Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Transkrypt

1 Vol. 8/2009 Nr 1(26) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Mutacje jako przyczyny nieprawidłowego wzrastania w aspekcie diagnostycznym i terapeutycznym Diagnostic and Therapeutic Aspect of Mutations as Causes of Impaired Growth 1 Andrzej Kędzia, 2 Anna Goździcka-Józefiak, 1 Monika Obara-Moszyńska, 3 Mieczysław Walczak, 4 Mieczysław Szalecki 1 II Katedra Pediatrii Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Klinika Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego, 2 Zakład Wirusologii Molekularnej, Instytut Biologii Eksperymentalnej Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu, 3 II Klinika Chorób Dzieci Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie, 4 Oddział Endokrynologiczno-Diabetologiczny Wojewódzkiego Specjalistycznego Szpitala Dziecięcego im. Władysława Buszkowskiego w Kielcach Adres do korespondencji: dr hab. med. Andrzej Kędzia, II Katedra Pediatrii Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Klinika Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego, ul. Szpitalna 27/33, Poznań, tel.: , fax: , akedzia@ump.edu.pl Słowa kluczowe: niedobory wzrostu, transdukcja sygnału wzrostowego, mutacje, diagnostyka Key words: growth deficit, transduction of growth signal, mutations, diagnostic STRESZCZENIE/ABSTRACT Wstęp. Celem pracy była diagnostyka molekularna czynników biorących udział w transdukcji sygnału wzrostowego u chorych z dużymi niedoborami wzrostu i nadmierną odpowiedzią wydzielniczą hormonu wzrostu w testach stymulacyjnych. Materiał i metody. Badaniami objęto 103 pacjentów w wieku 4,6-18,0 lat, u których przy pomocy metod molekularnych, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy, analiza polimorfizmu konformacji pojedynczych nici DNA, sekwencjonowania oraz kompleksacji z czynnikami transkrypcyjnymi, dokonano oceny prawidłowości przekazu sygnału wzrostowego. Wyniki. U niespełna 8% badanych stwierdzono mutacje odcinka promotorowego V1 genu receptora dla hormonu wzrostu, u niespełna 16% mutacje receptora dla hormonu wzrostu, a u prawie 15% mutacje P1 promotora genu insulinopodobnego czynnika wzrostu I. Jednego z chorych podejrzewamy o mutację receptora dla insulinopodobnego czynnika I, co wymaga jednak dalszych badań. Wnioski. Mutacje cząsteczek biorących udział w przekazie sygnału wzrostowego wydają się częstsze, niż to się dotychczas wydawało. Równie istotną rolę odgrywają nieprawidłowości w rejonach promotorowych i regulatorowych genów kodujących czynniki transdukujące sygnał. Endokrynol. Ped. 8/2009;1(26):9-16. Introduction. The aim of the study was the analysis of molecular factors taking part in the growth signal transduction in patients with major growth deficits and excessive secretory response of the growth hormone in stimulation tests. Material and methods. The study included 103 patients, years of age, in whom during molecular analysis involving polymerase chain reaction, analysis of conformation of single DNA strands, sequencing and complexing with transcriptional factors the growth signal transduction was assessed. Results. In nearly 8% of cases a mutation of promoter region V1 of growth hormone receptor gene was found, 16% have had mutations of the growth hormone receptor itself, while almost 15% patients there was mutation of promoter gene P1 of insulin like growth factor I. One 9

