(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2009/40 EP B1 (13) T3 (51) Int. Cl. C07D487/02 A61P35/00 A61K31/519 A61P29/00 ( ) ( ) ( ) ( ) (54) Tytuł wynalazku: Związki i kompozycje jako inhibitory kinazy białkowej (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2008/28 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 03/2010 (73) Uprawniony z patentu: IRM LLC, Hamilton, BM THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE, La Jolla, US PL/EP T3 (72) Twórca (y) wynalazku: NAGLE Advait, San Diego, US GRAY Nathanael S., Boston, US (74) Pełnomocnik: Jan Wierzchoń&Partnerzy Biuro Patentów i Znaków Towarowych Sp.j. rzecz. pat. Twardowska Aleksandra Warszawa skr. poczt. 709 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 10399/AT EP B1 Związki i kompozycje jako inhibitory kinazy białkowej TŁO WYNALAZKU Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek ujawnia nową klasę związków, kompozycje farmaceutyczne zawierające takie związki oraz sposoby wykorzystania takich związków w leczeniu lub zapobieganiu chorobom lub zaburzeniom związanym z nieprawidłową lub niewłaściwie regulowaną aktywnością kinaz, w szczególności chorobom lub zaburzeniom związanym z nieprawidłową aktywacją kinaz Abl, Hcr-A,bl, Aurorn-A, Ax1, BMX, CHK2, c-raf, csrc, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IR, lnk2α2, Lck, Met, MKK6, MST2, p70s6k, PDGFRα, PKA, PKD2, ROCK-II, Ros, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SAPK4, Syk, Tie2 i TrkB. Tło [0002] Kinazy białkowe stanowią dużą rodzinę białek mających podstawowe znaczenie w regulowaniu wielu różnorodnych procesów komórkowych i zachowywaniu kontroli czynności komórki. Częściowa, nieograniczająca lista takich kinaz obejmuje: receptorowe kinazy tyrozynowe, takie jak kinaza receptorowa płytkowego czynnika wzrostu (PDGF-R), receptora czynnika wzrostu nerwów, trkb, Met oraz receptora czynnika wzrostu fibroblastów, FGFR3; niereceptorowe kinazy tyrozynowe, takie jak Abl oraz kinaza fuzyjna BCR-Abl, Lck, Csk, Fes, Bmx i c-src, a także kinazy serynowo-treoninowe, takie jak b-raf, c-raf, sgk, kinazy MAP (np. MKK4, MKK6 itd.) oraz SAPK2α, SAPK2β i SAPK3. Nieprawidłową aktywność kinaz stwierdzono w wielu stanach chorobowych, w tym w przypadku łagodnych i złośliwych zaburzeń rozrostowych, a także chorób wynikających z nieprawidłowej aktywacji układów odpornościowego i nerwowego. [0003] Nowe związki według niniejszego wynalazku powodują hamowanie aktywności jednej lub większej liczby kinaz białkowych i dlatego oczekuje się, że będą użyteczne w leczeniu chorób związanych z kinazami. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0004] Jeden aspekt niniejszego wynalazku dostarcza związki o wzorze I: [0005] w którym: [0006] Y jest wybrany z N i CH; [0007] R 1 jest wybrany z atomu wodoru i grupy C 1-6 alkilowej; [0008] R 2 jest wybrany z atomu wodoru i grupy C 1-6 alkilowej; lub R 1 i R 2, wraz z pierścieniem fenylowym, do którego R 1 i R 2 są dołączone, tworzą grupę C 6-10 arylową lub C 5-10 heteroarylową; [0009] R 3 jest wybrany z NR 4 R 5 i X 1 R 5 ; przy czym X 1 jest wybrany z wiązania i grupy C 1-4 alkilenowej; R 4 jest wybrany z atomu wodoru i grupy C 1-6 alkilowej; R 5 jest wybrany z grupy C 6-10 arylowej ewentualnie podstawionej 1 do 3 grupami wybranymi niezależnie spośród podstawionej halogenem grupy C 1-6 alkilowej, C 1-6 alkoksylowej, C 5-10 heteroarylo-c 0-4alkilowej i C 3-8 heterocykloalkilowo-c 0-4 alkilowej, przy czym wspomniane podstawniki heteroarylowe i heterocykloalkilowe R 5 są ewentualnie podstawione grupą C 1-6 alkilową, a także ich pojedyncze stereoizomery i mieszaniny stereoizomerów, a także dopuszczalne farmaceutycznie sole i solwaty (np. hydraty) takich związków. [0010] W drugim aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję farmaceutyczną zawierającą związek zdefiniowany powyżej lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól w mieszaninie z jedną lub większą liczbą odpowiednich substancji pomocniczych. [0011] W trzecim aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza związki o wzorze I do zastosowania w sposobie leczenia choroby u zwierzęcia, u którego zahamowanie aktywności kinazy, w szczególności aktywności Abl, Bcr-Abl, Aurora-A, Ax1, BMX, CHK2, c-raf, csrc, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IR, JNK2α2, Lck, Met, MKK6, MST2, p70s6f, PDGFRα, PKA, PKD2, ROCK-II, Ros, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SAPK4, Syk, Tie2 i/lub TrkB, może zapobiec, zahamować lub polepszyć patologię i/lub symptomatologię tych chorób. [0012] W czwartym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza zastosowanie związku o wzorze I do wytwarzania leku stosowanego w leczeniu choroby u zwierzęcia, u którego aktywność kinazy, w szczególności aktywność Abl, Bcr-Abl, Aurora-A, Ax1, BMX, CHK2, c-raf, csrc, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IR, INK2α2, Lck, Met, MKK6, MST2, p70s6k, PDGFRα, PKA, PKD2, ROCK-II, Ros, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SAPK4, Syk, i/lub TrkB, przyczynia się do patologii i/lub symptomów takiej choroby. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU Definicje [0013] Aryl" jako grupa oraz jako element strukturalny innych grup, na przykład podstawionych halogenem grup alkilowych i alkoksylowych, może być prostołańcuchowy lub rozgałęziony. Grupa C 1-4 -alkoksylowa obejmuje grupy metoksylowe, etoksylowe i podobne. Podstawiona halogenem grupa alkilowa obejmuje grupy trifluorometylowe, pentafluoroetylowe i podobne.

3 2 [0014] Aryl" oznacza monocykliczne lub sprzężone bicykliczne pierścieniowe ugrupowania aromatyczne zawierające sześć do dziesięciu atomów węgla w pierścieniu. Na przykład arylem może być grupa fenylowa lub naftylowa, korzystnie fenylowa. Arylen oznacza rodnik dwuwartościowy wywodzący się z grupy arylowej. [0015] Heteroaryl" definiuje się jak aryl powyżej, przy czym jeden lub więcej atomów w pierścieniu stanowi heteroatom. Na przykład grupami heteroarylowymi są pirydyl, indolil, indazolil, chinoksalinyl, chinolinyl benzofuranyl, benzopiranyl, benzotiopiranol, benzo[1,3]dioksol, imidazolil, benzoimidazolil, pirymidynyl, furanyl, oksazolil, izoksazolil, triazolil, tetrazolil, pirazolil, tienyl itd. [0016] Cykloalkil" oznacza ugrupowanie pierścieniowe nasycone lub częściowo nasycone, monocykliczne, sprzężone bicykliczne lub mostkowe policykliczne zawierające podaną liczbę atomów w pierścieniu. Na przykład grupami C 3-10cykloaklilowymi są cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cykloheksyl itd. [0017] Heterocykloalkil" oznacza cykloalkil jak zdefiniowano w niniejszym zgłoszeniu, przy czym jeden lub większą liczbę podanych atomów z pierścienia zastąpiono ugrupowaniem wybranym z -O-, -N=, -NR-, -C(O)-, -S-, -S(O)- lub - S(O) 2 -, przy czym R jest atomem wodoru, grupą C- 1-4 alkilową lub grupą blokującą atom azotu. Na przykład określenie grupa C 3-8 heterocykloalkilowa stosowane w niniejszym zgłoszeniu opisuje związki według wynalazku obejmujące morfolino, pirolidynylo, pirolidynyl-2-on, piperazynyl, piperydynyl, piperydynylon, 1,4-dioksa-8-aza-spiro[4.5]dec-8-yl itd. [0018] Halogen" (lub halo) oznacza korzystnie chloro lub fluoro, ale także bromo lub jodo. [0019] Panel kinaz" to lista kinaz obejmująca Abl(ludzka), Abl(T315l), JAK2, JAK3, ALK, JNKIαl, ALK4, KDR, Aurora-A, Lck, Blk, MAPK1, Bmx, MAPKAP-K2, BRK, MEK1, CaMKII(szczurza), Met, CDKI/cyklinaB, p70s6k, CHK2, PAK2, CKI, PDGFRα, CK2, PDK1, c-kit, Pim-2, c-raf, PKA(h), CSK, PKBα, csrc, PKCα, DYRK2, Plk3, EGFR, ROCK-I, Fes, Ron, FGFR3, Ros, Flt3, SAPK2α, Fms, SGK, Fyn, SIK, GSK3β, Syk, IGF-1R, Tie-2, IKK8, TrKB, IR, WNK3, IRAK4, ZAP-70, ITK, AMPK(szczurza), LIMK1, Rsk2, Axl, LKB1, SAPK2β, BrSK2, Lyn (h), SAPK3, BTK, MAPKAP-K3, SAPK4, CaMKIV, MARK1, Snk, CDK2/cyklinaA, MINK, SRPK1, CDK3/cyklinaE, MKK4(m), TAK1, CDK5/p25, MKK6(h), TBK1, CDK6/cyklinaD3, MLCK, TrkA, CDK7/cyklinaH/MATI; MRCKβ, TSSK1, CHK1, MSK1, Yes, CK1d, MST2, ZIPK, c-kit (D816V), MuSK, DAPK2, NEK2, DDR2, NEK6, DMPK, PAK4, DRAK1, PAR-1Bα, EphA1, PDGFRβ, EphA2, Pim-1, EphA5, PKBβ, EphB2, PKCβI, EphB4, PKCδ, FGFR1, PKCη, FGFR2, PKCθ, FGFR4, PKD2, Fgr, PKG1β, Flt1, PRK2, Hck, PYK2, HIPK2, Ret, IKKα, RIPK2, IRR, ROCK-ll(ludzka), JNK2a2, Rse, JNK3, Rskl(h), PI3 Ky, PI3 Kδ i PI3-Kβ. Związki według niniejszego wynalazku bada się przesiewowo zgodnie z panelem kinaz (typu dzikiego lub ich mutacji) na hamowanie aktywności co najmniej jednego z elementów panelu. [0020] Formy zmutowane BCR-Abl" to pojedyncze lub wielokrotne zmiany aminokwasów w porównaniu z sekwencją typu dzikiego. Mutacje BCR-ABL mają działanie polegające na częstszym zakłócaniu najważniejszych punktów kontaktu między białkiem a inhibitorem (na przykład Gleevec i podobne) poprzez powodowanie przejścia od stanu nieaktywnego do aktywnego, czyli do konformacji, w której nie może dojść do związania BCR-ABL i leku Gleevec. Na podstawie analiz próbek klinicznych wiadomo, że różnorodność stwierdzanych mutacji związanych z fenotypem opornym powoli, ale nieuchronnie wzrasta z upływem czasu. Wydaje się, że mutacje skupiają się w czterech głównych regionach. Jedna grupa mutacji (G250E, Q252R, Y253F/H, E255K/V) obejmuje aminokwasy tworzące pętlę wiążącą fosforan z ATP (określaną także jako pętla P). Druga grupa (V289A, F311L, T315I,F317L) występuje w miejscu wiązania leku Gleevec; oddziałuje ona bezpośrednio z inhibitorem poprzez wiązania wodorowe lub oddziaływania van der Waalsa. Trzecia grupa mutacji (M351T, E355G) skupia się w bliskim otoczeniu domeny katalitycznej. Czwarta grupa mutacji (H396R/P) jest zlokalizowana w pętli aktywacji, której konformacja stanowi przełącznik molekularny kontrolujący aktywację i inaktywację kinazy. Mutacje punktowe BCR-ABL związane z opornością na lek Gleevec wykryte u pacjentów z przewlekłą białaczką szpikową (CML) oraz ostrą białaczką limfoblastyczną (ALL) obejmują: M224V, L248V, G250E, G250R, Q252R, Q252H, Y253H, Y253F, E255K, E255V, D276G, T277A, V289A, F311L, T315I, T315N, F317L, M343T, M315T, E355G, F359V, F359A, V379I, F382L, L387M, L387F, H396P, H396R, A397P, S417Y, E459K oraz F486S (pozycje aminokwasów oznaczane kodem jednoliterowym są zgodne z pozycjami w