Autoreferat. dr Halyna Tkachenko. Załącznik 3

Załącznik 3 Autoreferat dr Halyna Tkachenko Akademia Pomorska w Słupsku Wydział Matematyczno-Przyrodniczy Instytut Biologii i Ochrony Środowiska ul. Arciszewskiego 22b 76-200 Słupsk Słupsk 2018

2 1. Imię i nazwisko: Halyna Tkachenko 2. POSIADANE DYPLOMY, STOPNIE NAUKOWE ORAZ PRZEBIEG PRACY ZAWODOWEJ 1.09.1996 29.06.2001 Studia wyższe magisterskie dzienne, kierunek Biologia, Wydział Biologii, Lwowski Uniwersytet Narodowy imienia Iwana Franki (Lwów, Ukraina) 14.06.2001 Magister biologii, w zakresie fizjologii człowieka i zwierząt; Wydział Biologii, Lwowski Uniwersytet Narodowy imienia Iwana Franki (Lwów, Ukraina). Tytuł pracy magisterskiej: Wpływ peroksydacji lipidów na systemy transportu wapnia w komórkach wydzielniczych gruczołu ślinowego, praca napisana pod kierunkiem prof. dr hab. W. Mańko. 1.11.2001 31.10.2004 Dzienne Studium Doktoranckie, Wydział Biologii, Lwowski Uniwersytet Narodowy imienia Iwana Franki (Lwów, Ukraina). 21.09.2005 Obrona pracy doktorskiej w Kijowskim Uniwersytecie Narodowym imienia Tarasa Szewczenki. Tytuł rozprawy doktorskiej: Wpływ modulatorów ATP-czułych kanałów potasowych na procesy energetyczne w wątrobie i sercu szczurów z różną wytrzymałością na niedotlenienie. Promotor: dr Stepan Hordiy (Lwowski Uniwersytet Narodowy imienia Iwana Franki, Lwów, Ukraina); Recenzenci: prof. dr hab. Petro Yanchuk (Kijowski Uniwersytet Narodowy imienia Tarasa Szewczenki, Kijów, Ukraina), prof. dr hab. med. Halina Anokhina (Państwowa Akademia Medyczna Kształcenia Podyplomowego im. P.L. Shupyka, Kijów, Ukraina), Instytucja wiodąca: Instytut Fizjologii im. A. Bohomolca, Państwowa Akademia Nauk (Kijów, Ukraina). 19.01.2006 Doktor nauk biologicznych w dyscyplinie biologia o specjalności fizjologia człowieka i zwierząt; Wyższa Komisja Atestacyjna, Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Ukrainy (Kijów, Ukraina). 1.11.2004 30.09.2009 Asystent w Katedrze Higieny i Toksykologii, Wydział Lekarski,

3 od 1.11.2009 - obecnie Lwowski Narodowy Uniwersytet Medyczny im. Daniela Halickiego Adiunkt w Instytucie Biologii i Ochrony Środowiska, Akademia Pomorska w Słupsku 3. DZIAŁALNOŚĆ NAUKOWO-BADAWCZA 3.1. Omówienie cyklu publikacji powiązanych tematycznie, będącego podstawą do ubiegania się o stopień naukowy doktora habilitowanego Tytuł osiągnięcia naukowego: Markery stresu oksydacyjnego w wybranych tkankach ryb w warunkach zmienności indywidualnej i środowiskowej Ocena poziomu markerów stresu oksydacyjnego i bilansu antyoksydacyjnego 1) u troci wędrownej (Salmo trutta m. trutta L.) dotkniętych wrzodziejącą martwicą skóry z dorzecza Słupi (województwo pomorskie) i w różnych stadiach rozwojowych tego gatunku ryb, 2) w skuteczności stosowania wybranych środków myjąco-dezynfekujących oraz szczepienia przeciwko szczepom Aeromonas spp. i Yersinia ruckeri u tarlaków ryb łososiowatych (pstrąg tęczowy, pstrąg potokowy, lipień), 3) w zmianach adaptacyjnych populacji ptaków w odpowiedzi na stres spowodowany zanieczyszczeniem środowiska, 4) w treningu koni sportowych różnej płci i wieku jest jednym z głównych nurtów prowadzonych przeze mnie badań po uzyskaniu stopnia doktora. Przeprowadzone badania i analiza procesów oddychania mitochondrialnego były podstawą do opublikowania szeregu prac naukowych poświęconych tematyce prewencji uszkodzeń stresowych serca i wątroby zwierząt z różną wytrzymałością na niedotlenienie w warunkach adrenalinowej i kobalt-indukowanej kardiomiopatii oraz zatrucia metalami ciężkimi i korekcja tych procesów L-argininą jako prekursorem syntezy tlenku azotu, inhibitorem NO-syntazy N ω -nitro-l-argininą (L-NNA), modulatorami ATPczułych kanałów potasowych (KATP) oraz metodą treningu przerywanej hipoksji (IHT, Intermittent hypoxia training). Jako osiągnięcie naukowe, które zgodnie z art. 16. ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz.U. nr 65, poz. 595 z późn. zm.) stanowi podstawę do ubiegania się o stopień doktora habilitowanego, wybrano spośród nich cykl powiązanych tematycznie pięciu oryginalnych publikacji naukowych (ON.1 ON.5.). Przedstawiono w nich wieloaspektowe ujęcie analizowanego problemu badawczego.

4 Publikacje stanowiące osiągnięcie naukowe, o którym mowa w art. 16 ust. 2 ustawy (Dz. U. nr 65, poz.595 ze zm.) 1,2,*,** : ON.1. Kurhalyuk N., Tkachenko H., Pałczyńska K. 2009. Antioxidant enzymes profile in the brown trout (Salmo trutta trutta) with ulcerative dermal necrosis. Bull. Vet. Inst. Puławy (Journal of Veterinary Research), 53: 813-818 (IF2009 0,218; IF2016 0,462; IF5 0,419; 15 pkt*, 15 pkt**) ON.2. Kurhalyuk N., Tkachenko H., Pałczyńska K. 2011. Resistance of erythrocytes from brown trout (Salmo trutta m. trutta L.) affected by ulcerative dermal necrosis syndrome. Pol. J. Vet. Sciences, 14(3): 443-448 (IF2011 0,565; IF2016 0,697; IF5 0,773; 20 pkt*, 20 pkt**) ON.3. Tkachenko H., Kurhaluk N., Grudniewska J., Andriichuk A. 2014. Tissue-specific responses of oxidative stress biomarkers and antioxidant defenses in rainbow trout Oncorhynchus mykiss during a vaccination against furunculosis. Fish Physiology and Biochemistry, 40(4): 1289-1300 (IF2014 1,622; IF2016 1,647; IF5 1,859; 20 pkt*, 20 pkt**) ON.4. Tkachenko H., Kurhaluk N., Grudniewska J. 2015. Biomarkers of oxidative stress and antioxidant defences as indicators of different disinfectants exposure in the heart of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum). Aquaculture Research, 46: 679-689 (IF2015 1,606; IF2017 1,461; IF5 1,745; 25 pkt*, 30 pkt**) ON.5. Tkachenko H., Grudniewska J. 2016. Evaluation of oxidative stress markers in the heart and liver of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) exposed to the formalin. Fish Physiology and Biochemistry, 42: 1819-1832 (IF2016 1,647; IF5 1,859; 20 pkt*, 20 pkt**) 1 opis indywidualnego wkładu habilitantki w powstanie każdej z wieloautorskich publikacji znajduje się w Załączniku 5 (Wykaz osiągnięć w pracy naukowo-badawczej); 2 oświadczenia wszystkich współautorów opisujące indywidualny wkład każdego z nich w powstanie poszczególnych prac wchodzących w skład osiągnięcia naukowego znajdują się w załączniku 8 (Oświadczenia współautorów); * Punktacja MNiSW dla poszczególnych publikacji podano zgodnie z rokiem opublikowania; ** Punktacja MNiSW dla poszczególnych publikacji podano zgodnie z wykazem z 2016 r. 3.1.1. Wprowadzenie i cel naukowy Organizmy żywe w swym środowisku życia podlegają wpływom różnorodnych czynników stresogennych, które w zależności od siły i czasu działania mogą modyfikować ich procesy fizjologiczne, a w skrajnych przypadkach zmniejszać szanse przeżycia. Z jednej strony są to czynniki naturalne, takie jak zbyt wysoka lub zbyt niska temperatura, dostępność pokarmu, interakcje z innymi organizmami, z drugiej zaś są to czynniki antropogeniczne (Hudson i in., 2016). Stresory działają bezpośrednio na poziomie komórki, chociaż przesunięte w czasie pośrednie skutki ich oddziaływań mogą się manifestować na wyższych poziomach organizacji biologicznej (Schmidt-Nielsen, 1997; Wilczek, 2008). W badaniach ekotoksykologicznych rozwijane są koncepcje, w których oceniając efekty działania różnorodnych składowych stresu środowiskowego, korzysta się z biomarkerów,

5 definiowanych jako molekularne, biochemiczne, histologiczne lub fizjologiczne parametry, które na poziomie poniżej organizmu zmieniają się proporcjonalnie do stopnia ekspozycji zwierząt na działanie czynników zanieczyszczających ich środowisko (Depledge i Fossi, 1994) bądź też rozumianych jako zmiana na poziomie molekularnym, która może służyć za wskaźnik stanu stresu spowodowanego przez dowolny czynnik środowiskowy (Laskowski i Migula, 2004; Forbes i in., 2006). Analiza tkanek lub płynów ustrojowych organizmów w celu stwierdzenia obecności obcych substancji chemicznych, ich metabolitów, zmienionych poziomów enzymów oraz innych substancji biochemicznych umożliwia ocenę zagrożenia związaną z obecnością czynników szkodliwych w środowisku. Analizowane substancje nazywa się markerami biologicznymi (Limón-Pacheco i Gonsebatt, 2009; Traczewska, 2011). Według Światowej Organizacji Zdrowia, biomarkerem jest każdy pomiar interakcji zachodzącej w systemach biologicznych z potencjalnymi zagrożeniami, mogącymi mieć charakter chemiczny, fizyczny lub biologiczny (Pagenkopf, 1983; Van Gastel i Van Brummelen, 1996; Garnaga, 2012). U ryb parametry fizjologiczne pozostają w prostej zależności od wielu czynników, oddziaływujących na ich organizm (Val i Kapoor, 2003). Reakcje organizmu ryb na niezadowalający stan środowiska, m.in. działanie substancji chemicznych czy metali ciężkich, jak również manipulacje w hodowli ryb, stanowi przede wszystkim rozwój odpowiedzi stresowej, a w efekcie zmiany w funkcjonowaniu narządów i tkanek (Stosik i Deptuła, 1998; Hook i in., 2014; Benedetti i in., 2015). Mierzona odpowiedź organizmu wywołana czynnikami stresotwórczymi może mieć charakter funkcjonalny na poziomie organizmu, biochemiczny na poziomie komórkowym lub molekularny na poziomie subkomórkowym (Sarkar i in., 2006). Postępujące skażenie środowiska, nowe technologie chowu oraz intensyfikacja produkcji przyczyniły się w znacznym stopniu do pojawienia się nowych jednostek chorobowych oraz szczególnie zjadliwych szczepów bakterii wywołujących duże straty w chowie i hodowli ryb (Noga, 1996; Grudniewska i in., 2006, 2008, 2010; Siwicki i in., 1998, 2005, 2006; Terech-Majewska i in., 2010). W tej sytuacji niezwykle ważna jest ochrona zdrowia stada tarłowego ukierunkowana na podnoszenie odporności ryb oraz wyhodowanie dobrej jakości materiału zarybieniowego. Stymulowanie odporności przeciwzakaźnej u ryb stanowi ważny element w profilaktyce i terapii chorób infekcyjnych ryb (Anderson, 1992; Raa, 1996; Siwicki i in., 1998). Ponadto stosowanie dezynfektantów, probiotyków oraz szczepionek jest znaczącym postępem w ochronie zdrowia ryb, a także w ochronie środowiska (Ellis, 1988; Anderson, 1992; Jørgensen i in., 1993; Håstein i in., 2005; Harikrishnan i in., 2011; Assefa i Abunna, 2018).

6 Pomimo znaczenia i sukcesu szczepień oraz stosowania dezynfektantów w akwakulturze, niewiele wiadomo na temat stresu oksydacyjnego podczas stosowania różnych metod stymulowania odporności przeciwzakaźnej u ryb. Odpowiedź stresowa organizmu przyczynia się do powstania zjawiska stresu oksydacyjnego, który określa się jako zaburzenie równowagi pro- i antyoksydacyjnej w kierunku reakcji utleniania białek, lipidów i materiału genetycznego komórek (Sies i Cadenas, 1985; Halliwell i Gutteridge, 2007). Do powstania zjawiska stresu oksydacyjnego przyczyniają się reaktywne formy tlenu (RFT) i azotu oraz wolne rodniki. Mianem wolnego rodnika określamy cząsteczki zdolne do niezależnej egzystencji i posiadające co najmniej jeden lub więcej niesparowanych elektronów. Stan taki jest niekorzystny metabolicznie ze względu na wysoką reaktywność, krótki czas życia wolnych rodników oraz niezwykłą łatwość wchodzenia w reakcje chemiczne ze składnikami komórek (Martins i in., 1991; Davies, 1995; Finkel i Holbrook, 2000; Young i Woodside, 2001; Fenech i Ferguson, 2001; Sohal i in., 2002). Aby w pełni poznać kondycję fizjologiczną ryb, wskazane jest użycie szerokiego spektrum parametrów, które pozwoliłyby ocenić procesy metaboliczne zachodzące w komórkach, a tym samym rozstrzygałyby o stopniu uciążliwości dla organizmu oddziałujących czynników stresogennych (Ercal i in., 2001; Livingstone, 2001; Valavanidis i in., 2006; Sarkar i in., 2006; Hook i in., 2014; Benedetti i in., 2015). Peroksydacja lipidów błon komórkowych indukowana przez wolne rodniki jest obecnie najlepiej przebadanym procesem (Shevchuk i in., 2002; Bartosz, 2003; Kulbacka i in., 2009). Powszechnie wiadomo, że wolnorodnikowy proces utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych i innych lipidów, w którym powstają nadtlenki tych związków zaburza funkcje komórek (Halliwell i in., 1992; Maxwell, 1995). Do bardzo toksycznych produktów peroksydacji lipidów należą aldehydy (dialdehyd malonowy, MDA), które blokują grupy SH białek, powodując inhibicję enzymów komórkowych oraz uszkodzenia DNA. W wyniku peroksydacji lipidów obserwuje się zmniejszenie płynności błon komórkowych oraz zwiększenie ich przepuszczalności dla wielu jonów i związków oraz uszkodzenie enzymów błonowych (Girotti, 1998; Halliwell, 2001; Yin i in., 2011; Aufschnaiter i in., 2017). Dialdehyd malonowy zmienia właściwości antygenowe białek, hamuje aktywność niektórych enzymów, replikację i transkrypcję DNA oraz powoduje pęknięcia DNA (Di Micco i in., 2006; Rodier i in., 2009; Rossiello i in., 2014). Obok lipidów bardzo podatne na działanie wolnych rodników są białka (Dean i in., 1997; Berlett i Stadtman, 1997). Reakcje RFT z białkami prowadzą do różnego rodzaju uszkodzeń, takich jak fragmentacja, modyfikacja reszt aminokwasowych czy agregacja. W wyniku tych procesów możliwa jest utrata biologicznej funkcji białka. Oznaczenie ilości grup

7 karbonylowych pozwala ocenić oksydacyjne uszkodzenia białek w organizmie (Stadtman, 2001, 2004; Dalle-Donne i in., 2003; Murray i in., 2008). Znacznikiem określającym poziom oksydacyjnych uszkodzeń białek jest stężenie białkowych grup karbonylkowych obecnych w pochodnych aminokwasów o charakterze aldehydów lub ketonów (Stadtman i Berlett, 1999; Levine i in., 2000). Powstają one na skutek utlenienia reszt aminokwasowych zawierających wolną grupę aminową, amidową lub hydroksylową reszt aminokwasów tryptofanu oraz proliny (Stadtman i Levine, 2000). Skutkiem tych zmian są zaburzenia w transporcie jonów oraz aktywności enzymatycznej (Duikan i in., 2000; Chevion i in., 2000; Balcerczyk i Bartosz, 2003; Ponczek i Wachowicz, 2005). Toksyczne produkty reakcji utleniania działają cytostatycznie na komórkę uszkadzając błony komórkowe oraz prowadząc do śmierci komórki na drodze apoptozy lub nekrozy (Rhee, 2006; Finkel, 2011; Mittler i in., 2011; Ray i in., 2012; Farmer i Mueller, 2013). Z innej strony, RFT są niezbędne w wielu fizjologicznie przebiegających procesach w organizmie i pełnią wiele korzystnych funkcji, m.in. są mediatorami i regulatorami metabolizmu, indukują apoptozę, stymulują transport glukozy do komórek, serotoniny do płytek krwi, wpływają na przekazywanie sygnałów do komórek i wewnątrz komórek, regulują ekspresję genów, aktywują białka kierujące podziałami komórkowymi oraz biorą udział w procesach obronnych organizmu (Apel i Hirt, 2004; Asada, 2006; Matyska-Piekarska i in., 2006; Pospíšil, 2009). Komórki organizmu dysponują naturalnymi systemami obronnymi przed nadmiarem i szkodliwym działaniem RFT. W skład bariery antyoksydacyjnej wchodzą enzymy, takie jak dysmutaza ponadtlenkowa (SOD, superoxide dismutase), katalaza (CAT), reduktaza glutationowa (GR), peroksydaza glutationowa (GPx) transferaza S-glutationowa, białka sekwestrujące metale, związki drobnocząsteczkowe (np. glutation, kwas moczowy, cysteina i inne) oraz witaminy C, E i A. Związki te umożliwiają usuwanie nadmiaru RFT z komórek (Halliwell i Gutteridge, 1990; Sundaresan i in., 1995; Choi i in., 2005; Connor i in., 2007; Schröder i in., 2007; Lee i in., 2009). Wyczerpanie przez organizm rezerw antyoksydacyjnych pod wpływem nadmiaru RFT prowadzi do uszkodzenia struktury białek, utleniania lipidów, uszkodzenia kwasów nukleinowych i depolimeryzacji kwasu hialuronowego. RFT inaktywują ponadto inhibitory proteinaz, co nasila ich działanie proteolityczne na tkanki (Ziemlański i Wartanowicz, 1999; Farmer i Mueller, 2013; Mittler i in., 2011; Ray i in., 2012). W świetle powyższej problematyki, celem moich badań była ocena kształtowania się reakcji prooksydacyjnych (markery peroksydacji lipidów i oksydacyjnej modyfikacji białek) i antyoksydacyjnych (aktywność enzymów obrony antyoksydacyjnej, całkowita zdolność