2 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;1(26):9-16 of the patients was suspected of having a mutation of the insulin like growth factor I receptor, which requires however further studies. Conclusions. Mutations of factors taking part in growth signal transduction seem far more frequent that it was previously believed. An equally important role is played by mutations within the promoter and regulatory regions of genes encoding the signal transducing factors. Pediatr. Endocrinol. 8/2009;1(26):9-16. Wstęp W naszym ośrodku od dziesięciu lat diagnozujemy pacjentów z niskorosłością i prowadzimy terapię hormonem wzrostu. Z biegiem czasu powstała grupa pacjentów, u których nie można było znaleźć przyczyny niskorosłości, a deficyt wzrostu stale, stopniowo pogłębiał się. Stało się to punktem wyjścia do obecnych badań nad nieprawidłowościami transdukcji sygnału wzrostowego. Dotychczasowa uwaga badaczy zajmujących się nieprawidłowym przekazem sygnału wzrostowego skupiona była przede wszystkim na samych cząsteczkach przenoszących informację wzrostową oraz na ich receptorach. W pracy tej zwrócono uwagę na odcinki promotorowe i regulatorowe genów kodujących cząsteczki biorące udział w tej transdukcji, jako miejsca wrażliwe na mutacje, mogące być przyczyną nieprawidłowego przekazu sygnału wzrostowego. Materiał i metody Spośród badanych dzieci, u których wykluczono GHD, wyodrębniono grupę chorych o wygórowanej odpowiedzi somatotropinowej (103 osoby). Jako wartość graniczną przyjęto wydzielanie wyższe niż 40 mciu/ml. Dodatkowym kryterium były obniżone stężenia IGF-I oraz niezadowalająca odpowiedź w teście generacji somatomedyn. Grupa ta liczyła 88 pacjentów: 37 dziewcząt i 51 chłopców. Wiek tych badanych wahał się od 6 3/12 do 17 8/12. U wszystkich badanych oznaczono stężenie białek wiążących dla hormonu wzrostu (GHBP). W grupie tej przeprowadzono analizę molekularną receptora dla hormonu wzrostu (GHR) oraz jego odcinka promotorowego V1 GHR. U chorych z wykluczonym uszkodzeniem GHR wykonano ocenę budowy molekularnej cząsteczki IGF-I, a następnie ocenę 1630 nukleotydów odcinka promotorowego IGF-I oraz 322 nukleotydów końca 3`UTR. Analizę genu IGF-I i 3`UTR przeprowadzono także u dzieci z prawidłowym poziomem IGF-I. W przypadku znalezienia mutacji w odcinku promotorowym przeprowadzano kompleksację zmienionych fragmentów DNA z białkami ekstraktów komórek HeLa oraz ekstraktów wątrobowych, analizując wiązanie czynników transkrypcyjnych. Dodatkowo oznaczono poziomy białka wiążącego dla IGF-I (IGFBP3). Metodykę oznaczeń stężenia GH, IGF-I, GHBP, IG- FBP3 oraz metody molekularne dokładnie opisano we wcześniejszej pracy [1]. Aby sprawdzić wpływ mutacji w obrębie odcinka promotorowego P1 IGF-I na wiązanie czynników transkrypcyjnych, prowadzono kompleksację zmutowanych fragmentów z ekstraktami komórek HeLa i ekstraktami wyciągów wątrobowych. Wyniki Charakterystykę biochemiczną pacjentów z nadmiernym wyrzutem hormonu wzrostu przedstawiono w tabeli I. Wśród pacjentów diagnozowanych w kierunku uszkodzeń receptora dla hormonu wzrostu, pomijając stwierdzone zmiany polimorficzne, w pierwszym przypadku stwierdzono obecność mutacji w domenie zewnątrzbłonowej GHR. Mutacja ta była zlokalizowana w eksonie 5 GHR, a więc w jednym z eksonów kodujących część receptora, odpowiadającą za odebranie sygnału niesionego przez cząsteczkę hormonu wzrostu. Polegała ona na