Załącznik 2 Autoreferat przedstawiający opis dorobku i osiągnięć naukowych dr Robert Lenartowski Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Pracownia Izotopowa i Analizy Instrumentalnej
Spis treści 1. Dane biograficzne 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych 4. Wskazanie osiągnięcia naukowego 5. Komentarz autorski do publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe 5.1 Wprowadzenie 5.2 Cel badań 5.3 Model badawczy 5.4 Główne tezy osiągnięcia naukowego 5.5 Podsumowanie 5.6 Literatura 6. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych
1. Dane biograficzne Robert Lenartowski 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe 1995 dyplom magistra biologii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi (BiNoZ), Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu (UMK w Toruniu) 1995 dyplom ukończenia Międzywydziałowego Studium Pedagogicznego, UMK w Toruniu 2001 dyplom doktora nauk biologicznych, Wydział BiNoZ, UMK w Toruniu 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych 2001-2005 asystent, Pracownia Genetyki, Wydział BiNoZ UMK w Toruniu 2003-2005 associate researcher, prof. Karen O Malley Laboratory, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, USA 2006-2012 adiunkt, Zakład Genetyki, Wydział BiNoZ UMK w Toruniu od 2011 kierownik Pracowni Izotopowej i Analizy Instrumentalnej (PIiAI), Wydział BiNoZ, UMK w Toruniu od 2013 adiunkt, PIiAI, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska (BiOŚ, dawny Wydział BiNoZ), UMK w Toruniu 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): Tytuł osiągnięcia naukowego: Ekspresja i funkcja kalretikuliny podczas kluczowych wydarzeń procesu rozmnażania generatywnego Petunia hybrida Osiągnięciem naukowym zgłoszonym do postępowania habilitacyjnego jest spójny tematycznie cykl publikacji, złożony z czterech oryginalnych prac badawczych i jednej pracy przeglądowej, opublikowanych w latach 2009-2017. Prace eksperymentalne zawierają wyniki badań nad rolą kalretikuliny (CRT, ang. calreticulin) w procesie rozmnażania generatywnego roślin okrytozalążkowych na przykładzie Petunia hybrida (Ph), prowadzonych przeze mnie w kilkuosobowym zespole naukowym. Polskojęzyczna publikacja przeglądowa, stanowiąca wstęp teoretyczny do prezentowanych prac doświadczalnych, opisuje budowę i lokalizację komórkową CRT oraz funkcje tego białka w komórkach eukariotycznych. Syntetyczny opis najważniejszych wyników badań przedstawia komentarz autorski. Łączny wskaźnik oddziaływania (IF, ang. impact factor) czterech oryginalnych prac badawczych będących podstawą osiągnięcia naukowego wynosi 12,942 (zgodnie z rokiem opublikowania), natomiast sumaryczna liczba punktów wszystkich pięciu publikacji wg listy MNiSW wynosi 154 pkt. (zgodnie z rokiem opublikowania). Dla pracy opublikowanej w 2017 r. przyjęto wartość IF oraz punktację MNiSW z 2016 r.
Wykaz prac stanowiących osiągniecie naukowe: 1. Lenartowska M, Walczewski J, Lenartowski R (2009) Kalretikulina budowa, lokalizacja komórkowa oraz proponowane funkcje u zwierząt i roślin. Post Bioch 55:406-15. 4 pkt. MNiSW Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu jej koncepcji oraz wiodącej roli w przygotowaniu i korekcie manuskryptu. Swój udział procentowy w powstaniu pracy szacuję na 70%. 2. Lenartowski R, Suwińska A, Prusińska J, Gumowski K, Lenartowska M (2014) Molecular cloning and transcriptional activity of a new Petunia calreticulin gene involved in pistil transmitting tract maturation, progamic phase, and double fertilization. Planta 239:437-454. IF: 3,376; 40 pkt. MNiSW Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu i koordynacji przebiegu wszystkich zadań badawczych oraz przeprowadzeniu większości doświadczeń. Wykonałem analizy in silico, sklonowałem i scharakteryzowałem pełnej długości sekwencję PhCRT cdna, na jej podstawie wygenerowałem sondę molekularną specyficzną dla PhCRT mrna, wykonałem hybrydyzację northern, analizę Western blot oraz badania ilościowe i statystyczne oraz uczestniczyłem eksperymentach z wykorzystaniem FISH. Miałem wiodący udział w interpretacji uzyskanych wyników badań, przygotowaniu manuskryptu i ostatecznej korekcie wydawniczej jako autor korespondujący. Swój udział procentowy w powstaniu pracy szacuję na 70%. 3. Lenartowski R, Suwińska A, Lenartowska M (2015) Calreticulin expression in relation to exchangeable Ca 2+ level that changes dynamically during anthesis, progamic phase, and double fertilization in Petunia. Planta 241:209-227. IF: 3,239; 40 pkt. MNiSW Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu i koordynacji przebiegu wszystkich zadań badawczych oraz przeprowadzeniu większości doświadczeń. Wykonałem analizę Western blot, badania ilościowe, statystyczne i immunocytochemiczne oraz uczestniczyłem w analizach cytochemicznych. Miałem wiodący udział w interpretacji uzyskanych wyników badań, przygotowaniu manuskryptu i ostatecznej korekcie wydawniczej jako autor korespondujący. Swój udział procentowy w powstaniu pracy szacuję na 80%. 4. Suwińska A, Lenartowski R, Smoliński DJ, Lenartowska M (2015) Molecular evidence that rough endoplasmic reticulum is the site of calreticulin translation in Petunia pollen tubes growing in vitro. Plant Cell Rep 34:1189-99. IF: 3,088; 35 pkt. MNiSW wskazani autorzy mają równy udział w publikacji Mój wkład w powstanie pracy polegał na współudziale w opracowaniu koncepcji badań oraz ich realizacji. Przygotowałem sondy molekularne specyficzne dla PhCRT mrna i Ph18S rrna. Miałem wiodący udział w koordynacji przebiegu zaplanowanych zadań badawczych, interpretacji uzyskanych wyników i przygotowaniu manuskryptu. Swój udział procentowy w powstaniu pracy szacuję na 40%.