8 antyoksydacyjna), parametrów hematologicznych i wybranych wskaźników biochemicznych u osobników ryb łososiowatych w rzekach przybałtyckich (troć wędrowna), jak również w warunkach hodowli (pstrąg tęczowy, pstrąg potokowy, lipień) decydujących o kondycji fizjologicznej ryb oraz efektywności stosowania środków i zabiegów w profilaktyce chorób infekcyjnych, w tym: 1) zbadanie mechanizmów kształtowania się bilansu pro- i antyoksydacyjnego oraz zmian metabolicznych we krwi i wybranych tkankach (mięśniowej, skrzelowej, wątrobowej i sercowej) samic i samców troci wędrownej (Salmo trutta m. trutta L.) żyjących w strefie przybałtyckiej z klinicznymi objawami wrzodziejącej martwicy skóry w celu oceny kondycji fizjologicznej tego cennego gatunku ryb; 2) przeanalizowanie reakcji pro- i antyoksydacyjnych oraz wybranych wskaźników biochemicznych u młodocianych osobników ryb hodowlanych (pstrąg tęczowy, pstrąg potokowy) decydujących o efektywności stymulowania mechanizmów obronnych i pobudzania odpowiedzi immunologicznej przeciwko ściśle określonemu patogenowi (szczepienia przeciwko szczepom Aeromonas hydrophila, A. salmonicida i Yersinia ruckeri); 3) określenie kondycji zdrowotnej gatunków ryb hodowlanych (pstrąg tęczowy, pstrąg potokowy, lipień) w wyniku stosowania środków dezynfekujących w profilaktyce ogólnej (chloramina-t, formalina, dwutlenek chlorku, kwaśny środek dezynfekujący CIP ). Dla realizacji powyższych celów materiał do badań pobrano od osobników troci wędrownej (Salmo trutta m. trutta L.) zasiedlających rzekę Słupię (Pomorze Środkowe). Połowy ryb odbyły się w ścisłej współpracy z dyrekcją Parku Krajobrazowego Dolina Słupi oraz Zarządem Okręgu Polskiego Związku Wędkarskiego w Słupsku (ON.1., ON.2.). Pobór materiału do badań od młodocianych osobników ryb hodowlanych (pstrąg tęczowy Oncorhynchus mykiss, pstrąg potokowy Salmo trutta m. fario, lipień pospolity Thymallus thymallus) w ocenie stosowania środków dezynfekujących i immunostymulujących w profilaktyce ogólnej odbyły się przy ścisłej współpracy z Zakładem Hodowli Ryb Łososiowatych Instytutu Rybactwa Śródlądowego w Olsztynie, Wydziałem Nauk Weterynaryjnych Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie i Zakładem Chorób Ryb Państwowego Instytutu Weterynaryjnego w Puławach (ON.3., ON.4., ON.5.). 3.1.2. Najważniejsze wyniki badań Rzeki Pomorza Środkowego unikatowe miejsce, w którym ryby łososiowate odbywają swoje tarło (Bartel, 2000, 2001; Pelczarski, 2000; Radtke i in., 2007; Dębowski i in., 2008). W ostatnich latach zauważono, że w rzekach pomorskich wzrosła ilości cennych w

9 rybołówstwie gatunków ryb (troć wędrowna, pstrąg potokowy, lipień i in.) ze zmianami skórnymi o różnym natężeniu: owrzodzenia i ubytki skóry, przechodzące w guzowate obrzęki pokryte pleśnią (Pietrzak, 2009; Bartel i in., 2009). Z uwagi na niekorzystne zmiany stanu populacji ryb łososiowatych w Bałtyku i rzekach przybałtyckich polegające na występowaniu wrzodziejącej martwicy skóry (ulcerative dermal necrosis, UDN), mówi się o epidemiach zabijających te unikatowe gatunki. Dane literaturowe donoszą, że osłabiony organizm ryby ma słaby układ odpornościowy, zmniejsza się ilość śluzu, powiększa się ilość bakterii i ryba szybko zostaje zainfekowana grzybami i bakteriami, które w skrajnych przypadkach mogą pokrywać całą powierzchnię ciała (Khoo, 2000; Řehulka, 2002; Kozińska, 2001, 2007; Kozińska i Pękala, 2007, 2012; Harikrishnan i in., 2009). Czynnikami sprzyjającymi są także zanieczyszczenia wody, niska temperatura (poniżej 10 0 C) oraz osłabienie ryb w czasie wędrówek na tarło (Roberts, 1993; Kane i in., 2000; Khoo, 2000; Law, 2001; Bruno i in., 2007). W tej sytuacji niezwykle ważna jest ocena kondycji zdrowotnej ryb z ukierunkowaniem na podnoszenie ich odporności. Szczegółowa analiza stężenia markerów stresu oksydacyjnego w organizmie ryb z dorzecza rzek przybałtyckich, głównie Słupi i jej zlewni, pozwala na ocenę kondycji fizjologicznej i zdrowotnej ryb łososiowatych oraz przeanalizowanie stopnia zanieczyszczenia ich naturalnych środowisk tarłowych. Celem tego etapu badań było określenie zmian metabolicznych we krwi i wybranych tkankach (mięśniowej, skrzelowej, wątrobowej i sercowej) samic i samców troci wędrownej (Salmo trutta m. trutta L.) z klinicznymi objawami wrzodziejącej martwicy skóry. Ponadto, przeanalizowano różnorodne interakcji zachodzące pomiędzy wskaźnikami bilansu antyoksydacyjnego i markerami stresu oksydacyjnego z udziałem zależności korelacyjnych. Materiał do badań pobrano od osobników troci wędrownej (Salmo trutta m. trutta L.) zasiedlających rzekę Słupię (Pomorze Środkowe). Dokładny opis obiektów badań, jak również zakres i metodyka pomiarów oraz przebieg prac terenowych i laboratoryjnych przedstawione zostały w pracach ON.1. i ON.2. Ze zmienionych chorobowo obszarów ciała wyizolowano bakterie: Aeromonas hydrophila, Pseudomonas fluorescens, P. aeruginosa, P. oryzihabitans, Shewanella putrefaciens, Ochrobactrum anthropi, Chryseobacterium indologens. Stwierdzono obfity wzrost grzybów, drożdżaków z rodzaju Candida i jednokomórkowe Geotrichum. Wyizolowane bakterie i grzyby nie są typowo chorobotwórcze dla ryb. Większość zmian chorobowych to proces wtórny związany najprawdopodobniej ze szkodliwym oddziaływaniem czynników środowiskowych i zaburzeniami metabolizmu ryb w okresie około tarłowym. Najmniej ryb ze zmianami na

10 skórze obserwowano podczas badań terenowych w 2009 i 2010 roku. W roku 2011 i 2012 ryb chorych było znacznie więcej niż w latach poprzednich (Zał. 5., poz. 2.2.2.7., 2.2.4.49.). Wyniki badań histopatologicznych świadczą o zmianach patologicznych miąższu wątroby zainfekowanych osobników troci (wakuolizacja i utrata normalnej bazofilii cytozolu hepatocytów, odkładanie pigmentu w miąższu). Upośledzenie mikrokrążenia w wątrobie zainfekowanych samic troci przejawia się obrzękami i występowaniem dużej ilości erytrocytów w zatokach i przestrzeni międzykomórkowej (Zał. 5., poz. 2.1.14., 2.2.4.27., 2.3.196.). Przeprowadzone badania biochemiczne wykazały, że wrzodziejąca martwica skóry zwiększa podatność tkanek ryb na negatywny wpływ wolnych rodników zmieniając białkowo-lipidową kompozycję błon komórkowych. Zanotowano wzrost poziomu biomarkerów peroksydacji lipidów produktów reagujących z kwasem 2-tiobarbiturowym (TBARS) w tkance mięśniowej samców o 112% (p=0,000), a wartość tego parametru u samic zwiększyła się o 85% (p=0,000). W tkance sercowej samic zawartość TBARS wzrosła o 85% (p=0,000) i pozostała bez istotnych zmian w wątrobie (ON.1.). Zanotowano zwiększenie poziomu TBARS w homogenacie mlecza o 61% (p=0,000), a wartość tego parametru w ikrze samic wzrosła o 42% (p=0,025) (Zał. 5., poz. 2.2.2.7.). Największy odsetek wzrostu markerów peroksydacji lipidów zanotowano w tkance skrzelowej ryb z klinicznymi objawami wrzodziejącej martwicy skóry o 187,6% (p=0,000) u samców i o 247,7% (p=0,000) u samic (Zał. 5., poz. 2.2.1.4.). Podobne zmiany mogą negatywnie wpływać na funkcjonowanie tkanek i przeżywalność tego cennego gatunku ryb. Nie mniej ważnym markerem w ocenie zmian oksydacyjnych (w porównaniu ze stopniem intensyfikacji peroksydacji lipidów) jest poziom aldehydowych i ketonowych pochodnych oksydacyjnie zmodyfikowanych białek (OMB). Analiza statystyczna wyników badań wykazała wysoce istotne zmiany zawartości produktów OMB zarówno w grupie samców, jak i samic z klinicznymi objawami wrzodziejącej martwicy skóry. Zaobserwowano wzrost poziomu ketonowych pochodnych u samców w tkance mięśniowej o 62,7% (p=0.040), w wątrobie o 48% (p=0,000), w mleczu o 81,9% (p=0,000), jak i u samic w tkance sercowej o 49% (p=0,001), w ikrze o 172,5% (p=0,000) oraz aldehydowych pochodnych OMB u samców w tkance mięśniowej o 60,5% (p=0.005), w wątrobie o 55% (p=0,002), w tkance sercowej o 99,4% (p=0,040), w mleczu o 136,5% (p=0,000), a u samic w tkance mięśniowej o 126% (p=0.000), w wątrobie o 59% (p=0,000), w tkance sercowej o 65% (p=0,000), w ikrze o 137,3% (p=0,000). Można zatem wnioskować o zwiększonym

11 udziale aldehydowych i ketonowych pochodnych OMB w przebiegu wrzodziejącej martwicy skóry, zwłaszcza w grupie samic (Zał. 5., poz. 2.2.2.7., 2.2.4.27.). Nasze badania pokazują również, że negatywne skutki wrzodziejącej martwicy skóry dotyczą funkcjonowania bariery antyoksydacyjnej na poziomie podstawowych enzymów katalizujących reakcje eliminacji RFT. Mianowicie, u samców zanotowano obniżenie aktywności SOD w tkance sercowej o 49% (p=0,020), w skrzelach o 30,4% (p=0.000), w mleczu o 51,6% (p=0,001), katalazy w wątrobie o 43% (p=0,014), w skrzelach o 34% (p=0.000), w mleczu o 57,7% (p=0,000), reduktazy glutationowej w mleczu o 52,2% (p=0,001), a peroksydazy glutationowej w tkance mięśniowej o 53,5% (p=0,000) i w mleczu o 82,6% (p=0,000). Analogiczną tendencję zmian zaobserwowano u samic z wrzodziejącą martwicą skóry; istotna różnica aktywności SOD dotyczyła obniżenia wartości o 27,2% (p=0.000) w skrzelach, katalazy o 48,2% (p=0,000) w ikrze, o 25,9% (p=0.002) w skrzelach i 46,4% (p=0,007) w tkance mięśniowej, reduktazy glutationowej o 52,9% (p=0,000) w ikrze, o 48,2% (p=0,000) w wątrobie i o 36.4% (p=0.000) w skrzelach, peroksydazy glutationowej o 23,9% (p=0,018) w ikrze, o 61% (p=0,000) w wątrobie, o 58,5% (p=0,000) w tkance mięśniowej, o 55,7% (p=0.000) w skrzelach i o 41% (p=0,011) w tkance sercowej (ON.1., Zał. 5., poz. 2.2.1.4., 2.2.2.7., 2.2.4.27.). W naszych badaniach wrzodziejącą martwicą skóry w tkance mięśniowej, wątrobie i sercu samic powoduje obniżenie poziomu całkowitej zdolności antyoksydacyjnej w większym stopniu niż w grupie samców (ON.1.). Natomiast, mechanizmy utrzymywania równowagi pro- i antyoksydacyjnej w mleczu samców były obniżone o 39,3% (p=0,000) w porównaniu do grupy samic (Zał. 5., poz. 2.2.1.4.). Analiza korelacyjna potwierdziła zależności między obniżoną aktywnością enzymów antyoksydacyjnych i wysokim poziomem pochodnych aldehydowych i ketonowych oksydacyjnie zmodyfikowanych białek w tkankach ryb z klinicznymi objawami wrzodziejącej martwicy skóry. Erytrocyty są bardziej wrażliwe na uszkodzenia spowodowane RFT przez specyficzne mechanizmy antyoksydacyjne, tj. tworzenie się methemoglobiny, właściwości agregacyjne i zmienną strukturę błony komórkowej (Baskurt i Meiselman, 1999). Dlatego wysoka podatność erytrocytów na uszkodzenia spowodowane RFT i wynikające z tego zmiany hemoreologiczne mogą mieć istotne konsekwencje dla perfuzji tkanek i funkcjonowania układów w warunkach stresu oksydacyjnego (Baskurt i Meiselman, 1999; Walter i in., 2014). W związku z powyższym, erytrocyty mogą służyć jako adekwatny model w ocenie skutków wrzodziejącej martwicy skóry u ryb. Przeprowadzone badania wykazały zwiększony poziom markerów peroksydacji lipidów w erytrocytach samic z klinicznymi objawami wrzodziejącej

12 martwicy skóry (o 32,8%, p<0,05). Badania kwasowej odporności erytrocytów, ocenianej poprzez pomiar dynamiki rozpadu erytrocytów pod wpływem działania kwasu solnego wykazały, że odsetek hemolizy erytrocytów po pierwszej minucie od początku indukowanej hemolizy był wyższy o 39,9% (p<0,05) u samców i o 33,4% (p<0,05) u samic ryb z klinicznymi objawami wrzodziejącej martwicy skóry. Maksymalny procent hemolizy erytrocytów na minutę zaobserwowano po 3. i 2,5 minucie odpowiednio po dodaniu HCl do suspensji erytrocytów (18,23% dla samców i 25,45% dla samic z klinicznymi objawami wrzodziejącej martwicy skóry). Najwyższy procent hemolizy erytrocytów zanotowano w 3. minucie od początku hemolizy (86% dla samców i 89% dla samic) w porównaniu z grupą ryb bez klinicznych objawów (96% dla samców w 4. minucie i 94% dla samic w 5. minucie). Wyniki badań osmotycznej odporności erytrocytów na działanie roztworu z różnym stężeniem NaCl i mocznika wykazały, że hemoliza najszybciej zachodzi w erytrocytach ryb z klinicznymi objawami wrzodziejącej martwicy skóry. Osmotyczna odporność erytrocytów samic pozostawała na wyższym poziomie niż u samców. Stwierdzono, że odporność erytrocytów na działanie nadtlenku wodoru jest niższa u samców i samic z klinicznymi objawami wrzodziejącej martwicy skóry odpowiednio o 43% (p<0,05) i 31,8% (p<0,001) w porównaniu z grupą ryb zdrowych. Szczegółowy opis wyników badań przedstawiono w publikacji ON.2. Zarówno infekcje bakteryjne, jak i wirusowe występujące u ryb hodowlanych stanowią zagrożenie dla gatunków dziko żyjących (Siriyappagouder i in., 2014). Niebezpieczeństwo zakażenia występuje już na etapie podchowu w obiekcie produkującym materiał zarybieniowy oraz w rzece stanowiącej miejsce bytowania gatunków dziko żyjących i hodowlanych. W tej sytuacji bardzo ważna jest ochrona zdrowia i podnoszenie odporności ryb oraz wyhodowanie dobrej jakości materiału zarybieniowego (Peeler i Taylor, 2011; Romero i in., 2012). Stymulowanie nieswoistych mechanizmów obronnych oraz pobudzanie odpowiedzi immunologicznej przeciwko ściśle określonemu patogenowi, zanim dojdzie do naturalnego ich kontaktu, wydaje się najbardziej korzystną i nieszkodliwą dla organizmu i środowiska drogą zapobiegania chorobom infekcyjnym u ryb (Plant i Lapatra, 2011; Adams, 2016; Siwicki i Terech-Majewska, 2016; Assefa i Abunna, 2018). Pomimo znaczenia i sukcesu szczepień w akwakulturze i hodowli ryb, na razie niewiele wiadomo na temat zmian metabolicznych u ryb podczas wakcynacji. Za pomocą analizy zmian markerów stresu oksydacyjnego możemy dokonać oceny kondycji fizjologicznej ryb oraz w jasny sposób uzasadnić i ocenić czas oraz metodykę zabiegu immunizacji, a przede wszystkim ocenić

13 funkcjonalne zdolności organizmu ryb szczepionych przeciwko chorobom zakaźnym oraz dokonać oceny skuteczności działania szczepionek. W kolejnym etapie naszych badań określiliśmy wpływ szczepienia przeciwko szczepom Aeromonas spp. i Yersinia ruckeri na zmiany stężenia biomarkerów stresu oksydacyjnego i obrony antyoksydacyjnej w wybranych tkankach pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss) i pstrąga potokowego (Salmo trutta m. fario L.). Równolegle prowadzone badania wykazały, że pod koniec pierwszego tygodnia od czasu podania szczepionki przeciwko szczepom Aeromonas spp. w organizmach ryb pojawiły się pierwsze swoiste przeciwciała, których ilość rosła w następnych tygodniach po wakcynacji (Grudniewska i in., 2010). Wynik ten stworzył pierwsze podstawy do podjęcia odpowiednich badań nad opracowaniem nowych cechujących się dużą skutecznością szczepionek przeciwko najistotniejszym dla ekonomii chorobom bakteryjnym ryb łososiowatych, których wyleczenie jest bardzo trudne i kosztowne (Siwicki i in., 2004). Zaobserwowany statystyczny wzrost aktywności lizozymu oraz frakcji γ-globulin jest dowodem na to, że nowo opracowane szczepionki podawane drogą pokarmową indukują odporność nieswoistą (Grudniewska i in., 2010). Nasze badanie wykazało, że działanie szczepionki przeciwko szczepom Aeromonas spp. spowodowało różnokierunkowe zmiany w tkankach pstrąga tęczowego. Zaobserwowano zmniejszenie zawartości aldehydowych i ketonowych pochodnych OMB w skrzelach, tkance mózgowej i mięśniach ryb oraz obniżenie poziomu biomarkerów peroksydacji lipidów w tkance mózgowej. Jednak w wątrobie zanotowano zmiany przeciwne wzrost poziomu biomarkerów stresu oksydacyjnego (ON.3.). W naszym badaniu ustalono, że skrzela i wątroba ryb zaszczepionych przeciwko Aeromonas spp. wykazują wyższy poziom peroksydacji lipidów. Skóra, skrzela i jelita ryb to tkanki ściśle związane z układem odpornościowym (Kirron, 2012). Skrzela są wielofunkcyjnym narządem; przede wszystkim to narząd oddechowy ryb, który jest również zaangażowany w obronę immunologiczną poprzez tkanki limfoidalne związane z błoną śluzową obejmujące makrofagi, neutrofile, limfocyty i komórki tuczne / eozynofile (Pratap i Wendelaar Bonga, 1993; Reite i Evensen, 2006). Ponieważ skrzela są w ciągłym ścisłym kontakcie ze środowiskiem wodnym, więc wyższy poziom markerów peroksydacji lipidów w skrzelach immunizowanych ryb wynika z ich kontaktu z antygenami szczepionki immersyjnej. Skrzela ryb są szczególnie wrażliwe na jakość wody, stanowiąc pierwszą linię obrony przed środkami toksycznymi ze względu na ich anatomiczne położenie, bezpośredni kontakt z wodą i szybką absorpcję (Pereira i in., 2013). W naszym badaniu wyższy poziom TBARS w skrzelach