substytucji tyminy cytozyną w pozycji 88. Ponadto, jak wykazano podczas sekwencjonowania, mutacja ta była obecna tylko w połowie badanych klonów. Pozostała połowa klonów była prawidłowa. W części zewnątrzbłonowej GHR u około 22% badanych pacjentów i zdrowych z grupy kontrolnej wykazano także obecność mutacji w obrębie eksonu 6, ale miała ona charakter polimorficzny, stanowiąc często występujący wariant. U ośmiu badanych wykazano obecność mutacji w eksonie 10, kodującym część cytoplazmatyczną receptora. W sześciu przypadkach prowadziło to do zmiany kodowanego aminokwasu (tabela II). W jednym przypadku była to zmiana polimorficzna, występująca zarówno u zdrowych, jak i u chorych. Także u 19 badanych wykryto zmiany w obrębie fragmentu 3`UTR. U 16 spośród nich był to polimorfizm. Analizie molekularnej poddano także sekwencję nukleotydową promotora V1 GHR. Zidentyfikowano dziewięć mutacji. U jednego z pacjentów stwierdzono substytucję T w C w pozycji (-) 597, G-A 10

3 Kędzia A. i inni: Mutacje jako przyczyny nieprawidłowego wzrastania w aspekcie diagnostycznym i terapeutycznym Tabela I. Charakterystyka biochemiczna pacjentów z nadmiernym wyrzutem hormonu wzrostu Table I. Biochemical characteristic of the patients with excessive reproach of growth hormone Całość badanej grupy Dziewczęta Chłopcy Liczba badanych Max. stężenie GH w teście stymulacyjnym (mciu/ml) GHBP (ng/ml) IGF-I (ng/ml) ,08 8, (-3,98 do+2,1 SD) ,09 6,78 0,08 8, IGFBP3 (ng/ml) (-3,7 do+7,5 SD) Tabela II. Mutacje receptora GHR i odcinka 3`UTR Table II. GHR mutations and the 3 UTR region Zmiany nukleotydów i kodonów T C TCT TCC GGGG T G ATT ATG T C GTG GCG GAAG CCA CCG T A CTC CAC ATG GTG C A CTC ATC ATT GTT C A AAC AAA AAAA TGA TGG AAA AGA Lokalizacja mutacji Zmiana aminokwasu (kodon) Ilość przypadków Komentarz (pacjent) 110 nt, ekson 5 brak zmiany (88) 1 heterozygota 174 nt, ekson 6 brak zmiany (168) ~22% badanych polimorfizm 300 nt, ekson 10 Ile-Met (376) 2 heterozygota 755 nt, ekson 10 Val-Ala (528) 1 heterozygota 777 nt, ekson 10 brak zmiany (536) 1 heterozygota 793 nt, ekson 10 brak zmiany (541) 1 heterozygota 686 nt, ekson 10 Leu-Hpro (505) 1 heterozygota 706 nt, ekson 10 Met-Val (512) 1 heterozygota 748 nt, ekson 10 Leu-Ile (526) 11 polimorfizm, gł. heterozygota 811 nt, ekson 10 Ile-Val (532) 1 homozygota 1482 nt 3`UTR - 1 heterozygota 1381 nt 3`UTR - 1 heterozygota 1335 nt 3`UTR - 16 polimorfizm, gł. heterozygota 1380 nt 3`UTR - 1 heterozygota 11

4 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;1(26):9-16 w pozycji (-) 618 oraz G w A w pozycji (-) 564. Drugi badany wykazywał substytucje w pozycji (-) 437 T w C a w (-) 545 A w T. Wszystkie mutacje występowały u pacjentów heterozygotycznych. Mutacje stwierdzone w V1 GHR są prezentowane w tabeli III. Tabela III. Mutacje sekwencji promotorowej V1 GHR Table III. Mutations of the promoter sequence of V1 GHR Rodzaj mutacji Lokalizacja mutacji Komentarz (pacjent) 1 T C -597 heterozygota 2 G A -618 heterozygota 3 G A -564 heterozygota 4 T C -437 heterozygota 5 A T -545 heterozygota 6 A T -605 heterozygota heterozygota 8 T C -439 heterozygota heterozygota U wszystkich pacjentów, którzy wykazali się nadmierną odpowiedzią na bodziec w teście stymulacyjnym GH, zarówno tych z obniżonym, jak i tych z prawidłowym poziomem IGF-I, wykonano analizę molekularną genu IGF-I. U żadnego z pacjentów nie znaleziono mutacji w badanym genie. W