Słowa kluczowe: choroba wieńcowa, generacja trombiny, kompleks trombina-antytrombina, trombogram

Transkrypt

1 Czynniki wpływające na generację trombiny mierzoną jako stężenie kompleksów trombina- -antytrombina i metodą automatycznego skalibrowanego trombogramu u chorych z zaawansowaną chorobą wieńcową Factors influencing thrombin generation measured as thrombin-antithrombin complexes levels and using calibrated automated thrombogram in patients with advanced coronary artery disease Ewa Stępień 1, Dariusz Plicner 1, Agnieszka Branicka 1, Elżbieta Stankiewicz 1, Agnieszka Pazdan 1, Maria Śnieżek-Maciejewska 2, Izabela Górkiewicz 1, Bogusław Kapelak 2, Jerzy Sadowski 2 1 Krakowski Szpital Specjalistyczny im. Jana Pawła II, Kraków 2 Klinika Chirurgii Serca, Naczyń i Transplantologii, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków Streszczenie: Wprowadzenie. Układ krzepnięcia odgrywa istotną rolę w patogenezie miażdżycy. Generacja trombiny jest kluczowym etapem w procesie krzepnięcia. Cele. Porównanie metod automatycznego trombogramu (calibrated automated thrombogram CAT) i pomiaru kompleksów trombina-antytrombina (TAT). Identyfikacja czynników wpływających na generację trombiny u chorych z zaawansowaną chorobą wieńcową zakwalifikowanych do zabiegu pomostowania aortalno-wieńcowego (coronary artery bypass graft CABG). Analiza tradycyjnych (wiek, płeć, nadciśnienie tętnicze, cukrzyca) i nowych (fibrynogen i białko C reaktywne CRP) czynników ryzyka miażdżycy oraz leczenia w okresie przedoperacyjnym (aspiryna mg/d) w odniesieniu do aktywacji krzepnięcia. Pacjenci i metody. Oceniano 135 pacjentów ze stabilną dławicą piersiową przyjętych do planowanego zabiegu CABG z istotnym zwężeniem pnia lewej tętnicy wieńcowej (>50%) lub w głównych tętnicach nasierdziowych (>70%). Generację trombiny mierzono jako stężenie kompleksu TAT oraz metodą CAT (C max maksymalne stężenie trombiny, ETP endogenous thrombin potential, endogenny potencjał trombiny, czyli pole pod krzywą przyrastania stężenia trombiny w czasie). Mierzono również poziom markera aktywacji płytek (β-tromboglobuliny). Wyniki. Nie stwierdzono korelacji między TAT, C max i ETP oraz czynnikami ryzyka, a także poziomem β-tromboglobuliny. Zastosowanie uogólnionego modelu regresji liniowej wykazało, że wiek oraz płeć męska i cukrzyca były niezależnymi predyktorami TAT (odpowiednio: β = 0,5; p <0,0001 i β = 0,36; p = 0,02). CRP wpływało niezależnie na TAT oraz ETP (β = 0,24 i β = 0,22; p <0,05), natomiast fibrynogen na C max (β = 0,21; p <0,05). Dla β-tromboglobuliny niezależnym predyktorem było odstawienie aspiryny i płeć męska (β = 0,46; p = 0,01). Leczenie aspiryną nie miało wpływu na generację trombiny w badanej grupie. Wnioski. Wiek, zwiększony poziom fibrynogenu, CRP, cukrzyca i płeć męska wpływają na zwiększenie generacji lub aktywność trombiny u chorych kwalifikowanych do CABG. Wyniki uzyskane metodą CAT i oznaczenia TAT nie korelują ze sobą, co wskazuje na odmienny mechanizm generacji trombiny w obu układach i wyklucza zamienne stosowanie obu metod. Słowa kluczowe: choroba wieńcowa, generacja trombiny, kompleks trombina-antytrombina, trombogram Abstract: Introduction. Haemostatic factors play an important role in atherothrombosis. Thrombin generation is a crucial stage of blood coagulation. Objectives. Comparison of different thrombin generation markers: thrombin-antithrombin complex (TAT) generation and calibrated automated thrombogram method (CAT). Identification of factors influencing thrombin generation in patients with stable angina (SA) enrolled to the coronary artery bypass grafting (CABG) surgery. Analysis of traditional (age, gender, hypertension and diabetes) and novel (fibrinogen and C-reactive protein [CRP]) risk factors and the antiplatelet therapy (aspirin mg/d) in relation to coagulation. Patients and methods. In 135 SA patients with left main coronary artery stenosis Czynniki wpływające na generację trombiny mierzoną jako stężenie kompleksów