14 zaszczepionych ryb prawdopodobnie wynika z bliskiego kontaktu tkanki skrzelowej z antygenami szczepionki immersyjnej, aktywując obronę immunologiczną poprzez tkanki limfoidalne i komórki fagocytarne, tj. neutrofile, monocyty i makrofagi (Kirron, 2012). Zaktywowane przez antygeny komórki fagocytarne wytwarzają RFT wywołując wybuch tlenowy przez związaną z błoną komórkową NADPH-oksydazę, i odgrywają ważną rolę w obronie przed mikroorganizmami i różnymi związkami egzogennymi (Rossi, 1986; Pietarinen-Runtti i in., 2000). Produkcja RFT jest ważnym mechanizmem efektorowym pośredniczącym w wewnątrzkomórkowej eliminacji drobnoustrojów przez fagocyty. Z innej strony, niewłaściwa lub przedwczesna produkcja RFT może prowadzić do uszkodzenia komórek i tkanek (Steevels i in., 2013). Poziom TBARS oraz karbonylowych pochodnych oksydacyjnej modyfikacji białek był wyższy w wątrobie niż w innych tkankach. Znaczący wzrost poziomu biomarkerów stresu oksydacyjnego w wątrobie zaszczepionych ryb może wskazywać na wysoki poziom metabolizmu i podatność cząsteczek lipidów na działanie RFT wykazując stopień uszkodzeń oksydacyjnych w wątrobie w wyniku immunizacji ryb (Velisek i in., 2011). W naszych badaniach zaobserwowano znaczny wzrost aktywności SOD w mięśniach i w wątrobie immunizowanych pstrągów. Może to być reakcją adaptacyjną na immunizację, która neutralizuje nadprodukcję RFT i aktywację peroksydacji lipidów błon komórkowych (Cadenas i in., 1992). Aktywność katalazy była znacznie obniżona w mięśniach i skrzelach zaszczepionych pstrągów, co może być spowodowane nadmiernym wytwarzaniem rodników ponadtlenkowych, które mogą hamować aktywność katalazy (Kono i Fridovich, 1982). Aktywność enzymów glutationowych (GR i GPx) uległa znacznemu zmniejszeniu w mięśniach i skrzelach immunizowanych pstrągów, ale wzrosła w wątrobie. Upośledzenie syntezy enzymatycznych antyoksydantów u zaszczepionych ryb może być najważniejszym czynnikiem w zmniejszaniu poziomu całkowitej zdolności antyoksydacyjnej tkanek, która była znacznie obniżona w mięśniach, wątrobie, skrzelach i mózgu szczepionego pstrąga w porównaniu z grupą kontrolną (ON. 3.). Nasze wyniki sugerują, że zarówno obrona antyoksydacyjna, jak i endogenny glutation, odgrywają kluczową rolę w wewnątrzkomórkowej obronie antyoksydacyjnej u immunizowanych ryb. Jednocześnie, mechanizmy obrony antyoksydacyjnej były znacznie wyższe w wątrobie zaszczepionych ryb, prawdopodobnie ze względu na jej funkcjonalną i metaboliczną aktywność (Velisek i in., 2011). Szczegółowe wyniki omawianych badań przedstawiono w publikacji ON.3. Przeprowadzono również analizę możliwości adaptacyjnych i poziomu kondycji ryb poprzez zmiany markerów stresu oksydacyjnego wywołanego immunizacją w tkance

15 mięśniowej, skrzelach, wątrobie i sercu młodocianych osobników pstrąga tęczowego decydujących o efektywności stosowania immunizacji przeciwko Yersinia ruckeri. Badania biochemiczne wykazały, że opracowane nowe typy szczepionek dla ryb podawane drogą pokarmową zdolne są do aktywacji stresu oksydacyjnego w mięśniach, sercu i skrzelach ryb pod koniec pierwszego miesiąca od czasu podania szczepionki (Zał. 5., poz. 2.1.16., 2.2.1.18., 2.2.1.34., 2.2.1.38., 2.2.2.33., 2.2.4.35.). Nie zaobserwowano znaczącej różnicy w poziomie markerów stresu oksydacyjnego w drugim miesiącu po szczepieniu, a w tkance sercowej zanotowano nawet zmniejszenie stężenia markerów peroksydacji lipidów i aldehydowych pochodnych OMB (Zał. 5., poz. 2.2.1.43.). Korelacje między aktywnością katalazy a peroksydacją lipidów i całkowitą zdolnością antyoksydacyjną w tkance mięśniowej ryb potwierdzają kluczową rolę katalazy w obronie antyoksydacyjnej podczas immunizacji przeciwko Y. ruckeri (Zał. 5., poz. 2.1.16.). Statystycznie istotne zmniejszenie poziomu markerów peroksydacji lipidów w wątrobie między średnimi w grupach immunizowanych po upływie 1. i 2. miesiąca po szczepieniu, aldehydowych i ketonowych pochodnych OMB po upływie 2. miesiąca po immunizacji oraz wzrost całkowitej aktywności antyoksydacyjnej w wątrobie osobników grup kontrolnej i immunizowanej w 2. miesiącu po szczepieniu wskazuje na skuteczne adaptacyjne mechanizmy obrony antyoksydacyjnej organizmu ryb na działanie szczepionki przeciwko Y. ruckeri (Zał. 5., poz. 2.2.1.18., 2.2.1.34., 2.2.1.38., 2.2.1.43., 2.2.2.33., 2.2.4.35.). Korelacyjne zależności miedzy stężeniem markerów stresu oksydacyjnego oraz metabolitami w wątrobie pstrąga tęczowego immunizowanego szczepionką przeciwko Y. ruckeri w 1. i 2. miesiącu po szczepieniu potwierdzają ważną rolę enzymów przemian energetycznych w wątrobie pstrąga tęczowego w przebiegu stresu oksydacyjnego spowodowanego immunizacją przeciwko Y. ruckeri (Zał. 5., poz. 2.2.2.33.). Zanotowany przez nas znaczny spadek stężenia mleczanu i aktywności dehydrogenazy mleczanowej w tkance wątroby odzwierciedla dynamikę reakcji tlenowych i beztlenowych oraz wskazuje na wpływ aerobowych przemian glukozy w całkowitej podaży energetycznej (Zał. 5., poz. 2.2.2.33.). Ze względu na bardzo szybki rozwój w ostatnich latach kontrolowanej technologii chowu ryb, która wpływa na zmiany flory bakteryjnej środowiska wodnego oraz występowanie w nim wielu chorób wirusowych i bakteryjnych, zwiększyło się znaczne zainteresowanie profilaktyką w akwakulturze (Grudniewska i in., 2010; Phu i in., 2016). Istotnym elementem profilaktyki ogólnej jest dezynfekcja polegająca na przestrzeganiu zasad higieny przez stosowanie środków myjąco-dezynfekcyjnych oraz profilaktyczne kąpiele ikry, narybku lub starszych ryb. Zadaniem tych zabiegów jest zniszczenie drobnoustrojów

16 (saprofitów, patogenów, potencjalnych patogenów) przez działanie na struktury komórkowe lub funkcje metaboliczne mikroorganizmów (Dvorak, 2009; Taw, 2017; Assefa i Abunna, 2018). Można w ten sposób likwidować ogniska infekcji w środowisku zewnętrznym oraz chronić zakażony obiekt przed wystąpieniem choroby. Ze względu na ograniczenia środowiskowe i pozostałości w rybach, nie wszystkie środki dezynfekujące mimo wysokiej skuteczności nadają się w chwili obecnej do wykorzystania w rybactwie (Grudniewska i in., 2005; Terech-Majewska i in., 2010). Ma to istotne znaczenie, albowiem silnie toksycznych i szkodliwych dla środowiska naturalnego preparatów nie można wprowadzać do wody, a tym bardziej narażać ryb na ich toksyczne oddziaływanie, które może powodować m.in. występowanie stresu oksydacyjnego i zmiany patologiczne u ryb. Biorąc pod uwagę powyższe aspekty, głównym celem kolejnego etapu badań było przeanalizowanie zmian biochemicznych u młodocianych osobników ryb hodowlanych (pstrąg tęczowy, pstrąg potokowy, lipień) decydujących o efektywności stosowania środków dezynfekujących w profilaktyce ogólnej (chloramina T, formalina, dwutlenek chlorku, kwaśny środek dezynfekujący CIP ). Szczegółowy zakres prac, metodyka pomiarów, przebieg prac terenowych i laboratoryjnych oraz obliczenia przedstawione zostały w publikacjach ON.4., ON.5., Zał. 5., poz. 2.2.1.6., 2.2.1.10., 2.2.1.25., 2.2.1.35., 2.2.1.39., 2.2.1.40., 2.2.3.52., 2.2.3.59., 2.2.3.60., 2.2.3.69., 2.2.3.72., 2.2.4.45. W tkance mięśniowej i sercowej lipienia, kąpiele profilaktyczne z chloraminą-t (9 mg/l) znacząco zmniejszają peroksydację lipidów oraz stężenie aldehydowych i ketonowych pochodnych OMB (Zał. 5., poz. 2.2.1.35., 2.2.3.52., 2.2.3.59., 2.2.4.45.). Jednakże, obniżona peroksydacja lipidów powoduje zmniejszenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych i całkowitej zdolności antyoksydacyjnej (Zał. 5., poz. 2.2.1.35.). Zmniejszona aktywność aminotransferaz (ALT i AST) zapewnia metabolizm kwasu szczawiowo-octowego i pirogronianu, aby zabezpieczyć zapotrzebowanie energetyczne hamując glukoneogenezę z aminokwasów. Dezynfekcja z chloraminą-t również znacząco wpływa na metabolizm mleczanu i pirogronianu powodując obniżenie aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i mniejsze zapotrzebowanie energetyczne w okresie rekonwalescencji ryb po dezynfekcji. Co więcej, najwyższą aktywność LDH odnotowano w tkance mięśniowej i sercowej. Rzeczywiście, aktywność LDH w mięśniach ryb jest związana głównie z jej zaangażowaniem w beztlenową glikolizę (Somero i Childress, 1980). Proces ten jest głównym źródłem energii w tkance mięśniowej podczas aktywności fizycznej ryb (Churova i in., 2017). W naszych badaniach procedury dezynfekcyjne z chloraminą-t obniżają poziom mleczanu i aktywność LDH zwiększając wydajność energetyczną. Zmiany stężenia mleczanu sugerują o

17 zwiększeniu produkcji glukozy w wątrobie poprzez glikogenolizę i/lub glukoneogenezę (Zał. 5., poz. 2.2.1.25., 2.2.1.40.). Działanie chloraminy-t nie spowodowało istotnych zmian w poziomie TBARS w tkance mięśniowej, skrzelach, wątrobie i sercu pstrąga tęczowego obniżając poziom aldehydowych i ketonowych pochodnych OMB, co może świadczyć o bezpiecznym działaniu chloraminy-t w zaznaczonej dawce niepowodującej oksydacyjnych zmian w lipidach i białkach błon komórkowych tkanek (Zał. 5., poz.: 2.2.1.25., 2.3.76.). Odpowiedzi fizjologiczne pstrąga tęczowego po kąpielach profilaktycznych z dwutlenkiem chloru również wykazywały zależności tkankowe. Znaczące zmniejszenie poziomu aldehydowych i ketonowych pochodnych OMB w tkance wątroby i skrzelach pstrąga tęczowego po kąpielach z dwutlenkiem chloru wskazuje na skuteczne adaptacyjne mechanizmy obrony antyoksydacyjnej w wyniku działania tego środka dezynfekującego (Zał. 5., poz.: 2.3.132., 2.3.139., 2.3.182., 2.3.316.). Natomiast, w tkance sercowej zanotowano wzrost markerów stresu oksydacyjnego. Ważną rolę w aktywacji proteolitycznej degradacji zmodyfikowanych reszt aminokwasowych odgrywają enzymy związane z przemianami glutationu (GR i GPx). Szczegółowe wyniki badań przedstawiono w publikacji ON.4. Po kąpielach dezynfekujących z formaliną stwierdzono niższy poziom aldehydowych i ketonowych pochodnych OMB w skrzelach i wątrobie pstrąga tęczowego w porównaniu do grupy kontrolnej. Natomiast w tkance sercowej zanotowano odwrotne tendencje zmian zwiększenie stężenia markerów stresu oksydacyjnego (ON.4.). Wiadomo, że poziom oksydacyjnej modyfikacji białek nie zawsze jest związany z intensywnością peroksydacji lipidów i/lub oksydacyjnego uszkodzenia DNA, a może być determinowany aktywnością obrony antyoksydacyjnej i zmianą metabolizmu (Radak i in., 2003). Nasze wyniki podkreślają znaczący wpływ wywołanego formaliną stresu oksydacyjnego w tkance sercowej na biochemiczną aktywność ważnych enzymów, szczególnie na znacznie zwiększoną aktywność LDH i poziom mleczanu. Wysoka aktywność LDH w połączeniu z podwyższonym poziomem mleczanu sugeruje o zwiększonym potencjale glikogenowym w syntezie ATP w funkcjonowaniu tkanki sercowej. Podczas gdy aktywność LDH jako wskaźnika efektywności glikolizy nie wykazywała istotnych zmian w tkance wątroby pstrąga eksponowanego na działanie formaliny, spadek aktywności ALT i AST (kluczowe enzymy zaangażowane w katabolizm aminokwasów i dostarczanie substratów C3 dla glukoneogenezy) świadczy o zwiększeniu pojemności glukoneogenowej wątroby. Analiza korelacyjna wykazała zależności pomiędzy markerami peroksydacji lipidów, karbonylowymi pochodnymi oksydacyjnej modyfikacji białek oraz aktywnością ALT i AST. Uważa się, że aktywność aminotransferaz jest bardziej wiarygodną miarą pojemności glukoneogenowej tkanek u ryb (Mommsen i in., 1999;

18 Vijayan i in., 2003). Utrzymywanie poziomu glikogenu w wątrobie, choć na obniżonym poziomie, przez zmienioną zdolność wątroby do glukoneogenezy może być ważną strategią adaptacyjną podczas dezynfekcji z formaliną. Ponadto, znacznie obniżona aktywność aminotransferaz wątrobowych, bez żadnych związanych z tym zmian stężenia mleczanu i pirogronianu wspiera obniżony katabolizm aminokwasów. W związku z tym, zmniejszone zapotrzebowanie metaboliczne tkanek, m.in. do syntezy białek w wątrobie pstrąga po dezynfekcji z formaliną, może prowadzić do hamowania przebiegu stresu oksydacyjnego, w tym zmniejszenia oksydacyjnego uszkodzenia białek. Aminotransferazy wątrobowe są bardziej wrażliwe niż LDH na działanie formaliny (ON.5.). Ponieważ aminokwasy, szczególnie alanina, są preferowanymi substratami dla glukoneogenezy u ryb (Mommsen i in., 1999), niższa aktywność ALT świadczy o obniżonej zdolności wątroby do katabolizmu aminokwasów i glukoneogenezy. Ponieważ proces ten odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu hiperglikemii, zahamowanie glukoneogenezy i katabolizmu aminokwasów w wątrobie może być kluczowym czynnikiem zmniejszonej zawartości karbonylowych pochodnych w wątrobie po dezynfekcji roztworem formaliny. Zmniejszenie glukoneogenetycznych zdolności wątroby może również przyczyniać się do obniżenia poziomu glikogenu, zwłaszcza, że niezmieniona aktywność LDH w wątrobie przemawia przeciwko glikolizie w tkance wątrobowej. Poziom oksydacyjnie zmodyfikowanych białek, peroksydacja lipidów, aktywność LDH i stężenie mleczanu mogą występować jako ważne biomarkery w ocenie działania formaliny jako środka dezynfekującego w tkance sercowej pstrąga tęczowego. Szczegółowe wyniki badań przedstawiono w publikacji ON.5. Dezynfekcyjne preparaty produkowane na bazie kwasu nadoctowego i nadtlenku wodoru (nazwy producentów: Dezynfektant CIP, Oxim, Steridial ), czyli tzw. kwaśne preparaty, mają szerokie spektrum działania obejmujące bakterie, grzyby i wirusy. Są skuteczne w działaniu na niektóre wirusy i bakterie patogenne dla ryb łososiowatych (Grudniewska i Dobosz, 2007; Grudniewska i in., 2007, 2008). Mają mniejszą wrażliwość na zanieczyszczenia organiczne niż związki chlorowe, nie powodują powstawania oporności komórkowej. Są w pełni ekologiczne, ponieważ po kilku godzinach od ich użycia ulegają samorozkładowi nie pozostawiając substancji szkodliwych. Są bezpieczne dla zdrowia ludzi i zwierząt, jeśli przestrzega się zasad właściwego ich użytkowania. Można je stosować w wylęgarni do dezynfekcji urządzeń i sprzętu rybackiego. W badaniach własnych oceniających wpływ działania preparatu Dezynfektant CIP nie zaobserwowano znaczących zmian w biomarkerach stresu oksydacyjnego i całkowitej zdolności antyoksydacyjnej u pstrąga

19 tęczowego. Zmniejszona aktywność SOD i CAT w tkance sercowej oraz zwiększona aktywność GPx zarówno w tkankach wątroby, jak i serca wskazują na ważną rolę potencjału antyoksydacyjnego związanego z metabolizmem glutationu jako odpowiedź na działanie dezynfekujące preparatu Dezynfektant CIP. Zaobserwowano zmniejszenie aktywności SOD i katalazy w tkance sercowej, prawdopodobnie ze względu na zwiększone wytwarzanie RFT. Wyniki naszych badań wykazują, że preparat Dezynfektant CIP indukuje wzrost aktywności GPx w tkankach, co może łagodzić stres oksydacyjny (Zał. 5., poz.: 2.2.1.10.). Potwierdzeniem tego są tendencje zmniejszenia poziomu pochodnych karbonylowych jako biomarkerów oksydacyjnego uszkodzenia białek w tkance mięśniowej i skrzelach, wątrobie i sercu pstrąga tęczowego po kąpielach dezynfekcyjnych z preparatem Dezynfektant CIP (ON.4., Zał. 5., poz.: 2.2.1.10., 2.2.3.69.). Aktywności ALT i AST w tkance mięśniowej były znacząco niższe po ekspozycji ryb ze środkiem dezynfekującym "CIP" niż u ryb w grupie kontrolnej. Obniżony poziom mleczanu ze zmniejszoną aktywnością LDH potwierdza tezę o zahamowaniu metabolizmu glikolitycznego w tkance mięśniowej ryb (Zał. 5., poz.: 2.2.3.72.). 3.1.3. Podsumowanie i wnioski U osobników troci wędrownej z wrzodziejącą martwicą skóry zachodzą znaczące interakcje pomiędzy najważniejszymi wskaźnikami systemu obrony antyoksydacyjnej, które odzwierciedlają stopień uszkodzenia wszystkich poziomów funkcjonowania tkanek i narządów. Mianowicie, wysoki poziom markerów stresu oksydacyjnego (oceniany przez oksydacyjną modyfikacje białek i poziom peroksydacji lipidów) przy obniżeniu aktywności enzymów obrony antyoksydacyjnej w następstwie może powodować obniżenie przeżycia ryb w niekorzystnych warunkach wzmożonej antropopresji oraz fizjologiczne, biochemiczne i behawioralne zaburzenia u ryb. W naszych badaniach negatywne skutki wrzodziejącej martwicy skóry w tkance mięśniowej, wątrobie i sercu samic powodowały obniżenie poziomu całkowitej zdolności antyoksydacyjnej w większym stopniu niż w grupie samców. Analiza korelacyjna potwierdza zależności między obniżoną aktywnością enzymów antyoksydacyjnych i wysokim poziomem pochodnych aldehydowych i ketonowych oksydacyjnie zmodyfikowanych białek w tkankach ryb z klinicznymi objawami wrzodziejącej martwicy skóry. Wyniki badań odporności erytrocytów (kwasowej, osmotycznej, peroksydacyjnej) ryb z klinicznymi objawami wrzodziejącej martwicy skóry potwierdzają możliwość i celowość wykorzystania tych metod w ocenie przebiegu procesu patologicznego u ryb. Przeprowadzone badania wykazały, że hemoliza najszybszej zachodzi w erytrocytach