sekwencji dostępnej w GenBank, numer dostępowy AAB60394 i odpowiadają typowi 1a ABL; Martinelli et al., Haematologica/The Hematology Journal, 2005, kwiecień; 90-4). Jeśli w niniejszym wynalazku nie podano inaczej, Bcr-Abl oznacza formy typu dzikiego i zmutowane enzymu. [0021] Zabieg, leczenie oraz metoda leczenia oznaczają sposób łagodzenia lub ograniczania choroby i/lub towarzyszących jej objawów. Opis preferowanych realizacji [0022] Niniejszy wynalazek ujawnia związki, kompozycje i sposoby leczenia choroby związanej z kinazą, w szczególności chorób związanych z kinazą Abl, Bcr-Abl, Aurora-A, Ax1, BMX, CHK2, c-raf, csrc, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IR, JNK2α2, Lck, Met, MKK6, MST2, p70s6k, PDGFRα, PKA, PKD2, ROCK-II, Ros, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SAPK4, Syk, Tie2 i TrkB. Na przykład białaczkę i inne zaburzenia rozrostowe związane z BCR-Abl można leczyć poprzez hamowanie form typu dzikiego i zmutowanych Bcr-Abl. [0023] W jednej realizacji w odniesieniu do związków o wzorze I oba R 1 i R 2 to atomy wodoru. [0024] W innej realizacji R 1 i R 2, wraz z pierścieniem fenylowym, do którego R 1 i R 2 są dołączone, tworzą grupę chinolinylową lub naftalenylową. [0025] W innej realizacji R 3 wybiera się z NHR 5 i X 1 R 5, przy czym X 1 wybiera się z wiązania i grupy metylenowej; R 5 wybiera się z grupy fenylowej ewentualnie podstawionej 1 do 3 grupami wybranymi niezależnie spośród grup trifluorometylowej, metoksylowej, imidazolilowej i piperazynometylowej, przy czym wspomniane podstawniki imidazolilowe lub piperazynylowe R 5 są ewentualnie podstawione grupą metylową i etylową. [0026] Preferowane związki według wynalazku wybiera się spośród następujących: 1-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4- yloksy)-fenylo]-3-(3-trifluorometylo-fenylo)-mocznik; 1-[4-(4-etylopiperazyn-1-ylometylo)-3-trifluorometylo-fenylo]-3-[4- (7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4-yloksy)-fenylo]-mocznik; 1-[3-(4-metylo-imidazol-1-ilo)-5-trifluorometylo-fenylo]-3-[4-(7Hpirolo[2,3-d]pirymidyn-4-yloksy)-fenylo]-mocznik; 1-(3,5-dimetoksy-fenylo)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4-yloksy)- fenylo]-mocznik; 1-[4-(9H-puryn-6-yloksy)-fenylo]-3-(3-trifluorometylo-fenylo)-mocznik; 1-[3-(4-metylo-imidazol-1-ilo)-5- trifluorometylo-fenylo]-3-[4-(9h-puryn-6-yloksy)-fenylo]-mocznik; 1-[4-(4-etylo-piperazyn-1-ylometylo)-3-trifluorometylo-

4 3 fenylo]-3-[4-(9h-puryn-6-yloksy)-fenylo]-mocznik; 1-[5-(7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4-yloksy)-chinolin-8-ylo]-3-(3-trifluorometylo-fenylo)-mocznik; N-[4-(7H-pirolo [2,3-d]pirymidyn-4-yloksy)-fenylo]-2-(3-trifluorometylo-fenylo)-acetamid; 2-[3-(4- metylo-imidazol-1-ilo)-5-trifluorometylo-fenylo]-n-[4-(9h-puryn-6-yloksy)-fenylo]-acetamid; N-[4-(7H-pirolo[2,3- d]pirymidyn-4-yloksy)-fenylo]-3-trifluorometylo-benzamid; 3-(4-metylo-imidazol-1-ilo)-N-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4- yloksy)-fenylo]-5-trifluorometylo-benzamid; N-[4-(9H-puryn-6-yloksy)-fenylo]-3-trifluorometylo-benzamid; 4-(4-etylopiperazyn-1-ylometylo)-N-[4-(9H-puryn-6-yloksy)-fenylo]-3-trifluorometylo-benzamid oraz N-[5-(9H-puryn-6-yloksy)- chinolin-8-ylo]-3-trifluorometylo-benzamid. [0027] Kolejne preferowane związki według wynalazku omówiono szczegółowo w przykładach i tabeli I (patrz niżej). Farmakologia i wykorzystanie [0028] Związki według niniejszego wynalazku modulują aktywność kinaz, dlatego są użyteczne w leczeniu chorób lub zaburzeń, w których kinazy przyczyniają się do patologii i/lub symptomatologii choroby. Przykłady kinaz ulegających hamowaniu przez związki i kompozycje opisywane w dokumencie i przeciwko którym użyteczne są sposoby opisywane w dokumencie obejmują między innymi Abl, Bcr-Abl (formy typu dzikiego i zmutowane), Aurora-A, Axl, BMX, CHK2, c- RAF, csrc, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IR, JNK2a2, Lck, Met, MKK6, MST2, p70s6k, PDGFRα, PKA, PKD2, ROCK-II, Ros, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SAPK4, Syk, Tie2 i TrkB. [0029] Kinaza tyrozynowa Abelsona, czyli Abl, c-abl, bierze udział w regulowaniu cyklu komórkowego, odpowiedzi komórkowej na stres genotoksyczny oraz w przekazywaniu informacji o środowisku komórkowym poprzez przekazywanie sygnału przez integryny. Wydaje się ogólnie, że białko Abl odgrywa złożoną rolę jako moduł komórkowy odpowiedzialny za integrację sygnałów z różnych źródeł zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych, który wpływa na decyzje dotyczące cyklu komórkowego i apoptozy. Do kinaz tyrozynowych Abelsona należą podtypy, takie jak chimeryczne białko fuzyjne (onkoproteina) BCR-Abl z zaburzoną regulacją aktywności kinazy tyrozynowej lub v-abl. BCR-Ab1 ma podstawowe znaczenie w patogenezie 95% przypadków przewlekłej białaczki szpikowej (ang. CML) oraz 10% przypadków ostrej białaczki limfoblastycznej. STI-571 (Gleevec) jest inhibitorem onkogennej kinazy tyrozynowej BCR-Abl i stosuje się go w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej (CML). Niektórzy jednak pacjenci w stadium przełomu limfoblastycznego w CML są odporni na STI-571 wskutek mutacji kinazy BCR-Abl. Dotychczas stwierdzono ponad 22 mutacji, przy czym najczęściej występują G250E, E255V, T315I, F317L i M351T. [0030] Związki według niniejszego wynalazku hamują kinazę abl, w szczególności kinazę v-abl. Związki według niniejszego wynalazku hamują także kinazę BCR-Abl typu dzikiego oraz mutacje kinazy BCR-Abl; w związku z tym nadają się do leczenia nowotworów Bcr-abl-dodatnich oraz chorób nowotworowych, takich jak białaczki (w szczególności przewlekła białaczka szpikowa oraz ostra białaczka limfoblastyczna, w których to przypadkach stwierdza się zwłaszcza apoptotyczne mechanizmy działania), a także wykazują działanie na podgrupę białaczkowych komórek macierzystych oraz potencjał oczyszczania tych komórek in vitro po usunięciu wspomnianych komórek (na przykład usunięciu szpiku kostnego) i ponownym wszczepieniu tych komórek po ich oczyszczeniu z komórek nowotworowych (na przykład ponowne wszczepienie oczyszczonych komórek szpiku kostnego). [0031] Malarię wywołują pasożyty pierwotniaki z rodzaju Plasmodium. Za poszczególne postaci choroby odpowiedzialne są cztery gatunki Plasmodium: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale i Plasmodium malaria. P. falciparum gatunek najbardziej rozpowszechniony i najgroźniejszy może powodować malarię mózgową i zgon, jeśli nie podejmie się leczenia. Aktywność białkowych kinaz tyrozynowych występuje na wszystkich etapach dojrzewania pasożyta P. falciparum, zaś inhibitory kinaz według niniejszego wynalazku można wykorzystywać do leczenia chorób związanych z rodzajem Plasmodium. Inhibitory kinaz tyrozynowych według niniejszego wynalazku, w szczególności inhibitory c-kit, mogą stanowić metodę leczenia chorób związanych z rodzajem Plasmodium poprzez hamowanie rozwoju Plasmodium falciparum. Test in vitro (patrz niżej) wykorzystuje się jako metodę określania aktywności związków według wynalazku przeciwko różnorodnym szczepom pasożyta powodującego malarię. [0032] Szlak przekazywania sygnału Ras-Raf-MEK-ERK pośredniczy w odpowiedzi komórki na sygnały do wzrostu. W ~15% przypadków raka u człowieka następuje mutacja Ras w formę onkogenną. Rodzina Raf należy do serynowotreoninowych kinaz białkowych i obejmuje trzy kinazy: A-Raf, B-Raf i c-raf (lub Raf-1). Zainteresowanie kinazą Raf jako obiektem docelowym dla leków skupia się na związku Raf jako efektorze Ras poniżej w szlaku. Najnowsze dane wskazują jednak, że B-Raf może odgrywać istotną rolę w powstawaniu niektórych guzów, przy czym nie jest konieczna aktywacja allelu Ras (Nature 417, (01 Jul 2002). W szczególności mutacje B-Raf wykryto w znacznym odsetku przypadków czerniaka złośliwego. [0033] Dostępne obecnie metody leczenia czerniaka mają ograniczoną skuteczność, w szczególności w przypadku czerniaka w stadium schyłkowym. Związki według niniejszego wynalazku hamują ponadto procesy komórkowe, w których uczestniczy kinaza b-raf, co stanowi nową możliwość terapeutyczną w przypadku leczenia nowotworów u człowieka, w szczególności czerniaka. [0034] Związki według niniejszego wynalazku hamują ponadto procesy komórkowe, w których uczestniczy kinaza c-raf. Kinaza ta ulega aktywacji przez onkogen ras, który ulega mutacji w wielu przypadkach nowotworów u człowieka. W związku z tym hamowanie aktywności kinazowej c-raf może stanowić sposób zapobiegania wzrostowi guza, w którym pośredniczy ras [Campbell, S. L., Oncogene, 17, 1395 (1998)]. (0036) PDGF (płytkowy czynnik wzrostu) jest bardzo rozpowszechnionym czynnikiem wzrostu odgrywającym istotną rolę w prawidłowym wzroście, ale także w patologicznym namnażaniu komórek, które na przykład występuje w procesie kancerogenezy, a także w chorobach komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, na przykład miażdżycy tętnic i zakrzepicy. Związki według niniejszego wynalazku mogą hamować aktywność receptorów PDGF (PDGFR), w związku z czym nadają się do leczenia chorób nowotworowych, takich jak glejaki, mięsaki, nowotwory prostaty oraz nowotwory jelita grubego, piersi i jajnika. [0035] Związki według niniejszego wynalazku można wykorzystywać nie tylko jako substancje powodujące hamowanie rozwoju nowotworów, na przykład w przypadku raka drobnokomórkowego płuca, ale także jako środki do leczenia niezłośliwych chorób rozrostowych, takich jak miażdżyca tętnic, zakrzepica, łuszczyca, twardzina i zwłóknienie oraz do ochrony komórek macierzystych, na przykład do zmniejszania skutków hemotoksycznych środków