dalszym etapie u wszystkich badanych, którzy wykazywali obniżone poziomy IGF-I, wykonano analizę fragmentu regulatorowego promotora genu IGF-I oraz końca 3`UTR. U 13 badanych wykazano nieprawidłowości w obrębie odcinka regulatorowego promotora. Napotkano tu mutacje o charakterze delecji, addycji oraz substytucji dotyczących zarówno pojedynczych nukleotydów, jak i fragmentów (tabela IV). U 8 pacjentów stwierdzono obecność więcej niż jednej mutacji w odcinku promotorowym. Aby ocenić wpływ wykrytych mutacji na funkcję i stężenie IGF-I, wykonano ocenę wiązania czynników transkrypcyjnych pochodzących z ekstraktu komórek HeLa oraz ekstraktów wątrobowych przez zmutowane fragmenty odcinka regulatorowego promotora. W pięciu przypadkach stwierdzono różnice w wiązaniu czynników transkrypcyjnych. Dotyczyło to zmiany (-)888(-G), (-)775(A-G), (-)812(C-T). Występowanie tych zmian w jednym fragmencie powoduje niemożność Tabela IV. Mutacje odcinka regulatorowego promotora i fragmentu 3`UTR genu IGF-I Table IV. Mutation of the regulatory fragment of the promoter and the 3`UTR fragment of the IGF-I gene Lokalizacja mutacji* Rodzaj mutacji C G Liczba osób 28, polimorfizm C T i CC GT 16, polimorfizm C T G T G C C T G 1, heterozygota C G T A 1, heterozygota T A 1, heterozygota T 1, heterozygota T 1, heterozygota T C C T T G 1, heterozygota T C 1, heterozygota T C 1, heterozygota * Lokalizacja mutacji według głównego miejsca lokalizacji transkrypcji. przyłączenia dwóch czynników transkrypcyjnych. Delecja reszty G w pozycji (-)888 powoduje brak wiązania jednego lub dwóch czynników transkrypcji w zależności od użytego ekstraktu. Substytucja C-T w pozycji (-)383, addycja +G(-383) i substytucja T-A(-376) powoduje zanik formowania co 12

5 Kędzia A. i inni: Mutacje jako przyczyny nieprawidłowego wzrastania w aspekcie diagnostycznym i terapeutycznym najmniej jednego kompleksu DNA-białko w przypadku ekstraktu HeLa, ale nie występuje w przypadku ekstraktu wątroby ludzkiej. Substytucja w pozycji +105 T-C powoduje niezwiązanie jednego z czynników transkrypcyjnych z ekstraktu HeLa, natomiast nie obserwowano różnic w wiązaniu czynników pochodzących z ekstraktów wątrobowych. Podobnie dzieje się w przypadku zamiany T-C(+156). U jednego chłopca ze szczególnie dużym deficytem wzrostu, znacznym opóźnieniem wieku kostnego i dysmorfią twarzy (kariotyp w granicach normy) podejrzewamy mutację w receptorze dla IGF-I. Poziom spoczynkowego IGF-I był nieco obniżony (123 ng/ml, -1 SDS), w teście generacji somatomedyny podnosił się do wartości 397 ng/ml. Stężenie GHBP wynosiło 2,75 ng/ml, IGFBP ng/ml. Próba leczenia GH nie wpłynęła na zmianę tempa wzrastania. Analiza receptora GH wykazała mutacje w eksonie 3, 6 i 8 o charakterze polimorfizmu. Obecnie analizujemy receptor dla IGF-I. Wyniki będą opublikowane w oddzielnej pracy. Dyskusja Powszechnie przyjmuje się, że za niskorosłość o podłożu hormonalnym odpowiedzialne jest zaburzone wydzielanie hormonu wzrostu. W praktyce klinicznej często mamy do czynienia z innymi przyczynami hormonalnymi, jak np. z niedoczynnością tarczycy, której częstość występowania wśród innych przyczyn niskorosłości określa się na 4% [2]. Także inne hormony i czynniki wywierają znaczący wpływ na rozwój układu szkieletowego i wzrastanie. Deficyt hormonu wzrostu stanowi w 8-10% przyczynę nieprawidłowego wzrastania [1, 2]. Coraz bardziej liczna staje się grupa niskorosłych, u