5. Suwińska A, Wasąg P, Zakrzewski P, Lenartowska M, Lenartowski R (2017) Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in Petunia. Planta doi:10.1007/s00425-017-2649-0. IF: 3,239; 35 pkt. MNiSW Mój wkład w powstanie pracy polegał na współudziale w opracowaniu koncepcji badań oraz wiodącej roli w zaplanowaniu i koordynacji przebiegu wszystkich zadań badawczych oraz udziale w ich realizacji. Wykonałem analizy in silico, zaprojektowałem i zweryfikowałem doświadczalnie sekwencje sirna degradujące wybiórczo PhCRT mrna i wygenerowałem sondę molekularną specyficzną dla PhCRT mrna. Uczestniczyłem w przeprowadzeniu większości eksperymentów, w tym badań ilościowych i analiz statystycznych. Miałem wiodący udział w interpretacji uzyskanych wyników badań, przygotowaniu manuskryptu i ostatecznej korekcie wydawniczej jako autor korespondujący. Swój udział procentowy w powstaniu pracy szacuję na 70%. 5. Komentarz autorski do publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe Cytowania prac wchodzących w skład osiągnięcia naukowego zostały wyróżnione Wykaz najczęściej stosowanych skrótów: AF filamenty aktynowe Ca 2+ wapń/jony wapnia Ca 2+ c stężenie Ca 2+ w cytozolu CRT/CRT gen/białko kalretikuliny/a ER siateczka śródplazmatyczna FISH fluorescencyjna in situ hybrydyzacja Ph Petunia hybrida PTGS potransrypcyjne wyciszenie ekspresji genu rer cysterny siateczki śródplazmatycznej ziarnistej ser rurki gładkiej siateczki śródplazmatycznej sirna krótki (mały) interferujący RNA 5.1 Wprowadzenie Przedmiotem badań stanowiących podstawę osiągnięcia naukowego są kluczowe elementy molekularne mechanizmów komórkowych gwarantujących sukces reprodukcyjny rośliny okrytonasiennej. Wieloetapowy proces rozmnażania generatywnego roślin obejmuje kilka faz: wytworzenie gametofitu męskiego w pylniku (dojrzałe ziarno pyłkowe) i żeńskiego w słupku (woreczek zalążkowy), otwarcie kwiatu (anteza), fazę progamiczną (zapylenie, kiełkowanie pyłku, wzrost łagiewki pyłkowej, depozycja komórek plemnikowych w docelowej synergidzie), podwójne zapłodnienie oraz embriogenezę i rozwój bielma. Efektywny przebieg kolejnych zdarzeń reprodukcyjnych jest konsekwencją zgodnego zapylenia i zależy od interakcji kiełkującego ziarna pyłkowego i rosnącej łagiewki z komórkami szlaku transmisyjnego słupka, komunikacji obu gametofitów poprzedzającej fuzję gamet oraz powstania zarodka i tkanki odżywczej w postaci bielma. Uważa się, że większość
zdarzeń reprodukcyjnych (jeśli nie wszystkie) wymaga precyzyjnej regulacji poziomu jonów wapniowych (Ca 2+ ) w komunikujących się komórkach, w których Ca 2+ pełnią funkcję fizjologiczną, sygnałową i regulatorową (Ge i in. 2007; Dresselhaus i Franklin-Tong 2013; Steinhorst i Kudla 2013). Ca 2+ występuje w komórkach roślinnych w trzech podstawowych postaciach: trwale związanej (nierozpuszczalny Ca 2+ pełniący funkcję strukturalną); jonowej (jako wtórny przekaźnik informacji w procesie transdukcji sygnału); oraz luźno-związanej (tzw. wymienny Ca 2+, buforowany m. in. przez białka wiążące Ca 2+ ). Wymienna pula Ca 2+ stanowi mobilny magazyn tych jonów uruchamiany w chwili zapotrzebowania na wyższe stężenie Ca 2+ w cytozolu ( Ca 2+ c ). Utrzymanie stanu dynamicznej równowagi między jonowym i wymiennym Ca 2+ jest krytyczne dla funkcjonowania komórek i wymaga ścisłej kontroli podczas skomplikowanych interakcji komórkowych związanych z rozmnażaniem płciowym roślin. Istotne zmiany w poziomie Ca 2+ są obserwowane podczas kiełkowania pyłku na znamieniu słupka, ukierunkowanego wzrostu łagiewki pyłkowej, podwójnego zapłodnienia, aktywacji genomu zygotycznego oraz embriogenezy (Ge i in. 2007; Dresselhaus i Franklin-Tong 2013; Steinhorst i Kudla 2013). Większość autorów wskazuje, że głównym magazynem Ca 2+ podczas tych procesów jest ściana komórkowa. Niemniej, równie istotne wydają się być struktury wewnątrzkomórkowe, takie jak siateczka śródplazmatyczna (ER) czy diktiosomy, które dzięki akumulacji białek wiążących Ca 2+ mogą stanowić niezwykle efektywne, mobilne magazyny tych jonów w cytoplazmie. Jak dotąd, wewnątrzkomórkowe źródła Ca 2+ i mechanizmy ich mobilizacji podczas kluczowych wydarzeń reprodukcyjnych u roślin okrytozalążkowych nie zostały w pełni zdefiniowane. Jednym z podstawowych procesów umożliwiających podwójne zapłodnienie jest wzrost łagiewki pyłkowej w słupku transportującej pozbawione zdolności ruchu komórki plemnikowe do woreczka zalążkowego, w którym dochodzi do fuzji gamet (Boavida i in. 2005; Takeuchi i Higashiyama 2011). Łagiewka pyłkowa jest najszybciej rosnącą komórką roślinną, charakteryzującą się szczytowym wzrostem oraz strefową organizacją cytoplazmy i procesów komórkowych. W wydłużonej łagiewce wyróżnia się trzy podstawowe strefy organizacji protoplastu (Qin i Yang 2011; Onelli i Moscatelli 2013; Cai i in. 2015): (i) strefa apikalna (jasna, ang. clear zone), bogata w pęcherzyki egzo/endocytarne; (ii) strefa podwierzchołkowa (subapikalna, ang. subapical zone), w której gromadzą się aktywne metabolicznie organelle komórkowe, takie jak ER, mitochondria i diktiosomy; oraz (iii) strefa trzonowa (nazywana także strefą dużych organelli, ang. shank), w której występują głównie amyloplasty i wakuole. Polarny wzrost łagiewki pyłkowej odbywa się dzięki egzocytozie elementów błonowych i prekursorów ściany komórkowej na jej wierzchołku. Natomiast w regionie podwierzchołkowym i trzonowym obserwowany jest dwukierunkowy przepływ cytoplazmy wg modelu odwrotnej fontanny (ang. reverse fountain cytoplasmic streaming), który odpowiada za transport metabolicznie aktywnych organelli i pęcherzyków do strefy wzrostu łagiewki pyłkowej. Akumulacja małych organelli w regionie podwierzchołkowym oraz pęcherzyków wydzielniczych w strefie jasnej rosnącej łagiewki umożliwia szczytowy wzrost komórki. W strefie subapikalnej dochodzi do nagromadzenia rurek gładkiej siateczki śródplazmatycznej (ser, ang. smooth endoplasmic reticulum), podczas gdy cysterny siateczki ziarnistej/szorstkiej (rer, ang. rough endoplasmic reticulum) występują w cytoplazmie całej łagiewki, poza apikalnym wierzchołkiem (Cheung i Wu 2007). W literaturze wyodrębnia się