5 4 chemioterapeutycznych, takich jak 5-fluorouracyl, oraz w astmie. Związki według wynalazku można w szczególności wykorzystywać w leczeniu chorób, w których następuje reakcja na hamowanie kinazy receptora PDGF. [0036] Wykazano, że związki według niniejszego wynalazku mają użyteczne działanie w przypadku leczenia zaburzeń wynikających z przeszczepów, na przykład przeszczepów allogenicznych, w szczególności odrzutów tkanki, takich jak w szczególności zarostowe zapalenie oskrzelików (OB), czyli przewlekłe odrzucanie allogenicznych przeszczepów płuc. W przeciwieństwie do pacjentów bez OB u pacjentów, u których OB występuje, występuje podwyższone stężenie PDGF w popłuczynach oskrzelowo-płucnych. [0037] Związki według niniejszego wynalazku są ponadto skuteczne w przypadku chorób związanych z migracją i rozrostem komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, w których znaczenie mają także PDGF i PDGF-R), takich jak nawrót zwężenia oraz miażdżyca tętnic. Działania takie, a także ich konsekwencje dla namnażania lub migracji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro i in vivo, można wykazać za pomocą podawania związków według niniejszego wynalazku, a także poprzez badanie wpływu na zwiększanie grubości błony wewnętrznej naczynia krwionośnego po uszkodzeniu mechanicznym in vivo. [0038] Rodzina receptorów neurotrofinowych trk (trka, trkb, trkc) pomaga w przetrwaniu, wzroście i różnicowaniu tkanki nerwowej i innej niż nerwowa. Białko TrkB ulega ekspresji w komórkach typu neuroendokrynnego w jelicie cienkim i jelicie grubym, w komórkach alfa trzustki, w monocytach i makrofagach węzłów chłonnych oraz w śledzionie, a także w warstwach ziarnistych naskórka (Shibayama i Koizumi, 1996). Ekspresję białka TrkB wiąże się z niekorzystną progresją guzów Wilmsa oraz neuroblastomy. Ponadto TkrB ulega ekspresji w rakowatych komórkach prostaty, ale nie w komórkach prawidłowych. Przekazywanie sygnału receptorów trk poniżej w szlaku obejmuje kaskadę aktywacji MAPK poprzez geny Shc, zaktywowane Ras, ERK-1 i ERK-2, a także szlak przekazywania sygnału PLC-gamma I (Sugimoto et al., 2001). [0039] Kinazy c-src przekazują sygnały onkogenne wielu receptorów. Na przykład nadekspresja EGFR lub BER2/neu w przypadku nowotworów prowadzi do konstytucyjnej aktywacji c-src, która jest charakterystyczna dla komórek nowotworowych, ale nie występuje w komórkach prawidłowych. Z drugiej strony myszy, u których występuje niedobór ekspresji c-crs, stanowią fenotyp marmurowatości kości, co wskazuje na podstawowe znaczenie c-src w czynności osteoklastów i prawdopodobne znaczenie w zaburzeniach powiązanych. [0040] Rodzina kinaz Tec, Bmx, niereceptorowa białkowa kinaza tyrozynowa kontroluje namnażanie wielu komórek nowotworowych naskórka u ssaków. [0041] Wykazano, że receptor czynnika wzrostu fibroblastów 3 wywiera ujemny wpływ regulacyjny na rozwój kości oraz hamowanie namnażania chondrocytów. Dysplazję tanatoforyczną powodują różne mutacje receptora czynnika wzrostu fibroblastów 3, zaś jedna mutacja TDII FGFR3 powoduje konstytucyjną aktywność kinazy tyrozynowej, która aktywuje czynnik transkrypcyjny Stat1 prowadzący do ekspresji inhibitora cyklu komórkowego, zatrzymania wzrostu i nieprawidłowego rozwoju kości (Su et al., Nature, 1997, 386, ). FGFR3 ulega także często ekspresji nowotworach mnogich typu czerniakowego. Inhibitory aktywności FGFR3 są użyteczne w leczeniu chorób zapalnych lub autoimmunologicznych, w których pośredniczą limfocyty T, w tym między innymi reumatoidalnego zapalenia stawów (RA), zapalenia stawów związanego z kolagenem typu II, stwardnienia rozsianego (MS), tocznia rumieniowatego układowego (SLE), łuszczycy, cukrzycy młodzieńczej, zespołu Sjogrena, chorób tarczycy, sarkoidozy, autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej oka, zapalenia jelit (choroby Cohna i wrzodziejącego zapalenia jelita grubego), celiakii oraz miastenii rzekomoporaźnej. [0042] Aktywność kinazy surowiczej i regulowanej przez glukokortykoidy (SGK) jest skorelowana z zaburzeniami aktywności kanałów jonowych, w szczególności kanałów sodowych i/lub potasowych, przy czym związki według niniejszego wynalazku mogą być użyteczne w leczeniu nadciśnienia. [0043] Lin et al. (1997) J. Clin. Invest. 100, 8: i P. Lin (1998) PNAS 95, wykazali hamowanie wzrostu nowotworu i rozwoju naczyń, a także zmniejszenie przerzutów do płuc w przypadku zakażeń adenowirusami lub w przypadku wstrzykiwania domeny zewnątrzkomórkowej Tie-2 (Tek) do modeli przeszczepu obcogatunkowego nowotworu sutka i czerniaka. Inhibitory Tie2 można wykorzystywać w sytuacjach, w których wytwarzanie naczyń odbywa się w sposób niewłaściwy (np. w retinopatii cukrzycowej, przewlekłych procesach zapalnych, łuszczycy, mięsaku Kaposiego, przewlekłej neowaskularyzacji, zwyrodnieniu plamki, reumatoidalnym zapaleniu stawów, dziecięcym naczyniaku krwionośnym i nowotworach). [0044] Lck ma znaczenie w przekazywaniu sygnałów związanych z limfocytami T. U myszy nieposiadających genu Lck występuje niewielka zdolność do wytwarzania tymocytów. Funkcja Lck jako dodatniego aktywatora przekazywania sygnałów związanych z limfocytami T wskazuje, że inhibitory Lck mogą być użyteczne w leczeniu chorób autoimmunologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów. [0045] Podobnie jak inne MAPK, uważa się, że JNK mają znaczenie w pośredniczeniu w odpowiedzi komórkowej na nowotwór, agregację płytek krwi wywoływaną przez trombinę, zaburzenia związane z niedoborem odporności, choroby autoimmunologiczne, śmierć komórki, alergie, osteoporozę i choroby serca. Obiekty docelowe w leczeniu związane z aktywacją szlaku JNK obejmują przewlekłą białaczkę szpikową (CML), reumatoidalne zapalenie stawów, astmę, zapalenie kości i stawów, niedokrwienie, nowotwory oraz choroby neurodegeneracyjne. W związku ze znaczeniem aktywacji JNK powiązanej z chorobami wątroby oraz epizodami niedokrwienia wątroby, związki według niniejszego wynalazku mogą ponadto być użyteczne w leczeniu różnych chorób wątroby. Donoszono także o znaczeniu JNK w chorobach sercowo-naczyniowych, takich jak zawał mięśnia sercowego lub zastoinowa niewydolność serca, ponieważ wykazano, że JNK pośredniczy w procesach przerostowych w odpowiedzi na różne postacie stresu sercowego. Wykazano, że kaskada JNK ma ponadto znaczenie w aktywacji limfocytów T, w tym aktywacji promotora IL-2. W związku z tym inhibitory JNK mogą mieć wartość leczniczą polegającą na zmianie patologicznej odpowiedzi immunologicznej. Wykazano ponadto znaczenie aktywacji JNK w różnych postaciach nowotworów, co wskazuje na możliwość zastosowania inhibitorów JNK w leczeniu nowotworów. Na przykład konstytucyjna aktywacja JNK wiąże się z rozwojem nowotworu, w którym pośredniczy HTLV-1 [Oncogene 13: (1996)]. JNK może odgrywać rolę w przypadku mięsaka Kaposiego (KS). W innych skutkach rozrostowych innych cytokin związanych z rozwojem KS, takich jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), IL-6 i TNFα, także może pośredniczyć JNK. Ponadto regulacja

6 5 genu c-jun w komórkach transformowanych p210 BCR-ABL pokrywa się z aktywnością JNK, co wskazuje na znaczenie inhibitorów JNK w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej (CML) [Blood 92: (1998)]. [0046] Uważa się, że niektóre nieprawidłowe warunki rozrostowe są związane z ekspresją raf, dlatego więc sądzi się, że mogą reagować na hamowanie ekspresji raf. Nieprawidłowo wysoki poziom ekspresji białka raf wiązany jest ponadto z transformacją i nieprawidłowym rozrostem komórek. Uważa się ponadto, że takie nieprawidłowe warunki rozrostowe mogą reagować na hamowanie ekspresji raf. Na przykład sądzi się, że ekspresja białka c-raf może mieć znaczenie w nieprawidłowym rozroście komórek, ponieważ stwierdzono, że w 60% wszystkich linii komórkowych gruczolakoraka płuca występuje ekspresja wyjątkowo dużej ilości mrna i białka c-raf. Kolejne przykłady nieprawidłowych warunków rozrostowych to choroby związane z nadmiernym rozrostem, takie jak nowotwory, guzy, rozrost, mukowiscydoza, angiogeneza, łuszczyca, miażdżyca tętnic oraz rozrost komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, taki jak zwężenie naczyń i jego nawrót po angioplastyce. Szlak przekazywania sygnałów w komórce, którego elementem jest raf, wiązano także z chorobami zapalnymi, które charakteryzują się namnażaniem limfocytów T (aktywacja i namnażanie limfocytów T), takimi jak na przykład odrzucanie przeszczepów tkankowych, wstrząs endotoksynowy oraz kłębuszkowe zapalenie nerek. [0047] Kinazy białkowe aktywowane stresem (SAPK) to rodzina kinaz białkowych stanowiąca przedostatni etap szlaków przekazywania sygnałów prowadzących do aktywacji czynnika transkrypcyjnego c-jun i ekspresji genów regulowanych przez c-jun. W szczególności c-jun uczestniczy w transkrypcji genów kodujących białka biorące udział w naprawie DNA uszkodzonego wskutek działania czynników genotoksycznych. Dlatego środki hamujące aktywność SAPK w komórce nie dopuszczają do naprawy DNA i uczulają komórki na środki wywołujące uszkodzenia DNA lub hamują syntezę DNA i wywołują apoptozę komórki, bądź hamują namnażanie komórek. [0048] Kinazy białkowe aktywowane mitogenami (MAPK) to elementy stałych szlaków przekazywania sygnałów, które aktywują czynniki transkrypcyjne, czynniki translacyjne i inne cząsteczki docelowe w odpowiedzi na szereg sygnałów z zewnątrz komórki. MAPK ulegają aktywacji poprzez fosforylację na podwójnym motywie fosforylacji o sekwencji Thr-X- Tyr przez kinazy kinaz białkowych aktywowane mitogenami (MKK). U wyższych eukariontów znaczenie fizjologiczne przekazywania sygnału z udziałem MAPK wiąże się z etapami życia komórki, takimi jak namnażanie, onkogeneza, rozwój i różnicowanie. W związku z tym zdolność do regulacji przekazywania sygnałów na tych szlakach (w szczególności poprzez MKK4 i MKK6) może doprowadzić do opracowania metod leczenia i terapii prewencyjnych chorób człowieka związanych z przekazywaniem sygnału z udziałem MAPK, takich jak choroby zapalne, choroby autoimmunologiczne i nowotwory. [0049] Rodzina ludzkich kinaz białka rybosomalnego S6 obejmuje co najmniej 8 przedstawicieli (RSK1, RSK2, RSK3, RSK4, MSK1, MSK2, p70s6k i p70s6 Kb). Kinazy białka rybosomalnego S6 pełnią istotne funkcje plejotropowe, wśród nich mają podstawowe znaczenie w regulacji translacji mrna w procesie biosyntezy białka (Eur. J. Biochem 2000 November; 267(21): , Exp Cell Res. Nov. 25, 1999; 253 (1):100-9, Mol Cell Endocrinol. May 25,1999;151(1-2):65-77). Fosforylację białka rybosomalnego S6 przez p70s6 wiązano ponadto z regulacją ruchliwości komórek (Immunol. Cell Biol August; 78(4):447-51) i wzrostem komórek (Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 2000;65:101-27), dlatego właśnie mogą mieć duże znaczenie w przerzutach nowotworowych, odpowiedzi immunologicznej