2 (>50%) or major epicardial artery stenosis (>70%), plasma TAT levels, maximal thrombin concentration (C max ) and endogenous thrombin potential (ETP) were determined. A marker of the platelet activation (β-thromboglobulin) was also measured. Results. No correlations among TAT, C max, ETP, risk factors and β-thromboglobulin were observed. Linear regression model showed that independent predictors of TAT levels were age (β = 0.5; p = <0.0001), male gender and diabetes (β = 0.36; p = 0.02). CRP independently predicted TAT and ETP (β = 0.24 and β = 0.22; p <0.05, respectively), while fibrinogen predicted C max (β = 0.21; p <0.05). Independent predictors of β-thromboglobulin were a male gender and aspirin use cessation (β = 0.46; p = 0.01). Aspirin treatment had no effect on thrombin generation. Conclusions. Age, higher fibrinogen, CRP, diabetes and male gender influence thrombin generation and/or coagulation activation in SA patients. Plasma levels of thrombin-antithrombin complexes do not correlate with the parameters obtained using the calibrated automated thrombogram method (C max, ETP). Key words: calibrated automated thrombogram, coronary artery disease, thrombin generation, thrombin- -antithrombin complex Adres do korespondencji: dr biol. Ewa Stępień, Samodzielna Pracownia Biologii Molekularnej i Badań Naukowych, Krakowski Szpital Specjalistyczny im. Jana Pawła II, ul. Prądnicka 80, Kraków, tel.: , fax: , estepien@szpitaljp2.krakow.pl Praca wpłynęła: Przyjęta do druku: Nie zgłoszono sprzeczności interesów. Pol Arch Med Wewn. 2007; 117 (7): Copyright by Medycyna Praktyczna, Kraków 2007 WPROWADZENIE Już od ponad 20 lat wiadomo, że układ krzepnięcia odgrywa ważną rolę w patogenezie miażdżycy [1]. Badanie ARIC pokazało, że zwiększone poziomy fibrynogenu, czynnika VIII (FVIII) i czynnika von Willebranda zwiększają ryzyko wystąpienia choroby wieńcowej zarówno u kobiet, jak i mężczyzn [2]. Obecność aktywnego biologicznie czynnika tkankowego (tissue factor TF), który w warunkach fizjologicznych rozpoczyna proces krzepnięcia, stwierdzono w blaszkach miażdżycowych [3]. Wykazano obecność fragmentów protrombiny F1+2 (markera generacji trombiny) w krwi pobranej z naczyń wieńcowych od pacjentów z niestabilną chorobą wieńcową [4]. Zaobserwowano również związek między stężeniem F1+2 w osoczu a zwiększoną grubością błony wewnętrznej i środkowej tętnicy szyjnej (intima-media thickness IMT, wskaźnik zaawansowania miażdżycy) [5]. Trombina jest kluczowym enzymem kaskady krzepnięcia. W osoczu, z nieaktywnego proenzymu (protrombiny) powstaje enzymatycznie czynna trombina na skutek konwersji przez protrombinazę (kompleks aktywowanych czynników Va i Xa na powierzchni fosfolipidów) w obecności jonów Ca 2+. Aktywność osoczowa trombiny zależy zatem nie tylko od stężenia wyjściowego protrombiny, ale także od szybkości reakcji konwersji protrombiny w trombinę oraz od procesu inaktywacji trombiny, w którym biorą udział endo- i egzogenne inhibitory. Endogenna inaktywacja trombiny w osoczu następuje głównie na skutek przyłączenia się do cząsteczki trombiny jej inhibitora antytrombiny (AT), który tworzy z trombiną równomolowe kompleksy białkowe, tzw. TAT (trombina-antytrombina). Kompleksy te są wykrywane w osoczu krwi obwodowej [6] oraz w nadsączu pozyskiwanym z nacięć wykonanych na skórze w modelu uszkodzenia mikrokrążenia [7] i są, obok pomiaru stężenia fibrynopeptydu A i fragmentów F1+2 protrombiny, jednym z markerów aktywacji trombiny [8,9]. AT może również działać na poziomie hamowania aktywności protrombinazy poprzez nieodwracalne przyłączanie się do czynnika Xa. Proces inaktywacji czynnika Xa jest wzmocniony w obecności egzogennego inhibitora trombiny heparyny [10]. Poprzez allosteryczne wiązanie heparyny do AT zwiększa się szybkość i skuteczność inaktywacji Xa przez AT. Heparyna działa również bezpośrednio na trombinę zmniejszającjej aktywność niemal 5-krotnie poprzez allosteryczne wiązania osłabiające aktywność enzymatyczną trombiny [10]. Generacja trombiny zależy również w dużym stopniu od układu fibrynolitycznego: jej aktywność jest hamowana przez oddziaływania z fibryną [11], a tworzenie kompleksu trombina-trombomodulina powoduje zmianę specyficzności rozpoznawania fibrynogenu jako substratu i aktywację inhibitora fibrynolizy [12]. Złożone mechanizmy powstawania trombiny i jej hamowania są regulowane w osoczu na każdym etapie przez wzajemne oddziaływania endogennych aktywatorów i inhibitorów krzepnięcia oraz ulegają modulacji przez wprowadzenie do układu egzogennych inhibitorów, takich jak np. heparyna niefrakcjonowana i jej pochodne drobnocząsteczkowe. Ważną rolę w hamowaniu krzepnięcia, głównie za