dodatkową strefę jądrową, ze względu na lokalizację męskiej jednostki rozrodczej (MGU, ang. male germ unit) na granicy strefy trzonowej i subapikalnej (Cheung i Wu 2007; Qin i Yang 2011; Onelli i Moscatelli 2013). W proksymalnym regionie trzonowym łagiewki małe wakuole zlewają się tworząc jedną centralną, która wspomaga utrzymanie turgoru ekstremalnie wydłużonej komórki. Liczne badania dowodzą, że przepływ cytoplazmy w rosnącej łagiewce jest generowany przy udziale cytoszkieletu, głównie filamentów aktynowych i współdziałających z nimi białek wiążących aktynę (ABP, ang. actin binding proteins), w tym białek motorycznych z rodziny miozyn (Ren i Xiang 2007; Cai i Cresti 2009; Staiger i in. 2010; Guan i in. 2013; Hepler i in. 2013; Cai i in. 2015). W wydłużonych łagiewkach pyłkowych różnych gatunków roślin okrytozalążkowych wykazano odmienną organizację aktyny w zdefiniowanych strefach cytoplazmy. W strefie trzonowej występują długie włókna aktynowe zbudowane z równolegle ułożonych mikrofilamentów, które tworzą główne szlaki transportu dla organelli i pęcherzyków. Znacznie krótsze filamenty aktynowe (AF, ang. actin filaments) strefy subapikalnej formują charakterystyczną strukturę opisywaną w literaturze jako obrączka (ang. ring, Kost i in. 1998), kołnierz (ang. collar, Gibbon i in. 1999), sieć subapikalna (ang. subapical mesh, Geitmann i in. 2000), lejek (ang. funnel, Vidali i in. 2001), kosz (ang. basket, Snowman i in. 2002; Hörmanseder i in. 2005) lub grzywka (ang. fringe, Lovy-Wheeler i in. 2005; Vidali i in. 2009; Dong i in. 2012). Uważa się, że AF strefy subapikalnej umożliwiają zmianę kierunku przepływu cytoplazmy, transport pęcherzyków wydzielniczych do rosnącego wierzchołka, utrzymanie odrębności strukturalnej strefy jasnej oraz ruch pęcherzyków endocytarnych. W strefie jasnej funkcjonuje najprawdopodobniej dynamiczna populacja AF, określanych jako krótkie wiązki aktynowe (SAB, ang. short actin bundles). Przypisuje się im udział w egzocytozie pęcherzyków do błony apikalnej łagiewki. Dlatego AF strefy podwierzchołkowej wraz z dynamiczną siecią SAB strefy jasnej są uważane za podstawowy element strukturalno-funkcjonalny odpowiedzialny elongację łagiewki pyłkowej. Ukierunkowany wzrost łagiewki w słupku wymaga koordynacji szeregu procesów komórkowych związanych z utrzymaniem strefowej organizacji cytoplazmy, sprawnym funkcjonowaniem wewnątrzkomórkowego transportu, syntezą ściany komórkowej oraz wymianą informacji podczas interakcji gametofitu męskiego z komórkami słupka. Zgodnie z obecną wiedzą, prawidłowy przebieg tych procesów moduluje optymalne Ca 2+ c w zdefiniowanych strefach rosnącej łagiewki (Ge i in. 2007). W łagiewkach pyłkowych roślin okrytozalążkowych powstaje gradient Ca 2+ (ang. tip-focused Ca 2+ gradient), w wyniku napływu tych jonów ze środowiska zewnątrzkomórkowego do cytoplazmy łagiewki przez aktywne na jej wierzchołku kanały Ca 2+ oraz redukcji [Ca 2+ ] c w strefie podwierzchołkowej (Hepler i in. 2013; Steinhorst i Kudla 2013). Stabilizacja gradientu Ca 2+ w rosnącej łagiewce wymaga więc istnienia niezwykle efektywnego mechanizmu usuwania nadmiaru Ca 2+ z cytozolu strefy subapikalnej na teren ściany komórkowej lub gromadzenia tych jonów w przedziałach wewnątrzkomórkowych uważanych za mobilne magazyny Ca 2+ (Vandecaetsbeek i in. 2011). Wciąż jednak brak jednoznacznej odpowiedzi na pytanie, które elementy komórkowe i w jaki sposób uczestniczą w regulacji mobilnej puli Ca 2+ w rosnącej łagiewce pyłkowej. Dostępne dane literaturowe oraz wyniki wcześniejszych badań naszego zespołu stały się podstawą do sformułowania hipotezy, zgodnie z którą CRT jest istotnym elementem
molekularnym wewnątrzkomórkowego mechanizmu kontrolującego homeostazę Ca 2+ w komunikujących się komórkach podczas kluczowych zdarzeń reprodukcyjnych u roślin okrytozalążkowych. CRT jest zachowywanym w toku ewolucji białkiem opiekuńczym wiążącym/buforującym Ca 2+ w ER komórek eukariotycznych. Jej udział w utrzymaniu homeostazy Ca 2+ i kontroli jakości białek dojrzewających w ER determinuje prawidłowy przebieg wielu procesów komórkowych (Jia i in. 2009; przegl. Lenartowska i in. 2009; Michalak i in. 2009). Obie funkcje CRT wydają się być równie istotne podczas kolejnych etapów rozmnażania generatywnego roślin, kiedy wymagane jest wysokie tempo syntezy białek oraz mobilizacja Ca 2+ związana z transdukcją sygnałów i modulowaniem metabolizmu komórek w sposób zależny od Ca 2+ (przegl. Lenartowska i in. 2009). U zwierząt zidentyfikowano jak dotąd dwa geny CRT CRT1, który podlega ekspresji w różnych tkankach oraz CRT2, który jest aktywny wyłącznie w jądrach samców (Persson i in. 2002). Funkcjonalna specjalizacja roślinnych genów CRT o zróżnicowanej ekspresji w różnych organach i tkankach, jest wynikiem ewolucji molekularnej sekwencji kodującej i pojawieniem się genów paralogów (CRT1 i CRT2) i ortologów (CRT3) u różnych gatunków roślin (Persson i in. 2003; Jia i in. 2009; przegl. Lenartowska i in. 2009; Del Bem 2011; Thelin i in. 2011). Podobnym do siebie białkom roślinnym grupy CRT1/2 przypisuje się podstawowe i niekwestionowane funkcje związane z utrzymaniem homeostazy Ca 2+ i kontrolą jakości polipeptydów dojrzewających w ER, podczas gdy CRT3 charakteryzuje się najwyższym stopniem homologii międzygatunkowej i podlega wzmożonej ekspresji w odpowiedzi na stres abiotyczny lub biotyczny (Li i in. 2009, Christensen i in. 2010). Wyniki badań prowadzonych w kilku ośrodkach naukowych dokumentują aktywność genów CRT w organach generatywnych roślin, ziarnach i łagiewkach pyłkowych, zalążkach, zarodkach i dojrzewających nasionach (przegl. Lenartowska i in. 2009). U Arabidopsis podwyższoną ekspresję CRT stwierdzono w pylnikach i górnej części słupka, przy czym aktywność CRT1 i CRT2 (odpowiednio AtCRT1a i AtCRT1b) obserwowano zarówno w znamieniu/szyjce słupka jak i w dojrzałym pyłku (Christensen i in. 2010). Ostatnie doniesienia jednej grupy badawczej wskazują, że mutacje genów CRT u Arabidopsis skutkują większą wrażliwością tych mutantów na stres wodny (Kim i in. 2013) lecz nie wpływają w istotny sposób na ich wzrost i rozwój (Vu i in. 2017). Jednak autorzy wnioskują, że współdziałanie dwóch białek opiekuńczych ER (CRT i kalneksyny) jest bezwzględnie wymagane dla utrzymania funkcji wegetatywnych i rozwoju męskiego gametofitu/wzrostu łagiewek pyłkowych u tego gatunku (Vu i in. 2017). Krytyczną rolę CRT w rozwoju embrionalnym potwierdzają badania z użyciem zwierzęcych modeli, które dowodzą, że mutacja w genie CRT (-/-) u myszy jest letalna (Mesaeli i in. 1999; Rauch i in. 2000, Michalak i in. 2009). Wnioski z toczącej się dyskusji wskazują, że rozmnażanie generatywne organizmów eukariotycznych wymaga aktywności CRT. Wciąż jednak nie wiadomo, które izoformy tego białka i w jaki sposób uczestniczą w kolejnych fazach procesu reprodukcji u roślin okrytozalążkowych. Dlatego określenie wzorca ekspresji genów CRT oraz czasowoprzestrzennej dystrybucji ich produktów w komunikujących się komórkach podczas kluczowych wydarzeń reprodukcyjnych jest podstawą dla zrozumienia biologicznej funkcji CRT w procesie rozmnażania płciowego roślin okrytonasiennych.
