Znaczenie próbobrania w analizach genetycznie zmodyfikowanych organizmów

Transkrypt

1 Znaczenie próbobrania w analizach genetycznie zmodyfikowanych organizmów Anna M. Linkiewicz Laboratorium Kontroli GMO, Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin PIB w Radzikowie Warszawa

2 Próbobranie GMO Stosowanie GMO wiąże się z koniecznością przestrzegania prawa w tym zakresie (lata 90 UE). Prawo ma na celu: 1. ochronę zdrowia konsumenta i środowiska; 2. umożliwienie swobodnego przepływu autoryzowanych produktów w ramach UE. Metody wykrywania i identyfikacji GMO stanowią konieczny element procesu autoryzacji, czego elementem jest informacja na temat metod próbobrania (w tym odniesienie do istniejących, oficjalnych i wystandaryzowanych metod), Informacja dla konsumenta poprzez obowiązkowe znakowanie GMO w żywności i paszach, Zerowa tolerancja dla nieautoryzowanych GMO. 2

3 Próbobranie Działanie mające na celu uzyskanie próbki o wielkości odpowiedniej do badań, w której prawdopodobieństwo obecności danego składnika jest determinowane tylko przez poziom jego występowania w partii (nasion) /International Seed Testing Associacion/. 3

4 Cel próbobrania Zapewnienie informacji i ochrony konsumentowi Identyfikacja żywności/paszy/materiału siewnego, który może stanowić zagrożenie dla konsumentów, Dostarczenie danych do przeprowadzenia właściwej oceny ryzyka i do zarządzania ryzykiem, Wykrycie nieprawidłowości związanych ze stosowaniem prawa. 4

5 Próbobranie Zawsze związane jest z błędem próbobrania Im większa próbka, tym większe szanse na precyzyjny wynik partia próbka 5

6 Źródła niepewności w analizach GMO Błąd całkowity analizy Błąd próbobrania? % Błąd analityczny PCR 20-30% Partia Próba Analiza C. Paoletti JRC 6

7 Wierne odzwierciedlenie obiektu - Jeśli mają być formułowane prawidłowe wnioski na temat przedmiotu oceny, którego zaledwie część podlega analizie, to analizowana część musi być wiernym odzwierciedleniem obiektu. - Pobieranie próbek środowiskowych do analizy Jacek Namieśnik, Jerzy Łukasiak, Zygmunt Jamrógiewicz Wydawnictwo Naukowe PWN 7

8 Rozkłady w próbie Homogenny =Próbki mogą być pobierane z każdego miejsca w partii bez wpływu na błąd analizy Heterogenny (najczęściej) =niejednorodny rozkład w partii. Próbki pobierane z różnych miejsc będą dawały niejednorodne wyniki w analizie (błąd analizy) 8 Plan pobierania prób musi być odpowiednie dla populacji!

9 Charakterystyka materiału GM Błąd analizy wynikający z heterogeniczności próby dokłada się do całkowitego błędu próbobrania (Pierre Gy) Heterogeniczności składu Heterogeniczności rozkładu 9

10 Charakterystyka materiału GM Heterogeniczność składu Rozdrabnianie (kruszenie/cięcie/mielenie) lub inne metody zmieniające fizyczne właściwości próbki Mieszanie nie wpływa na zmianę heterogeniczności składu próby 10 JRC Technical Report 2014

11 Wykrywanie Cry9C w 0,5% CRM kukurydzy Próby pozytywne [%] Młynek Moździerz Kontrola (ADH1) > <300 Wielkość cząstek [μm] Holden et al,

12 Niejednorodne rozmieszczenie materiału GMO w próbach (heterogeniczność rozkładu) Rozkład GMO w różnych częściach partii Rozkład różnych GMOs w partii Mieszanie i blendowanie są technikami mogącymi zredukować błąd wynikający z próbobrania materiałów o niejednorodnym rozkładzie Stopniowe dzielenie czy ujmowanie mniejszych losowych porcji a następnie ich łączenie może 12 pomóc zapobiec błędowi Szkolenie analizy pobieranie prób GMO _Linkiewicz AM

13 Próbobranie - definicje partia materiału określona ilość materiału (nasion) dająca się fizycznie i jednoznacznie zidentyfikować, próbkę ogólną uzyskujemy z partii materiału (nasion) poprzez pobranie próbek pierwotnych z różnych miejsc całej partii i ich połączenie, z próbki ogólnej zgodnie z procedurami redukcji uzyskuje się podpróbki w 1 lub wielu etapach, tworząc próbkę średnią a ostatecznie próbki analityczne do badań (wg. ISTA) 13

14 KeLDA (Kernel Lot Dostribution Assessment) Obserwowany rozkład GMO w wybranych partiach materiału Paoletti, i in.2006 Cel: Rozkład soi GM RRS w15 transportach konternerowych do UE, 100 pr pierw/partię; 3000 nasion/próbę; Czas pobierania prób = całkowity czas wyładunku 14 Średnia zawartość GMO 0,01% - 96,14%, heterogeniczny rozkład