których wykluczyliśmy niedobory hormonu wzrostu i nie potrafimy powiedzieć, dlaczego nie rosną. Wykonując diagnostykę wydzielania hormonu wzrostu, niejednokrotnie w odpowiedzi na stymulację uzyskiwaliśmy wręcz wysokie wyrzuty hormonu wzrostu. Jak się wydaje, zjawisko to może sugerować istnienie przeszkody na drodze dalszego przekazu sygnału wzrostowego, w odpowiedzi na co organizm, próbując ją obejść, zwiększa ilości uwalnianego hormonu wzrostu [3]. Podobne mechanizmy opisywane są także u części pacjentów z niewrażliwością na IGF-I [4]. W badaniach początkowo wzięliśmy pod uwagę tylko te przypadki, w których mieliśmy do czynienia z niskim poziomem IGF-I, a zwłaszcza tych chorych, którzy nie mogli wykazać się prawidłową odpowiedzią w teście generacji somatomedyn. Ten model postępowania został także zaakceptowany przez innych [3]. Jak wykazał na swoim przykładzie jeden z naszych pacjentów, zasady takie nie mogą być przyjmowane dogmatycznie. Otóż okazało się, że już obniżenie poziomu IGF-I, z częściowo zachowaną zdolnością udzielenia odpowiedzi w teście generacji, może być dostatecznym wskazaniem do poszukiwania przyczyny, jaką jest uszkodzenie receptora dla hormonu wzrostu (GHR). Chłopiec ten okazał się mozaiką pod względem GHR. W trakcie prowadzonej analizy molekularnej napotkaliśmy zarówno prawidłowe, jak i nieprawidłowe klony. Sugeruje to, że nasz pacjent jest heterozygotą i posiada różne allele genu GHR na homologicznych chromosomach. Obecnie w GHR zidentyfikowano ponad 36 mutacji [5]. Większość z nich występuje w eksonach domeny zewnątrzbłonowej receptora [5 9]. Trzeba jednak pamiętać, że na powstanie aktywnej cząsteczki GHR duży wpływ ma także proces dojrzewania mrna, wycinanie intronów i składanie eksonów. Mutacje w sekwencji intronów mogą prowadzić do syntezy transkryptów, które nie ulegają translacji lub syntezowane na nich białka funkcjonują nieprawidłowo. Znacznie rzadziej niż w domenie zewnątrzkomórkowej mutacje identyfikowane są w pozostałych domenach receptora. Na przykład w opisanej przez Iida mutacji w eksonie 9 następuje utrata 98% domeny cytoplazmatycznej i całkowity brak możliwości przekazywania sygnału, z jednoczesnym występowaniem wysokich poziomów białek wiążących [9]. Jak się wydaje, istnieją jeszcze inne możliwe oddziaływania mutacji punktowych na proces wzrastania. Zmiany niektórych zasad w kodonie powodować mogą zmianę w postaci pojawiania się lub znikania miejsc potencjalnych metylacji, co może wywierać znaczący wpływ na imprinting genomowy. Tak jak w przypadku jednego z naszych pacjentów, trzeba pamiętać o tym, że większość cytozyn jest metylowana. Mutacja polegająca na zamianie cytozyny w tyminę może spowodować zniknięcie miejsca metylacji, co może za sobą pociągnąć oddziaływanie na kontrolę ekspresji genu [10]. Takie pojedyncze zmiany zasad mogą także być odpowiedzialne za osłabienie lub stabilizację siły poszczególnych wiązań. W oparciu o uzyskane przez nas wyniki możemy stwierdzić, że nieprawidłowości w sekwencji kodującej GHR nie zawsze muszą odpowiadać za niskorosłość. Spośród 14 zidentyfikowanych mutacji tylko 6 powodowało zmianę kodowanego aminokwasu, w tym jedną można uznać za polimorfizm. Zmienione 13