5.2 Cel badań Wyniki prowadzonych przeze mnie badań w ramach wcześniejszej współpracy naukowej z zespołem prof. dr hab. Elżbiety Bednarskiej (Lenartowska i in. 2001, 2002, 2009) potwierdziły obecność CRT i kodujących ją transkryptów w kiełkującym pyłku i rosnących łagiewkach pyłkowych dwóch gatunków roślin okrytonasiennych, należących do kladu jednoliściennych (Haemanthus albiflos) i kladu dwuliściennych (Petunia hybrida). Były to pierwsze doniesienia na świecie dokumentujące ekspresję CRT zarówno w łagiewkach pyłkowych rosnących w warunkach in vitro jak i w słupku. Otrzymane wyniki badań doprowadziły nas do wniosku, że wzorzec dystrybucji CRT mrna oraz białka CRT jest uniwersalny w badanych komórkach, co może wskazywać na istotną funkcję CRT w interakcjach pyłek-słupek. Niestety, nie uzyskaliśmy wówczas wystarczających dowodów na poparcie tej hipotezy. Jej weryfikacja była możliwa dopiero dzięki wykorzystaniu zaawansowanych technik biologii molekularnej, szerokiego spektrum metod biologii komórki, analiz biochemicznych, bioinformatycznych i ilościowych/statystycznych w badaniach, które stanowią podstawę prezentowanego osiągnięcia naukowego. Głównym celem badań było określenie biologicznej roli CRT w interakcjach komórkowych podczas kluczowych wydarzeń reprodukcyjnych u modelowej rośliny dwuliściennej Petunia hybrida (Ph). Badania realizowano w kilku etapach, zmierzając do osiągnięcia następujących celów szczegółowych: (i) sklonowania i molekularnej charakterystyki swoistej gatunkowo sekwencji PhCRT cdna oraz przypuszczalnej sekwencji aminokwasowej PhCRT (Lenartowski i in. 2014); (ii) określenia poziomu i wzorca ekspresji PhCRT podczas dojrzewania słupka, antezy, fazy progamicznej, podwójnego zapłodnienia i wczesnej embriogenezy (Lenartowski i in. 2014, 2015); (iii) ustalenia korelacji pomiędzy ekspresją PhCRT a dynamiką zmian w poziomie wymiennego Ca 2+ podczas interakcji pyłeksłupek w kolejnych etapach procesu reprodukcji (Lenartowski i in. 2015); (iv) wskazania miejsc translacji PhCRT w kiełkujących ziarnach i rosnących łagiewkach pyłkowych (Suwińska i in. 2015); (v) ujawnienia efektu utraty funkcji genu PhCRT podczas szczytowego wzrostu łagiewki pyłkowej (Suwińska i in. 2017). W zależności od przyjętej strategii badawczej, eksperymenty prowadzono w warunkach in vitro lub in vivo wykorzystując metody biochemiczne (izolacja i oczyszczanie białek i kwasów nukleinowych, analiza Western blot), cytochemiczne (podstawowe barwienia cytologiczne, bioobrazowanie filamentów aktynowych, piroantymonianowa technika lokalizacji wymiennego Ca 2+, fluorescencyjna metoda wizualizacji jonowego Ca 2+, badania ultrastrukturalne z wykorzystaniem konwencjonalnej mikroskopii elektronowej), immunocytochemiczne (metoda immunofluorescencyjna i immunozłotowa), techniki biologii molekularnej (RT-PCR, szybka amplifikacja końców cdna-race, hybrydyzacja northern, hybrydyzacja in situ, interferencja RNA) oraz analizy bioinformatyczne (analiza baz sekwencji nukleotydowych, analiza filogenetyczna i poszukiwanie motywów strukturalnych). Otrzymane wyniki badań poddano analizie statystycznej (test ANOVA lub Mann-Whitney), a ich wiarygodność była weryfikowana w kolejnych powtórzeniach eksperymentów oraz w reakcjach kontrolnych.
5.3 Model badawczy Materiałem badawczym były izolowane z kwiatów słupki oraz dojrzały pyłek Petunia (odmiana o białych płatkach korony i jasnym zabarwieniu organów generatywnych, z których łatwo pozyskuje się kwasy nukleinowe i białka). Uprawa tych roślin jest możliwa przez cały rok w komorach hodowlanych, w optymalnych warunkach temperatury, wilgotności i światła. Istotną zaletą Petunia jest możliwość uzyskiwania dużej liczby pojedynczych kwiatów w relatywnie krótkim czasie, których zapylenie krzyżowe może być ściśle kontrolowane. Słupek Petunia ma długą szyjkę typu zamkniętego wypełnioną tkanką transmisyjną o charakterze sekrecyjnym, mokre znamię pokryte lepką wydzieliną w stadium receptywnym i dwukomorową zalążnię zawierającą liczne zalążki na środkowym łożysku, do których łagiewki pyłkowe dorastają niemal w tym samym czasie od zapylenia. Taka budowa anatomiczna słupka umożliwia utrwalenie jego określonych fragmentów bez utraty ziaren pyłkowych kiełkujących na powierzchni znamion lub łagiewek pyłkowych rosnących w szlaku transmisyjnym, a także analizę poziomu ekspresji wybranych genów w odpowiedzi na kolejne zdarzenia reprodukcyjne odbywające się w tzw. słupku górnym (fragment znamięszyjka) lub dolnym (zalążnia). Dojrzały pyłek Petunia, pozyskiwany z otwartych pylników w dniu antezy, kiełkuje efektywnie na podłożach hodowlanych stałych i płynnych, a łagiewki pyłkowe rosnące w warunkach in vitro zachowują polarny typ wzrostu charakteryzujący się strefową organizacją cytoplazmy. Dlatego też Petunia, podobnie jak Arabidopsis czy Lilium, jest gatunkiem modelowym w badaniach z zakresu embriologii roślin (Dowd i in. 2006; Wang i Kumar 2007; Trivellini i in. 2015). Ponadto, w bioinformatycznych bazach danych zostały zdeponowane sekwencje EST Petunia (ang. expressed sequence tag), na podstawie których możliwa jest przynajmniej częściowa rekonstrukcja cząsteczek cdna określonych genów. Dzięki temu sklonowano pełnej długości sekwencję PhCRT cdna oraz wewnętrzną część sekwencji Ph18S rrna, co pozwoliło na wygenerowanie swoistych gatunkowo sond molekularnych oraz sekwencji sirna (ang. short/small interfering RNA) selektywnie degradujących PhCRT mrna. W trakcie prowadzonych badań poziom i wzorzec ekspresji PhCRT w słupku Petunia analizowano w kilku następujących po sobie etapach procesu reprodukcji, które uznano za szczególnie istotne: (i) dojrzewający słupek przed i po antezie; (ii) słupek zapylony zgodnym pyłkiem, izolowany z kwiatów w trzech etapach fazy progamicznej (wczesna, zaawansowana i późna) oraz (iii) słupek w okresie okołozapłodnieniowym i podczas wczesnej embriogenezy. Doświadczenia z użyciem kiełkujących ziaren pyłkowych i rosnących łagiewek Petunia prowadzono również w kulturach in vitro. 5.4 Główne tezy osiągnięcia naukowego Zidentyfikowany w słupku Petunia gen PhCRT należy do grupy homologów CRT1/2 Roślinne warianty CRT wykazują różnice w budowie sekwencji aminokwasowej. Obserwowane zmiany poziomu poszczególnych polipeptydów w trakcie wzrostu, rozwoju i odpowiedzi organizmu roślinnego na czynniki środowiskowe (biotyczne i abiotyczne) sugerują ich funkcjonalną dywergencję (Jin i in. 2009; Li i in. 2009; przegl. Lenartowska i in. 2009; Saijo i in. 2009; Christensen i in. 2010; Thelin i in. 2011). Warianty CRT1/2