i naprawie tkanek, a także w innych stanach chorobowych. [0050] SAPK (określane także jako kinazy N-końcowe jun lub JNK) to rodzina kinaz białkowych stanowiąca przedostatni etap szlaków przekazywania sygnałów prowadzących do aktywacji czynnika transkrypcyjnego c-jun i ekspresji genów regulowanych przez c-jun. W szczególności c-jun uczestniczy w transkrypcji genów kodujących białka biorące udział w naprawie DNA uszkodzonego wskutek działania czynników genotoksycznych. Środki hamujące aktywność SAPK w komórce nie dopuszczają do naprawy DNA i uczulają komórki na onkologiczne środki lecznicze, których działanie polega na wywoływaniu uszkodzeń DNA. [0051] BTK ma znaczenie w chorobach autoimmunologicznych i/lub zapalnych, takich jak toczeń rumieniowaty układowy (SLE), reumatoidalne zapalenie stawów, rozsiane zapalenie naczyń, samoistna plamica małopłytkowa (ITP), miastenia rzekomoporaźna i astma. Ze względu na znaczenie BTK w aktywacji limfocytów B, inhibitory BTK są użyteczne jako inhibitory aktywności patologicznej, w której pośredniczą limfocyty B, takiej jak wytwarzanie autoprzeciwciał, i są użyteczne w leczeniu chłoniaka z limfocytów B i białaczki. [0052] CHK2 jest przedstawicielem rodziny kinaz punktu kontrolnego białkowych kinaz serynowo-treoninowych i ma znaczenie w mechanizmach wykorzystywanych do kontroli uszkodzeń DNA, takich jak uszkodzenia wywołane przez mutageny środowiskowe oraz reaktywne formy tlenu pochodzenia zewnętrznego. W wyniku tego ma znaczenie jako supresor nowotworów i obiekt docelowy w terapii nowotworów. [0053] CSK wpływa na potencjał przerzutowy komórek nowotworowych, w szczególności w przypadku raka jelita grubego. [0054] Fes jest niereceptorową kinazą białkową, która ma znaczenie w różnorodnych szlakach przekazywania sygnałów związanych z cytokinami, a także w różnicowaniu komórek szpiku. Fes jest także podstawowym elementem mechanizmu różnicowania granulocytów. [0055] Aktywność białkowej kinazy tyrozynowej Flt 3 ma związek z białaczką i zespołem mielodysplastycznym. W około 25% przypadków ostrej białaczki szpikowej w komórkach białaczkowych zachodzi ekspresja aktywnej konstytucyjnie formy autofosforylowanej kinazy tyrozynowej (p) FLT3 na powierzchni komórek. Aktywność p-flt3 prowadzi do przewagi komórek białaczkowych w procesach wzrostu i zdolności do przeżycia. U pacjentów z białaczką ostrą, u których w komórkach białaczkowych zachodzi ekspresja aktywności kinazy p-flt3, stwierdza się złe ogólne rokowania kliniczne. Hamowanie aktywności kinazy p-flt3 wywołuje apoptozę (programowaną śmieć komórki) w przypadku komórek białaczkowych. [0056] Inhibitory IKKα i IKKβ (1 i 2) są środkami leczniczymi w przypadku chorób, do których należą reumatoidalne zapalenie stawów, odrzuty przeszczepów, zapalenie jelit, zapalenie kości i stawów, przewlekła obturacyjna choroba płuc, miażdżyca tętnic, łuszczyca, stwardnienie rozsiane, udar, toczeń rumieniowaty układowy, choroba Alzheimera, niedokrwienie mózgu, urazowe uszkodzenie mózgu, choroba Parkinsona, stwardnienie zanikowe boczne, krwotoki

7 6 podpajęczynówkowe oraz inne choroby i zaburzenia związane z nadmiernym wytwarzaniem substancji pośredniczących w reakcji zapalnej w mózgu i ośrodkowym układzie nerwowym. [0057] Met wiąże się z większością głównych typów nowotworów człowieka, zaś ekspresja często prowadzi do złych rokowań i przerzutów. Inhibitory Met to środki lecznicze stosowane w przypadku chorób, do których należą nowotwory, takie jak rak płuca, NSCLC (niedrobnokomórkowy rak płuca), rak kości, rak trzustki, rak skóry, rak okolic głowy i szyi, czerniak skóry lub gałki ocznej, rak macicy, rak jajnika, rak odbytu, rak okolic odbytu, rak żołądka, rak jelita grubego, rak sutka, nowotwory ginekologiczne (np. mięsaki macicy, gruczolakorak jajowodu, gruczolakorak śluzówki macicy, gruczolakorak szyjki macicy, gruczolakorak pochwy lub gruczolakorak sromu), choroba Hodgkina, rak przełyku, rak jelita cienkiego, rak układu wewnątrzwydzielniczego (np. rak tarczycy, gruczołów przytarczycznych lub nadnerczy), mięsaki tkanek miękkich, rak cewki moczowej, rak prącia, rak prostaty, białaczka przewlekła lub ostra, guzy lite wieku dziecięcego, chłoniaki limfocytowe, rak pęcherza moczowego, rak nerki lub moczowodu (np. gruczolakorak komórek nerki, gruczolakorak miedniczek nerkowych), nowotwory wieku dziecięcego, nowotwory ośrodkowego układu nerwowego (np. pierwotny chłoniak ośrodkowego układu nerwowego, guzy kręgosłupa, glejak pnia mózgu lub gruczolaki przysadki), nowotwory krwi, takie jak ostra białaczka szpikowa, przewlekła białaczka szpikowa itd., przełyk Barretta (zespół przednowotworowy), nowotworowa choroba skóry, łuszczyca, ziarniniaki grzybiaste oraz łagodny przerost prostaty, choroby związane z cukrzycą, takie jak retinopatia cukrzycowa, niedokrwienie siatkówki oraz neowaskularyzacja siatkówkowa, marskość wątroby, choroby sercowo-naczyniowe, takie jak miażdżyca tętnic, choroby immunologiczne, takie jak choroby autoimmunologiczne, oraz choroby nerek. Korzystnie, jeśli chorobą jest nowotwór, taki jak ostra białaczka szpikowa i rak jelita grubego. [0058] Kinaza 2 związana z Nima (Nek2) jest kinazą białkową regulowaną przez cykl komórkowy, przy czym jej maksymalna aktywność zlokalizowana w centrosomie przypada na początek mitozy. Badania czynnościowe pozwoliły powiązać Nek2 z regulowaniem rozdzielenia centrosomu i tworzenia wrzeciona. Stężenie białka Nek2 zwiększa się 2- do 5-krotnie w liniach komórkowych wywodzących się z szeregu nowotworów człowieka, w tym szyjki macicy, jajnika, prostaty i w szczególności sutka. [0059] Choroby lub stany, w których pośredniczy p70s6k, obejmują między innymi zaburzenia rozrostowe, takie jak nowotwory i stwardnienie guzowate. [0060] Zgodnie z powyższym niniejszy wynalazek dotyczy ponadto sposobu zapobiegania lub leczenia dowolnej z chorób lub zaburzeń, o których mowa powyżej, u pacjenta wymagającego takiego leczenia, przy czym sposób ten obejmuje podawanie wspomnianemu pacjentowi ilości skutecznej leczniczo (patrz niżej: Podawanie i kompozycje farmaceutyczne ) związku o wzorze I lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli. W przypadku wszystkich powyższych zastosowań wymagane dawkowanie zależy od sposobu podawania, konkretnego stanu podlegającego leczeniu i pożądanego działania. Podawanie i kompozycje farmaceutyczne [0061] Zasadniczo związki według niniejszego wynalazku podaje się w dawkach skutecznych leczniczo za pomocą dowolnego z typowych i dopuszczalnych sposobów znanych w stanie techniki w monoterapii lub w skojarzeniu z jednym lub większą liczbą środków leczniczych. Ilość skuteczna leczniczo może być znacznie zróżnicowana w zależności od ciężkości choroby, wieku oraz względnego stanu zdrowia pacjenta, mocy zastosowanego związku i innych czynników. Zasadniczo wydaje się, że zadowalające wyniki można uzyskać układowo w dawkach dobowych od około 0,03 do 2,5 mg/kg masy ciała. Wskazane dawkowanie dobowe u dużych ssaków, np. u człowieka, zawiera się w zakresie od około 0,5 mg do około 104 mg podawanych w sposób dogodny, na przykład w dawkach podzielonych do czterech razy na dobę lub w postaci o opóźnionym działaniu. Odpowiednie postacie dawkowania do podawania doustnego zawierają od ok. 1 do 50 mg substancji czynnej. [0062] Związki według niniejszego wynalazku można podawać w postaci kompozycji farmaceutycznej dowolną typową drogą, w szczególności dojelitowo, na przykład doustnie, na przykład w postaci tabletek lub kapsułek, bądź pozajelitowo, na przykład w postaci roztworów zawiesin do iniekcji, miejscowo, na przykład w postaci emulsji, żeli, maści lub kremów bądź w postaci donosowej lub czopków. Kompozycje farmaceutyczne zawierające związek według niniejszego wynalazku w postaci wolnej lub w postaci dopuszczalnej farmaceutycznie soli związanej z co najmniej jednym dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub rozcieńczalnikiem można wytwarzać w sposób typowy za pomocą mieszania, granulacji lub powlekania. Na przykład kompozycjami doustnymi mogą być tabletki lub kapsułki żelatynowe zawierające substancję czynną wraz z a) rozcieńczalnikami, na przykład laktozą, dekstrozą, sacharozą, mannitolem, sorbitolem, celulozą i/lub glicyną; b) substancjami smarującymi, na przykład krzemionką, talkiem, kwasem stearynowym, jego solą magnezową lub wapniową i/lub glikolem polietylenowym; w przypadku tabletek także c) substancjami wiążącymi, na przykład krzemianem magnezu i glinu, pastą skrobiową, żelatyną, gumą tragakantową, metylocelulozą, solą sodową karboksymetylocelulozy i/lub poliwinylopirolidonem; w razie potrzeby d) substancjami ułatwiającymi rozpad, np. skrobią, agarem, kwasem alginowym lub jego solą sodową bądź mieszaninami musującymi i/lub e) absorbentami, barwnikami, aromatami i środkami słodzącymi. Kompozycje do iniekcji mogą być izotonicznymi roztworami wodnymi lub zawiesinami, zaś czopki można wytwarzać z emulsji tłuszczowych lub zawiesin. Kompozycje można sterylizować i/lub mogą zawierać substancje pomocnicze, takie jak środki konserwujące, stabilizujące, zwilżające lub emulgujące, środki ułatwiające tworzenie roztworu, sole do kontroli ciśnienia osmotycznego i/lub bufory. Mogą one ponadto zawierać inne substancje cenne leczniczo. Odpowiednie preparaty do stosowania przezskórnego zawierają skuteczną ilość związku według niniejszego wynalazku wraz z nośnikiem. Nośnik może zawierać ulegające wchłanianiu dopuszczalne farmakologicznie rozpuszczalniki ułatwiające przejście przez skórę pacjenta. Na przykład wyroby przezskórne są w postaci bandaża zawierającego podłoże, zbiornik ze związkiem ewentualnie z dodatkiem nośników, ewentualnie z barierą regulującą przenikanie, tak by podawanie leku przez skórę pacjenta odbywało się z kontrolowaną, założoną szybkością przez dłuższy okres, a także elementy mocujące wyrób do skóry. Można także zastosować matrycowe preparaty przezskórne. Odpowiednie preparaty do podawania miejscowego, na przykład na skórę i do oka, to korzystnie roztwory wodne, maści, kremy i żele dobrze znane w stanie techniki. Mogą one zawierać substancje ułatwiające rozpuszczanie, stabilizatory, środki zwiększające toniczność, bufory i substancje konserwujące.