6 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;1(26):9-16 aminokwasy zwykle niewiele różnią się budową i właściwościami od aminokwasów wyjściowych. Inaczej ma się sytuacja, gdy, tak jak u naszych pacjentów pojawia się substytucja izoleucyny metioniną w pozycji 376, czy też metioniny waliną w kodonie 512 oraz leucyny hydroksyproliną w kodonie 505. Może to prowadzić do znacznych zmian konformacyjnych, bowiem lokalizacja ta wypada poza bogatym w prolinę regionem odpowiedzialnym za przekaz sygnału do komórki. Przedstawione przez nas mutacje w odcinku promotorowym V1 GHR miały wyłącznie charakter heterozygotyczny. Trudno jednoznacznie określić wpływ, jaki wywierają na przekaz sygnału wzrostowego. Wydaje się jednak, że podjęty przez nas kierunek badań może przynieść u przyszłego pacjenta wyjaśnienie przyczyny zwolnionego wzrastania, jaką potencjalnie może być nieprawidłowa transkrypcja białka receptorowego. Może to prowadzić do zmniejszonej ilości receptora i stanowić czynnik ograniczający w przekazie sygnału. W ostatnim roku pojawiły się doniesienia o odkryciu mutacji genu kodującego białko STAT5b, biorące udział w komórkowej transdukcji sygnału [11, 12]. Prowadzi to do unieruchomienia kaskady fosforylacyjnej. Fakt ten podkreśla, jak ważne jest poszukiwanie molekularno-genetycznych nieprawidłowości oddziałujących na oś GH-IGF-I [11, 12]. Analiza struktury genu kodującego IGF-I nie wykazała obecności mutacji u żadnego z badanych. Jak wiadomo z literatury, mutacje te stanowią stosunkową rzadkość w porównaniu z innymi przyczynami zaburzeń w transdukcji sygnału wzrostowego [3, 13]. Na przykład Savage opisuje pacjenta ze stwierdzoną mutacją w 4 i 5 domenie IGF-I [3]. U tego chorego poziom hormonu wzrostu był wysoki, IGFBP3 prawidłowy, a IGF-I nieoznaczalny. Wśród naszych pacjentów był chłopiec, u którego poziom IGF-I wynosił 10 ng/ml, poziom białka wiążącego był obniżony (315 ng/ml), a wydzielanie hormonu wzrostu przekraczało 40 miu/ml. Analiza genu IGF-I nie wykazała jednak u niego żadnych nieprawidłowości [14]. W analizie odcinka regulatorowego promotora IGF-I oraz fragmentu 3`UTR odpowiedzialnego za trwałość cząsteczki wykazaliśmy u 13 badanych różne mutacje [14]. Występowanie mutacji w obrębie tego odcinka może prowadzić do nieprawidłowego wiązania czynników transkrypcyjnych, czego efektem będzie obniżenie poziomu IGF-I. Ocena wpływu, jaki wywierają te mutacje na nieprawidłowo niski poziom IGF-I, jest bardzo trudna, a więc trudne jest też sprawdzenie, w jakim stopniu wykazane nieprawidłowości są przyczyną występującego obrazu klinicznego. W ocenie wiązania czynników transkrypcyjnych do nieprawidłowych fragmentów okazało się, że tylko w kilku przypadkach dało się udowodnić, że za niski poziom IGF-I i nieprawidłowe wzrastanie odpowiada nieprawidłowa transkrypcja IGF-I powodowana mutacjami w obrębie promotora P1 IGF-I. Natomiast u pozostałych badanych wiązanie przebiegało, jak się wydaje, prawidłowo, chociaż nie można tego przyjąć z całą pewnością. Niemałą rolę w transdukcji sygnału wzrostowego odgrywają także białka wiążące. Ostatnio opisano przypadek deficytu w systemie IGF skojarzony z inaktywacją genu kodującego ALS (Acid-Labile Subunit) [15]. Jak widać z powyższych przykładów, potencjalnych możliwości uszkodzenia drogi przekazu sygnału jest wiele. Najgroźniejsze dla naszych pacjentów są mutacje w genie IGF1R [4, 16 18]. Jak podano w wynikach, u jednego z naszych pacjentów podejrzewamy ten typ mutacji. Wnioski Mutacje cząsteczek biorących udział w przekazie sygnału wzrostowego wydają się częstsze, niż to się dotychczas wydawało. Równie istotną rolę odgrywają nieprawidłowości w rejonach promotorowych i regulatorowych genów hodujących czynniki transdukujące sygnał. 14