charakteryzuje zdolność wiązania znacznych ilości Ca 2+ w domenach P-C. Są one uznawane za podstawowe białka zaangażowane w utrzymanie wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca 2+ oraz kontrolę jakości fałdowania polipeptydów w ER. Ekspresja genu CRT3 wiążę się natomiast z odpowiedzią rośliny na stres, a kodowane przez tę sekwencję białko ma ograniczoną pojemność wiązania Ca 2+ w domenie C-końcowej ze względu na jej odmienną strukturę (Qiu i in. 2012). Szereg wcześniej opublikowanych prac wskazuje na wzmożoną aktywność genów CRT w trakcie rozmnażania płciowego roślin okrytozalążkowych (przegl. Lenartowska i in. 2009). W kwiatach podwyższony poziom ekspresji dotyczył głównie genów CRT1/2 (Nelson i in. 1997; Persson i in. 2003; Christensen i in. 2010). Doniesienia na ten temat są jednak fragmentaryczne i nie odnoszą się do określonych etapów rozwoju organów generatywnych lub faz procesu płciowego. Aby zweryfikować potencjalny udział CRT1/2 w przebiegu kluczowych etapów procesu reprodukcji w słupku Petunia, podjąłem próbę pozyskania swoistej gatunkowo sekwencji PhCRT cdna (Lenartowski i in. 2014). W pierwszym etapie badań dokonałem identyfikacji in silico sekwencji EST Petunia (CV296977.1, CV296202.1, and DC240877.1) wykazujących wysoki stopień identyczności z CRT1 cdna Arabidopsis thaliana (NM_001036122), zamieszczonej w internetowej bazie sekwencji GenBank. Odszukane EST posłużyły do zaprojektowania specyficznych starterów wykorzystanych do przeprowadzenia reakcji RT-PCR oraz szybkiej amplifikacji końców 5 i 3 PhCRT cdna (RACE). Namnożoną wewnętrzną części sekwencji PhCRT oraz oba jej końce poddano zsekwencjonowaniu, co umożliwiło sklonowanie pełnej długości PhCRT cdna w obecności specyficznych starterów. Otrzymana sekwencja o długości 1550 pz składała się z 5 UTR, 1254 pz potencjalnej otwartej ramki odczytu, dwóch przypuszczalnych sygnałów poliadenylacji oraz regionu 3 UTR zakończonego sekwencją polia. Analiza bioinformatyczna przypuszczalnej sekwencji aminokwasowej kodowanej przez PhCRT wykazała, że polipeptyd składa się z 417 reszt aminokwasowych (aa) i jest niewielkim, kwaśnym białkiem o teoretycznej masie ~48 kda, która odpowiada białkom CRT zidentyfikowanym u różnych gatunków roślin (przegl. Lenartowska i in. 2009). W sekwencji aminokwasowej PhCRT wyznaczono granice trzech charakterystycznych domen (N, P i C) oraz zmapowano motywy uważane za typowe dla CRT, tj. sekwencję sygnałową kierującą do ER, charakterystyczne regiony Calreticulin1 i Calreticulin2, dwa ciągi trzykrotnych powtórzeń M1 (PXXIXDPXXKKPEXWDE) i M2 (GXWXAXXIXNPXYK), a także sekwencję retencyjną HDEL. Obecność dużej liczby ujemnie naładowanych aa w domenie C-końcowej oraz lokalizacja miejsca glikozylacji w domenie N-końcowej pomiędzy 59. a 62. aa (jedno z najsilniej konserwowanych miejsc glikozylacji w roślinnych wariantach CRT; Jia i in. 2009) świadczy o przynależności sklonowanej sekwencji PhCRT do grupy genów CRT1/2. Natomiast przeprowadzona analiza filogenetyczna pozwala przypuszczać, że PhCRT jest izoformą CRT1, która wykazuje najwyższą zgodność sekwencji aminokwasowej z CRT Nicotiana tabacum, gatunkiem należącym do tej samej rodziny co Petunia (Solanaceae). Oba polipeptydy rozpoczynają się sześcioma jednakowymi aa MATQRR i kończą motywem HDEL (Lenartowski i in. 2014). Zatem zidentyfikowany w słupku Petunia gen PhCRT jest zachowywany w toku ewolucji i koduje białko należące do grupy izoform CRT1/2.
Gen PhCRT podlega wzmożonej ekspresji podczas zdarzeń reprodukcyjnych w słupku Petunia wiążących się z dynamiką zmian w poziomie wymiennego Ca 2+ Sklonowana sekwencja PhCRT cdna stanowiła matrycę dla syntezy gatunkowo specyficznej antysensownej sondy RNA. Jej wykorzystanie podczas hybrydyzacji northern i fluorescencyjnej in situ hybrydyzacji (FISH) umożliwiło określenie aktywności transkrypcyjnej PhCRT w kluczowych etapach procesu reprodukcji w słupku Petunia (Lenartowski i in. 2014). Przeprowadzone badania wykazały najwyższy poziom transkryptów PhCRT w górnej części słupka (fragment znamię-szyjka) przed antezą oraz w trakcie wczesnej fazy progamicznej, kiedy z pyłku na powierzchni znamienia kiełkują łagiewki pyłkowe. W zalążniach odnotowałem postępujący wzrost poziomu PhCRT mrna od momentu zapylenia do późnego etapu fazy progamicznej, kiedy komórki plemnikowe są deponowane na terenie woreczka zalążkowego. Bioobrazowanie miejsc lokalizacji PhCRT mrna za pomocą FISH potwierdziło nagromadzenie transkryptów PhCRT w: (i) komórkach wydzielniczych znamion izolowanych z pąków kwiatowych i dojrzałych kwiatów w dniu antezy; (ii) kiełkujących ziarnach pyłkowych i łagiewkach penetrujących szlak transmisyjny słupka; (iii) komórkach regionu mikropylarnego zalążka podczas późnej fazy progamicznej, fuzji gamet i wczesnej embriogenezy (Lenartowski i in. 2014). Szczególne nagromadzenie badanych transkryptów występowało w docelowej synergidzie zawierającej komórki plemnikowe oraz w zygocie i rozwijającym się bielmie. Następnie wykonałem analizę porównawczą poziomu i lokalizacji białka CRT w analogicznych stadiach rozwojowych/regionach/komórkach słupka Petunia za pomocą metody Western blot oraz immunozłotowej techniki lokalizacji antygenu na ultracienkich skrawkach z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej (Lenartowski i in. 2015). W badaniach wykorzystałem poliklonalne przeciwciało pierwotne anty-crt z kukurydzy (Napier i in. 1995), którego specyficzność została potwierdzona dla PhCRT (Lenartowski i in. 2015). Analiza Western blot wykazała najwyższy poziom badanego białka podczas wczesnej fazy progamicznej w górnej części słupka oraz w stadium okołozapłodnieniowym (późna faza progamiczna - fuzja gamet - wczesna embriogeneza) w zalążni (Lenartowski i in. 2015). Jednocześnie badania immunocytochemiczne zapylonych znamion oraz zalążków, do których wrastały łagiewki pyłkowe, potwierdziły lokalizację PhCRT w: (i) wydzielniczych komórkach znamienia; (ii) aktywnej aperturze kiełkujących ziaren pyłkowych; (iii) strefie subapikalnej rosnących łagiewek pyłkowych, (iv) komórkach aparatu jajowego (głównie w docelowej synergidzie) oraz w zygocie i rozwijającym się bielmie. Szczególne nagromadzenie badanego białka w tych komórkach obserwowałem w ER i diktiosomach, a także na terenie aparatu fibrylarnego synergid (Lenartowski i in. 2015). Zasadniczo we wszystkich powyżej wymienionych miejscach lokalizacji PhCRT występowały dynamiczne zmiany w poziomie wymiennego Ca 2+, głównie w cysternach ER i diktiosomach komunikujących się komórek podczas interakcji pyłek-słupek (Lenartowski i in. 2015). Podobnie jak w przypadku PhCRT, szczególne gromadzenie Ca 2+ obserwowałem przede wszystkim w aktywnej aperturze kiełkujących ziaren pyłkowych, strefie subapikalnej rosnących łagiewek pyłkowych, komórkach aparatu jajowego (głównie w docelowej synergidzie), zygocie i rozwijającym się bielmie.