20 ryb z klinicznymi objawami wrzodziejącej martwicy skóry. Osmotyczna odporność erytrocytów samic pozostawała na wyższym poziomie niż u samców. Stwierdzono, że odporność erytrocytów na działanie nadtlenku wodoru jest niższa u samców i samic z wrzodziejącą martwicą skóry w porównaniu z grupą ryb bez klinicznych objawów tej patologii. Analiza zmian biochemicznych w odpowiedzi na stres spowodowany wrzodziejącą martwicą skóry u osobników troci wędrownej pozostaje bardzo istotnym motywem dalszych poszukiwań możliwości adaptacyjnych organizmów wodnych. Uzyskane wyniki badań biochemicznych jednoznacznie wykazały, że zastosowanie szczepionki przeciwko szczepom Aeromonas spp. w immersji spowodowało statystycznie istotne zmiany w poziomie biomarkerów stresu oksydacyjnego, i odpowiedzi te wykazywały wyraźne różnice narządowe związane z metabolizmem tkankowym u tarlaków. Szczepione tarlaki pstrąga tęczowego wykazywały zmiany w obronie antyoksydacyjnej z wyższym nasileniem stresu oksydacyjnego w wątrobie w porównaniu z innymi tkankami. Immunizacja ryb indukowała peroksydację lipidów w skrzelach i tkance wątroby, natomiast tkanka mózgowa była w stanie przywrócić równowagę pro- i antyoksydacyjną po stosowanym szczepieniu. Zaobserwowano zmniejszenie zawartości aldehydowych i ketonowych pochodnych oksydacyjnie zmodyfikowanych białek w skrzelach, tkance mózgowej i mięśniach ryb. Ocena kondycji zdrowotnej gatunków ryb hodowlanych w wyniku działania środków dezynfekujących wykazała tkankowe różnice w stężeniu markerów stresu oksydacyjnego. W tkance mięśniowej i sercowej lipienia, kąpiele profilaktyczne z chloraminą- T znacząco zmniejszają peroksydację lipidów i stężenie aldehydowych i ketonowych pochodnych oksydacyjnie zmodyfikowanych białek. Jednakże, obniżona peroksydacja lipidów powoduje zmniejszenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych i całkowitej zdolności antyoksydacyjnej. Działanie chloraminy-t nie spowodowało istotnych zmian w poziomie TBARS w tkance mięśniowej, skrzelach, wątrobie i sercu pstrąga tęczowego obniżając poziom aldehydowych i ketonowych pochodnych OMB, co może świadczyć o bezpiecznym działaniu chloraminy-t w zaznaczonej dawce niepowodującej oksydacyjnych zmian w lipidach i białkach błon komórkowych tkanek ryb. Przeprowadzone badania wykazały, że funkcjonowanie serca jest szczególnie wrażliwe na dezynfekujące działanie formaliny w dawce 200 ml na m 3 u pstrąga tęczowego. Dezynfekcja indukuje stres oksydacyjny w tkance sercowej. Sposób działania formaliny może obejmować bezpośredni wpływ na aktywność enzymów lub pośredni wpływ na zapotrzebowanie energetyczne tkanek ryb. Pośredni wpływ formaliny na funkcje

21 metaboliczne potwierdzony jest znacznym podwyższeniem poziomu TBARS i zawartością związków karbonylowych oksydacyjnie zmodyfikowanych białek, dodatniej korelacji pomiędzy aldehydowymi i ketonowymi pochodnymi oraz aktywnością aminotransferaz, co sugeruje większe uszkodzenie tkanki sercowej w odpowiedzi na stres oksydacyjny wywołany formaliną. Tkanka wątrobowa wykazała większą plastyczność metaboliczną, objawiającą się obniżonym poziomem biomarkerów stresu oksydacyjnego i aktywnością aminotransferaz. Znaczące zmniejszenie poziomu aldehydowych i ketonowych pochodnych oksydacyjnie zmodyfikowanych białek w tkance wątroby i skrzelach pstrąga tęczowego po kąpielach z dwutlenkiem chloru wskazuje na skuteczne adaptacyjne mechanizmy obrony antyoksydacyjnej w wyniku działania tego środka dezynfekującego. Natomiast, w tkance sercowej zanotowano wzrost poziomu markerów stresu oksydacyjnego. Ważną rolę w aktywacji proteolitycznej degradacji zmodyfikowanych reszt aminokwasowych odgrywają enzymy związane z przemianami glutationowymi. W naszych badaniach oceniających skuteczność działania preparatu Dezynfektant CIP nie zaobserwowano znaczących zmian w biomarkerach stresu oksydacyjnego i całkowitej zdolności antyoksydacyjnej u pstrąga tęczowego. Generowanie RFT w procesie utleniania kwasu nadoctowego i nadtlenku wodoru (środek Dezynfektant CIP ) może być częściowo inaktywowane przez układ antyoksydacyjny w tkankach pstrąga tęczowego. Jak wykazały przeprowadzone badania, środek Dezynfektant CIP w końcowym stężeniu 16 ml na m 3 może być używany jako bezpieczny środek dezynfekujący w akwakulturze pstrąga tęczowego. Przedstawione wyniki badań stanowią uzupełnienie istniejącego stanu wiedzy na temat odpowiedzi organizmu ryb na stres oksydacyjny wywołany czynnikami środowiskowymi i antropogenicznymi (hodowla). Wnoszą istotny wkład w zrozumienie procesów fizjologicznych i przemian biochemicznych niezbędnych w ocenie kondycji zdrowotnej ryb. Podkreślają bardzo ważną rolę markerów stresu oksydacyjnego, obrony antyoksydacyjnej i przemian biochemicznych w monitorowaniu kondycji, stanu fizjologicznego i zdrowotnego narybku cennych gatunków ryb w warunkach naturalnych i hodowlanych. Wyniki badań mogą być przydatne zwłaszcza dla konstruowania zasad gospodarki rybackiej. Prezentowane wyniki mogą być ważnym źródłem informacji dla opracowania: 1) oceny stanu fizjologicznego i zdrowotnego populacji troci wędrownej w rzece Słupi i innych gatunków ryb łososiowatych dotkniętych wrzodziejącą martwicą skóry; 2) oceny kondycji populacji troci wędrownej, mającej olbrzymie znaczenie dla wędkarzy i rozwijającej się turystyki wędkarskiej

22 w regionie (troć wędrowna bowiem znacząco wzbogaca różnorodność biologiczną naszych rzek i jest najpowszechniej występującym gatunkiem ryb łososiowatych w dorzeczu Słupi); 3) szerszego poznania etiologii, czynników sprzyjających i zmian patologicznych wrzodziejącej martwicy skóry, co umożliwi dokładniejszą diagnozę tego schorzenia oraz poznania i określenia źródeł antropogenicznego zanieczyszczenia wód Słupi, których skład jakościowy i ilościowy ma istotny wpływ na przeżywalność populacji troci wędrownej i innych gatunków ryb łososiowatych; 4) działań ochronnych skutkujących dalszym zwiększeniem ilości osobników ryb łososiowatych oraz kondycji materiału zarybieniowego oraz pomogą w odzwierciedleniu kształtowania możliwości adaptacyjnych u ryb; 5) monitorowania kondycji, stanu fizjologicznego i zdrowotnego narybku cennych gatunków ryb hodowlanych w wyniku działania środków myjąco-dezynfekujących i stosowania immunoprofilaktyki u gatunków hodowlanych. Przemawia za tym również ważny udział terenów pomorskich w hodowli przede wszystkim pstrąga tęczowego, dla którego tereny te, ze względu na dogodne warunki klimatyczne, są ukierunkowane. Dzięki temu realne jest określenie wpływu działalności antropogenicznej (hodowla) na kształtowanie się wrażliwości gatunków hodowlanych na warunki środowiskowe w hodowli. Pozwoli to na dostarczenie cennych wskazówek dla hodowców dotyczących skuteczności stosowanych zabiegów. 3.2. Omówienie pozostałych form aktywności naukowo-badawczej W roku 2001 ukończyłam studia magisterskie na kierunku Biologia na Wydziale Biologii Lwowskiego Uniwersytetu Narodowego imienia Iwana Franki. Wykonałam pracę magisterską z zakresu wpływu markerów peroksydacji lipidów na systemy transportu wapnia w komórkach wydzielniczych gruczołu ślinowego. Po ukończeniu studiów rozpoczęłam dzienne studia doktoranckie na Wydziale Biologii Lwowskiego Uniwersytetu Narodowego imienia Iwana Franki. Rozprawę doktorską Wpływ modulatorów ATP-czułych kanałów potasowych na procesy energetyczne w wątrobie i sercu szczurów z różną wytrzymałością na niedotlenienie obroniłam na Wydziale Biologii Kijowskiego Uniwersytetu Narodowego imienia Tarasa Szewczenki w 2005 roku, uzyskując stopień doktora nauk biologicznych w dyscyplinie biologia o specjalności fizjologia człowieka i zwierząt. Od października 2004 roku kontynuowałam pracę naukową i dydaktyczną na Wydziale Lekarskim Lwowskiego Narodowego Uniwersytetu Medycznego im. Daniela Halickiego. Od listopada 2009 roku rozpoczęłam pracę naukową na Wydziale Matematyczno-Przyrodniczym Akademii Pomorskiej w Słupsku.

23 Przez lata nauki i pracy w tych jednostkach zajmowałam się różnorodną tematyką badawczą. Od początku mojej pracy naukowej prowadzone przeze mnie badania koncentrują się na różnych aspektach farmakologicznej korekcji metabolizmu energetycznego z udziałem aktywatorów KATP kanałów, prekursora syntezy tlenku azotu NO L-argininy i metody treningu przerywanej hipoksji. Jeszcze jako studentka, brałam udział w badaniach nad rolą indywidualnej wytrzymałości w kształtowaniu odpowiedzi organizmu na negatywne skutki stresu oksydacyjnego w ramach projektów Calcium homeostasis and energetic metabolism of secretory cells from digestive glands and their changes under extreme factors influence (N0100U0011452, 2000-2002) i Mechanisms of Ca 2+ - and NO-dependent regulation of secretory cells functioning (N0103U001872, 2003-2005). Stąd też w mojej aktywności naukowo-badawczej wyróżnić można kierunki badań bezpośrednio związane z głównym nurtem moich zainteresowań jak i te, których realizacja umożliwiła mi zdobycie doświadczenia w posługiwaniu się nowymi technikami i metodami badawczymi. Podsumowałem je poniżej w dziewięciu tematach. 3.2.1. NO-zależne mechanizmy korekcji i modulatory ATP-czułych kanałów potasowych w prewencji uszkodzeń stresowych w sercu i wątrobie zwierząt z różną wytrzymałością na niedotlenienie Odkrycie, że L-arginina jest substratem w syntezie tlenku azotu (NO) spowodowało, że zaczęto wykorzystywać ją w terapii chorób charakteryzujących się niedoborami NO w celu zwiększania jego syntezy. Bardzo dobre wyniki uzyskiwano, stosując L-argininę w leczeniu nadciśnienia tętniczego, chorobie niedokrwiennej i niewydolności krążenia, a także miażdżycy, cukrzycy, jaskrze, udarach mózgowych i zakrzepach naczyniowych, niewydolności nerek, zaburzeniach czynności wątroby związanych z nieprawidłowym przebiegiem cyklu mocznikowego i zatruciach amoniakiem (Wu i in., 1998, 2000; Ignarro i in., 1999; Morris, 1999; Blantz i in., 2000; Flynn i in., 2002; Ścibior i Czeczot, 2004; Gornik i Creager, 2004). Dobre wyniki uzyskano, stosując L-argininę w leczeniu wspomagającym miażdżycę tętnic (Tousoulis i in., 2002; Kostka-Trąbka, 2002) i jako lek ochraniający wątrobę i wspomagający jej funkcje przez stymulację procesu detoksykacji amoniaku (Wu i Meiniger, 2000; Wu i in., 2000). Z roku na rok rozszerzają się możliwości klinicznego zastosowania L-argininy w leczeniu różnych schorzeń. Wyniki wielu badań klinicznych wskazują, że L-arginina może być stosowana zarówno w terapii, jak i profilaktyce wielu patologii. Stosowanie nawet w dużych dawkach nie wykazuje działań niepożądanych. Z tego też powodu, celem zaplanowanych i realizowanych przeze mnie w latach 2000-2011 badań była ocena wpływu aminokwasu L- argininy jako prekursora syntezy tlenku azotu oraz inhibitora NO-syntazy N ω -nitro-l-

24 argininy (L-NNA) na przebieg procesów oddychania mitochondrialnego, stężenia markerów stresu oksydacyjnego i obrony antyoksydacyjnej w wybranych tkankach szczurów z różną wytrzymałością na niedotlenienie w modelach ostrego stresu, adrenalinowego i kobaltindukowanego uszkodzenia mięśnia sercowego oraz przewlekłego zatrucia ołowiem i kadmem. Wyniki naszych badań wykazują, że zwierzęta z wysoką i niską odpornością na niedotlenienie różnią się dominacją NAD- i FAD-zależnych szlaków metabolicznych, aktywnością enzymów antyoksydacyjnych i poziomem markerów stresu oksydacyjnego. Fizjologiczna aktywność enzymów antyoksydacyjnych i produkcja RFT jest wyższa u osobników z niską wytrzymałością. Podanie L-argininy zwiększało wytrzymałość na fizyczne obciążenie u szczurów z niską reaktywnością fizjologiczną do poziomu zwierząt z wysoką wytrzymałością w grupie kontrolnej. Wpływ L-argininy na mitochondrialne funkcje oddechowe przy obniżonym poziomie peroksydacji lipidów był bardziej znaczący u szczurów z początkowo niską reaktywnością fizjologiczną, natomiast, podanie L-NNA przed fizycznym obciążaniem zwiększyło zużycie mitochondrialnego tlenu i wydajność fosforylacji oksydacyjnej w utlenianiu α-ketoglutaranianu u szczurów z wysoką wytrzymałością na niedotlenienie. Nasze badania potwierdzają różne sposoby NO-zależnej regulacji oddychania mitochondrialnego i zależą od początkowej wytrzymałości fizjologicznej zwierząt. L-arginina może być efektywnie stosowana podczas fizycznego obciążenia u zwierząt z niską wytrzymałością na niedotlenienie, natomiast L-NNA powoduje, że komórki i tkanki są odporne na stres oksydacyjny u zwierząt o wysokiej początkowej reaktywności fizjologicznej (zwierzęta z wysoką wytrzymałością na niedotlenienie) (Zał. 5., poz.: 2.1.5.). Poziom stresu oksydacyjnego indukowanego w różnych modelach (adrenalinowego i kobalt-indukowanego uszkodzenia mięśnia sercowego, przewlekłego zatrucia ołowiem i kadmem) był wyższy dla osobników z niską wytrzymałością na niedotlenienie. L-arginina wywołuje efekt ochronny zachowując homeostazę antyoksydacyjną, szczególnie u zwierząt z niską wytrzymałością na niedotlenienie w warunkach zatrucia ołowiem (Zał. 5., poz.: 2.1.3., 2.1.8., 2.1.9., 2.2.4.1., 2.2.4.26., 2.3.4., 2.3.5., 2.3.38., 2.3.95.). Efektem zwiększenia działania biologicznie czynnego NO jest ograniczenie wytwarzania RFT, dlatego celowe wydaje się stosowanie L-argininy jako substratu dla syntazy tlenku azotu (NOS) u zwierząt z niską wytrzymałością w przypadku dystrofii mięśnia sercowego indukowanej chlorkiem kobaltu (Zał. 5., poz.: 2.2.3.87., 2.3.3., 2.3.6., 2.3.9., 2.3.14., 2.3.18., 2.3.23., 2.3.27., 2.3.42., 2.3.66., 2.3.96., 2.3.243.). Natomiast L-NNA wywołuje obniżenie poziomu markerów stresu oksydacyjnego i zwiększa aktywność enzymów antyoksydacyjnych u zwierząt z wysoką wytrzymałością na

25 niedotlenienie. Występowanie wyraźnych różnic w funkcjonowaniu systemu tlenku azotu w mechanizmach metabolizmu energetycznego i obrony antyoksydacyjnej wykazuje znaczną role indywidualnej wytrzymałości w kształtowaniu odpowiedzi organizmu na negatywne skutki stresu oksydacyjnego. Stwierdzamy, że indywidualne cechy funkcjonowania organizmu muszą być wliczane i uwzględniane w farmakologicznych metodach korekcji stanów patologicznych. NO reguluje aktywność KATP kanałów, które kontrolują różne funkcje fizjologiczne, w tym związaną z NO ochronę przed apoptozą, rozszerzeniem naczyń i modulacją wydzielania przekaźników (Kawano i in., 2009). Zaburzenia funkcji KATP kanałów leżą u podstaw patogenezy i patomechanizmu wielu chorób, w tym nadciśnienia, miażdżycy, cukrzycy, szoku itd. (Kitazono i in., 1993, 1995; Landry i Oliver, 2001; Miura i Miki, 2003; Pollesello i Mebazaa, 2004; Bisseling i in., 2005; Jackson, 2005, 2006; Baranowska i in., 2007; Olson i Terzic, 2010). Stosunkowo niedawno stwierdzono obecność tych kanałów w różnych typach komórek (Randall, 1995; Dumas i in., 1999; Rubaiy, 2016). Biorąc pod uwagę NO-zależne mechanizmy aktywacji KATP kanałów, przypuściliśmy, że modulacja ich aktywności za pomocą aktywatorów i inhibitorów może odgrywać istotną rolę w indukowaniu procesów zmniejszających uszkodzenie komórek w patofizjologicznych zmianach serca i wątroby. Głównym celem zaplanowanych i realizowanych przeze mnie badań w latach 2001-2011 była ocena procesów oddychania mitochondrialnego, stężenia markerów stresu oksydacyjnego, obrony antyoksydacyjnej w wybranych tkankach szczurów Wistar z różną wytrzymałością na niedotlenienie i świnek morskich w modelach ostrego stresu, adrenalinowego i kobaltindukowanego uszkodzenia mięśnia sercowego. W naszych badaniach oceniliśmy w jakim stopniu modulatory KATP kanałów zapobiegają uszkodzeniom stresowym w tkance serca i wątroby zwierząt. Wykorzystując aprobowane w badaniach innych autorów modele stresu oksydacyjnego indukowanego dużymi dawkami katecholamin i metali ciężkich na zwierzętach z różną wytrzymałością na niedotlenienie, oceniliśmy procesy powstawania lub progresji uszkodzenia mięśnia sercowego w różnych warunkach zbliżonych do patologicznych. Stąd model adrenalinowego i kobalt-indukowanego stresu oksydacyjnego stanowi bardzo cenne podejście w badaniach nad mechanizmami stresu oksydacyjnego, a stosowanie modulatorów KATP kanałów i L-argininy występuje jako źródło testowania nowych efektywnych metod terapii w zaburzeniach sercowo-naczyniowych, głównie ze względu na brak takich badań na zwierzętach z różną wytrzymałością na niedotlenienie. Negatywne skutki stresu oksydacyjnego w większym stopniu dotyczą obniżenia efektywności funkcjonowania obrony