8 7 [0063] Związki według niniejszego wynalazku można podawać w dawkach skutecznych leczniczo w skojarzeniu z jednym lub większą liczbą środków leczniczych (połączenia farmaceutyczne). Na przykład działanie synergistyczne może wystąpić w połączeniu z innymi substancjami działającymi na układ odpornościowy lub przeciwzapalnymi, na przykład w przypadku stosowania w skojarzeniu z cyklosporyną, rapamycyną lub aksomycyną bądź ich analogami o działaniu immunosupresyjnym, na przykład cyklosporyną A (CsA), cyklosporyną G, FK-506, rapamycyną i porównywalnymi związkami, kortykosteroidami, cyklofosfamidem, azatiopryną, metotreksatem, brechinarem, leflunomidem, mizorybiną, kwasem mykofenolowym, mykofenolanem mofetylu, 15-deoksyspergualiną, przeciwciałami o działaniu immunosupresyjnym, w szczególności przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko receptorom leukocytów, na przykład MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45, CD58 bądź ich ligandom, oraz innymi związkami działającymi na układ odpornościowy, takimi jak CTLA41g. Jeśli związki według niniejszego wynalazku podaje się w skojarzeniu z innymi metodami leczenia, dawkowanie związków podawanych w skojarzeniu będzie się rzecz jasna różnić w zależności od rodzaju leku stosowanego w skojarzeniu, od konkretnego stosowanego leku, leczonego schorzenia i tak dalej. [0064] Wynalazek dotyczy także połączeń farmaceutycznych, na przykład zestawu zawierającego a) pierwszy środek będący związkiem według niniejszego wynalazku ujawnionym w dokumencie w postaci wolnej lub w postaci dopuszczalnej farmaceutycznie soli oraz b) co najmniej jeden środek stosowany w skojarzeniu. Zestaw może zawierać instrukcje dotyczące podawania. [0065] Określenia podawanie w skojarzeniu lub podawanie skojarzone bądź podobne stosowane w dokumencie oznaczają uwzględnienie podawania wybranych środków leczniczych danemu pacjentowi, przy czym obejmuje to schematy leczenia, w których środków nie podaje się koniecznie poprzez tę samą drogę podania lub w tym samym czasie. [0066] Określenie połączenie farmaceutyczne stosowane w dokumencie oznacza produkt powstały w wyniku zmieszania lub połączenia jednej lub większej liczby substancji czynnych i uwzględnia połączenia substancji czynnych związane i inne niż związane. Określenie połączenie związane oznacza, że substancje czynne, na przykład związek o wzorze I i środek stosowany w skojarzeniu, podaje się pacjentowi jednocześnie w jednej postaci lub dawce. Określenie połączenie inne niż związane oznacza, że substancje czynne, na przykład związek o wzorze I i środek stosowany w skojarzeniu, podaje się pacjentowi w oddzielnych postaciach jednocześnie, równocześnie lub jeden po drugim bez określenia konkretnych terminów, przy czym takie podanie zapewnia uzyskanie skutecznego leczniczo stężenia obu związków w organizmie pacjenta. To ostatnie dotyczy także terapii koktajlowej, na przykład podawania 3 lub więcej substancji czynnych. Sposoby wytwarzania związków według wynalazku [0067] Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto sposobów otrzymywania związków według wynalazku. W opisanych reakcjach konieczne może być zablokowanie reaktywnych grup funkcyjnych, na przykład grup hydroksylowych, aminowych, iminowych, tio lub karboksylowych, jeśli mają one występować w produkcie ostatecznym w celu uniknięcia niepożądanego ich udziału w reakcjach. Typowe grupy blokujące można wykorzystać zgodnie ze standardową praktyką, patrz na przykład T.W. Greene i P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley And Sons, [0068] Związki o wzorze I można otrzymać w postępowaniu przedstawionym w poniższym schemacie reakcji I: Schemat reakcji I [0069] gdzie Y, T 1, R 2 i R 3 są jak zdefiniowano w streszczeniu wynalazku. Związek o wzorze I można zsyntetyzować w reakcji związku o wzorze 2 ze związkiem o wzorze 3 w obecności odpowiedniego rozpuszczalnika (na przykład DMF, dichlorometanu, toluenu i podobnych), odpowiedniej zasady (na przykład trietyloaminy, DIPEA, Na 2 CO 3 i podobnych) oraz odpowiedniego odczynnika sprzęgającego (na przykład DCC, HATU i podobnych). Reakcja zachodzi w zakresie temperatur od około 0 C do około 50 C, a przereagowanie następuje w ciągu do 24 godzin. [0070] Szczegółowe przykłady syntezy związku o wzorze I można znaleźć w przykładach (patrz niżej). Dodatkowe sposoby wytwarzania związków według wynalazku [0071] Związek według wynalazku można otrzymać w postaci soli addycyjnej z dopuszczalnym farmaceutycznie kwasem w reakcji związku w postaci wolnej zasady z dopuszczalnym farmaceutycznie kwasem nieorganicznym lub organicznym. Ewentualnie sól addycyjną związku według wynalazku z dopuszczalną farmaceutycznie zasadą można otrzymać w reakcji związku w postaci wolnego kwasu z dopuszczalną farmaceutycznie zasadą nieorganiczną lub organiczną. [0072] Postacie soli związków według wynalazku można ewentualnie otrzymać z soli substancji wyjściowych lub produktów pośrednich. [0073] Postacie wolnego kwasu lub wolnej zasady związków według wynalazku można otrzymać odpowiednio z odpowiednich soli addycyjnych z zasadami lub soli addycyjnych z kwasami. Na przykład związek według wynalazku w postaci soli addycyjnej z kwasem można przekształcić w odpowiednią wolną zasadę w reakcji z odpowiednią zasadą (na przykład roztworem wodorotlenku amonu, wodorotlenkiem sodu i podobnymi). Związek według wynalazku w postaci soli addycyjnej z zasadą można przekształcić w odpowiedni wolny kwas w reakcji z odpowiednim kwasem (na przykład kwasem chlorowodorowym itd.).

9 8 [0074] Związki według wynalazku w postaci nieutlenionej można otrzymywać z N-tlenków związków według wynalazku w reakcji z reduktorem (na przykład siarką, dwutlenkiem siarki, trifenylofosfiną, borowodorkiem litu, borowodorkiem sodu, trichlorkiem, tribromkiem fosforu i podobnymi) w odpowiednim obojętnym rozpuszczalniku organicznym (na przykład acetonitrylu, etanolu, wodnym roztworze dioksanu i podobnych) w temperaturze 0 do 80 C. [0075] Pochodne związków według wynalazku będące prolekami można otrzymać sposobami znanymi w stanie techniki (więcej informacji szczegółowych znajduje się na przykład w Saulnier et al., (1994), Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, str. 1985). Na przykład odpowiednie proleki można otrzymać w reakcji niezderywatyzowanego związku według wynalazku z odpowiednim środkiem karbamylującym (np. 1,1-acyloksyalkilokarbanochlorydatem, węglanem para-nitrofenylu i podobnymi). [0076] Pochodne związków według wynalazku z grupami blokującymi można otrzymywać metodami znanymi specjalistom w dziedzinie. Szczegółowy opis metod nadających się do przyłączania grup blokujących i ich usuwania znajduje się w T. W. Greene, Protecting Groups in Organic Chemistry", wydanie trzecie, John Wiley And Sons, Inc., [0077] Związki według wynalazku można dogodnie otrzymywać lub wytwarzać w sposobie według wynalazku w postaci solwatów (na przykład hydratów). Hydraty związków według niniejszego wynalazku można dogodnie otrzymywać za pomocą przekrystalizowania z mieszaniny roztworu wodnego i rozpuszczalnika organicznego za pomocą rozpuszczalników organicznych, takich jak dioksyna, tetrahydrofuran lub metanol. [0078] Związki według niniejszego wynalazku można otrzymywać w postaci pojedynczych stereoizomerów w reakcji mieszaniny racemicznej związku z czynnym optycznie środkiem rozdzielającym uzyskując parę związków diastereoizomerycznych, rozdzielając stereoizomery i odzyskując czyste optycznie enancjomery. Jakkolwiek rozdział enancjomerów można przeprowadzić za pomocą kowalencyjnych pochodnych diastereoizomerycznych związków według wynalazku, preferowane są kompleksy mogące ulegać dysocjacji (np. krystaliczne sole diastereoizomeryczne). Diastereoizomery mają różne właściwości fizyczne (np. temperatura topnienia, temperatura