Otrzymane wyniki badań stały się podstawą do wyciągnięcia wniosku, że gen PhCRT podlega wzmożonej ekspresji w słupku Petunia w odpowiedzi na: (i) dojrzewanie słupka poprzedzające antezę; (ii) kiełkowanie pyłku i wzrost łagiewek pyłkowych; (iii) depozycję komórek plemnikowych w docelowej synergidzie; oraz (iv) podwójne zapłodnienie i wczesną embriogenezę. Zdecydowana większość wymienionych zdarzeń reprodukcyjnych wymaga wysokiego tempa biosyntezy białek, kiedy aktywność CRT w roli białka opiekuńczego może być szczególnie istotna dla funkcji wydzielniczej komórek szlaku transmisyjnego słupka, szczytowego wzrostu łagiewek pyłkowych związanego z egzocytozą oraz procesu formowania zarodka i tkanki odżywczej w postaci bielma. Na podwyższoną ekspresję genów CRT (w większości przypadków bez wskazania określonych ortologów/paralogów) w tkankach sekrecyjnych/odżywczych pylników i rozwijających się nasion, w rosnących in vitro łagiewkach pyłkowych, a także w odpowiedzi na zapłodnienie i/lub rozwój zarodka wskazywały również wyniki innych grup badawczych (przegl. Lenartowska i in. 2009). W organach generatywnych Arabidopsis potwierdzono wysoki poziom ekspresji wszystkich trzech genów CRT, z wyjątkiem CRT3 w dojrzałych pylnikach (Christensen i in. 2010). Autorzy tych doniesień skłaniali się ku hipotezie, zgodnie z którą rozmnażanie generatywne roślin wymaga bezwzględnie wysokiej aktywności białek opiekuńczych, wśród których CRT może pełnić nadrzędną rolę. Otrzymane przeze mnie wyniki badań nie kwestionują tej tezy lecz wskazują, że równie istotny w omawianym procesie może być udział CRT w regulacji mobilnej puli Ca 2+ podczas zdarzeń reprodukcyjnych w słupku. Świadczą o tym następujące fakty: produktem zidentyfikowanego w słupku Petunia genu PhCRT jest białko należące do grupy izoform CRT1/2 (Lenartowski i in. 2014), które wiążą znaczne ilości Ca 2+ w domenach P-C (Qiu i in. 2012); podwyższona ekspresja PhCRT w słupku Petunia koreluje z dynamiką zmian w poziomie wymiennego Ca 2+ w wyspecjalizowanych komórkach uczestniczących w interakcji pyłeksłupek (Lenartowski i in. 2014, 2015). Precyzyjna regulacja Ca 2+ c jest wymagana podczas kluczowych etapów procesu reprodukcji, takich jak kiełkowanie pyłku, wzrost łagiewki pyłkowej, uwolnienie komórek plemnikowych w docelowej synergidzie, blok polispermii, fuzja gamet, aktywacja genomu zygotycznego oraz rozwój zarodka i bielma (Ge i in. 2007; Dresselhaus i Franklin-Tong 2013; Steinhorst i Kudla 2013); PhCRT i wymienny Ca 2+ współwystępują w komunikujących się komórkach, głównie w ER i diktiosomach (Lenartowski i in. 2015), stanowiących niekwestionowane miejsca występowania CRT u roślin (przegl. Lenartowska i in. 2009) oraz efektywne magazyny Ca 2+ w komórkach eukariotycznych (Vandecaetsbeek i in. 2011). W świetle powyższych faktów, CRT pretenduje do roli istotnego elementu wewnątrzkomórkowego mechanizmu gromadzenia i mobilizacji Ca 2+ podczas kluczowych zdarzeń reprodukcyjnych w słupku Petunia. W kiełkujących ziarnach pyłkowych i rosnących łagiewkach Petunia translacja CRT odbywa się na rybosomach związanych z ER Ukierunkowany wzrost łagiewki pyłkowej w słupku jest jednym z podstawowych procesów gwarantujących sukces reprodukcyjny rośliny okrytonasiennej. Łagiewki różnych
gatunków roślin rosną także w kulturach in vitro, gdzie z oczywistych powodów nie funkcjonują mechanizmy odpowiedzialne za orientację ich wierzchołków do mikropyle zalążków. Możliwość elongacji łagiewek pyłkowych na podłożach hodowlanych dowodzi, że ich szczytowy wzrost jest procesem niezależnym od specyficznych sygnałów słupkowych. Z tego powodu rosnące in vitro łagiewki pyłkowe stanowią dogodny model w badaniach nad ekspresją/funkcją określonych genów/białek w procesie wierzchołkowego wzrostu wyspecjalizowanych komórek roślinnych. Na tej podstawie, w kolejnych etapach badań wykorzystano kultury in vitro łagiewek Petunia w celu: (i) określenia miejsc syntezy CRT w rosnącej łagiewce pyłkowej oraz (ii) zdefiniowania roli CRT w procesie szczytowego wzrostu tej komórki. Powszechnie akceptowany model zakłada, że w komórkach eukariotycznych biosynteza białek cytozolowych i białek jądrowych odbywa się na polisomach wolnych, natomiast białka wydzielnicze, białka rozpuszczalne organelli komórkowych oraz integralne białka błonowe powstają na rybosomach zasocjowanych z ER (Cui i Pallazo 2014). O translacji na powierzchni ER decyduje sekwencja sygnałowa na N-końcu syntetyzowanego polipeptydu wiązana przez znajdującą się w cytozolu cząstkę rozpoznającą sygnał (SRP, ang. signal recognition particle), która kieruje rybosom do ER. W błonie ER znajduje się receptor SRP odpowiedzialny za powstanie kompleksu umożliwiającego wznowienie syntezy białka na rer i przemieszczenie nowo syntetyzowanego polipeptydu do wnętrza organelli. Białka rezydujące w ER mają także C-końcową sekwencję retencyjną (zwykle KDEL u zwierząt i HDEL u roślin), która uniemożliwia ich eksport do innych przedziałów komórkowych lub sekrecję poza komórkę. CRT, jako rozpuszczalne białko wnętrza ER, posiada sekwencję sygnałową i retencyjną (Jia i in. 2009; Michalak i in. 2009). Wyniki moich badań wykazały, że PhCRT mrna koduje polipeptyd zawierający obie sekwencje, w tym typowy dla roślinnej CRT sygnał retencyjny HDEL (Lenartowski i in. 2014). Ponadto, obecność PhCRT, transkryptów PhCRT mrna, cząsteczek Ph18S rrna i cystern rer została potwierdzona w aktywnych aperturach kiełkujących ziaren pyłkowych oraz w strefie subapikalnej i dystalnym trzonie rosnących łagiewek (Suwińska i in. 2015). Podobną dystrybucję CRT i jej transkryptów obserwowano również w łagiewkach pyłkowych penetrujących tkankę transmisyjną słupka Petunia (Lenartowski i in. 2014, 2015) oraz w kiełkujących ziarnach pyłkowych i/lub wydłużonych łagiewkach innych gatunków roślin okrytozalążkowych (Nardi i in. 2006; Lenartowska i in. 2009). Akumulacja CRT występowała w regionach cytoplazmy bogatych w struktury rer/ser. Dlatego wyniki badań dokumentujące współwystępowanie PhCRT, kodujących ją transkryptów, Ph18S rrna oraz rer dowodzą w sposób pośredni, że w ściśle określonych regionach cytoplazmy kiełkujących ziaren pyłkowych i rosnących łagiewek Petunia translacja CRT odbywa się na rybosomach związanych z błonami ER. Powyższy wniosek wymaga pewnego uzupełnienia. Wydaje się, że niektóre transkrypty mogą wiązać się z ER bez udziału sekwencji sygnałowej rozpoznawanej przez SRP (Pyhtila i in. 2008; Chen i in. 2011), za pomocą swoistych białek bezpośrednio promujących kotwiczenie określonych rodzajów mrna na powierzchni ER (Cui i Pallazo 2014). Wydaje się, że ten alternatywny mechanizm mógłby funkcjonować także w przypadku translacji CRT w rosnących łagiewkach pyłkowych. W komórkach z obniżonym poziomem lub brakiem białek SRP, transkrypty CRT są akumulowane w pobliżu ER (Pyhtila in. 2008). Ich asocjacja z błoną ER wymaga prawdopodobnie obecności innych, hipotetycznych
