Cytoplazma złoŝony koloid wodny cząsteczek i makrocząsteczek Cytoplazma cytoplazma podstawowa (cytozol) organelle Cytoplazma podstawowa (macierz cytoplazmatyczna) ok. 55% objętości komórki złoŝony koloid wodny białek (20%), i wszelkich rozpuszczalnych związków organicznych i nieorganicznych biorących udział w przemianie materii komórki (zol/ŝel) kompleksy białkowe (+RNA) rybosomy proteasomy cytoszkielet krople tłuszczu, ziarna glikogenu 1
Cytoplazma podstawowa (macierz cytoplazmatyczna) Procesy zachodzące w cytoplazmie podstawowej - wszelkie procesy związane z metabolizmem pośrednim: syntezy /rozkładu biosynteza białek (translacja) / proteoliza początkowe etapy oddychania (glikoliza lub oksydacyjny szlak pentozofosforanowy) Rybosomy u Eukariotów rybosomy 80S; (70S w mitochondriach i chloroplastach) białek duŝa podjednostka białek mała podjednostka Białka: strukturalne enzymatyczne Aktywność katalityczna: RNA Podjednostki rybosomu duŝa mała kompletny rybosom RNA -2/3masy białka - 1/3 2
Rybosomy-biosynteza białka Translacja składa się z czterech faz: Film 1 aktywacja (aminokwas + trna = aminoacylo- trna) inicjacja (mała podjednostka rybosomu do5 mrna + duza podjednostka) elongacja terminacja (kodon stop: UAA, UAG lub UGA) miejsce wiązania mrna Miejsca wiązania t-rna A-site: akceptorowe (aminoacylo-trna) P-site peptydylowe (peptydylo trna) E-site: wyjścia (ang. exit) Filmy _rybosom_elong transl I i II Polirybosomy (polisomy) Synteza białek: 20sek kilka min wielokrotna inicjacja Film translacji Film_polirybosom Rybosom rrna rdzeń rybosomu (struktura) rybozymem - aktywność katalityczna (rrna 23S duŝej podjednostki miejsce katalityczne peptydylotransferazy) miejsce spotkania się wszystkich rodzajów RNA 3
Proteoliza proteoliza lizosomowa nieselektywna; białka pobierane przez komórki strukturalne długowieczne proteoliza proteasomowa (80-90%) białka uszkodzone, nieprawidłowo sfałdowane krótkoŝyjące (regulacyjne) selektywna ubikwitynacja białka (wiązanie ubikwityny przez wiązanie izopeptydowe) Proteasomy (proteosomy) Kompleks: białka RNA aparat importujący białka do proteolizy (19S)- regulatorowy (aktywator proteasomu, 6 ATP-az) proteasom 26S aparat dokonujący proteolizy białek (20S) katalityczny (4 pierścienie z 7 podjednostek, beczułka) we wszystkich komórkach eukariotycznych w cytoplazmie i jądrze 4
Proteasomy proteoliza proteasomowa białko -sekwencja rozpoznawcza pudełko destrukcyjne (N-końcu 8-10 reszt) 76 aa związanie ubikwityny (3 enzymy, ligaza; wiązanie izopeptydowe: białko-lys_ Gly76_Ub) proteaza proteasomowa wnikanie do proteasomu degradacja białek do peptydów ( 8-15 aa), odłączenie ubikwityny Proteosomy proteoliza proteasomowa tylko u eukariotów związana z ubikwityną selektywna białka krótkoŝyjące (SS blisko N-końca) białka uszkodzone, źle sfałdowane 5
CYTOSZKIELET Sieć włókienek białkowych; struktura wysoce dynamiczna Filamenty aktynowe Filamenty pośrednie Mikrotubule Fibroblast CYTOSZKIELET 6
CYTOSZKIELET 7nm 10nm 25nm Filamenty pośrednie ich średnica 9-12 nm zbudowane z białek specyficznych tkankowo stanowią ochronę mechaniczną komórki odpowiedzialne za spręŝystość cytoplazmy 7
Budowa filamentu pośredniego animacja 8
Filamenty pośrednie Klasyfikacja FP w oparciu o sekwencje domeny trzonowej (α- helisy) I i II homo- i heteropolimery 12 izoform w ludzkim naskórku III IV V zwykle 1 klasa cytoplazmatycznych FP w danym typie komórek komórki nowotworowe ekspresja FP jak w komórkach wyjściowych 9
Białka wiąŝące filamenty pośrednie Plakiny plektyna desmoplakina Białka epidermalne filagryna Związane z laminami LAP1, LAP2, LBR FILAMENTY POŚREDNIE Mikrografia fluorescencyjna komórek epitelialnych w hodowli wybarwione wiązki filamentów keratynowych Mikrografia elektronowa cienkich skrawków komórek nerki chomika w hodowli filamenty wimentynowe (strzałki) 10
Filamenty pośrednie keratynowe w komórkach epitelialnych desmosomy i hemidesmosomy desmosomy półdesmosomy 11