26 antyoksydacyjnej u zwierząt z niską wytrzymałością, i ulegają efektywnej korekcji farmakologicznej z wykorzystaniem aktywatorów KATP kanałów i L-argininy. W naszych badaniach stwierdzono, że farmakologiczna korekcja z udziałem aktywatorów KATP kanałów pinacidylu i diazoksydu wykazała efektywne ograniczenie stresu oksydacyjnego, aktywację enzymów obrony antyoksydacyjnej oraz miała korzystny wpływ na procesy oddychania i fosforylacji oksydacyjnej w mitochondriach serca i wątroby. Wyniki naszych badań pozwoliły wysunąć wniosek o efektywnym działaniu aktywatorów KATP i L-argininy w patofizjologicznych zmianach serca i wątroby, m.in. u zwierząt z niską wytrzymałością. Przeprowadzone badania wykazały, że kluczową rolę w cytoprotekcji odgrywa wzrost aktywności mitochondrialnych KATP kanałów (Zał. 5., poz.: 2.1.1., 2.1.2., 2.1.4., 2.1.17., 2.2.3.1., 2.2.3.8., 2.2.4.41. 2.2.4.43., 2.2.4.52., 2.3.1., 2.3.2., 2.3.28., 2.3.83.). 3.2.2. Metoda treningu przerywanej hipoksji (IHT) i modulatory KATP kanałów w adaptacji zwierząt do stresu oksydacyjnego W ramach naszej współpracy naukowej z Wydziałem Badań Stanów Niedotlenienia (Department of Hypoxical States Studying) Instytutu Fizjologii imienia Aleksandra Bohomolca Państwowej Akademii Nauk Ukrainy (Kijów, Ukraina) kontynuowaliśmy badania dotyczące metod zwiększenia adaptacyjnych możliwości organizmu za pomocą treningu w warunkach niedotlenienia i treningu przerywanej hipoksji (IHT). Teoretycznym podłożem tej metody jest fakt, że stres wywołany działaniem hipoksji połączony ze stresem treningowym, może przyczynić się do wywołania większych zmian adaptacyjnych w organizmie, w porównaniu z efektami treningu realizowanego w warunkach normoksji (Xi i Serebrovskaya, 2009, 2012; Navarrete-Opazo i Mitchell, 2014; Dale i in., 2014; Mateika i in., 2015; Serebrovskaya i Xi, 2015). Charakteryzując rolę metody treningu przerywanej hipoksji podczas symulowanej szkieletowej nieważkości (Skeletal unloading; Wronski i Morey-Holton, 1987), wykazaliśmy protekcyjną rolę metody IHT w zaburzeniach oddychania mitochondrialnego i efektywności syntezy ATP związanego z nieważkością (Zał. 5., poz.: 2.1.11.). Model nieważkości powodował spadek oddychania mitochondrialnego i fosforylacji ATP podczas utleniania NADH-zależnych substratów (α-ketoglutaranian). Zmiany te zostały całkowicie zniesione za pomocą aktywacji szlaku transaminacji glutaminianu i pirogronianu u szczurów po treningu IHT. Nieenzymatyczna dekarboksylacja α-ketoglutaranu i transaminowanie przełączają cykl Krebsa na utlenianie bursztynianu, omijając zależne od NADH utlenianie substratów, a tym samym wspomagając oddychanie mitochondrialne w warunkach stresowych. Transaminacja

27 dostarcza α-ketoglutaranian i zmniejsza wrażliwość NADH-zależnego utleniania na działanie RFT. Szlak transaminacji substratów może działać w warunkach stresu oksydacyjnego i jest wyjątkowo odporny na utleniacze (Fedotcheva i in., 2006). Metoda IHT poprzez uwalnianie tlenku azotu może modulować aktywność mitochondrialnego łańcucha oddechowego poprzez aktywację transportu elektronów przez I kompleks mitochondrialny zwiększając efektywność fosforylacji oksydacyjnej w mitochondriach mięśni szkieletowych i wątroby (Zał. 5., poz. 2.2.3.2., 2.3.248.). Nasze badania dowodzą poprawę funkcjonowania oddychania mitochondrialnego i wydolności tlenowej oraz możliwości wysiłkowych na skutek mięśniowej i systemowej adaptacji do stanu hipoksji. Komórki hartowane niedokrwieniem mają wyższe stężenie ATP niż te niehartowane. Hartowanie można również osiągnąć stosując aktywatory KATP kanałów, a substancje blokujące te kanały znoszą ochronny wpływ aktywatorów (Grover i in., 1989, 1990). W naszych badaniach wykazaliśmy, że połączenie metody IHT i stosowanie aktywatorów KATP kanałów wykazuje efekty synergiczne w indukowaniu procesów zmniejszających uszkodzenie komórek (Zał. 5., poz.: 2.3.11., 2.3.12., 2.3.13., 2.3.43., 2.3.97.). 3.2.3. Markery stresu oksydacyjnego w badaniach ekotoksykologicznych populacji ptaków z różnych regionów Polski Antropogeniczna działalność człowieka jest jednym z istotniejszych czynników ekologicznych degradujących środowisko przyrodnicze. W wyniku podejmowanych działań związanych głównie z rozwojem przemysłu, postępującym procesem urbanizacji wraz z całą infrastrukturą miejską oraz rozwojem motoryzacji do środowiska przyrodniczego uwalniane są różnorodne zanieczyszczenia, w tym zanieczyszczenia powietrza i wód otwartych, które pogarszają ich stan sanitarny (Dżygóra, 2009). Dlatego w badaniach ekotoksykologicznych w warunkach naturalnych ptaki są przedmiotem szczególnego zainteresowania (Jakubiec, 1985; Mateo i Hoffman, 2001; Hoffman, 2002; Mateo i in., 2003; Gomez i in., 2004; Hoffman i in., 2005, 2009, 2011; Berglund i in., 2007, 2011; Kamiński i in., 2009; Kenow i in., 2009, Koivula i in., 2011; Martinez-Haro i in., 2011). Są one dobrymi wskaźnikami stopnia zanieczyszczenia, ponieważ odznaczają się widocznymi rozmiarami ciała, są podatne na wpływ substancji toksycznych, a ich łańcuch pokarmowy jest całkowicie związany ze środowiskiem, w którym żyją. Ponadto ptaki pozostają naturalnymi komponentami ekosystemów. Uważa się więc, że są one wczesnym biowskaźnikiem stresu środowiskowego i wykorzystywane są one na szeroką skalę do badań ekotoksykologicznych (Kaługa, 2006; Berglund i in., 2007, 2011; Kamiński i in., 2009).

28 We współpracy z pracownikami Katedry Ekologii i Ochrony Środowiska, Collegium Medicum w Bydgoszczy i Uniwersytetu Zielonogórskiego postanowiliśmy określić wzajemne powiązania między stężeniem biomarkerów stresu oksydacyjnego (peroksydacja lipidów, oksydacyjna modyfikacja białek, aktywność enzymów antyoksydacyjnych, hemoliza erytrocytów) oraz poziomem makroelementów (Na, K, Ca, Mg i Fe) i mikroelementów (Zn, Cu, Mn i Co), toksycznych metali ciężkich (Pb i Cd) we krwi piskląt bociana białego (Ciconia ciconia) w środowiskach o różnym stopniu antropopresji (wieś Kłopot, południowozachodnia Polska; kilka podmiejskich stanowisk położonych 20 km od Zielonej Góry, w pobliżu Głogowa, gdzie znajduje się huta miedzi, południowo-zachodnia Polska; wieś Cecenowo, północna Polska). Wyniki tych badań zostały opublikowane w formie oryginalnych prac naukowych (Zał. 5., 2.1.6., 2.1.7., 2.1.10., 2.1.12., 2.2.1.1., 2.2.1.7., 2.2.2.2., 2.2.2.3., 2.2.4.3., 2.2.4.7., 2.2.4.14., 2.2.4.32.) oraz prezentowane były podczas licznych konferencji krajowych i międzynarodowych (Zał. 5., poz.: 2.3.7., 2.3.8., 2.3.15., 2.3.20., 2.3.22., 2.3.45., 2.3.46., 2.3.48., 2.3.51., 2.3.103.). Stwierdziliśmy względnie wysoki poziom aktywności enzymów antyoksydacyjnych (CAT, GPx, SOD i GR) oraz zawartości dialdehydu malonowego (MDA) u piskląt z zanieczyszczonych obszarów. Stosunkowo wysokie poziomy CAT, CP i GPx również stwierdzono we krwi piskląt z terenów w pobliżu Morza Bałtyckiego. Poziomy Co, Pb i Cd były wyższe (p<0,001) we krwi piskląt gnieżdżących się w pobliżu huty miedzi w Głogowie. Dowodzi to ważnemu znaczeniu antropopresji wpływającej na przebieg procesów biogeochemicznych i bioakumulacji metali toksycznych. Podobne tendencje zauważono również we krwi piskląt z rejonu Pomorza, u których poziom Cd był dość wysoki (2,7 mg/kg), co może wskazywać na wysoki stopień intoksykacji w tym regionie. Stwierdzono wysokie wartości markerów stresu oksydacyjnego (stężenie TBARS, poziom aldehydowych i ketonowych pochodnych OMB) oraz podwyższoną aktywność aminotransferaz we krwi piskląt z obszarów zanieczyszczonych. Aktywność LDH była nieznacznie obniżona, być może z powodu zwiększonego stężenia mleczanu we krwi piskląt z obszarów zanieczyszczonych (Zał. 5., poz.: 2.1.10.). Wykazaliśmy również, że w środowiskach zanieczyszczonych metale toksyczne, wskutek wzmożonej antropopresji są modulatorami aktywności najważniejszych enzymów antyoksydacyjnych (Zał. 5., poz.: 2.1.6., 2.1.7., 2.1.10., 2.1.12., 2.2.1.7.). Nasze badania potwierdzają założenie, że duże różnice w akumulacji metali ciężkich u ptaków z różnych miast świadczą o zróżnicowanym stopniu zanieczyszczenia tych obszarów. Generacja RFT w organizmach ptaków z terenów zanieczyszczonych ma duży wpływ na funkcje komórkowe i dotyczy przede wszystkim dezintegracji przepuszczalności błon komórkowych, uszkadzania

29 lipidów i białek, a także mogą prowadzić do deregulacji obrony antyoksydacyjnej i/lub powodować hemolizę erytrocytów. Łabędzia niemego (Cygnus olor) można uznać za gatunek reprezentacyjny dla grupy ptaków związanych ze środowiskiem wodnym. Zliczanie populacji tych ptaków wykazało, że gatunek ten bardzo wyraźnie reaguje na zmiany zachodzące w środowisku (Molnar, 1983; Pennycott, 1998; Sparling i in., 2009; Perrins i in., 2003; Beyer i Day, 2004; Cousquer, 2006; Grúz i in., 2015). Wychodząc z założenia, że stan populacji łabędzia niemego dobrze oddaje stan środowiska, gatunek ten postanowiliśmy wykorzystać w swoich badaniach jako biowskaźnikowy. Dla realizacji postawionego celu założenia badawcze polegały na zdiagnozowaniu i zestawieniu szczepów oportunistycznych i patologicznych, oraz na scharakteryzowaniu ich według ujęcia ilościowego (Zał. 5., poz.: 2.2.2.34., 2.3.170.) oraz ocenie wskaźników hematologicznych zimującej populacji łabędzia niemego zamieszkujących aglomeracje miejskie o różnym stopniu antropopresji (Zał. 5., poz.: 2.3.162.). Markery stresu oksydacyjnego we krwi gołębia skalnego (Columba livia) zostały przez nas wykorzystane również w badaniach wpływu zróżnicowanego stresu środowiskowego. Prowadzone badania porównawcze wykazały, że ptaki z miast, odznaczających się intensywnym ruchem samochodowym, akumulują znacznie więcej metali ciężkich w porównaniu do ptaków z kolonii zamieszkujących obrzeża miast, a szczególnie tych żyjących na wsiach (Zał. 5., poz.: 2.2.1.2., 2.2.2.1., 2.3.169.). 3.2.4. Markery stresu oksydacyjnego i bioakumulacja pierwiastków w tkance mięśniowej troci wędrownej (Salmo trutta m. trutta L.) w różnych stadiach rozwojowych Troć wędrowna jest rybą anadromiczną, tzn. dwuśrodowiskową odbywając wędrówki z morza do rzek i strumieni (Dębowski i in., 2008). Poprzez to, że w swoim cyklu życiowym trocie wykorzystują bardzo szerokie spektrum środowiskowe i uważane są za doskonały wskaźnik stanu ekologicznego środowiska (Brinkmann i in., 2013; Zelníckova i in., 2013; Vincze i in., 2015). Ryby te ze względu na swoją długość życia, skomplikowane procesy życiowe oraz tendencję do wędrówek określić można mianem bioindykatorów wielkoobszarowych i wieloletnich (Kaleta, 2007). W związku z powyższym, za cel badań postawiliśmy sobie określenie ekofizjologicznych uwarunkowań pomiędzy wybranymi stadiami rozwojowymi troci wędrownej rozwijającej się w środowisku morskim i słodkowodnym poprzez określenie poziomu bioakumulacji wybranych mikro-i makroelementów (Fe, Mn, Zn, Cu, Ca, Mg), mechanizmów kształtowania się reakcji

30 biochemicznych w odpowiedzi na stres oksydacyjny wywołany czynnikami środowiskowymi za pomocą markerów stresu oksydacyjnego i całkowitej zdolności antyoksydacyjnej. Wraz ze wzrostem bioakumulacji pierwiastków (Mg, Fe i Zn) w ciele smoltów następuje zwiększenie dostarczania energii niezbędnej do wszystkich przemian metabolicznych oraz funkcji życiowych komórek. Podczas tarła w organizmie u troci wędrownej zachodzą istotne zmiany metaboliczne, takie jak modyfikacja przenoszenia tlenu przez zmieniające się poziomy dostępnej hemoglobiny i powiększanie wydolności układu krwionośnego. Podczas tarła podwyższa się poziom glukozy, który obniża poziom wolnych kwasów tłuszczowych we krwi (Opuszyński, 1983). Nadmiar tlenu niezbędnego do długotrwałego wysiłku może potęgować zjawisko powstawania RFT. Tarło i związany z tym duży wysiłek mogą mieć bezpośredni wpływ na reakcje odpowiedzialne za stres oksydacyjny w komórkach. Przeprowadzone przez nas badania wykazały znaczący wzrost stężenia markerów peroksydacji lipidów w tkance mięśniowej tarlaków, co wskazuje na rozwój stresu oksydacyjnego spowodowanego przez zmianę środowiska bytowania i stanu fizjologicznego organizmu ryb. Aktywacja proteolitycznej degradacji zmodyfikowanych reszt aminokwasowych może być jedną z przyczyn redukcji oksydacyjnie zmodyfikowanych pochodnych w wyniku adaptacji ryb do czynników środowiska. Przeprowadzona analiza korelacyjna pomiędzy bioakumulacją mikro- i makroelementów oraz poziomem markerów stresu oksydacyjnego w tkance mięśniowej wykazała zależności skierowane do ograniczenia stresu oksydacyjnego przez utrzymanie poziomu mikro- i makroelementów w granicach fizjologicznych niezbędnych dla aktywacji obrony antyoksydacyjnej u troci wędrownej na różnych stadiach rozwojowych (Zał. 5., poz. 2.2.2.17.). Na podstawie przeprowadzonych badań i mojej opieki jako promotora pomocniczego, mgr Katarzyna Pałczyńska-Guguła obroniła pracę doktorską pt. Kształtowanie się mechanizmów reakcji antyoksydacyjnych oraz wybranych parametrów biochemicznych w różnych stadiach rozwojowych troci wędrownej (Salmo trutta m. trutta L.) i uzyskała stopień doktora nauk biologicznych (21 lutego 2017 r., Akademia Pomorska w Słupsku). Organizmy wskaźnikowe dostarczają podstawowych informacji o stanie jakości danego zbiornika lub rzeki (Kołodziejczyk i in., 1998; Sato i Aoki, 2002; Benedetti i in., 2015; Henry, 2015; Branco i in., 2016). Do kontroli stanu wód w Europie, Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zaleca stosowanie ryb bardzo wrażliwych na zmiany klimatyczne i antropogeniczne (Pagenkopf, 1983). Do takich ryb należy m.in. troć wędrowna (Salmo trutta L.). Jako, że ryby te są jednymi z najwrażliwszych obiektów testowych dzięki swoim zdolnościom adaptacyjnym, są również dogodnym obiektem badań na poziomie organizmu, komórkowym i

31 molekularnym (Wester i in., 1994; Sures i in., 1997; Cajaraville i in., 2000; Galloway i Depledge, 2001). Zwracając uwagę na aktualność problematyki zanieczyszczenia wód oraz wpływu zanieczyszczeń na organizm ryb postawiono za cel badań analizę zawartości markerów stresu oksydacyjnego, zmian metabolicznych oraz mikro- i makroelementów (Mn, Cu, Zn, Fe, Ca, Mg) w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej zasiedlających cztery dopływy rzeki Słupi (Pomorze Środkowe) rzeki Glaźnę, Skotawę, Kamienną i Kwaczę. Odłowy smoltów przeprowadzono w ścisłej współpracy z Parkiem Krajobrazowym Dolina Słupi oraz Zarządem Okręgu Polskiego Związku Wędkarskiego w Słupsku. Najwyższy poziom zarówno aldehydowych jak i ketonowych pochodnych OMB w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej uzyskano w 2009 r. Natomiast w 2010 r. zanotowano tendencję spadkową, po czym w roku 2011 ponowny wzrost. Wysoki poziom markerów peroksydacji lipidów oraz ketonowych i aldehydowych pochodnych OMB w tkance mięśniowej smoltów troci wędrownej może świadczyć o pewnym stopniu zanieczyszczenia środowiska bytowania ryb, zwłaszcza w 2011 roku. Znaczący wzrost aktywności aminotransferazy asparaginowej oraz dehydrogenazy mleczanowej wskazuje na zasadniczą rolę tych enzymów w transporcie kluczowych metabolitów przez membrany oraz w mediacji metabolicznych zmian adaptacyjnych ryb zarówno pod wpływem czynników zewnętrznych (zmiany środowiska bytowania ryb), jak i wewnętrznych (wzrost i rozwój). Uzyskane wyniki świadczą o aktywacji obrony antyoksydacyjnej, m.in. wzroście aktywności peroksydazy glutationowej, katalazy oraz reduktazy glutationowej w wyniku aktywacji stresu oksydacyjnego w tkance mięśniowej smoltów. Wysoki poziom markerów peroksydacji lipidów jak również ketonowych i aldehydowych pochodnych OMB w tkance mięśniowej smoltów świadczy o odpowiedzi adaptacyjnej ryb na wpływ zanieczyszczenia środowiska ich bytowania. Uzyskane rezultaty prezentowane były podczas konferencji międzynarodowych (Zał. 5., poz.: 2.3.163., 2.3.258., 2.3.282.) oraz opublikowane w formie oryginalnych prac naukowych (Zał. 5., poz.: 2.2.2.5., 2.2.2.18., 2.2.2.24., 2.2.2.26., 2.2.2.35., 2.2.4.29., 2.2.4.50., 2.2.4.56.). 3.2.5. Markery stresu oksydacyjnego i zmiany biochemiczne we krwi koni sportowych w dynamice treningu Dynamicznie rozwijające się jeździectwo, a wraz z nim wiedza o fizjologii wysiłku, pozwala na wykorzystanie wartości wskaźników fizjologicznych i klinicznych do oceny wydolności fizycznej koni i ich zdolności adaptacyjnych do wzrastających obciążeń (Szarska, 2002; Hinchcliff i Geor, 2008; Ogoński i in., 2010). Współcześnie coraz większego znaczenia