receptorów błonowych (Cui i in. 2012). Jednym z nich może być białko p180, w którego sekwencji zidentyfikowano region wiążący się bezpośrednio z RNA (Cui i in. 2012). Ponadto, niektóre mrna kodujące białka rezydujące w ER są zdecydowanie mocniej wiązane z powierzchnią tej organelli niż inne, co sugeruje istnienie odmiennych mechanizmów kotwiczenia ich transkryptów na powierzchni ER (Chen i in. 2011; Cui i in. 2012). W świetle przedstawionych wyników badań wydaje się, że w kiełkujących ziarnach pyłkowych i rosnących łagiewkach Petunia synteza CRT na rybosomach związanych z ER może odbywać się w sposób zależny lub niezależny od SRP. Niewykluczone, że w określonych przypadkach mogą funkcjonować obie alternatywne drogi kierujące mrna PhCRT do translacji na rer. Jednak weryfikacja tej hipotezy wymaga dalszych badań. CRT uczestniczy w utrzymaniu homeostazy Ca 2+ w rosnącej łagiewce pyłkowej Petunia, co umożliwia jej prawidłowy wzrost W ostatnim etapie badań zaplanowałem szereg eksperymentów w warunkach in vitro z wykorzystaniem sekwencji sirna komplementarnych do PhCRT cdna. Celem tych doświadczeń było ujawnienie potencjalnych zaburzeń w procesie wzrostu łagiewek pyłkowych Petunia, będących skutkiem niedoboru CRT. Badania te są szczególnie istotne z uwagi na fakt, że po raz pierwszy na świecie otrzymano wyniki dokumentujące efekt wyciszenia ekspresji CRT na poziomie transkryptu w rosnących łagiewkach pyłkowych. Mechanizm potranskrypcyjnego wyciszenia ekspresji genu (PTGS, ang. post-transcriptional gene silencing) w komórkach roślinnych jest naturalnym procesem degradacji/regulacji poziomu mrna z udziałem aktywnego kompleksu RISC (ang. RNA-induced silencing complex), indukowanym obecnością efektora, jakim jest dwuniciowy sirna (Vaucheret et al. 2001). Adaptacja mechanizmu PTGS do celów eksperymentalnych polega na dostarczeniu do komórek egzogennych, komplementarnych do określonego mrna dupleksów sirna. Oczekiwanym efektem jest wybiórcza degradacja transkryptów danego genu umożliwiająca poznanie funkcji jego produktu (białka) podczas analizy potencjalnych zmian fenotypowych w badanym układzie biologicznym (komórka-tkanka-organizm). W oparciu o sklonowaną sekwencję PhCRT cdna (Lenartowski i in. 2014), zaprojektowałem szereg gatunkowo swoistych sekwencji sirna komplementarnych do PhCRT mrna (Suwińska i in. 2017). Proces wyboru i syntezy dupleksów poprzedziłem wieloetapową analizą bioinformatyczną, która umożliwiła wykluczenie sirna homologicznych do mrna innych genów lub podobnych do endogennych, małych niekodujących RNA Petunia. Szczególną uwagę zwróciłem na zachowanie komplementarności tzw. regionu seed projektowanych sekwencji sirna z docelowym transkryptem. Każdy dupleks zawierał wymagany procent par A/T i G/C oraz miał zmodyfikowane końce 3 w celu zapewnienia stabilności cząsteczki. W trakcie badań wstępnych, z trzech zsyntetyzowanych siphcrt został wybrany najbardziej efektywny (si1phcrt), wywołujący efekt potranskrypcyjnego wyciszenia ekspresji PhCRT w rosnących in vitro łagiewkach Petunia na wymaganym poziomie przy najniższym stężeniu roboczym w pożywce hodowlanej. Wykonane eksperymenty, reakcje kontrolne i analizy statystyczne potwierdziły wybiórczą degradację transkryptów PhCRT oraz wykluczyły potencjalną cytotoksyczność dupleksów sirna. Badania z wykorzystaniem specyficznych sekwencji
si1phcrt obejmowały szereg analiz porównawczych dotyczących morfologii, parametrów wzrostu, ultrastruktury, organizacji cytoszkieletu aktynowego oraz poziomu Ca 2+ w wydłużonych łagiewkach pyłkowych Petunia z wyciszoną ekspresją PhCRT (łagiewki si1phcrt) oraz w łagiewkach kontrolnych (Suwińska i in. 2017). Badania ilościowe poziomu PhCRT mrna (pomiar sygnału FISH) oraz PhCRT (pomiar sygnału immunofluorescencji) wykazały istotny spadek poziomu badanego transkryptu i białka w łagiewkach pyłkowych si1phcrt w stosunku do łagiewek kontrolnych (odpowiednio o 85 i 79%). Dodatkowo, analiza Western blot potwierdziła wyniki otrzymane dzięki pomiarom sygnału immunofluorescencji oraz wykluczyła potencjalny wpływ interferencji si1phcrt na poziom białek referencyjnych, takich jak aktyna i tubulina. Kolejne obserwacje prowadzone w mikroskopie optycznym i elektronowym ujawniły, że skutkiem niedoboru CRT w rosnących łagiewkach Petunia są poważne anomalie morfologiczne i ultrastrukturalne. Łagiewki si1phcrt wykazywały nieprawidłowe parametry wzrostu, deformacje kształtu i zaburzenia w strefowej organizacji cytoplazmy. Podczas gdy w strefie jasnej łagiewek kontrolnych obserwowałem głównie pęcherzyki, w cytoplazmie wierzchołkowej łagiewek si1phcrt występowały liczne mitochondria, krótkie cysterny ER, ciała lipidowe i małe wakuole. W strefie subapikalnej i dystalnym trzonie stwierdziłem zaburzoną lokalizację diktiosomów i zredukowanych struktur ER oraz postępującą wakuolizację cytoplazmy. Ponadto, w łagiewkach pyłkowych z wyciszoną ekspresją PhCRT następowała dezorganizacja wszystkich typowych dla łagiewek roślin okrytonasiennych konfiguracji mikrofilamentów, w tym długich wiązek F-aktyny w strefie trzonowej, obrączki krótkich AF w strefie subapikalnej i sieci SAB w strefie wierzchołkowej. Procesowi dekompozycji struktur aktynowych towarzyszyła destabilizacja gradientu Ca 2+, a efektem kumulacji wszystkich obserwowanych zaburzeń było zahamowanie wzrostu i pękanie zdecydowanej większości łagiewek si1phcrt (Suwińska i in. 2017). Unikalna organizacja cytoszkieletu aktynowego w łagiewce pyłkowej warunkuje strefową organizację cytoplazmy, wewnątrzkomórkowy transport metabolicznie aktywnych organelli i pęcherzyków do rosnącego wierzchołka oraz egzo- i endocytozę, co umożliwia szczytowy wzrost komórki (Cai i Cresti 2009; Onelli i Moscatelli 2013; Cai i in. 2015). Dynamikę aktyny i funkcjonowanie szlaków transportu opartych na systemie aktomiozynowym regulują liczne białka ABP, których aktywność moduluje optymalne Ca 2+ c w zdefiniowanych strefach rosnącej łagiewki pyłkowej (Ren i Xiang 2007; Fu 2010; Staiger i in. 2010; Hepler i Winship 2015; Qu i in. 2015). W świetle tych faktów, otrzymane wyniki badań wskazują, że CRT jest ważnym elementem wewnątrzkomórkowego mechanizmu, który stabilizując gradient Ca 2+ wpływa na współdziałanie podstawowych procesów i struktur warunkujących szczytowy wzrost łagiewki pyłkowej Petunia. Równie istotna w tym procesie może być niekwestionowana funkcja CRT w kontroli jakości polipeptydów dojrzewających w ER, ze względu na wymagane wysokie tempo syntezy białek podczas elongacji łagiewki najszybciej rosnącej komórki roślinnej.