wrzenia, rozpuszczalność, reaktywność itd.) i można je łatwo rozdzielić wykorzystując te różnice. Diastereoizomery można rozdzielać za pomocą chromatografii lub korzystnie metodami rozdzielania lub wyodrębniania wykorzystującymi różnice w rozpuszczalności. Następnie odzyskuje się optycznie czysty enancjomer wraz ze środkiem rozdzielającym dowolną praktyczną metodą nieprowadzącą do racemizacji. Bardziej szczegółowy opis metod nadających się do rozdziału stereoizomerów związków z ich mieszanin racemicznych znajduje się w Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, Enantiomers, Racemates and Resolutions", John Wiley And Sons, Inc., [0079] Podsumowując, związki o wzorze I można wytworzyć sposobem, który obejmuje: (a) postępowanie zgodnie ze schematem reakcji I; oraz (b) ewentualnie przekształcenie związku według wynalazku w dopuszczalną farmaceutycznie sól; (c) ewentualnie przekształcenie postaci soli związku według wynalazku w postać niebędącą solą; (d) ewentualnie przekształcenie nieutlenionej postaci związku według wynalazku w dopuszczalny farmaceutycznie N- tlenek; (e) ewentualnie przekształcenie postaci N-tlenku związku według wynalazku w postać nieutlenioną; (f) ewentualnie wyodrębnienie pojedynczego izomeru związku według wynalazku z mieszaniny izomerów; (g) ewentualnie przekształcenie niezderywatyzowanego związku według wynalazku w dopuszczalną farmaceutycznie pochodną proleku; oraz (h) ewentualnie przekształcenie pochodnej proleku związku według wynalazku w postać niezderywatyzowaną. [0080] Jakkolwiek wytwarzanie substancji wyjściowych nie zostało konkretnie opisane, związki te są znane lub można je otrzymać analogicznie do metod znanych w stanie techniki lub zgodnie z ujawnieniem w przykładach poniżej. [0081] Specjalista w dziedzinie będzie wiedział, że powyższe przekształcenia są jedynie reprezentatywne dla sposobów otrzymywania związków według niniejszego wynalazku i można zastosować inne sposoby dobrze znane w stanie techniki. Przykłady [0082] Niniejszy wynalazek zilustrowano ponadto, jednak w sposób nieograniczający, następującymi przykładami przedstawiającymi otrzymywanie związków o wzorze I według wynalazku. Przykład 1 Synteza 1-[4-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4-yloksy)-fenylo]-3-(3-trifluorometylofenylo)-mocznika (4) [0083] 4-(4-Nitrofenoksy)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna:

10 9 [0084] [0085] Do roztworu 4-chloro-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyny (3,1 g, 20 mmol) rozpuszczonej w DMF (60 ml) dodaje się 4- nitrofenol (4,9 g, 35 mmol) i węglan potasu (5,3 g, 38 mmol). Powstały roztwór ogrzewa się do temperatury 110 C przez noc. Po zakończeniu reakcji, o czym świadczy zanik substancji wyjściowej, mieszaninę reakcyjną chłodzi się do temperatury pokojowej i wylewa do zimnej wody. Powstałe ciało stałe oddziela się za pomocą sączenia i przemywa wodą (3 x 100 ml). Surowy produkt oczyszcza się metodą chromatografii rzutowej za pomocą mieszaniny heksanów i octanu etylu (1/1 v/v) jako eluentu uzyskując żądany związek w postaci ciała stałego: 1 H NMR 400 MHz (DMSO-d 6 ) δ 12,34 (bs, 1H), 8,35 (m, 3H), 7,57 (m, 3H), 6,61 (m, 1H); HRMS (MALDI-FTMS) obliczone dla C 12 H 9 N 4 O 3 [MH] + 257,0669, stwierdzone 257, (7H-Pirolo[2,3-d]pirymidyn-4-yloksy)-fenyloamina [0086] [0087] Związek otrzymuje się za pomocą redukcji odpowiedniej grupy nitrowej stosując sposoby znane w stanie techniki, MS m/z 227,1 (M + 1). 1-[4-(7H-Pirolo[2,3-d]pirymidyn-4-yloksy)-fenylo]-3-(3-trifluorometylofenylo)-mocznik [0088] [0089] Do roztworu 3-(trifluorometylo)aniliny (0,013 ml, 1 mmol), w dichlorometanie (2 ml) dodaje się chloromrówczan 4- nitrofenylu (0,020 ml, 1 mmol) i pirydynę (0,008 ml, 1 mmol). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 5 minut, a następnie dodaje się związek 4 (0,018 g, 0,78 mmol) i N,N-diizopropyloetyloaminę (0,134 ml, 0,78 mmol). Powstałą mieszaninę reakcyjną miesza się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, przy czym następnie analiza LC-MS wykazała zanik związku 3. Rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskaną pozostałość rozpuszcza w DMSO (1 ml). Powstały roztwór oczyszcza się za pomocą LC-MS w układzie faz odwróconych uzyskując żądany związek w postaci soli z kwasem trifluorooctowym. 1 H NMR 400 MHz (DMSO-d 6 ) δ 12,19 (s, 1H), 8,98 (s, 1H), 9,1 (s, 1H), 8,91 (s, 1H), 8,28 (s, 1 H), 8,01 (s, 1H), 7,58 (m, 1H), 7,52 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 7,51-7,50 (m, 1H), 7,43 (t, J = 2,8 Hz, 1H), 7,31 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,18 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,42 (m, 1H); HRMS (MALDI-FTMS) obliczone dla C 20 H 15 F 3 N S O 2 [MH] + 414,1172, stwierdzone 414,1169. Przykład 2 Synteza N-[4-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4-yloksy)-fenylo]-2-(3-trifluorometylofenylo)-acetamidu [0090]

11 10 [0091] Do roztworu związku 3 (0,020 g, 0,088 mmol), kwasu (3-trifluorometylofenylo)-octowego (0,020 g, 0,10 mmol) i N,N-diizopropyloetyloaminy (17,2 μl, 0,1 mmol) w dimetyloformamidzie (0,5 ml) dodaje się heksafluorofosforanu O-(7- azabenzotriazol-1-ilo)-n,nn, N -tetrametylouroniowego (0,036 g, 0,096 mmol). Miesza się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i surową mieszaninę reakcyjną rozdziela pomiędzy octan etylu i wodę. Warstwy organiczne rozdziela się, suszy nad bezwodnym siarczanem sodu, sączy i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując surowy produkt. Pozostałość rozpuszcza się w DMSO (1 ml) i powstały roztwór oczyszcza za pomocą LC-MS w układzie faz odwróconych uzyskując żądany związek w postaci soli z kwasem trifluorooctowym. 1 H NMR 400 MHz (DMSO-d 6 ) δ 12,13 (bs, 1H), 10,38 (bs, 1H), 8,27 (s, 1H), 7,71 (s, 1H), 7,6-7,66 (m, 5H), 7,43 (m, 1H), 7,19 (d, J= 9,2 Hz, 2H), 6,41 (m, 1H) 3,82 (s, 2H); HRMS (MALDI-FTMS) obliczone dla C 21 H 16 F 3 N 4 O 2 [MH]+ 413,1220, stwierdzone 413,1222, [0092] Powtarzając postępowanie opisane w powyższych przykładach za pomocą odpowiednich substancji wyjściowych uzyskuje się następujące związki o wzorze I przedstawione w tabeli 1. Tabela 1 Numer związku Struktura Dane fizyczne HNMR 400 MHz (DMSO-d 6 ) i/lub MS(m/z) 3 1 H NMR 400 MHz (DMSO-d 6 ) δ 12,09 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 8,9 (s, 1H), 8,18 (s,1h), 7,87 (s, 1H), 7,53 (s, 2H), 7,42 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,3 (m, 1H), 7,07 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,32 (m, 1H),3,56 (s, 2H), 3,01 (q, J = 8,8 Hz, 2H), 2,84-2,87 (m, 8H), 1,1 (t,, J = 7,2 Hz, 3H) MS m/z 540,2 (M + 1). 4 1 H NMR 400 MHz (DMSO-d 6 ) δ 12,22 (s, 1H), 9,66 (s, 1H), 9,51 (s, 1H), 9,36 (s, 1H), 8,31 (s, 1H), 8,16 (s, 1H),8,01 (d, J=12,0Hz,1H), 7,77 (s, 1H), 7,59 (d,, J= 8,8 Hz, 2H), 7,48 (t, J= 2,4 Hz, 1H),7,23(d,, J=8,8Hz,2H), 6,95 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 6,46 (m, 1H), 2,36 (s, 3H) MS m/z 494,1 (M + 1). 5 MS m/z 406,1 (M+ 1). 6 1 H NMR 400 MHz DMSO-d 6 ) δ 9,1 (s, 1H), 8,9 (s, 1H), 8,5 (s, 1H),8,42 (s,1h), 8,01 (s, 1H), 7,56 (m, 1H) 7,52-7,55 (m, 3H), 7,32 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,22 (d, J = 8,8 Hz, 2H), MS m/z 415,1 (M + 1). 7 1 H NMR 400 MHz DMSO-d 6 ) δ 9,59 (s, 1H), 9,43 (s, 1H), 9,31 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 8,11 (s, 1H,), 7,97 (s, 2H), 7,74 (s, 1H), 7,57 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,25 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 2,34 (s, 3H)MSm/z 495,1 (M+1). 8 1 H NMR 400 MHz. (DMSO-d 6 )δ9,2 (s, 1H),9,02 (s, 1H), 8,5 (s, 1H),8,41 (s,1h), 7,97 (s, 1H), 7,63 (s, 2H), 7,53 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,21 (d, J = 8,8 Hz 2H,), 6,32 (m, 1H), 3,64 (s, 2H), 3,1 (q, J = 8,8 Hz, 2H), 2,94-2,97 (m, 8H), 1,2 (t,j= 7,2Hz,3H)MS m/z 541,2 (M+1).