15 Plan próbobrania 15 Odpowiedni do celu (sprecyzowanie celu determinuje czas trwania, częstotliwość, itp.) kontrola jakości w celu stwierdzenia zgodności badanych parametrów z obowiązującymi wymaganiami, której wyniki służą do podejmowania doraźnych i krótkoterminowych decyzji, charakterystykę jakości prób do wyznaczania lub prognozowania zmienności parametrów jakościowych prób w czasie oraz do długookresowych potrzeb kontrolnych, identyfikację źródeł lub przyczyn zmian jakości oraz ustalenia okresowości ich pojawiania się. Dobrany kosztowo Realistyczny Odpowiedni dla dalszych działań Kryteria przy formułowaniu planu próbobrania: rodzaj produktu (płynny, stały, nasiona) wielkość próby stopień ryzyka związanego z badanym materiałem (analiza ryzyka) ryzyko działań niezgodnych z prawem Plany próbobrania są istotne by zapewnić przejrzyste i odpowiednie procedury podczas oficjalnych kontroli

16 Próbka reprezentatywna czy próbka niereprezentatywna? Niezależnie od celu pobierania próbek i stosowanej techniki pobierania, reprezentatywność próbek jest w znacznym stopniu funkcją starannego i właściwego wykonania wszystkich czynności wchodzących w zakres pobierania. Niewłaściwy pobór próby może być powodem jej zanieczyszczenia tak samo jak przechowywanie prób w niewłaściwych naczyniach i warunkach nieuwzględniających właściwości oznaczanych związków Jakość próbki otrzymanej do analiz ma znaczenie dla wyniku analiz 16

17 Degradacja DNA w mące sojowej 1: DNA marker; 2: próbka kontrolna ucierana na sucho, IRMM-410S-3 3: działanie wodą w 4 C; 4: miksowana na mokro w młynku w 4 C; 5: miksowana na mokro w młynku turrax w 4 C; 6: miksowana na mokro w młynku w 45 C; 7: miksowana na mokro w młynku turrax 45 C; 8: ciasto pieczone w 250 C Wykrywanie GMO jest łatwiejsze jeśli procesy produkcji oraz przechowywanie w mniejszym stopniu degradują DNA i białka 17 źródło ENGL

18 W jakim celu pobieramy próby GMO? sprawdzenie zgodności z prawem dotyczącym GMO, czuwanie nad jakością i bezpieczeństwem produktów na rynku (przetwarzanych i importowanych do UE), identyfikacja źródeł potencjalnego ryzyka związanego ze stosowaniem GMO w żywieniu ludzi i zwierząt, sprawdzenie systemów produkcji żywności i pasz (ekologiczne/konwencjonalne/gmo), potwierdzenie zgodności poszczególnych partii materiału. 18

19 Progi znakowania GMO w UE Autoryzowane GMO Żywność i pasze 0.9% (niezamierzona lub technicznie nieunikniona obecność ) Rozporządzenie 1829/2003/EC Materiał siewny (brak oficjalnych ustaleń, granica wykrywalności LOD, ale praktycznie 0.1% - granica oznaczalności -LOQ). Nieautoryzowane GMO zero tolerancji dla żywności i pasz, zero tolerancji dla materiału siewnego do 0.1% w paszach LLP (Rozporządzenie 619/2011/EC) Próbobranie jest konieczne żeby sprawdzić i przestrzegać progów znakowania GMO 19

20 Rozporządzenie (EU) No 1829/2003 W celu kontroli GM paszy i żywności wnioskodawcy zezwolenia powinni zgłosić propozycje właściwych metod pobierania próbek (w tym odniesienia do istniejących oficjalnych lub znormalizowanych metod pobierania próbek), Metody pobierania próbek powinny zostać zatwierdzone przez wspólnotowe laboratorium referencyjne (EURL- GMFF). 20

21 Próbobranie oficjalne metody StatusOfDossiers.aspx 21

22 Dokumenty implementujące zasady próbobrania Rozp.1829/2003 i Rozp. 1830/2003 Rozporządzenie (WE) nr 882/2004 zasady oficjalnych kontroli, NRL 2004/787/WE Zalecenie Komisji techniczne wytyczne pobieranie na obecność GMO ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) nr 152/ ustanawiające metody pobierania próbek i dokonywania analiz do celów urzędowej kontroli pasz i zmieniające je Rozporządzenie 691/2013 Rozporzadzenie 619/2011 (LLP) Decyzja Komisji 2013/287/EU o środkach nadzwyczajnych EN/TS 21568, Foodstuffs Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products Sampling strategies 22