Ujawnione miejsca lokalizacji CRT w słupku i rosnących łagiewkach pyłkowych Petunia potwierdzają aktywność tego białka także poza ER Wszystkie opisane dotychczas roślinne warianty CRT zawierają peptyd sygnałowy i sekwencję retencyjną HDEL, które determinują ich lokalizację w ER (Jia i in. 2009; przegl. Lenartowska i in. 2009). Pomimo takiej budowy, potwierdzono obecność CRT poza wspomnianym przedziałem komórkowym (również w komórkach zwierzęcych), głównie w diktiosomach i różnego typu pęcherzykach, a także na terenie cytozolu, jądra komórkowego, wrzeciona podziałowego, w ciałach białkowych, błonie komórkowej, plazmodesmach, na powierzchni komórki i w ścianie komórkowej (przegl. Lenartowska i in. 2009). Dokumentowana przez kolejne doniesienia naukowe identyfikacja CRT poza ER podlega ciągłej dyskusji (Christensen i in. 2010; Lenartowski i in. 2015; Luczak i in. 2015; Niedojadło i in. 2015). Jak dotąd brak jednoznacznej odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób CRT może opuszczać wnętrze ER. Formułowane hipotezy uwzględniają możliwość powstawania wariantów splicingowych białka kierowanych do różnych lokalizacji w komórce, a także potranslacyjne modyfikacje CRT skutkujące utratą sekwencji retencyjnej HDEL (Johnson i in. 2001; Michalak i in. 2009). Jedna z najnowszych publikacji zespołu naukowego prof. dr hab. Przemysława Wojtaszka bezsprzecznie dowodzi, że CRT (podobnie jak kilka innych białek) jest wiązana w ścianach komórkowych kukurydzy, Lupinus i Arabidopsis (Luczak i in. 2015). W trakcie badań stanowiących podstawę osiągnięcia naukowego ujawniłem lokalizację PhCRT zarówno w przedziałach komórkowych uznawanych dla tego białka za typowe (ER i diktiosomy) jak i poza nimi (Lenartowski i in. 2015), co potwierdza wcześniejsze obserwacje naszego zespołu i innych grup badawczych. Badania immunocytochemiczne prowadzone na poziomie mikroskopu elektronowego wykazały, że głównym miejscem występowania CRT w szlaku transmisyjnym słupka Petunia, komórkach gametofitu żeńskiego, rosnących w słupku łagiewkach pyłkowych oraz w zygocie i rozwijającym się bielmie jest ER i diktiosomy (Lenartowski i in. 2015). Ponadto, obecność badanego białka potwierdziłem w jądrach komórkowych, ciałach jądrowych i jąderkach oraz na terenie aparatu fibrylarnego synergid. Wykazałem także akumulację PhCRT mrna w jądrach tych komórek oraz w jądrze wegetatywnym kiełkującego ziarna pyłkowego i wyrastającej łagiewki, jak i komórkach plemnikowych deponowanych na terenie docelowej synergidy (Lenartowski i in. 2014). Rozważania teoretyczne dotyczące lokalizacji PhCRT w subdomenach jądrowych oraz w aparacie fibrylarnym synergid podczas kluczowych zdarzeń reprodukcyjnych w słupku zostały obszernie przedyskutowane w odniesieniu do hipotetycznej roli tego białka w procesie regulacji aktywności transkrypcyjnej, organizacji przestrzennej chromatyny, eksportu białek na teren cytoplazmy, składania/dojrzewania transkryptów i biogenezy rybosomów oraz funkcji mobilnego magazynu Ca 2+ i roli białka opiekuńczego (Lenartowski i in. 2014, 2015). Niemniej, kwestia biologicznej roli CRT poza ER wymaga dalszych, szczegółowych badań.
5.5 Podsumowanie Wyniki badań stanowiących podstawę prezentowanego osiągnięcia naukowego umożliwiły sformułowanie następujących wniosków końcowych: zidentyfikowany w słupku Petunia gen PhCRT jest zachowywany w toku ewolucji i koduje transkrypt, na matrycy którego powstaje polipeptyd z grupy izoform CRT1/2 opisywane jako białka o podstawowym znaczeniu w utrzymaniu homeostazy Ca 2+ oraz kontroli jakości polipeptydów dojrzewających w ER; gen PhCRT podlega wzmożonej ekspresji podczas kluczowych etapów procesu reprodukcji w słupku Petunia, takich jak dojrzewanie szlaku transmisyjnego słupka poprzedzające antezę, kiełkowanie pyłku i wzrost łagiewek pyłkowych, depozycja komórek plemnikowych w docelowej synergidzie, podwójne zapłodnienie oraz wczesna embriogeneza; podwyższona ekspresja PhCRT w słupku Petunia koreluje z dynamiką zmian w poziomie wymiennego Ca 2+ w komórkach uczestniczących w interakcji pyłek-słupek, w których precyzyjna regulacja Ca 2+ c jest krytyczna podczas kolejnych zdarzeń reprodukcyjnych; w komunikujących się komórkach, PhCRT i wymienny Ca 2+ współwystępują w ER i diktiosomach, stanowiących niekwestionowane miejsca występowania CRT u roślin oraz mobilne magazyny Ca 2+ w komórkach eukariotycznych; w kiełkujących ziarnach pyłkowych i rosnących łagiewkach Petunia translacja PhCRT odbywa się na rybosomach związanych z ER w ściśle określonych regionach cytoplazmy, jakimi są aktywna apertura kiełkującego ziarna pyłkowego oraz strefa podwierzchołkowa i dystalny trzon rosnącej łagiewki pyłkowej; PhCRT uczestniczy w utrzymaniu homeostazy Ca 2+ w rosnącej łagiewce pyłkowej Petunia, co umożliwia przebieg podstawowych procesów i współdziałanie struktur warunkujących szczytowy wzrost komórki; ujawnione miejsca lokalizacji PhCRT w jądrach komórek szlaku transmisyjnego słupka Petunia, gametofitu żeńskiego, zygoty i rozwijającego się bielma oraz na obszarze aparatu fibrylarnego synergid potwierdzają aktywność tego białka także poza ER. Podsumowując, uzyskane wyniki badań wskazują, że CRT jest istotnym elementem wewnątrzkomórkowego mechanizmu gromadzenia i mobilizacji Ca 2+ podczas kluczowych etapów rozmnażania generatywnego Petunia, takich jak dojrzewanie szlaku transmisyjnego słupka, kiełkowanie pyłku i ukierunkowany wzrost łagiewki pyłkowej, uwolnienie komórek plemnikowych w docelowej synergidzie, blok polispermii, fuzja gamet, aktywacja genomu zygotycznego oraz rozwój zarodka i bielma. Równie ważne w tym wieloetapowym procesie może być zaangażowanie CRT w kontrolę jakości polipeptydów dojrzewających w ER. Ta niekwestionowana funkcja CRT może gwarantować utrzymanie wysokiego tempa syntezy białek podczas aktywności wydzielniczej komórek szlaku transmisyjnego słupka, szczytowy wzrost łagiewki pyłkowej związany z egzocytozą na jej wierzchołku oraz proces formowania zarodka i tkanki odżywczej w postaci bielma.