7 Kędzia A. i inni: Mutacje jako przyczyny nieprawidłowego wzrastania w aspekcie diagnostycznym i terapeutycznym PIŚMIENNICTWO/REFERENCES [1] Kędzia A.: Diagnostyka zaburzeń wzrastania oraz możliwości leczenia dzieci i młodzieży z niedoborem wzrostu z regionu wielkopolskiego. Wydawnictwo Naukowe UAM w Poznaniu, Poznań [2] Horner J.M., Thorsson A.V., Hintz R.L.: Growth deceleration patterns in children with constitutional short stature: an aid to diagnosis. Pediatrics, 1978:62, [3] Savage M.O., Woods K.A., Clark A.J. et al.: Phenotype-genotype relations in growth hormone insensitivity. Arch. Pediatr., 1998:5, [4] Abuzzahab M.J., Schneider A., Goddard A. et al.: IGF-I receptor mutations resulting in intrauterine and postnatal growth retardation. N. Engl. J. Med., 2003:349, [5] Rosenbloom A.L.: Physiology and disorders of the growth hormone receptor (GHR) and GH-GHR signal transduction. Endocrine, 2000:12, [6] Laron Z., Blum W., Chatelain P. et al.: Classification of growth hormone insensitivity syndrome. J. Pediatr., 1993:122, 241. [7] Rosenbloom A.L.: Growth hormone insensitivity: physiologic and genetic basis, phenotype, and treatment. J. Pediatr., 1999:135, [8] Obrępalska-Stęplowska A., Kędzia A., Goździcka-Józefiak A. et al.: Analysis of the human growth hormone receptor and IGF-I coding sequences in children with growth disorders. J. Pediatr. Endocrinol. Metab., 2003:16, [9] Iida K., Takahashi Y., Kaji H. et al.: Growth hormone (GH) insensitivity syndrom with high serum GH-binding protein levels caused by a heterozygous splice site mutation of the GH receptor gene producing a lack of intracellular domain. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1998:83, [10] Lewis J., Bird A.: DNA methylation and chromatin structure. FEBS Lett., 1991:285, [11] Eugster E.A., Pescovitz O.H.: New revelations about the role of STATs in stature. N. Engl. J. Med., 2003:349, [12] Kofoed E.M., Hwa V., Little B. et al.: Growth hormone insensitivity associated with a STAT5b mutation. N. Engl. J. Med., 2003:349, [13] Woods K.A., Clark A.J., Amselem S. et al.: Relationship between phenotype and genotype in growth hormone insensitivity syndrome. Acta Paediatr., 1999:88, [14] Obrępalska-Stęplowska A., Kędzia A., Trojan J. et al.: Analysis of coding and promoter sequences of the IGF-I gene in children with growth disorders presenting with normal level of growth hormone. J. Pediatr. Endocrinol. Metab., 2003:16, [15] Domene H.M., Bengolea S.V., Martinez A.S. et al.: Deficiency of the circulating insulin-like growth factor system associated with inactivation of the acid-labile subunit gene. N. Engl. J. Med., 2004:350, [16] Fukushima K., Komatsu H., Matsumoto M. et al.: IGF-related proteins at birth in a case of antenatally diagnosed Silver-Russell Syndrome. Pediatr. Res., 2002:51, [17] Root A.W.: Leanness, extended lifespan and IGF-I receptor mutations in mice: fascinating observations. Grow. Genet. Horm., 2003:19, [18] Okubo Y., Siddle K., Firth H. et al.: Cell proliferation activities on skin fibroblasts from a short child with absence of one copy of the type 1 insulin-like growth factor receptor (IGF1R) gene and a tall child with three copies of the IGF1R gene. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2003:88,