o czym się nie wie (np. nieznane elementy genetyczne) Nie wykryto kukurydzy MON810 nie znaczy brak MON810 Oznacza, że zawartość może być poniżej określonego progu z określoną niepewnością pomiaru Nie wykryto w reprezentatywnej próbie 3000 nasion może oznaczać zawartość mniejszą od 0,1% przy przedziale ufności 95%
Różne wyniki analiz przy małych zawartościach GM możliwe jest otrzymanie różnych wyników przy powtórnej analizie tej samej próbki (homogenizacja, efektywność izolacji DNA) Różne mogą być również wyniki analiz wykonywanych przez różne laboratoria (metody, niepewność) Harmonizacja metod? Progi znakowania nie powinny być zbyt niskie ponieważ niepewność analizy zwiększa się wraz ze spadkiem zawartości GM w próbie Wysoka zawartość GMO również może powodować duże różnice (problem zakresu roboczego walidowanych metod) Do czego wykorzystujemy wynik analizy?
Granica wykrywalności (LOD) LOD planu kontroli LOD analizy laboratoryjnej (zależy od progu domieszki, wielkości genomu, ilości DNA użytego do analizy etc Dla poziomu ufności (95%) 1% 300 nasion (1 próba) 0.1% 3,000 nasion (3 próby) 0.01% 30,000 nasion (30 prób) 0% wszystkie nasiona
Wynik analizy a zawartość GMO Zależy od metody badań PCR, qpcr, dpcr, ELISA, test paskowy walidacji metod (zakres roboczy, dokładność) reprezentatywność próbki laboratoryjnej (plan kontroli) homogenność próbki analitycznej efektywność ekstrakcji (małe domieszki)
Autoryzowane czy nieautoryzowane Autoryzowane GMO Metody zwalidowane przez EURL Odmiany stack metody specyficzne dla poszczególnych zdarzeń transformacji Nieautoryzowane GMO Metody niezwalidowane GMO nieznane jakie progi (stacki powstałe poprzez krzyżowanie?)
Progi zawartości W jakich jednostkach wyrażana jest ilość GMO (wady i zalety) % masy w liczbie kopii w przeliczeniu na genom haploidalny Różne progi dla autoryzowanych/ nieautoryzowanych żywności i pasz/ materiału siewnego
Wyniki a metody analiz Paski ELISA Próba pojedyncza -jakościowa wynik +/- Wiele podprób -semi jakościowa -wynik % nasion PCR Próba pojedyncza -jakościowa -wynik +/- Wiele podprób -semi jakościowa -wynik % nasion RealTime PCR Próba pojedyncza -jakościowa -wynik +/- - Ilościowa -wynik %DNA, %masy Wiele podprób -semi ilościowa -wynik % nasion -ilościowa -wynik %DNA, % masy dpcr - jakościowa/ilościowa % kopie
Niepewność pomiaru Parametr związany z wynikiem pomiaru, charakteryzujący rozrzut wartości, które można w uzasadniony sposób przypisać wielkości mierzonej. VIM pkt. 3.9.
Szacowanie niepewności PN EN ISO/IEC 17025:2005 Ścisłość szacowania niepewności pomiaru zależy od takich czynników jak: wymagania zawarte w metodzie badawczej wymagania klienta zakres granic będących podstawą do podjęcia decyzji o zgodności ze specyfikacją
Rozporządzenie 619/2011 Każde urzędowe laboratorium powinno określić niepewność pomiaru, potwierdzoną zgodnie z opisem w wytycznych dotyczących pomiaru niepewności do badań laboratoryjnych organizmów zmodyfikowanych genetycznie ( 2 ) opracowanych przez Wspólne Centrum Badawcze Komisji (WCB). Decyzja o tym, że dana pasza nie spełnia wymogów, powinna zatem być podejmowana jedynie wtedy, gdy materiał zmodyfikowany genetycznie objęty zakresem niniejszego rozporządzenia występuje na poziomie równym lub wyższym od MRPL, biorąc pod uwagę niepewność pomiaru.
Rozporządzenie 619/2011 jako minimalną wymaganą wartość graniczną wydajności (MRPL) należy określić najniższy poziom materiału zmodyfikowanego genetycznie brany pod uwagę przez LR- UE do zatwierdzenie metod ilościowych. Poziom ten odpowiada 0,1 % ułamka masy materiału zmodyfikowanego genetycznie w paszy i stanowi najniższy poziom, dla którego wyniki są zadowalająco powtarzalne w różnych urzędowych laboratoriach przy stosowaniu odpowiednich protokołów pobierania próbek i metod analiz do pomiarów próbek paszy.
Analizy próbek paszy 619/2011, - 0,1% Przedstawianie wyniku niepewność Wynik analizy 0,1% x-u 0,1% (w/w) lub x 0,1% +U gdzie x wynik U rozszerzona niepewność pomiaru U=k*u(x) W praktyce, przy założeniu RSDr 25% i k=2, odrzucenia partii przy analizie pasz dopiero przy 0,15% 0,1% +U = 0,1% +(50% * 0,1%) = 0,15% (w ujęciu wagowym)
Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Identyfikacja pojedynczych zdarzeń transformacyjnych Jak odróżnić stacks od ich form rodzicielskich? 50% 50% T25 MON810 x T25 Żywność i pasze MON810 50% 50% nasiona Nie GMO SmartStax TM USA w 2010 2 herbicydy 6 gatunków Lepidoptera 3 gatunki stonki korzeniowej NK603xMON810xMON863 - (Cp4 EPSPS, Cry1Ab, Cry3Bb);
Jak poprawnie wykonać analizę Wiedza Wyposażenie Metody Personel Zarządzanie Pieniądze
Wykrywanie - wyzwania oznaczanie ilościowe zgodnie z progami znakowania (0,9%, 0,1%) wpływ linii rodzicielskich na zawartość GMO jaka jednostka miary? HGE (Rec.787/2004) HGE % masy % liczba nasion zawyżenie zawartości GMO unikatowy identyfikator OECD T25xMON810: ACS-ZMØØ3-2 x MON-ØØ810-6
Wykrywanie wyzwania cd. certyfikowane materiały odniesienia są dostępne tylko dla poszczególnych modyfikacji, % masy, %DNA, w postaci mączki, DNA metody: przesiewowe, event-specific + species specific zwalidowane metody: event-specific wykrywające linie rodzicielskie zwalidowane metody mogą wykorzystywać inne geny referencyjne konieczność harmonizacji
Wykrywanie wyzwania cd. Niezamierzone stacks : gene stacking na polu: samosiewy gene stacking wokół pól: populacje polowe niezamierzone stacks w produkcji nasiennej problemy analityczne : jak odróznić komercyjne staks od niezamierzonych stacks? nieautryzowane GMO
Harmonizacja kontroli GMO w UE i w krajach trzecich Plan pobierania próbek oparty na analizie ryzyka przyjęcie wspólnych metod pobierania próbek. (Metody te powinny się opierać na uznanych protokołach naukowych i statystycznych) przyjecie jednolitych metod analitycznych i wymagań walidacji zharmonizowanie zasady interpretacji wyników analiz, aby zagwarantować, że w całej Unii Europejskiej wyciąga się takie same wnioski z tych samych wyników badań analitycznych.
Dziękuję za uwagę!