32 nabiera nie tylko tzw. wyczucie trenerskie, ale również systematyczne monitorowanie stanu zdrowia koni będących w treningu poprzez analizę różnorodnych parametrów fizjologicznych, hematologicznych i biochemicznych. W ostatnich latach podejmowane są także próby stosowania biomarkerów stresu oksydacyjnego oraz obrony antyoksydacyjnej koni jako wskaźników oceniających ich stopień wytrenowania (Avellini i in., 1995; Kinnunen i in., 2000; Shi i in., 2007; Kirschvink i in., 2008; Williams, 2016; Kusano i in., 2016; White i Warren, 2017; MacNicol i in., 2017). Wraz z procesem utleniania substratów energetycznych w mitochondriach podczas treningu zachodzi również proces powstawania RFT (Deaton i Marlin, 2003). Przy dużej ilości RFT, a zmniejszonej skuteczności działania układów antyoksydacyjnego i proteolitycznego dochodzi do kumulacji utlenionych produktów białkowych (Radak i in., 2008). Produkcja RFT w nadmiarze jest powodem obniżenia sportowej kondycji konia, zmęczenia, uszkodzenia mięśni i stawów, zaburzenia funkcjonowania układu sercowo-naczyniowego i oddechowego, uszkodzeń neurologicznych etc. (Chiaradia i in., 1998; Art i Lekeux, 2005). Nadmiar RFT i obniżenie obrony antyoksydacyjnej w wyniku intensywnego wysiłku fizycznego jest powodem inicjacji stresu oksydacyjnego (Deaton i Marlin, 2003; Art i Lekeux, 2005; Kinnunen i in., 2005; Kirschvink i in., 2008). Zwracając uwagę na aktualność podjętego problemu, postanowiliśmy przeanalizować poziom markerów stresu oksydacyjnego, aktywności aminotransferaz i dehydrogenazy mleczanowej, jak również zmian ilościowych mleczanu i pirogronianu jako wskaźników dla oceny funkcjonalnych zdolności organizmu koni sportowych w dynamice treningu. Badania wykonano w ramach współpracy z Instytutem Hodowli Zwierząt Państwowej Akademii Nauk Rolniczych (Charków, Ukraina). Nasze badania wykazały, że u koni sportowych znajdujących się w długotrwałym treningu poziom markerów stresu oksydacyjnego jest znacznie niższy po wysiłku fizycznym w porównaniu do stanu w spoczynku. Ogiery wykazywały obniżenie peroksydacji lipidów i wyższą aktywność reduktazy glutationowej, podczas gdy klacze cechowały się wyższą aktywnością dysmutazy ponadtlenkowej po próbie treningowej. Zaobserwowano korelację między biomarkerami stresu oksydacyjnego i obroną antyoksydacyjną u ogierów po treningu wskazując na udział dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w zmniejszeniu stresu oksydacyjnego wywołanego wysiłkiem fizycznym. Nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic w hemolizie erytrocytów u koni sportowych przed i po treningu (Zał. 5., poz.: 2.1.13.). Nasze badania wykazały również, że test wysiłkowy u koni sportowych powoduje zależne od rasy zmiany w stężeniu markerów stresu oksydacyjnego i w hemolizie

33 erytrocytów. Zanotowano spadek poziomu karbonylowych pochodnych OMB w erytrocytach koni rasy Ukraińskiej wierzchowej w dynamice treningu, natomiast u koni rasy Holsztyńskiej zaobserwowano wzrost stężenia tych biomarkerów po treningu (Zał. 5., poz.: 2.1.15.). Po teście wysiłkowym ogiery miały wyższy poziom leukocytów i granulocytów, co wskazuje na aktywację funkcji odpornościowych pod wpływem regularnego treningu. Podwyższony poziom erytrocytów, hemoglobiny i hematokrytu we krwi ogierów jest związany z uwalnianiem erytrocytów do krwiobiegu w celu efektywnego transportu tlenu w dynamice treningu. Nieco wyższe poziomy wskaźników erytrocytarnych u ogierów są prawdopodobnie spowodowane działaniem androgenów na erytropoezę. Znaczny wzrost aktywności aminotransferaz w osoczu krwi u ogierów po wysiłku można uznać za swoiste zmiany metaboliczne w systematycznym treningu. Test wysiłkowy u klaczy i ogierów prowadzi do obniżenia poziomu peroksydacji lipidów w erytrocytach. Kwasowa oporność erytrocytów była podobna u ogierów i klaczy. Nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic w odsetku zhemolizowanych erytrocytów przed i po treningu (Zał. 5, poz.: 2.1.18.). Wyniki przeprowadzonych badań prezentowane były w materiałach konferencyjnych (Zał. 5., poz.: 2.3.47., 2.3.53., 2.3.54., 2.3.60., 2.3.63., 2.3.71., 2.3.74., 2.3.75., 2.3.77., 2.3.85., 2.3.107., 2.3.108., 2.3.131., 2.3.138., 2.3.198., 2.3.199., 2.3.205., 2.3.284., 2.3.300., 2.3.317.) i opublikowane w formie oryginalnych prac naukowych (Zał. 5., poz.: 2.2.1.13., 2.2.1.19.,. 2.2.1.20., 2.2.2.10., 2.2.2.12., 2.2.3.33. 2.2.3.37., 2.2.3.39. 2.2.3.42., 2.2.3.45., 2.2.3.48., 2.2.3.54., 2.2.3.56., 2.2.3.57., 2.2.3.63.). Wyniki naszych badań dotyczących sezonowych zmian poziomu markerów stresu oksydacyjnego i parametrów hematologicznych we krwi koni uczestniczących w rekreacyjnych jazdach konnych w dynamice treningu zostały przedstawione w formie oryginalnych prac (Zał. 5., poz.: 2.2.1.16., 2.2.2.36., 2.2.2.37., 2.2.3.84., 2.2.4.24., 2.2.4.44.) oraz materiałów konferencyjnych (Zał. 5., poz.: 2.3.81., 2.3.164., 2.3.241., 2.3.242., 2.3.259., 2.3.266., 2.3.277., 2.3.287., 2.3.288.). Możemy wnioskować, że trening koni w okresie wiosennym i letnim aktywuje kompensacyjne i adaptacyjne mechanizmy organizmu na działanie stresu wysiłkowego. Analiza zmian markerów stresu oksydacyjnego i zmian metabolicznych pod wpływem wysiłku fizycznego jest bardzo ważną predyspozycją do analizowania adaptacyjnych możliwości i poziomu kondycji koni sportowych (Szarska, 1994; Deaton i Marlin, 2003; Art i Lekeux, 2005; Kirschvink i in., 2008; Kedzierski i in., 2009; Soares i in., 2011; Williams i Burk, 2012). Za pomocą analizy zmian metabolicznych można ocenić stopień wytrenowania konia oraz uzasadnić i/lub ustalić czas i tryb treningu.

34 3.2.6. Ocena właściwości farmakologicznych wybranych gatunków tropikalnych i subtropikalnych roślin Od 2015 roku we współpracy z Wydziałem Tropikalnych i Subtropikalnych Roślin Centralnego Ogrodu Botanicznego im. M.M. Gryshko Państwowej Akademii Nauk Ukrainy (Kijów, Ukraina) i Ogrodem Botanicznym Lwowskiego Narodowego Uniwersytetu im. Iwana Franki (Lwów, Ukraina) prowadzimy badania dt. oceny właściwości farmakologicznych roślin z rodzajów Ficus (Moraceae), Coelogyne, Cymbidium, Calanthe (Orchidaceae), Sansevieria (Asparagaceae), Camellia (Theaceae), Begonia (Begoniaceae) z uzasadnieniem racjonalnego wykorzystania tych gatunków roślin w medycynie, weterynarii i akwakulturze. Wyniki przeprowadzonych badań dotyczące oceny właściwości antybakteryjnych wybranych gatunków z rodzajów Ficus, Coelogyne, Sansevieria, Begonia przeciwko Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, MβL P. aeruginosa, Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteriditis, Staphylococcus aureus ATCC 25923, S. aureus MRSA, Candida albicans były opublikowane w formie oryginalnych prac naukowych (Zał. 5., poz.: 2.2.1.28., 2.2.1.29., 2.2.1.36., 2.2.3.51., 2.2.3.64., 2.2.3.75. 2.2.3.80., 2.2.4.51.) oraz materiałów konferencyjnych (Zał. 5., poz.: 2.3.106., 2.3.111., 2.3.115. 2.3.119., 2.3.125., 2.3.126., 2.3.128., 2.3.144., 2.3.149., 2.3.150., 2.3.158., 2.3.159., 2.3.172., 2.3.173., 2.3.183. 2.3.185., 2.3.190. 2.3.192., 2.3.194., 2.3.195., 2.3.204., 2.3.204., 2.3.212., 2.3.216., 2.3.227. 2.3.231., 2.3.236., 2.3.237., 2.3.244. 2.3.247., 2.3.253., 2.3.267., 2.3.274., 2.3.278., 2.3.281., 2.3.298., 2.3.307., 2.3.312., 2.3.313.). Dane z całego świata pokazują, że wśród patogenów ryb rośnie oporność na leki konwencjonalne, co stymuluje poszukiwanie alternatywnych środków do zwalczania zakażeń za pomocą środków profilaktycznych, takich jak stosowanie probiotyków lub szczepionek (Chinabut i Puttinaowarat, 2005; Founou i in., 2016; Gabriel i in., 2017). W związku z tym naturalne produkty roślinne mogą być cennym źródłem do badania ich właściwości antybakteryjnych przeciwko patogenom wielolekoopornym, również i w akwakulturze (Pachanawan i in., 2008; Galina i in., 2009; Ramudu i Dash, 2013; Tang i in., 2014). Aby przetestować to założenie, do oceny aktywności przeciwbakteryjnej wybrano rodzaj Ficus L. (Moraceae), jeden z najbogatszych gatunkowo i ekologicznie ważnych rodzajów roślin (Wagner i in., 1999; Berg i Corner 2005; Lansky i Paavilainen, 2011). Celem naszych badań była ocena działania antybakteryjnego etanolowych ekstraktów z liści wybranych gatunków fikusów przeciwko patogenom ryb, Aeromonas hydrophila, Citrobacter freundii, Pseudomonas fluorescens i Yersinia ruckeri, w celu oceny możliwości zastosowania tych roślin w zapobieganiu infekcjom powodowanym przez te bakterie w akwakulturze. Testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe przeprowadzono na agarze Mullera-Hintona metodą

35 dyfuzyjną Kirby-Bauera (1966). W naszych badaniach większość etanolowych ekstraktów uzyskanych z wybranych gatunków fikusów wykazywała najwyższą aktywność przeciwbakteryjną przeciwko wymienionym szczepom bakterii, przy czym zaobserwowano średnicę stref zahamowania wzrostu bakterii w granicach 8-22 mm. Obecne badania wykazały, że wśród różnych gatunków fikusów najskuteczniejszym przeciwko P. fluorescens były etanolowe ekstrakty z liści dziesięciu gatunków fikusów, m.in. F. hispida, F. binnendijkii, F. pumila, F. rubiginosa, F. erecta, F erecta var. sieboldii, F. sur, F. benjamina, F. craterostoma, F. lyrata, F. palmeri (gatunki są wymienione w kolejności, według skuteczności wobec badanego patogenu) (Zał. 5., poz.: 2.2.1.37., 2.2.4.47., 2.3.306.). Wyciągi z F. benghalensis, F. benjamina, F. binnendijkii, F. cyathistipula, F. deltoidea, F. erecta, F. erecta var. sieboldii, F. hispida, F. luschanthiana, F. lyrata, F. macrophylla, F. mucuso, F. natalensis subsp. leprieurii, F. natalensis subsp. natalensis, F. palmeri, F. platypoda, F. pumila, F. rubiginosa, F. sur, F. sycomorus i F. villosa wykazywały najwyższą aktywność w stosunku do Aeromonas hydrophyla (Zał. 5., poz.: 2.2.1.24., 2.2.3.62., 2.3.197.). Ekstrakty etanolowe uzyskane z F. pumila, F. binnendijkii "Amstel Gold", F. carica, F. erecta, F. hispida, F. mucuso, F. palmeri, F. religiosa mają wysoki potencjał przeciwbakteryjny w stosunku do Citrobacter freundii (Zał. 5., poz.: 2.2.1.26., 2.2.3.70.). Ważne wydaje się nie tylko określenie substancji zaangażowanych w działanie przeciwko patogenom, ale także ustalenie indukowanej odpowiedzi fizjologicznej ryb. Ilościową ocenę reakcji ryb można uzyskać, oceniając wskaźniki hematologiczne, immunologiczne i biochemiczne, ale także analizując parametry wzrostu bezpośrednio lub pośrednio zaangażowane w reakcję fizjologiczną. Ten cel zrealizowaliśmy wykorzystując w naszych badaniach in vitro erytrocyty i osocze koni biorących czynny udział w rekreacyjnych jazdach konnych. Erytrocyty koni są bardziej wrażliwe na uszkodzenia spowodowane RTF przez specyficzne mechanizmy antyoksydacyjne, tj. tworzenie się methemoglobiny, zmiany ich agregacji i zmniejszenie plastyczności błony komórkowej (Baskurt i Meiselman, 1999; Walter i in., 2014). Ekstrakty roślin mogą indukować lub hamować tworzenie się methemoglobiny i hemolizę (Costa i in., 2009; Thakur i in., 2016). Testy in vitro stosowane w wielu badaniach (Boyer i in., 2002; Walter i in., 2014) służą efektywną metodą diagnostyczną do szybkiej identyfikacji pro- i antyoksydantów pochodzących z różnych źródeł. W związku z powyższym, w naszych badaniach erytrocyty i osocze koni są adekwatnym modelem w ocenie in vitro właściwości antyoksydacyjnych wyciągów z wybranych gatunków roślin tropikalnych i subtropikalnych.

36 Wyniki naszych badań potwierdzają wykorzystanie ekstraktów z liści jako naturalnych antyoksydantów i uzasadniają podejście etnobotaniczne w poszukiwaniu nowych bioaktywnych związków o działaniu antyoksydacyjnym. Inkubacja suspensji erytrocytów koni z wyciągami z liści wybranych gatunków z rodzajów Ficus, Coelogyne, Sansevieria, Camellia, Begonia powodowała obniżenie poziomu TBARS i markerów OMB. Zmniejszony poziom markerów stresu oksydacyjnego korelował ze zwiększeniem całkowitej zdolności antyoksydacyjnej w osoczu i erytrocytach wskazując na aktywację skutecznych mechanizmów obrony antyoksydacyjnej krwi koni indukowanej działaniem wtórnych metabolitów roślin. Aktywacja proteolitycznej degradacji zmodyfikowanych reszt aminokwasowych może być jedną z przyczyn redukcji aldehydowych i ketonowych pochodnych OMB. Uwzględniając powyższe właściwości wyciągów, kontynuujemy przeprowadzenie całościowych badań farmakologicznych, weryfikujących możliwości stosowania leczniczego tych roślin, w różnych dziedzinach medycyny, weterynarii i akwakultury. Nasze wyniki zachęcają do stosowania ekstraktów z liści wybranych gatunków roślin tropikalnych i subtropikalnych w medycynie i weterynarii, jak i w żywności funkcjonalnej i nutraceutycznej ze względu na ich właściwości antyoksydacyjne. Przyszłe prace będą interesujące pod względem poznania składu chemicznego i lepszego zrozumienia mechanizmów działania antyoksydacyjnego, które obecne są w ekstraktach różnych gatunków roślin, do opracowania jako leki do zastosowania profilaktycznego i terapeutycznego w medycynie i weterynarii. Wyniki przeprowadzonych badań dotyczące omówionej tematyki były opublikowane w formie oryginalnych prac naukowych (Zał. 5., poz.: 2.2.1.24., 2.2.1.26., 2.2.1.37., 2.2.1.44. 2.2.1.46., 2.2.3.62., 2.2.3.66., 2.2.3.70., 2.2.3.74., 2.2.3.81. 2.2.3.84., 2.2.4.47., 2.2.4.55.) oraz komunikatów i doniesień naukowych (Zał. 5., poz.: 2.3.197., 2.3.221., 2.3.276., 2.3.285., 2.3.296., 2.3.298., 2.3.299., 2.3.301., 2.3.303. 2.3.305., 2.3.308. 2.3.311., 2.3.319. 2.3.322.). 3.2.7. Ocena właściwości absorpcyjnych minerału glaukonitu w badaniach ekotoksykologicznych Pracując na stanowisku asystenta w Katedrze Higieny i Toksykologii Wydziału Lekarskiego we Lwowskim Narodowym Uniwersytecie Medycznym im. Daniela Halickiego, pod opieką naukową prof. dr hab. n. med. Aleka Manenko, pracowałam nad tematem badawczym dotyczącym oceny właściwości absorpcyjnych surowego glaukonitu ze złóż Obwodu Chmielnickiego (Ukraina) w neutralizacji produktów naftowych (Zał. 5., poz.: 2.2.1.15., 2.2.1.22., 2.2.4.40., 2.3.92.), pestycydów (Zał. 5., poz.: 2.2.3.28., 2.3.154.), świeżego obornika drobiowego (Zał. 5., poz.: 2.2.1.32., 2.3.153.), jonów rtęci (Zał. 5., poz.: 2.2.4.28., 2.3.32.,

37 2.3.121.), radioaktywnych 137 Cs i 90 Sr (Zał. 5., poz.: 2.2.3.43., 2.3.122., 2.3.226.), leków (Zał. 5., poz.: 2.2.1.11., 2.3.155.). Glaukonit to zielony minerał z grupy miki, uwodniony glinokrzemian potasu, żelaza, magnezu i glinu; jest typowym produktem halmyrolizy, który pod względem strukturalnym odpowiada grupom montmorillonitów z illitami, tworzących się w strefie wietrzenia sialitowego. Surowiec ze złóż Obwodu Chmielnickiego zawierał naturalną mieszaninę glaukonitu (50-80%), kwarcu (10-25%) i montmorylonitu (5-25%). Ziarna kwarcu w surowym glaukonicie służą jako filtr mechaniczny (Manenko i in., 2007, 2009, 2010). Glaukonit jest minerałem ilastym, który czyni go, w przeciwieństwie do zeolitu, bardziej kompatybilnym z glebą. Ponadto glaukonit jest idealnym środowiskiem dla rozwoju i aktywności mikroorganizmów, które oczyszczają glebę z wielu organicznych zanieczyszczeń. Wzór chemiczny glaukonitu to K(Fe 3+, Fe 2+, Mg, Al)(OH)2(AlSiO10) nh2o. W składzie glaukonitu są również P, Ca i szeroki zakres pierwiastków śladowych. Cechy strukturalne zapewniają dużą powierzchnię czynną (96-140 m 2 /g) oraz wysoką zdolność wymiany kationów (26-41 meq/100 g). Zawartość głównych tlenków w glaukonicie (%): K2O 4.0 6.4; P2O5 1.3 2.4; CaO 2.0 5.0; MgO 0.5 1.5; SiO2 75.5 92.0; Al2O3 1.5 6.5; Fe2O3 1.5 6.5 (Manenko i Khopyak, 2001; Manenko i in., 2007, 2009, 2010; Zał. 5., poz.: 2.2.3.11., 2.2.4.9., 2.3.19.). Nasze badania wykazały, że glaukonit surowy ma wysoką zdolność absorpcyjną w odniesieniu do jonów rtęci (Zał. 5., poz.: 2.2.4.28., 2.3.32., 2.3.121.). Maksymalna zdolność absorpcyjna glaukonitu osiąga się po 1,5 godz. kontaktu z roztworem Hg (II). Zdolność absorpcji glaukonitu znacznie się zwiększa wraz ze wzrostem stężenia jonów rtęci w roztworze i praktycznie nie ulega zmianom w roztworach o ph 5-7. Wysoka zdolność absorpcji glaukonitu w odniesieniu do jonów rtęci daje podstawy do zaproponowania tego naturalnego absorbentu do oczyszczania gleby, a także do oczyszczania ścieków w przedsiębiorstwach wykorzystujących rtęć i inne metale ciężkie w procesach technologicznych. Wykazaliśmy również możliwość zastosowania glaukonitu do neutralizacji leków wybrakowanych w firmie farmaceutycznej "Lvivdialik" (Lwów, Ukraina) oraz do neutralizacji gleby zanieczyszczonej produktami naftowymi (benzyna, olej napędowy, olej silnikowy). Standardowe leki (siarczan gentamicyny, chlorek tiaminy i in.) zostały efektywnie zinaktywowane glaukonitem (Zał. 5., poz.: 2.2.1.11.). Maksymalną degradację produktów naftowych osiągnięto po 7. tygodniach sorpcji glaukonitem modyfikowanym biosurfaktantami Pseudomonas spp. PS-17 (Zał. 5., poz.: 2.2.1.15., 2.2.1.22., 2.2.4.40., 2.3.92.). Nasze badania również wykazały, że glaukonit przyspiesza procesy neutralizacji świeżego obornika