Filamenty pośrednie wzmacniają komórkę zwierzęcą Filamenty pośrednie wzmacniają komórkę Zdjęcie z mikroskopu świetlnego skóry prawidłowej i od pacjenta z chorobą genetyczną -zwykłe pęcherzowe oddzielanie się naskórka (epidermolysis bullosa simplex) - mutacja w obrębie genu keratyny odpowiedzialna za nieprawidłowe formowanie filamentów keratynowych (monomery jednej z keratyn pozbawione globularnych domen na C i N-końcach) 12
Odmienność filamentów jądrowych zbudowane z lamin tworzą sieć (nie liny) ulegają demontaŝowi i ponownemu formowaniu Mikrografia elektronowa sieci filamentów jądrowych oocytu Xenopus Fosforylacja lamin konieczna do rozpadu filamentów blaszki jądrowej 13
Filamenty aktynowe komórki CHO (Chinese hamster ovary cells ) Hoechst jądra, BOPIPY TR-X phallacidin filamenty aktynowe Cytoszkielet aktynowy G-aktyna 370 aminokwasów 42 43 kda izoformy: α,, β, β, γ aktyna konserwatywna 14
Filamenty aktynowe (F-aktyna) agregacja Cytoszkielet aktynowy Oddziaływania hydrofobowe Słabe wiązania niekowalencyjne 13 Cytoszkielet aktynowy hydroliza ATP 15
Cytoszkielet aktynowy Polimeryzacja aktyny Cytoszkielet aktynowy 50% ~ 50% 50-200µM G-aktyny 16
Białka wiąŝące aktynę (ABP -actin binding protein) białka wiąŝące monomery (profilina, tymozyna) białka czapeczkujące białka tnące białka wiąŝące się wzdłuŝ FA białka wiąŝące filamenty ze sobą białka wiąŝące filamenty z błonami Białka wiąŝące F-aktynę białka tnące, białka czapeczkujące 17
- białka wiąŝące się wzdłuŝ FA stabilizują filamenty destabilizują filamenty kofilina tropomiozyna Białka wiąŝące aktynę białka wiąŝące filamenty ze sobą równolegle krzyŝowo 18
równolegle krzyŝowo - białka wiąŝące FA krzyŝowo Komórki melanoma: (A)- niski poziom filaminy (B) - poziom filaminy zwiększony 19
- białka wiąŝące FA do błony komórkowej Rodzina białek EMR (ezrin, radixin, monesin) Miejsca kontaktów zogniskowanych - focal contacts Miejsca kontaktów zogniskowanych - focal contacts Fibroblasty w hodowli: A) focal contacts- zdjęcie z mikroskopu odbiciowego B) filamenty aktynowe wybarwione znakowaną falloidyną 20
Organizacja filamentów aktynowych w komórce Organizacja filamentów aktynowych rola białek Rho Nadrodzina RAS Rho Rab Arf/Sar Ran Ras Rodzina Rho rho rac cdc42 21
Filamenty aktynowe zmieniają kształt błony w komórkach zwierzęcych A) mikrokosmki B) włókna napręŝenowe C) filopodia D) pierścień kurczliwy Filamenty aktynowe Filamenty aktynowe w fibroblastach REF-52 - mikrografia elektronowa. a) sieć aktynowa w lamelipodium na końcu wiodącym komórki b) włókna napręŝeniowe (stress fibers) wzdłuŝ napręŝeń cytoplazmy Filamenty aktynowe zmieniają kształt błony w komórkach zwierzęcych 22
Organizacja filamentów aktynowych w komórce Mikrokosmki: stabilna struktura aktynowa Aparat kurczliwy mięśni sarkolema 2,5 µm włókna mięśniowe: kilka- kilkaset µm - grubość kilka- kilkadziesiąt cm - długość 23
Cytoszkielet aktynowy - funkcje warunkuje kształt komórki ruch komórki ruchy wewnątrzkomórkowe cytokineza mikrokompartmentacja Cytoszkielet aktynowy generacja ruchu przez polimeryzację aktyny przez aktynozaleŝne białka motoryczne 24
Generacja ruchu przez polimeryzację aktyny motorem ruchu sama aktyna kierunkowa polimeryzacja / depolimeryzacja aktyny źródłem energii hydroliza ATP w związanych monomerach aktynowych Generacja ruchu przez polimeryzację aktyny Zapoczątkowanie polimeryzacji aktyny w komórce: fragmentacja istniejących filamentów odsłonięcie końców + filamentów nukleacja de novo kompleks Arp2/3 25
Miozyny -aktynozaleŝne białka motoryczne + - 37 rodzin rośliny kręgowce Miozyny -aktynozaleŝne białka motoryczne 2 łańcuchy cięŝkie superhelisa 4 łańcuchy lekkie koniec koniec szyjka (ramię dźwigni) Miozyna II dimer 26
Miozyny -aktynozaleŝne białka motoryczne właściwości hydrolityczne miozyny aktywowane przez aktynę hamowane przez jony Mg +2 Bipolarny filament 15-20 cząsteczek Niektóre funkcje miozyn film film 27
Kroczenie miozyny po FA Cykl zmian umoŝliwiający wędrówkę miozyny po filamencie aktynowym cykl skurczowy około 15ms 1 filament gruby-300 głów miozyny film Pełzanie komórki 28
Czy i jak zmieni się wygląd i zachowanie komórek (film) po dodaniu do środowiska (poŝywki) cytochalazyny (toksyny grzybów) 29