12 11 (ciąg dalszy) Numer związku Struktura Dane fizyczne HNMR 400 MHz (DMSO-d 6 ) i/lub MS (m/z) 9 1 H NMR 400 MHz (DMSO-d 6 ) δ 11,07 (bs, 1H), 8,91 (s, 1H) 8,13 (d,, J=8,8 Hz, 2H), 7,96 (s, 1H), 7,49 (m, 1H), 7,45 (m, 1H), 7,22 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,01 (s, 2H) MS m/z 465,1 (M+1). 10 MS m/z 493,1 (M + 1) 11 1 H NMR 400 MHz (DMSO-d 6 ) δ 10,52 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 8,36 (s, 1H), 8,21-8,25 (m, 2H), 7,92 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 7,74-7,77 (m, 3H), 7,23 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,48 (s, 1H), MS m/z 399,1 (M +1) H NMR 400 MHz (DMSO-d 6 ) δ 12,24 (bs, 1H), 10,74 (s, 1H), 9,59 (s, 1H) 8,59 (s, 1H), 8,45 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 8,30 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 7,83 (d, J = 9,2 Hz, 2H), 7,46 (m, 1H), 7,31 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 6,46 (m, 1H), 2,36 (s, 3H) MSm/z 479,1 (M+ 1) H NMR 400 MHz (DMSO-d 6 ) δ 8,49 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 8,28 (m, 2H), 7,98, (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,80-7,83 (m,3h),7,31 (s, 1H),7,29(s, 1H) MS m/z 400,1 (M + 1). 14 MS m/z 526,2 (M + 1). 15 MS m/z 451,1 (M + 1). Badania [0093] Przeprowadzono testy związków według niniejszego wynalazku w celu pomiaru ich zdolności do selektywnego hamowania namnażania komórek 32D, w których zachodzi ekspresja BCR-Ab1 (32D-p210) w porównaniu z pierwotnymi komórkami 32D. Związki powodujące selektywne hamowanie namnażania tych komórek transformowanych BCR-Ab1

13 12 bada się na aktywność hamującą namnażanie komórek Ba/F3, w których zachodzi ekspresja postaci typu dzikiego lub zmutowanych Bcr-ab1. Ponadto związki bada się w celu pomiaru ich zdolności do hamowania kinaz Abl, Bcr-Ab1, Aurora-A, Axl, BMX, CHK2, c-raf, csrc, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IR, JNK2α2, Lck, Met, MKK6, MST2, p70s6k, PDGFRα, PKA, PKD2, ROCK-II, Ros, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SAPK4, Syk, Tie2 i TrkB. Hamowanie namnażania komórek zależnego od BCR-Ab1 (metoda o dużej wydajności) [0094] Wykorzystywana linia komórek mysich to linia hemopoetycznych komórek progenitorowych 32D transformowana cdna BCR-Abl (32D-p210). Komórki te hoduje się w RPMI/10% cielęcej surowicy płodowej (RPMI/FCS) z dodatkiem penicyliny w stężeniu 50 μg/ml, streptomycyny w stężeniu 50 μg/ml i L-glutaminy w stężeniu 200 mm. Nietransformowane komórki 32D hoduje się podobnie z dodatkiem 15% pożywki uwarunkowanej WEHI jako źródła IL3. [0095] 50 μl zawiesiny komórek 32D lub 32D-p210 wysiewa się na mikropłytki 384-dołkowe Greiner (czarne) uzyskując gęstość 5000 komórek na dołek. 50 nl związku badanego (1 mm w roztworze podstawowym DMSO) dodaje się do każdego dołka (zastosowano STI571 jako kontrolę dodatnią). Komórki inkubuje się w temperaturze 37 C, 5% CO 2 przez 72 godziny. 10 μl 60% roztworu błękitu Alamar (Tek diagnostics) dodaje się do każdego dołka i komórki inkubuje się jeszcze przez 24 godziny. Intensywność fluorescencji (wzbudzenie przy 530 nm, emisja przy 580 nm) oznacza się ilościowo za pomocą systemu Acquest (Molecular Devices). Hamowanie namnażania komórek zależnego od BCR-Ab1 [0096] Komórki 32D-p210 wysiewa się na płytki 96-dołkowe do hodowli tkankowych uzyskując gętość komórek na dołek. 50 μl serii rozcieńczeń dwukrotnych związku badanego (C max wynosi 40 mm) dodaje się do każdego dołka (zastosowano STI571 jako kontrolę dodatnią). Komórki inkubuje się przez 48 godzin w temperaturze 37 C, 5% CO 2 i do każdego dołka dodaje się 15 μl MTT (Promega) i komórki inkubuje się jeszcze przez 5 godzin. Gęstość optyczną przy długości fali 570 nm oznacza się ilościowo spektrofotometrycznie i z krzywej zależności odpowiedzi od dawki wyznacza wartości IC 50 (stężenie związku wymagane do 50% hamowania) Wpływ na rozkład cyklu komórkowego [0097] Komórki 32D i 32D-p210 wysiewa się na mikropłytki 6-dołkowe do hodowli tkankowych w ilości 2,5x10 6 komórek na dołek w 5 ml pożywki oraz dodaje 1 lub 10 μm związku badanego (STI571 stanowi kontrolę). Komórki następnie inkubuje się w temperaturze 37 C, CO 2 przez 24 lub 48 godzin. 2 ml zawiesiny komórek przemywa się PBS, utrwala w 70% EtOH przez 1 godzinę i poddaje działaniu PBS/EDTA/ RNazy A przez 30 minut. Dodaje się jodek propidyny (Cf= 10 μg/ml) i oznacza ilościowo intensywność fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej używając systemu FACScalibur (BD Biosciences). Badane związki według niniejszego wykazują działanie prowadzące do apoptozy w przypadku komórek 32D-p210, jednak nie wywołują apoptozy w komórkach pierwotnych 32D. Działanie na autofosforylację BCR-Abl w komórkach [0098] Autofosforylację BCR-Abl oznacza sie ilościowo za pomocą testu podwójnego wiązania Elisa używając swoistego przeciwciała przechwytującego c-abl i przeciwciała przeciwko fosfotyrozynie. Komórki 32D-p210 wysiewa się na 96- dołkowe płytki do hodowli tkankowych w ilości 2,5x10 5 komórek na dołek w 50 μl pożywki. 50 μl dwukrotnych serii rozcieńczeń związku badanego (C max wynosi 10 μm) dodaje się do każdego dołka (stosuje się STI571 jako kontrolę dodatnią). Komórki inkubuje się w temperaturze 37 C, 5% CO 2 przez 90 minut. Następnie komórki poddaje się działaniu 150 μl buforu lizującego (50 mm Tris-HCl, ph 7,4, 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, 1 mm EGTA i 1% NP-40) zawierającego inhibitory proteaz i fosfataz przez 1 godzinę. 50 μl lizatu komórkowego dodaje się do 96-dołkowych płytek typu OptiPlate uprzednio pokrytych przeciwciałem swoistym przeciwko ab1 i utrwala. Komórki inkubuje się w temperaturze 4 C przez 4 godziny. Po przemyciu za pomocą buforu TBS-Tween 20 dodaje się 50 μl przeciwciała przeciwko fosfotyrozynie sprzężonego z fosfatazą alkaliczną i płytkę dalej inkubuje przez noc w temperaturze 4 C. Po przemyciu za pomocą buforu TBS-Tween 20 dodaje się 50 μl substratu luminescencyjnego i oznacza ilościowo luminescencję za pomocą systemu Acques (Molecular Devices). Badane związki według wynalazku, które hamują namnażanie komórek, w których zachodzi ekspresja BCR-Ab1, powodują hamowanie autofosforylacji BCR-Abl w komórkach w sposób zależny od dawki. Wpływ na namnażanie komórek, w których zachodzi ekspresja zmutowanych form Bcr-ab1 [0099] Związki według wynalazku bada się na działanie hamujące namnażanie komórek Ba/F3, w których zachodzi ekspresja form typu dzikiego lub zmutowanych BCR-Ab1 (G250E, E255V, T315I, F317L, M351T) dających odporność lub zmniejszenie wrażliwości na STI571. Działanie hamujące namnażanie tych związków na komórki, w których zachodzi ekspresja zmutowanego BCR-Ab1, oraz na komórki nietransformowane badano przy stężeniu 10, 3,3, 1,1 i 0,37 μm jak opisano powyżej (w pożywkach bez IL3). Wartości IC 50 związków niewykazujących toksyczności wobec komórek nietransformowanych określono na podstawie krzywych zależności odpowiedzi od dawki jak opisano powyżej. FGFR3 (test enzymatyczny) [0100] Badanie aktywności kinazowej za pomocą oczyszczonego FGFR3 (Upstate) przeprowadza się w objętości końcowej 10 μl zawierającej 0,25 μg/ml enzymu w buforze do kinaz (30 mm Tris-HCl, ph 7,5, 15 mm MgCl 2, 4,5 mm MnCl 2, 15 μm Na 3 VO 4 i 50 μg/ml BSA) oraz substraty (5 μg/ml biotyno-poli-ey(glu, Tyr) (CIS-US, Inc.) i 3 μm ATP). Sporządza się dwa roztwory: pierwszy roztwór o objętości 5 μl zawierający enzym FGFR3 w buforze do kinaz wprowadza się do 384-dołkowej płytki ProxiPlate (Perkin-Elmer), a następnie dodaje 50 nl związków rozpuszczonych w DMSO i do każdego dołka dodaje 5 μl drugiego roztworu zawierającego substrat (poli-ey) i ATP w buforze do kinaz. Reakcje inkubuje się w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, zatrzymuje przez dodanie 10 μl mieszaniny detekcyjnej HARF zawierającej Tris-HCl, ph 7,5, 0,5 M KF, 50 mm ETDA, 0,2 mg/ml, BSA, 15 μg/ml streptawidyno-

14 13 XL665 (CIS-US, Inc.) i 150 ng/ml przeciwciała przeciwko fosfotyrozynie sprzężonego z kryptatem (CIS-US, Inc.). Po jednej godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej umożliwiającej oddziaływanie streptawidyny z biotyną odczytuje się rozdzielone w czasie sygnały fluorescencyjne za pomocą Analyst GT (Molecular Devices Corp.). Wartości IC 50 oblicza się za pomocą analizy regresji liniowej wartości procentowej hamowania przez każdy związek w 12 stężeniach (rozcieńczenie 1:3 od 50 μm do 0,28 nm). W tym badaniu związki według wynalazku charakteryzują się IC 50 w zakresie od 10 nm do 2 μm. FGFR3 (test komórkowy) [0101] Związki według wynalazku bada się na zdolność do hamowania namnażania komórek transformowanych Ba/F3- TEL-FGFR3, które zależy od aktywności kinazy komórkowej FGFR3. Ba/F3-TEL-FGFR3 hoduje się do uzyskania komórek/ml w zawiesinie w RPMI 1640, do którego dodaje się 10% cielęcej surowicy płodowej jako pożywki hodowlanej. Komórki wprowadza się do płytki 384-dołkowej w stężeniu 5000 komórek na dołek w 50 μl pożywki hodowlanej. Związki według wynalazku rozpuszcza się i rozcieńcza sulfotlenkiem dimetylu (DMSO). Sporządza się 12 kolejnych rozcieńczeń 1:3 za pomocą DMSO, aby uzyskać gradient stężenia zazwyczaj od 10 mm do 0,05 μm. Do komórek dodaje się 50 nl rozcieńczonych związków i inkubuje przez 48 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych. Do komórek w stężeniu końcowym 10% dodaje się AlamarBlue (TREK Diagnostic Systems), który można wykorzystywać do kontroli środowiska redukującego wytwarzanego przez namnażające się komórki. Po czterech kolejnych godzinach inkubacji w inkubatorze do kultur komórkowych w temperaturze 37 C oznacza się ilościowo sygnały fluorescencji zredukowanego AlamarBlue (wzbudzenie przy 530 nm, emisja przy 580 nm) za pomocą systemu Analyst GT (Molecular Devices Corp.). Wartości IC 50 oblicza się za pomocą analizy regresji liniowej wartości procentowej hamowania przez każdy związek w 12 stężeniach. FLT3 i PDGFRβ (test komórkowy) [0102] Działanie związków według wynalazku na aktywność komórkową FLT3 i PDGFRβ bada się metodami identycznymi, jak opisano powyżej w przypadku aktywności komórkowej FGFR3, jednak zamiast stosowania Ba/F3-TEL- FGFR3, wykorzystuje się odpowiednio Ba/F3-FLT3-ITD i Ba/F3-Tel-PDGFRβ. b-raf test enzymatyczny [0103] Związki według wynalazku bada się na zdolność do hamowania aktywności b-raf. Badanie wykonuje się na 384- dołkowych płytkach MaxiSorp (NUNC) z czarnymi ściankami i przezroczystym dnem. Substrat IκBα - rozcieńcza się w DPBS (1:750) i do każdego dołka dodaje 15 μl. Płytki inkubuje się przez noc w temperaturze 4 C i przemywa trzykrotnie TBST (25 mm Tris, ph 8,0, 150 