38 drobiowego w celu otrzymania organicznego i mineralnego nawozu. Takie nawozy humusowe znacznie poprawiają fizyczne i chemiczne właściwości gleby, pozwalając jej zachować żyzność i wzmacniać jej aktywność w procesach mikrobiologicznych (Zał. 5., poz.: 2.2.1.32., 2.3.153.). Przyszłościowe badania będą obiecujące w przeanalizowaniu właściwości absorpcyjnych modyfikowanego termicznie glaukonitu (poddanego działaniu polielektrolitów), znacznie zwiększając jego zdolności absorpcyjne. We współpracy z pracownikami Katedry Higieny i Toksykologii Wydziału Lekarskiego we Lwowskim Narodowym Uniwersytecie Medycznym im. Daniela Halickiego, brałam również udział w ekspertyzach toksykologicznych i ekologicznych obiektów oraz produktów przemysłowych, m.in. w ocenie toksykologicznej dekoracyjnej podłogi epoksydowej (Zał. 5., poz.: 2.2.3.7.), oczyszczających konstrukcji ROTH MICRO-STEP (Zał. 5., poz.: 2.2.3.9.), procesu gorącego cynkowania wyrobów metalowych z normatywnym uzasadnieniem strefy ochronnej dla tej technologii (Zał. 5., poz.: 2.2.3.10.), mieszaniny oczyszczającej Bio Enzim (Proteinaza DS-25) (Zał. 5., poz.: 2.2.3.12.), przenośnych kabin sanitarnych "Toi-toi" i destruktora gazów i zapachów "Blue Magic" (Zał. 5., poz.: 2.2.3.14.), nowego transplantatu na bazie proszku ze skorupy jaj (Zał. 5., poz.: 2.2.3.15.), stacji biologicznego oczyszczania ścieków "TOPAS 5-300" (Zał. 5., poz.: 2.2.3.16.), środka odtłuszczającego "KEBOSOL 2000" i reduktora gazów "KEBO ANTIFUMA" (Zał. 5., poz.: 2.2.3.18.), biopolimerowej mieszanki "BIBR (Zał. 5., poz.: 2.2.3.22.), systemów ochronnych metali przed korozją poprzez zastosowanie proszkowych farb polimerowych (Zał. 5., poz.: 2.2.3.26.), zastosowania kotłów pirolitycznych jako źródła zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego (Zał. 5., poz.: 2.2.3.32.), w ocenie uzasadnienia wielkości strefy ochronnej i sanitarnej przedsiębiorstwa do produkcji granulatów z odpadów drzewnych i bloków glinowych firmy "Techbudproekt" (Zał. 5., poz.: 2.2.3.19.), od torów kolejowych na stacji Lwów - Podzamcze do prywatnego sierocińca (Zał. 5., poz.: 2.2.3.23.), Lwowskiego przedsiębiorstwa napraw lokomotyw (Zał. 5., poz.: 2.2.3.29.), w ekologicznej i higienicznej ocenie stref Jaworowskiego wojskowego poligonu naziemnych sił zbrojnych Ukrainy (Zał. 5., poz.: 2.2.3.21.). 3.2.8. Analiza epidemiologiczna zachorowalności na choroby tarczycy wśród populacji dzieci, młodzieży i osób dorosłych na Ukrainie Od 2005 roku wspólnie z dr n. med. Olgą Kasiyan (Katedra Higieny i Toksykologii Wydziału Lekarskiego Lwowskiego Narodowego Uniwersytetu Medycznego im. Daniela Halickiego) prowadzimy badania dotyczące epidemiologicznej analizy zachorowalności na choroby tarczycy wśród populacji dzieci, młodzieży i osób dorosłych na Ukrainie. W rezultacie

39 takiej owocnej współpracy i przeprowadzonych badań powstały oryginalne prace naukowe (Zał. 5., poz.: 2.2.1.8., 2.2.1.14., 2.2.1.21., 2.2.1.30., 2.2.1.30., 2.2.1.41., 2.2.3.20., 2.2.3.47., 2.2.3.49., 2.2.3.53., 2.2.3.55., 2.2.3.67., 2.2.4.8., 2.2.4.25., 2.2.4.38., 2.2.4.39.) oraz komunikaty i doniesienia naukowe (Zał. 5., poz.: 2.3.10., 2.3.21., 2.3.55., 2.3.64., 2.3.67. 2.3.70., 2.3.72., 2.3.73., 2.3.80., 2.3.82., 2.3.87. 2.3.89., 2.3.93., 2.3.99., 2.3.114., 2.3.120., 2.3.129., 2.3.136., 2.3.145., 2.3.148., 2.3.151., 2.3.152., 2.3.174., 2.3.175., 2.3.179., 2.3.186., 2.3.218., 2.3.222., 2.3.232., 2.3.257., 2.3.291., 2.3.292.). Wśród narządowo swoistych chorób autoimmunologcznych bardzo dużą grupę stanowią choroby układu dokrewnego. Najczęstszymi tego typu chorobami stanowiącymi ponad 90% przypadków są: autoimmunologiczne choroby tarczycy (Choroba Gravesa- Basedowa i przewlekle limfocytarne zapalenie tarczycy typu Hashimoto), cukrzyca typu 1, niedokrwistość Addisona-Biermera, reumatoidalne zapalenie stawów i bielactwo (Krassas i in., 2007; Przybylik-Mazurek i in., 2007; Nystrӧm i in., 2011). Autoimmunologiczne zapalenie tarczycy Hashimoto (Hashimoto thyreoiditis, HT) lub limfocytarne zapalenie tarczycy, jest procesem przewlekłym i najczęstszą przyczyną nabytej niedoczynności tarczycy zarówno w wieku rozwojowym, jak i u osób dorosłych (Trbojević i Djurica 2005; Krassas i in., 2007; Nystrӧm i in., 2011; Hasham i Tomer, 2012). Wyniki naszych badań wykazały, że częstość występowania HT w dużym stopniu zależy od czynników środowiskowych, m.in. od wzrostu zanieczyszczenia środowiska oraz od masowego jodowania soli (Zał. 5., poz.: 2.2.3.53., 2.2.3.55., 2.3.82., 2.3.93., 2.3.114., 2.3.257.). W grupie chorych jest zdecydowanie więcej kobiet niż mężczyzn. Coraz częściej schorzenie to rozpoznawane jest w populacji wieku rozwojowego. Dodatkowo na wyższe statystyki zachorowań wpływa fakt, że obecnie społeczeństwo posiada lepszą diagnostykę oraz większą świadomość w zakresie chorób tarczycy, co przyczynia się do lepszego i wcześniejszego wykrywania tych schorzeń. Celem pierwszej części naszych badań była ocena występowania HT u dzieci, młodzieży i osób dorosłych w obwodzie Lwowskim (Ukraina zachodnia). Przeprowadzono również ocenę jakości powietrza, wody i gleby oraz jakość żywności według wskaźników higienicznych (liczba prób, które nie odpowiadają standardom higienicznym, %) w powiatach obwodu Lwowskiego. Zwiększoną częstość występowania HT wśród dorosłych stwierdzono w 16 powiatach i 3 miastach, wśród młodzieży w 5 powiatach, wśród dzieci w 8 powiatach i 2 miastach obwodu Lwowskiego. Wzrost częstości występowania HT wśród dorosłych w okresie 2000-2010 roku był zanotowany wśród mieszkańców głównie z obszarów miejskich. Ryzyko występowania HT wśród dorosłych mieszkających na bardziej zanieczyszczonych obszarach jest wyższe w porównaniu z mieszkańcami z stosunkowo czystych rejonów. Na

40 ryzyko występowania HT wśród mieszkańców obszarów wiejskich znaczący wpływ ma zanieczyszczenie chemiczne wód i gleby, natomiast, wśród mieszkańców miast zanieczyszczenie powietrza. Obserwowane tendencje zmian pozwolą określić zróżnicowany charakter działań prewencyjnych i terapeutycznych w celu zmniejszenia występowania HT w obszarach endemicznych z różnym stopniem zanieczyszczenia środowiska. Nasze wyniki wskazują na konieczność wyjaśnienia przyczyn i ocenę ryzyka patologii tarczycy wśród różnych grup wiekowych. Chociaż około 80% ryzyka rozwoju HT ma podłoże genetyczne (Sgarbi i Maciel, 2009), czynniki środowiskowe również mogą odgrywać ważną rolę w rozwoju chorób autoimmunologicznych tarczycy u mieszkańców z regionów endemicznych (Zał. 5., poz.: 2.2.4.25.). Wśród młodzieży stwierdzono spadek częstości występowania HT w okresie od 2000 do 2010. Szczyt występowania choroby odnotowano w latach 2000 i 2004 (Zał. 5., poz.: 2.2.1.14.). Na stan chorobowości gruczołu tarczowego populacji mieszkańców obszarów endemicznych w ciągu ostatnich 20-25 lat wpłynęła również awaria elektrowni atomowej w Czarnobylu w 1986 r. oraz zmienne modele profilaktyki jodowej (Kingman, 1992; Tronko i in., 1999; Williams, 2002; Williams i in., 2004; Tuttle i in., 2011; Dom i in., 2012). Podjęcie takich badań, zwłaszcza po wprowadzeniu powszechnego modelu jodowania soli kuchennej, pozwoliło nie tylko na ocenę stanu niedoboru jodu poprzez określenie częstości występowania wola i średnich wartości jodurii, ale również na wykrycie ewentualnych działań niepożądanych zwiększonego spożycia jodu (nadczynność tarczycy indukowana jodem oraz HT) (Tronko i in., 2005). Nasze badania wykazały znaczne zmniejszenie częstości występowania wola endemicznego I stopnia wśród dorosłych z obwodu Lwowskiego, natomiast znaczny wzrost zachorowalności na wole endemiczne II i III stopnia (Zał. 5., poz.: 2.2.1.21.). Różne zmiany w zachorowalności na wole endemiczne I, II i III stopnia wskazują na potrzebę dalszego monitoringu tej tyreopatologii w celu wyjaśnienia przyczyn i organizacji działań profilaktycznych z udziałem endokrynologów i innych lekarzy stosujących nowoczesne metody diagnostyczne i terapeutyczne. Na obszarze Ukrainy i Białorusi po awarii elektrowni jądrowej w Czarnobylu odnotowano znaczny wzrost zachorowań na raka tarczycy wśród dorosłych i dzieci (Tronko i in., 2005-2014; Nikiforov, 2006; Brenner i in., 2011; Little i in. 2015). Nasze badania również wykazały, że zachorowalność i rozpowszechnienie raka tarczycy na Ukrainie w latach 2004-2014 wzrosły odpowiednio o 1,61 i 1,97 razy (Zał. 5., poz.: 2.2.1.31.). Analiza epidemiologiczna wykazała, że wskaźniki te mają charakter regionalny. Najwyższą zachorowalność na raka tarczycy zaobserwowano w Kijowie i regionie Kijowskim, zarówno wśród kobiet, jak i u

41 mężczyzn. Wysokie wskaźniki tej patologii stwierdzono również w niektórych regionach północno-wschodnich i południowych, a najniższe w zachodnich regionach Ukrainy. Stwierdzono, że wzrost zachorowalności na raka tarczycy występuje głównie wśród populacji kobiet: ona jest większa o 3,63-3,58 razy, częstość występowania patologii o 5,01-5,04- krotnie wyższa w porównaniu do grupy mężczyzn (Zał. 5., poz.: 2.2.1.31.). Wyniki te wskazują na potrzebę profilaktyki pierwotnej nowotworów tarczycy, biorąc pod uwagę regionalne osobliwości zachorowalności i rozpowszechnienia patologii. Włączenie metod zapobiegawczych i różnych form edukacji zdrowotnej mających na celu wykrywanie przedklinicznych form nowotworów pozwoli na monitorowanie danego procesu w celu zmniejszenia zachorowalności i rozpowszechnienia raka tarczycy. Konieczne jest także prowadzenie profilaktyki wtórnej, polegającej na organizowaniu populacyjnych badań profilaktycznych, zwłaszcza w grupie kobiet. Objawy niedoczynności tarczycy związane z niedoborem jodu mogą mieć negatywny wpływ na stan psychiczny chorych (Bauer i in., 2003; Davis i Tremont, 2007; Demartini i in., 2010). Chorzy mają niższe poczucie własnej wartości, co negatywnie wpływa na efektywność ich pracy i życie rodzinne. Poza tym niedobór hormonów tarczycy we krwi wpływa na pogorszenie jakości życia, na wzrost ryzyka wystąpienia różnych schorzeń, co negatywnie odbija się na całym społeczeństwie (Davis i in., 2003; Lass i in., 2008, Nystrom i in., 2011). Nasze badania wykazały, że poziom jodu w organizmie wpływa na przebieg procesów psychofizjologicznych i intelektualnych (Zał. 5., poz.: 2.2.2.31., 2.3.25., 2.3.37., 2.3.41., 2.3.52., 2.3.90., 2.3.94., 2.3.100.), wpływając na dokładność i szybkość wykonywania testów mierzących poziom koncentracji uwagi i szybkości myślenia (Zał. 5., poz.: 2.2.2.13., 2.2.4.36.). Analiza korelacyjna pomiędzy poziomem jodu w organizmie a wskaźnikami szybkości myślenia wykazała, że nadmiar lub niedobór jodu u chłopców w większym stopniu wpływa na przebieg procesów intelektualnych w porównaniu z grupą dziewcząt (Zał. 5., poz.: 2.2.2.13.). Nadmiar jodu w organizmie wpływa na funkcjonowanie układu nerwowego, powodując zaburzenia w sferze psycho-emocjonalnej, m.in. zmieniając poziom agresji, frustracji i niepokoju (Zał. 5., poz.: 2.2.2.20.), depresji i niepokoju (Zał. 5., poz.: 2.2.4.21., 2.2.4.53.), samooceny aktywności, nastroju i samopoczucia (Zał. 5., poz.: 2.2.4.22., 2.2.4.31.). 3.2.9. Ocena adaptacyjnych możliwości funkcjonowania układu sercowonaczyniowego osób w różnym przedziale wiekowym Mimo coraz większej pewności specjalistów, co do tego, że zmiana stylu życia na siedzący, przekarmiony i zestresowany sprzyja rozwojowi chorób cywilizacyjnych, wśród

42 których w pierwszej kolejności występują choroby układu krążenia (Kostka i Koziarska- Rościszewska, 2009; Organization for Economic Co-operation and Development (OECD), 2015; GBD 2013 Mortality and Causes of Death Collaborators, 2015; WHO, 2017), zrozumienie wagi tych czynników dla zachowania zdrowia społeczeństwa jest nadal niedostateczne. Najczęściej opisywanym w literaturze aspektem dla wzmocnienia zdrowia populacji jest odpowiednia diagnostyka stanu zdrowia oraz jego jakościowych i ilościowych wskaźników (Oldridge i in., 1988; O'Connor i in., 1989; Schuler i in., 1992; Pyörälä, 1996). Najaktywniej rozwija się kierunek badań medycznych, oparty na ocenie stanu zdrowia według teorii adaptacji (Meerson, 1980; Kozłowski, 1986). Zgodnie z tą teorią, zdrowie jest rozpatrywane jako zdolność organizmu do adaptacji w warunkach środowiska zewnętrznego, natomiast choroba jako wstrząs mechanizmów adaptacyjnych (Singer i Baer, 2007; McElroy i Townsend, 2009). Zwracając uwagę na aktualny stan danej problematyki postawiliśmy sobie za cel ocenić sezonowe zmiany funkcjonowania układu sercowo-naczyniowego (wykorzystując parametry hemodynamiczne) oraz sezonowe adaptacyjne możliwości organizmu dziewcząt i chłopców w różnych przedziałach wiekowych. Nasze badania wykazały, że aklimatyzacja dzieci do zmian temperatury otoczenia występuje w określonych porach roku (wiosną i jesienią). W tych okresach obserwujemy obniżenie poziomu potencjału adaptacyjnego układu sercowonaczyniowego i zwiększenie procentowego ujęcia osób z natężeniem mechanizmów przystosowawczych. Zanotowano obniżenie funkcjonowania układu sercowo-naczyniowego w wyniku sezonowej aklimatyzacji w grupie dziewcząt (Zał. 5., poz.: 2.2.2.9., 2.2.4.18., 2.2.4.19.). Wyższy poziom adaptacyjnych możliwości organizmu wyznacza lepszy poziom wydolności fizycznej osób (Zał. 5., poz.: 2.2.2.14., 2.2.2.28., 2.2.4.15.). Parametry wydajności funkcjonowania układu sercowo-naczyniowego również wykorzystaliśmy w ocenie wpływu masażu refleksologicznego stóp u kobiet i mężczyzn rożnego wieku. Pozytywne oddziaływanie zabiegów masażu stóp spowodowało zmniejszenie liczby kobiet z niskim poziomem i zwiększenie liczby mężczyzn z wysokim i powyżej normy funkcjonowaniem układu sercowo-naczyniowego po ostatnim zabiegu. Wysokie wartości wskaźnika efektywności krwiobiegu świadczą o podwyższeniu wydajności układu sercowonaczyniowego po zabiegach masażu refleksologicznego stóp (Zał. 5., poz.: 2.2.2.23., 2.2.2.25., 2.3.126., 2.3.136., 2.3.283.). Wyniki przeprowadzonych badań dotyczące omówionej tematyki były opublikowane w formie oryginalnych prac naukowych (Zał. 5., poz.: 2.2.1.24., 2.2.1.26., 2.2.1.37., 2.2.1.44. 2.2.1.46., 2.2.3.62., 2.2.3.66., 2.2.3.70., 2.2.3.74., 2.2.3.81. 2.2.3.84., 2.2.4.47., 2.2.4.55.) oraz

43 materiałów konferencyjnych (Zał. 5., poz.: 2.3.29. 2.3.31., 2.3.33. 2.3.36., 2.3.49., 2.3.50., 2.3.134., 2.3.143., 2.3.146., 2.3.177., 2.3.180., 2.3.207.). 4. ZESTAWIENIE CAŁEGO DOROBKU NAUKOWO-BADAWCZEGO Efektem mojej działalności naukowej jest dorobek publikacyjny obejmujący 667 pozycji (Tab. 1 i 2), w tym opublikowane oryginalne prace naukowe (Zał. 5., poz.: 1; 2.1; 2.2; 2.3.; 3.1., 3.2.), komunikaty i doniesienia naukowe (Zał. 5., poz.: 2.3., 3.3.), prace popularno-naukowe (Zał. 5., poz.: 2.5.), słowniki (Zał. 5., poz.: 2.4.) oraz raporty (Zał. 5., poz.: 2.6.). Oryginalne prace naukowe zostały opublikowane również w języku angielskim, w tym w tytułach obecnie umieszczonych w bazie Journal Citation Reports. Ponadto, w redakcjach czasopism o zasięgu międzynarodowym złożone są 3 manuskrypty, których jestem współautorką, a część zgromadzonych przeze mnie wyników badań jest w trakcie opracowywania. Prace naukowe, których jestem współautorką opublikowane zostały (lub są przyjęte do druku) w wydawnictwach: zagranicznych i krajowych publikujących w języku angielskim (baza Journal Citation Reports): Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy (Journal of Veterinary Research) (7), Polish Journal of Veterinary Sciences (1), Fish Physiology and Biochemistry (2), Aquaculture Research (1), Polish Journal of Food And Nutrition Sciences (1), Central European Journal of Biology (Open Life Sciences) (1), Archives of Environmental Contamination and Toxicology (1), Environmental Research (1), Polish Journal of Environmental Studies (1), Journal of Environmental Monitoring (1), Annals of Clinical & Laboratory Science (1), Ecological Research (1), Journal of Equine Veterinary Science (2), Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences (1), Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berl.) (1); zagranicznych i krajowych publikujących w języku angielskim (spoza bazy Journal Citation Reports): Medical and Biological Sciences (1), Baltic Coastal Zone (10), Archives of Polish Fisheries (6), Ecological Questions (1), Słupskie Prace Biologiczne (28), Natural Almanac, Series: Biological Sciences (2), Scientific and Technical Bulletin of Institute of Animal Husbandry, National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine (4), Scientific Journal of «Kaliningrad State Technical University» (7), First independent scientific journal (1), Scientific Medical Bulletin (1), Agricultural Science and Practice (1), Trudy of Russian Research Institute of Fisheries and Oceanography (VNIRO) (6), Agroecological Journal (1), Plant introduction (1), Scientific Journal of the Far Eastern State Technical Fisheries University (4), Agrobiodiversity for improving nutrition, health and life quality (4), Bulletin