23 Rozporządzenie (WE) nr 882/2004 Rozporządzenie (WE) nr 882/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 29 kwietnia 2004 r. w sprawie kontroli urzędowych przeprowadzanych w celu sprawdzenia zgodności z prawem paszowym i żywnościowym oraz regułami dotyczącymi zdrowia zwierząt i dobrostanu zwierząt Rozdział III, Artykuł 11 Metody pobierania próbek i analizy 1 Metody pobierania próbek i analizy wykorzystywane w kontekście kontroli urzędowych są zgodne z właściwymi regułami wspólnotowymi albo a) jeżeli takie reguły nie istnieją, z uznanymi międzynarodowo regułami lub protokołami, na przykład zatwierdzonymi przez Europejski Komitet Normalizacyjny (CEN) lub uzgodnionymi w ustawodawstwie krajowym; albo b) w braku powyższych, z innymi metodami pasującymi do zamierzonego celu lub opracowanymi zgodnie z protokołami naukowymi. 7. Z próbkami należy obchodzić się i etykietować je w sposób gwarantujący zarówno prawną jak i analityczną ważność. 23

24 Zalecenie 787/2004 Zalecenie Komisji 787/2004 z dnia 4 października 2004 r. w sprawie wytycznych technicznych w zakresie pobierania próbek i wykrywania organizmów zmodyfikowanych genetycznie oraz materiałów produkowanych z organizmów zmodyfikowanych genetycznie lub w składzie produktów w kontekście rozporządzenia (WE) nr 1830/2003 CEN/TS 15568: Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Sampling strategies Protokoły: Pobieranie próbek partii nasion i innego materiału rozmnożeniowego roślin Pobieranie próbek zbiorczych towarów rolnych( np. ziarna) Protokół pobierania próbek produktów żywnościowych i paszowych w opakowaniach jednostkowych (np. ciastek) Protokół pobierania próbek produktów żywnościowych i paszowych w opakowaniach zbiorczych (np. mąka) 24

25 Pobieranie próbek zbiorczych towarów rolnych (787/2004) Towary (ziarno, nasiona roślin oleistych) pobierać zgodnie zasadami opisanymi w ISO 6644 i ISO Liczba próbek pierwotnych, czy punktów poboru próbek (w których pobiera się próbki pierwotne w celu stworzenia próbki zbiorczej i archiwalnych próbek pierwotnych), zależy od wielkości partii zgodnie z tabelą: 0,01% całkowitej wielkości partii W każdym odstępie czasu (w przypadku systematycznego pobierania próbek) lub punkcie poboru próbek (w przypadku statycznego poboru próbek) należy pobrać próbkę wielkości 1 kg i podzielić ją na dwie porcje po 0,5 kg: jedną wykorzystuje się do utworzenia próbki zbiorczej, drugą jako archiwalną próbkę pierwotną. Próbki materiałów większych niż ziarna (np. owoce, kłącza, ziemniaki) pobiera się zgodnie z normą ISO Próbki nasion roślin oleistych pobiera się zgodnie z normą ISO Wielkość partii w tonach Wielkość próbki zbiorczej w kg Liczba próbek pierwotnych

26 Pobieranie próbek zbiorczych towarów rolnych (787/2004) 20 próbek pierwotnych wszystkie analizujemy indywidualnie >20 wybrać losowo 20 próbek i indywidualnie przeanalizować na obecność GMO. Wyniki analizy tych 20 próbek wykorzystuje się do oszacowania zawartości GMO w partii i poziomu jej niepewności (SD). Jeżeli poziom niepewności analizy 20 próbek jest możliwy do przyjęcia, bez dodatkowej analizy pozostałych archiwalnych próbek pierwotnych. Jeżeli natomiast poziom niepewności nie jest możliwy do przyjęcia, należy analizować pozostałe próbki pierwotne. Liczbę dodatkowych próbek poddawanych analizie należy ustalać indywidualnie, zależnie od poziomu niepewności (SD) określonego na podstawie pierwszych 20 próbek. Dalsze analizy należy przerwać, gdy będzie spełniony jeden z poniższych warunków lub obydwa: szacowana zawartość GMO w partii jest wyższa lub niższa od ustalonego progu ± 50 % tej wartości, niepewność szacowanej zawartości GMO osiągnie możliwy do przyjęcia poziom (± 50 % średniego wyniku analizy). Po przetestowaniu wszystkich próbek podejmuje się decyzję w sprawie znakowania. 26

27 Znaczenie pobierania prób w analizach - Błędy popełniane przy pobieraniu prób niweczą wysiłek analityka i koszty ponoszone w trakcie analizy, wyniki analizy zaś mogą odnosić się wówczas tylko do badanej próbki a nie całego przedmiotu oceny, co najczęściej prowadzi do podejmowania błędnych decyzji. Pobieranie próbek środowiskowych do analizy Jacek Namieśnik, Jerzy Łukasiak, Zygmunt Jamrógiewicz Wydawnictwo Naukowe PWN 27