mm NaCl i 0,05% Tween-20) za pomocą urządzenia do przemywania płytek EMBLA. Płytki utrwala się za pomocą odczynnika Superblock (15 μl/dołek) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, przemywa trzykrotnie TBST i delikatnie suszy. Do każdego dołka dodaje się bufor testowy zawierający 20 μm ATP (10 μl), a następnie 100 nl lub 500 nl związku. B-Raf rozcieńcza się w buforze testowym (1 μl w 25 μl) i 10 μl rozcieńczonego b- Raf dodaje do każdego dołka (0,4 μg/dołek). Płytki inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 2,5 godziny. Reakcję kinaz zatrzymuje się przez 6-krotne przemywanie płytek TBST. Przeciwciało fosfo-iκbα (Ser32/36) rozcieńcza się w odczynniku Superblock (1:10.000) i do każdego dołka dodaje 15 μl. Płytki inkubuje się w temperaturze 4 C przez noc i przemywa 6-krotnie TBST. Kozie antymysie przeciwciało IgG sprzężone z AP rozcieńcza się w odczynniku Superblock (1:1.500) i do każdego dołka dodaje 15 μl. Płytki inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i przemywa 6- krotnie TBST. Do każdego dołka dodaje się 15 μl fluorescencyjnego substratu Attophos AP (Promega) i płytki inkubuje w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Płytki odczytuje się za pomocą systemu Acquest lub Analyst GT i programu intensywności fluorescencji (wzbudzenie przy 455 nm, emisja przy 580 nm). b-raf test komórkowy [0104] Związki według wynalazku bada się w komórkach A375 na zdolność do hamowania fosforylacji MEK. Linię komórkową A375 (ATCC) uzyskuje się od pacjenta (człowieka) z czerniakiem; ma ona mutację V599E w genie B-Raf. Stężenie ufosforylowanej MEK jest podwyższone wskutek mutacji B-Raf. Komórki A375 prawie zrastające się do zrastających się inkubuje się ze związkami w temperaturze 37 C przez 2 godziny w pożywce niezawierającej surowicy. Komórki następnie przemywa się jednokrotnie zimnym PBS i poddaje lizie za pomocą buforu lizującego zawierającego 1% odczynnika X100. Po odwirowaniu supernatanty podaje się na SDS-PAGE i następnie przenosi na błony nitrocelulozowe. Błony następnie analizuje się metodą western blot za pomocą przeciwciała przeciwko fosfo-mek (ser217/221) (Cell Signaling). Ilość ufosforylowanej MEK kontroluje się za pomocą gęstości pasm fosfo-mek na błonach nitrocelulozowych. Test działania przeciwmalarycznego za pomocą SYBR Green I [0105] Związki według niniejszego wynalazku można badać w celu pomiaru ich zdolności do hamowania rozwoju parazytemii w zakażonych krwinkach czerwonych. Rozwój oznacza się ilościowo dodając barwnik SYBR Green I (Invitrogen) mający duże powinowactwo do dwuniciowego DNA. [0106] W celu badania przesiewowego leków do 3 płytek testowych dodaje się 20 μl pożywki przesiewowej niezawierajacej surowicy ludzkiej. Następnie do płytek testowych wprowadza się po 50 nl każdego ze związków według wynalazku, w tym kontrolę dla działania antymalarycznego (chlorochinę i artemizyninę). Na płytki kontrolne odniesienia i tła wprowadza się 50 nl DMSO. Następnie 30 μl zawiesiny ludzkich krwinek czerwonych zakażonych P. falciparum w pożywce selekcyjnej wprowadza się do płytek testowych i płytki kontroli odniesienia, tak by ostateczny hematokryt wynosił 2,5% z ostateczną parazytemią 3%. Niezarażone krwinki czerwone podaje się na płytkę kontroli tła, tak by ostateczny hematokryt wynosił 2,5%. Płytki umieszcza się w temperaturze 37 C w inkubatorze na 72 godziny w atmosferze 93% N 2, 4% CO 2 i 3% O 2. Do płytek dodaje się 10 μl 10X roztworu SYBR Green I. Płytki zamyka się i

15 14 umieszcza w temperaturze -80 C na noc, aby nastąpiła liza krwinek czerwonych. Płytki rozmraża się i pozostawia w temperaturze pokojowej na noc, aby uzyskać optymalne barwienie. Intensywność fluorescencji (wzbudzenie przy 497 nm, emisja przy 520 nm) mierzy się za pomocą systemu Acquest (Molecular Devices). Dla każdego związku oblicza się wartość procentową hamowania. Upstate KinaseProfler - test wiązania z użyciem filtra radioenzymatycznego [0107] Związki według wynalazku bada się na zdolność do hamowania aktywności poszczególnych kinaz z panelu kinaz. Związki bada się w dwóch próbach przy stężeniu ostatecznym 10 μm za pomocą typowego protokołu. Należy zauważyć, że skład buforu do kinaz i substratów różni się dla poszczególnych kinaz uwzględnionych w panelu Upstate KinaseProfiler. Bufor do kinaz (2,5 μl, 10x zawierający w razie potrzeby MnCl 2 ), aktywną kinazę (0,001-0,01 jednostek; 2.5 μl), peptyd swoisty lub poli(glu4-tyr) (5-500 μm lub 0,1 mg/ml) w buforze do kinaz i bufor do kinaz (50 μm, 5 μl) miesza się w probówce Eppendorfa na lodzie. Dodaje się mieszaninę Mg/ATP (10 μl; 67,5 (lub 33,75) mm MgCl 2, 450 (lub 225) μm ATP i 1 μci/μl [γ- 32 P]-ATP (3000Ci/mmol)) i reakcję inkubuje się w temperaturze około 30 C przez około 10 minut. Mieszaniną reakcyjną skrapia się (20 μl) kwadratowe odcinki bibuły o wymiarach 2cm x 2cm: P81 (fosfoceluloza do substratów peptydowych naładowanych dodatnio) lub Whatman nr 1 (do substratu peptydowego poli(glu4-tyr)). Kwadratowe odcinki testowe przemywa się 4-krotnie przez 5 minut (na jedno przemywanie) 0,75% kwasem fosforowym i jednokrotnie acetonem przez 5 minut. Kwadratowe odcinki testowe przenosi się do fiolki scyntylacyjnej, dodaje 5 ml mieszaniny scyntylacyjnej i oznacza ilościowo włączenie 32 P (cpm) w substrat peptydowy za pomocą licznika scyntylacyjnego Beckman. Dla każdej reakcji oblicza się wartość procentową hamowania. [0108] Związki o wzorze I w postaci wolnej lub w postaci dopuszczalnej farmaceutycznie soli wykazują cenne właściwości farmakologiczne, o czym na przykład świadczą wyniki badań in vitro przedstawione w niniejszym opisie. Na przykład związki o wzorze I korzystnie charakteryzują się IC 50 w zakresie 1 x do 1 x 10-5 M, korzystnie poniżej 500 nm, 250 nm, 100 nm i 50 nm w przypadku BCR-Ab1 typu dzikiego i mutantów G250E, E255V, T315I, F317L i M351T BCR-Ab1. Związki o wzorze I w stężeniu 10 μm korzystnie charakteryzują się wartością procentową hamowania powyżej 50%, korzystnie powyżej około 70% względem kinaz Ab1, Bcr-Ab1, Aurora-A, Ax1, BMX, CHK2, c-raf, csrc, Fes, FGFR3, FIt3, IKKα,IR, JNK2α2, Lck, Met, MKK6, MST2, p70s6k, PDGFRα, PKA, PKD2, ROCK-II, Ros, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SAPK4, Syk, Tie2 i TrkB.

16 15 Zastrzeżenia patentowe 1. Związek o wzorze I: w którym: Y wybiera się z N i CH; R 1 wybiera się z atomu wodoru i grupy C 1-6 alkilowej; R 2 wybiera się z atomu wodoru i grupy C 1-6 alkilowej; lub R 1 i R 2, wraz z pierścieniem fenylowym, do którego dołączone są R 1 i R 2, tworzą grupę C 6-10 arylową lub C 5-10 heteroarylową; R 3 wybiera się z NR 4 R 5 i X 1 R 5 ; przy czym X 1 wybiera się z wiązania i grupy C 1-4 alkilenowej; R 4 wybiera się z atomu wodoru i grupy C 1-6 alkilowej; R 5 wybiera się z grupy C 6-10 arylowej ewentualnie podstawionej 1 do 3 grupami wybranymi niezależnie spośród podstawionej halogenem grupy C 1-6 alkilowej, C 1-6 alkoksylowej, C 5-10heteroarylo-C 0-4 alkilowej i C 3-8 heterocykloalkilowo-c 0-4 alkilowej, przy czym wspomniane podstawniki heteroarylowe i heterocykloalkilowe R 5 są ewentualnie podstawione grupą C 1-6 alkilową, a także ich dopuszczalne farmaceutycznie sole, hydraty, solwaty i stereoizomery 2. Związek według zastrzeżenia 1, w którym oba R 1 i R 2 to atomy wodoru lub R 1 i R 2, wraz z pierścieniem fenylowym, do którego dołączone są R 1 i R 2, tworzą grupę chinolinylową lub naftalenylową. 3. Związek według zastrzeżenia 2, w którym R 3 wybiera się z NHR 3 i X 1 R 5 ; przy czym X 1 wybiera się z wiązania i grupy metylenowej; R 5 wybiera się z grupy fenylowej ewentualnie podstawionej 1 do 3 grupami wybranymi niezależnie spośród grupy trifluorometylowej, metoksylowej, imidazolilowej i piperazynylometylowej, przy czym wspomniane podstawniki piperazynylowe R 5 są ewentualnie podstawione grupą metylową i etylową. 4. Związek według zastrzeżenia 1 wybrany spośród 1-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4-yloksy)-fenylo]-3-(3- trifluorometylofenylo)-mocznika; 1-[4-(4-etylo-piperazyn-ylometylo)-3-trifluorometylo-fenylo]-3-(d-(7H-pirolo[2,3- d]pirymidyn-4-yloksy)-fenylo]-mocznika;1-[3-(4-metylo-imidazol-1-ilo)-5-trifluorometylo-fenylo]-3-[4-(7hpirolo[2,3-d]pirymidyn-4-yloksy)-fenylo]-mocznika; 1-(3,5-dimetoksy-fenylo)-3-[4-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4- yloksy)-fenylo]-mocznika; 1-[4-(9H-puryn-6-yloksy)-fenylo]-3-(3-trifluorometylo-fenylo)-mocznika; 1-[3-(4-metylo- imidazol-1-ilo)-5-trifluometylo-fenylo]-3-[4-(9h-puryn-6-yloksy)-fenylo]-mocznika;1-[4(4-etylo-piperazyn-1- ylometylo)3-trifluorometylo-fenylo]-3-[4-(9h-puryn-6-yloksy)-fenylo]-mocznika; 1-[5-(7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4- yloksy)-chinolin-8-ylo]-3-(3-trifluorometylo-fenylo)-mocznika; N-[4-(7H-pirolo-[2,3-d]pirymidyn-4-yloksy)-fenylo]- 2-(3-trifluorometylo-fenylo)-acetamidu; 2-[3-(4-metylo-imidazol-1-ilo)-5-trifluorometylofenylo]-N-[4-(9H-puryn-6- yloksy)-fenylo]-acetamidu; N-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4-yloksy)-fenylo]-3-trifluorometylo-benzamidu; 3-(4- metylo-imidazol-1-ilo)-n-[4-(7h-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4-yloksy)-fenylo]-5-trifluorometylo-benzamidu; N-[4-(9Hpuryn-6-yloksy)-fenylo]-3-trifluorometylo-benzamidu; 4-(4-etylo-piperazyn-1-ylometylo)-N-[4-(9H-puryn-6- yloksy)-fenylo]-3-trifluorometylo-benzamidu i N-[5-(9H-puryn-6-yloksy)-chinolin-8-ylo]-3-trifluorometylobenzamidu. 5. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca skuteczną leczniczo ilość związków z jednego z zastrzeżeń 1 do 4 w połączeniu z dopuszczalną farmaceutycznie substancją pomocniczą. 6. Związek z jednego z zastrzeżeń 1 do 4 do stosowania w sposobie leczenia choroby u zwierzęcia, w przypadku której hamowanie aktywności kinazowej może zapobiegać, hamować lub poprawić stan patologiczny i/lub symptomy choroby. 7. Związek do stosowania w sposobie leczenia z zastrzeżenia 6, przy czym kinazę wybiera się spośród AbI, Bcr- Abl, AxI, BMX, CHK2, c-raf, csrc, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IR, JNK2α2, Lck, Met, MKK6, MST2, p70s6k, PDGFRα, PKA, PKD2, ROCK-II, Ros, Rskl, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SAPK4, Syk, Tie2 i TrkB. 8. Zastosowanie związku z jednego z zastrzeżeń 1 do 4 do wytwarzania leku do leczenia choroby u zwierzęcia, w przypadku której aktywność kinazowa Abl, Bcr-Abl, Axl, BMX, CHK2, c-raf, csrc, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IR, JNK2α2,Lck, Met, MKK6, MST2, p70s6k, PDGFRα, PKA, PKD2, ROCK-II, Ros, Rsk1, SAPK2α,SAPK2β, SAPK3, SAPK4, Syk, Tie2 i TrkB ma udział w patologii i/lub symptomów choroby.