44 of the Taras Shevchenko National University of Kyiv (Introduction and Conservation of Plant Diversity) (1), Multidisciplinary scientific and practical journal "Territory of Science" (1); krajowych publikujących w języku polskim: Słupskie Prace Biologiczne (34), Parki Narodowe i Rezerwaty Przyrody (1), Komunikaty Rybackie (2); zagranicznych publikujących w języku rosyjskim i ukraińskim: Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine (Doklady Akademii Nauk Ukrainy) (3), Scientific Notes of the V.I. Vernadsky Tavrida National University, Series: Biology (1), Visnyk of Lviv National University. Series: Biology (8), Problems of Ecological and Medical Genetics and Clinical Immunology (2), Medical Chemistry (2), Scientific Journal of the Uzhgorod National University, Series: Biology (1), Ukrainian Biochemistry Journal (4), Clinical and Experimental Pathology (2), Problems of radiation medicine and radiobiology (1), Bulletin of the Kiev National University named after T.G. Shevchenko, Series Biology (1), Experimental and Clinical Physiology and Biochemistry (2), Practical Medicine (13), Biomedical chemistry (1), Environment & Health (1), Hygiene of settlements (7), Scientific Herald of the O.O. Bogomolets National Medical University (3), Problems of Ecology and Medicine (1), Acta Medica Leopoliensia (2), Scientific and Technical Bulletin of State Scientific-Research Control Institute of Veterinary Medicinal Products and Feed Additives and the Institute of Animal Biology of the National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine (1), Natural Almanac, Series: Biological Sciences (1), Animal Biology (4), Bulletin of Dnipropetrovsk University. Biology. Ecology (1), Scientific and Technical Bulletin of Institute of Animal Husbandry, National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine (2), Scientific Journal of V.N. Karazin Kharkov National University. Series: Biology (1), Scientific Journal of «Kaliningrad State Technical University» (2), Scientific Medical Bulletin (5), Modern problems of hygiene, radiation and environmental medicine (1), Plant introduction (1), Scientific Journal of the Far Eastern State Technical Fisheries University (4); Tabela 1. Zestawienie dotychczasowego dorobku naukowego Rodzaj publikacji Przed Po doktoratem doktoracie Język (A angielski, P polski, R rosyjski, U ukraiński) Łącznie Czasopisma z bazy JCR A - 23 23 Czasopisma A - 81 81 recenzowane spoza P - 37 37 JCR R+U 23 54 77 Rozdziały monografii A - 24 24 P - 32 32

45 Recenzowane materiały konferencyjne, komunikaty i doniesienia naukowe Prace popularnonaukowe R+U 2-2 A 8 161 169 P - 48 48 R+U 43 114 157 P - 1 1 Raporty A 2 4 6 P - 3 3 U 3 5 8 Słowniki A, P, U - 1 1 Łącznie 81 588 669 Tabela 2. Zestawienie dorobku publikacyjnego z uwzględnieniem oceny punktowej czasopism wg listy MNiSW Lp. Nazwa czasopisma Liczb a publi kacji 1. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy (Journal of Veterinary Research) IF a) IF 2016 IF5 b) Punkty MNiSW c Czasopisma z bazy JCR 7 0,402 2006 0,462 2016 0,419 2006 0,273 2007 0,241 2007 0,218 2009 0,306 2009 0,414 2011 0,463 2011 0,462 2016 0,419 2016 ) 10 2006 15 2007 15 2009 20 2011 15 2016 Punkt y MNiS W d) Suma punkt ów MNiS W e) Suma punkt ów MNiS Wf ) 15 2016 100 105 2. Polish Journal of Food 1-1,276 2016-6 2007 15 2016 6 15 And Nutrition Sciences 3. Fish Physiology and 2 1,622 2014 1,647 2016 1,791 2014 20 2014 20 2016 40 40 Biochemistry 1,647 2016 1,859 2016 4. Aquaculture Research 1 1,606 2015 1,461 2016 1,745 2015 25 2015 30 2016 25 30 1,635 2016 5. Polish Journal of 1 0,565 2011 0,697 2016 0,576 2011 20 2011 20 2016 20 20 Veterinary Sciences 0,773 2016 6. Central European 1-0,448 2016 0,483 2016-20 - 20 Journal of Biology (Open Life Sciences) 7. Archives of 1 1,743 2009 2,467 2016 2,120 2009 20 2009 25 2016 20 25 Environmental Contamination and Toxicology 2,323 2016 8. Environmental 1 3,237 2009 3,835 2016 3,326 2009 24 2009 45 2016 24 45 Research 4,315 2016 9. Polish Journal of 1 0,508 2011 0,793 2016 0,808 2011 15 2011 15 2016 15 15 Environmental Studies 0,961 2016 10. Journal of Environmental Monitoring 1 2,085 2012 2,592 2016 2,137 2012 2,137 2014 25 2012 30 2016 25 30

46 11. Annals of Clinical & 1 0,839 2013 0,727 2016 1,117 2013 20 2013 20 2016 20 20 Laboratory Science 0,933 2016 12. Ecological Research 1 1,513 2013 1,283 2016 1,802 2013 20 2013 20 2016 20 20 1,623 2016 13. Journal of Equine 2 0,871 2014 0,882 2016 0,935 2014 25 2014 20 2016 45 40 Veterinary Science 0,882 2016 0,993 2016 20 2016 14. Turkish Journal of 1 0,566 2014 0,484 2016 0,711 2014 15 2014 15 2016 15 15 Fisheries and Aquatic Sciences 0,645 2016 15. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berl.) 1 1,244 2016 1,244 2016 1,422 2016 30 2016 30 2016 30 30 Łącznie 23 21,561 25,599 24,511 25,887 2016 405 470 16. Medical and Biological Sciences Czasopisma spoza bazy JCR 1 - - - - 7 2016-7 17. Baltic Coastal Zone 10 - - - 4 2009 18. Archives of Polish Fisheries 5 2011 11 2015 11 2016 6 - - - 9 2010 9 2011 8 2013 8 2014 12 2016 11 2016 97 110 12 2016 58 72 19. Ecological Questions 1 - - - 6 2013 13 2016 6 13 20. Słupskie Prace Biologiczne 62 - - - 1 2007-2014 7 2015-2016 7 2016 266 434 21. Komunikaty Rybackie 2 - - - 5 2015-2016 5 2016 10 10 22. Parki Narodowe i 1 - - - 3 2014 5 2016 3 5 Rezerwaty Przyrody 23. Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine (Doklady Akademii Nauk Ukrainy) 2 - - - 6 2006-12 - Łącznie 85 - - - 452 651 Inne 24. Rozdziały monografii w 24 - - - 5 5 120 120 języku angielskim 25. Rozdziały monografii w 32 - - - 4 4 128 128 języku polskim 26. Artykuły w 35 - - - - 0 0 0 czasopismach recenzowanych spoza listy MNiSW w języku angielskim 27. Artykuły w czasopismach recenzowanych spoza listy MNiSW w języku 77 - - - - 0 0 0

47 rosyjskim i ukraińskim 28. Recenzowane materiały 169 - - - 0 0 0 0 konferencyjne, komunikaty i doniesienia naukowe w języku angielskim 29. Recenzowane materiały 48 - - - 0 0 0 0 konferencyjne, komunikaty i doniesienia naukowe w języku polskim 30. Recenzowane materiały 157 - - - 0 0 0 0 konferencyjne, komunikaty i doniesienia naukowe w języku rosyjskim i ukraińskim 31. Prace popularnonaukowe 1 - - - 0 0 0 0 32. Raporty 17 - - - 0 0 0 0 33. Słowniki 1 - - - 0 0 0 0 Łącznie 561 - - - 248 248 Suma 669 21,561 25,599 24,511 25,887 2016 1105 1369 a) sumaryczny Impact Factor (IF) wg bazy Journal Citation Reports (JCR) zgodny z rokiem ukazania się pracy; b) 5-letni Impact Factor (IF) wg bazy Journal Citation Reports (JCR) zgodny z rokiem ukazania się pracy; c) liczba punktów wg wykazu czasopism naukowych MNiSW zgodny z rokiem ukazania się pracy wraz z pracami, nie ujętymi w tym wykazie, lecz z punktacją przedstawioną według ostatniego wykazu na którym tytuł, w którym ukazała się praca, został ujęty; d) liczba punktów wg wykazu czasopism naukowych MNiSW (z dnia 21.03.2018); e) suma punktów wg wykazu czasopism naukowych MNiSW zgodny z rokiem ukazania się pracy; f) suma punktów wg wykazu czasopism naukowych MNiSW (z dnia 21.03.2018). Wyniki moich badań prezentowane były również w formie referatów lub prezentacji posterowych na konferencjach o zasięgu międzynarodowym (Zał. 5., poz.: 5.1.) i krajowym (Zał. 5., poz.: 5.2.). Jestem również autorką 15 recenzji artykułów do czasopism krajowych i międzynarodowych: Fish Physiology and Biochemistry (1), Aquacultural Engineering (1), Archives of Industrial Hygiene and Toxicology (1), African Journal of Biotechnology (1), Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology (1), Journal of Food Biochemistry (1), Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences (1), Journal of Aquatic Animal Health (1), Journal of Complementary and Alternative Medical Research (1), Drug and Chemical Toxicology (1), Archives of Polish Fisheries (2), Komunikaty Rybackie (1), Trudy VNIRO (2) oraz 1 rozdziału monografii Tench2013 (Zał. 5., poz.: 10.3.). W okresie przed uzyskaniem stopnia doktora na mój dorobek składało się łącznie 81 prac, w tym 1 monografia, 23 artykuły naukowe i 1 rozdział monografii, 51 komunikatów i doniesień naukowych oraz 5 raportów (Zał. 5., poz.: 3.1., 3.2., 3.3.). Po uzyskaniu stopnia

48 doktora mój dorobek powiększył się o kolejne publikacje, w tym 195 artykułów naukowych, 56 rozdziałów monografii, 323 komunikatów i doniesień naukowych, oraz 12 raportów (Zał. 5., poz.:1., 2.). Prace naukowe, których jestem autorką lub współautorką, cytowane były zarówno w czasopismach z bazy Web of Science (Zał. 5., poz.: 4.1.), Scopus (Zał. 5., poz.: 4.2.), Google Scholar (Zał. 5., poz.: 4.3.) czy książkach (Zał. 5., poz.: 4.4.). Liczba cytowań moich prac naukowych wg bazy Web of Science wynosi 72 (bez autocytowań 59), a indeks Hirscha (h-index) 5. Liczba cytowań moich prac naukowych wg bazy Scopus wynosi 87, a indeks Hirscha (h-index) 5. Liczba cytowań moich prac naukowych wg bazy Google Scholar wynosi 290, a indeks Hirscha (h-index) 9. Łączna liczba punktów zgodnie z obecnie obowiązującą listą MNiSW wynosi 1105 (zgodnie z rokiem ukazania się publikacji) i 1369 (zgodnie z rokiem 2016). Sumaryczny Impact Factor według listy JCR wynosi 21,561 (zgodnie z rokiem ukazania się publikacji) i 25,599 (zgodnie z rokiem 2016) (sumaryczny aktualny pięcioletni IF 25,887). Prowadzone przeze mnie badania realizowane były w ramach 13 projektów badawczych finansowanych ze środków budżetowych. Brałam udział w dwóch grantach Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego Ukrainy i jednego grantu Ministerstwa Zdrowia Ukrainy jako wykonawca (Zał. 5., poz.: 6.1.). Byłam kierownikiem 3 projektów realizowanych ze środków MNiSW w ramach badań własnych oraz wykonawcą 1 projektu (zadanie wieloletnie) w ramach działalności statutowej Akademii Pomorskiej w Słupsku (Zał. 5., poz.: 6.2.). Realizowałam również granty dla młodych naukowców, przyznane mi przez West Ukrainian BioMedical Research Center (Los Angeles, USA) (Zał. 5., poz.: 6.3.). Zaangażowanie w realizację powyższych projektów badawczych zaowocowało opublikowanymi w czasopismach o zasięgu międzynarodowym i krajowym oryginalnymi pracami naukowymi, jak również jest przedmiotem dalszych opracowań, które będą w przyszłości publikowane. Systematycznie podnoszę swoje kwalifikacje uczestnicząc w różnych formach szkoleń (warsztaty szkoleniowe, kursy, konferencje szkoleniowe, staże) (Zał. 5., poz.: 8.) oraz biorąc udział w przygotowaniu projektów finansujących poprawę funkcjonowania uczelni (Zał. 5., poz.: 6.5.). Brałam udział w warsztatach tarliskowych poświęconych badaniu naturalnego tarła troci wędrownej i łososia atlantyckiego oraz w warsztatach szkoleniowych dotyczących chwytania i obrączkowania ptaków w celach naukowych. Uczestniczyłam w kursie w zakresie immunodetekcji białek (Politechnika Gdańska). Byłam słuchaczką szkoleń Jak z sukcesem przygotować wniosek o grant,,,web of Knowledge, kursu statystyki (Zał. 5., poz.: 8.). Pracując jako asystent w Katedrze Higieny i Toksykologii Wydziału Lekarskiego (Lwowski Narodowy Uniwersytet Medyczny im. Daniela Halickiego) odbyłam międzynarodowe staże naukowe w

49 ramach grantów naukowych Polskiego Komitetu do spraw UNESCO oraz w ramach współpracy międzynarodowej (Zał. 5., poz.: 7.1.). W latach 2015-2018 byłam opiekunem naukowym sześciu staży międzynarodowych w ramach grantów naukowych Polskiego Komitetu do spraw UNESCO i International Visegrad Fund (Zał. 5., poz.: 7.2.). Czynnie uczestniczyłam również w organizacji międzynarodowych konferencji naukowych (Zał. 5., poz.: 5.3.). Ponadto brałam udział w podpisaniu 14 umów o współpracy międzynarodowej w dziedzinie biologii i ochrony środowiska (Zał. 5., poz.: 11.). Zdobyte doświadczenia i kwalifikacje naukowe wykorzystuję z dużym powodzeniem w dydaktyce. Moja długoletnia działalność dydaktyczna obejmuje kształcenie studentów studiów stacjonarnych i niestacjonarnych przede wszystkim dla kierunków Biologia (Wydział Biologiczny Lwowskiego Uniwersytetu Narodowego im. Iwana Franki), Medycyna (Wydział Lekarski Lwowskiego Narodowego Uniwersytetu Medycznego im. Daniela Halickiego), Biologia, Kosmetologia i Ochrona Środowiska (Akademia Pomorska w Słupsku, Instytut Biologii i Ochrony Środowiska) (Zał. 6., poz.: 1.1.). Prowadziłam również zajęcia w ramach współpracy dydaktycznej dla studentów w ramach wymiany semestralnej oraz wymiany Erasmus+ (Akademia Pomorska w Słupsku, Instytut Biologii i Ochrony Środowiska). Łącznie, w latach 2001-2017 przygotowałam i wygłosiłam około 8300 godzin wykładów z ponad 25 przedmiotów (Zał. 6., poz.: 1.1.). Oprócz zajęć dydaktycznych, realizowałam opiekę naukową nad studentami w ramach działalności Koła Naukowego Fizjologów Zwierząt Oxygen. Zaangażowanie w realizację pracy naukowej ze studentami zaowocowało opublikowanymi w czasopismach o zasięgu międzynarodowym i krajowym oryginalnymi pracami naukowymi (Zał. 6., poz.: 2.4.1., 2.4.2.), jak również zdobyciem Stypendiów Ministra Nauki i Szkolnictwa Wyższego, Marszałka Województwa Pomorskiego i Rektora Akademii Pomorskiej w Słupsku (Zał. 6., poz.: 2.4.4., 2.4.5., 2.4.6.) oraz przygotowaniem projektów finansujących poprawę funkcjonowania uczelni (Zał. 6., poz.: 2.4.3.). Byłam promotorem 55 prac licencjackich i magisterskich (Zał. 6., poz.: 2.1.) oraz opiekunem naukowym 6 prac dyplomowych na studiach podyplomowych (Zał. 6., poz.: 2.2.). Recenzowałam 44 prace (Zał. 6., poz.: 2.3.). Realizowane pod moim kierunkiem badania naukowe pozwalają moim podopiecznym rozwijać swoje zainteresowania naukowe i następnie przenieść je na umiejętności w zakresie popularyzacji nauki (Zał. 6., poz.: 1.3.). Efektem tej współpracy jest 64 współautorskich publikacji naukowych (Zał. 6., poz.: 2.4.1.) oraz 91 komunikatów naukowych powstałych przy udziale studentów (Zał. 6., poz.: 2.4.2.). Brałam również udział w kształceniu kadry naukowej. Rezultatem mojej aktywności jako promotora pomocniczego była obrona pracy doktorskiej mgr Katarzyny Pałczyńskiej-Guguły

50 pt. Kształtowanie się mechanizmów reakcji antyoksydacyjnych oraz wybranych parametrów biochemicznych w różnych stadiach rozwojowych troci wędrownej (Salmo trutta m. trutta L.) w Instytucie Biologii i Ochrony Środowiska Akademii Pomorskiej w Słupsku (Zał. 5., poz.: 9.). Moim osiągnięciem jest również działalność związana z popularyzacją nauki. W tym obszarze byłam organizatorką lub współorganizatorką różnego rodzaju spotkań czy imprez (Bałtycki Festiwal Nauki, Noc Biologów, Uniwersytet Trzeciego Wieku, Uniwersytet Dziecięcy, Pomorski Festiwal Nauki) skierowanych do odbiorców w różnym wieku i z różnych środowisk. W ramach tych spotkań przygotowywałam wykłady, seminaria, prezentacje multimedialne, doświadczenia laboratoryjne, warsztaty terenowe oraz różnego rodzaju pomoce naukowe (Zał. 6., poz.: 1.3.). Prowadzę również aktywną działalność organizacyjną na rzecz Uczelni. W latach 2009-2017 pełniłam funkcję uczelnianego koordynatora wyjazdów studenckich oraz wymian semestralnych w ramach współpracy międzynarodowej, koordynatora wymian semestralnych studentów i wykładowców oraz opiekuna praktyk zawodowych studentów kierunków Biologia i Ochrona środowiska (Akademia Pomorska w Słupsku, Instytut Biologii i Ochrony Środowiska) (Zał. 6., poz.: 2.5., 2.6.). W latach 2009-2017 zorganizowałam i podpisałam 14 umów o współpracy z jednostkami zewnętrznymi (Zał. 6., poz.: 3.1.). Moja działalność organizacyjna jako wolontariusza została doceniona przez Prezydenta Miasta Słupska w 2011 r. W roku 2012 i 2016 otrzymałam nagrodę Rektora Akademii Pomorskiej w Słupsku za aktywność naukową (Zał. 5., poz.: 12.). Moje plany badawcze są ściśle związane z kontynuacją badań nad zastosowaniem wyciągów z wybranych gatunków roślin tropikalnych i subtropikalnych w celach profilaktycznych i terapeutycznych w medycynie, weterynarii oraz akwakulturze. Ponadto kontynuuję badania nad reakcją fizjologiczną ryb łososiowatych na działanie immunomodulatorów i finalizuję prace nad zastosowaniem ekologicznych sorbentów w badaniach ekotoksykologicznych.