pośrednictwem blokowania zależnej od cyklooksygenazy aktywacji płytek krwi, odgrywa niewątpliwie kwas acetylosalicylowy (aspiryna). Wykazano, że lek ten osłabia również proces generacji trombiny, prawdopodobnie na drodze zmniejszania aktywności protrombinazy lub hamowania ekspresji TF [13]. W procesie generacji trombiny in vivo duży udział mają czynniki, które w sposób ilościowy lub jakościowy wpływają na dostępność lub aktywność regulatorów krzepnięcia: wrodzone niedobory antytrombiny lub białek S i C, mutacje genu protrombiny (G20210A) lub czynnika V Leiden. Do czynników środowiskowych mających wpływ na zwiększoną generację trombiny zalicza się otyłość [14], wiek [15], doustną antykoncepcję [16], a także choroby takie jak: cukrzyca [17], nadciśnienie tętnicze [18] czy choroba wieńcowa [19]. 298 POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2007; 117 (7)

3 Do oceny aktywności trombiny in vivo stosuje się testy oparte na pomiarze stężenia produktów aktywacji protrombiny (peptydy F1+2) [8], oraz poziomu kompleksów TAT przy użyciu metody ELISA [9]. Oznaczenia TAT i F1+2 nie mają jednak zastosowania w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej. Mimo zalet wynikających ze swoistości tych metod pomiaru, są one niewystandaryzowane i stosuje się je wyłącznie w celach badawczych. Inną metodą, opracowaną w latach 90. przez Hemkera [20] i zaproponowaną przez niego do rutynowej analizy, jest ocena trombogennego potencjału osocza, czyli tzw. metoda skalibrowanego automatycznego trombogramu (calibrated automated trombogram CAT) [21]. W próbce osocza ubogopłytkowego (platelet poor plasma PPP) dokonuje się kinetycznego pomiaru sygnału (fluorescencji) emitowanego przez syntetyczny substrat trombiny dodany do osocza. Skalibrowana wartość tego sygnału, przedstawiona w postaci krzywej zależności stężenia trombiny od czasu, pozwala na obliczenie takich parametrów, jak: czas opóźnienia reakcji T lag (lag time), stężenie maksymalne C max (peak) i pole pod krzywą endogenny potencjał trombiny (endogenous thrombin potential ETP) (ryc. 1), które opisują dynamikę generacji trombiny w osoczu po dodaniu TF. Metodę CAT charakteryzuje automatyzacja pomiaru oraz uniwersalność mierzona jest de facto aktywność enzymatyczna endogennej trombiny w porównaniu do wzorca. Celem pracy było porównanie 2 metod oznaczania poziomu generacji trombiny u chorych z zaawansowaną chorobą wieńcową: pomiaru stężenia TAT oraz metody CAT. Ponadto postawiono sobie za cel próbę identyfikacji, które spośród czynników ryzyka miażdżycy (wiek, płeć, nadciśnienie tętnicze, cukrzyca) i tzw. nowych czynników ryzyka, takich jak fibrynogen i białko C-reaktywne (C-reactive protein CRP), wpływają na proces generacji trombiny u tych chorych. PACJENCI I METODY Badaniu poddano grupę kolejnych 135 pacjentów ze stabilną dławicą piersiową, przyjętych na oddział Kliniki Chirurgii Serca, Naczyń i Transplantologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego do planowanego zabiegu pomostowania aortalno-wieńcowego (coronary artery bypass graft CABG) w okresie styczeń maj 2006 roku. Średnia punktacja według klasyfikacji EUROSCORE dla pacjentów kwalifikowanych do zabiegu wynosiła 2 punkty. W badaniu koronarograficznym rozpoznano istotne zwężenia pnia lewej tętnicy wieńcowej (>50%) lub w głównych tętnicach nasierdziowych (>70%), nie zakwalifikowane do interwencji przezskórnej (PCI). Wynik oznaczenia poziomu troponiny I w dniu włączenia do badania wynosił <0,1 ng/ml. Kryteria wyłączające z udziału w badaniu to: zabiegi inne niż CABG wykonane w tym samym czasie, objawy ostrej infekcji, stosowanie acenokumarolu, heparyny lub tienopirydyn, żylna choroba zakrzepowozatorowa w wywiadzie, przebycie ostrego zespołu wieńcowego w okresie krótszym niż 3 miesiące przed włączeniem, poważne stężenie trombiny (nm) czas opóźnienia czas (min) stężenie maksymalne pole pod krzywą ETP Ryc. 1. Schemat przedstawiający charakterystykę parametrów mierzonych przy użyciu metody skalibrowanego automatycznego trombogramu (calibrated automated trombogram CAT). ETP endogenny potencjał trombiny (endogenous thrombin potential) choroby współistniejące wpływające na hemostazę: nowotwór złośliwy, choroby autoimmunologiczne, niewydolność nerek, uszkodzenie wątroby. Ze względu na prawdopodobieństwo występowania przewlekłego stanu zapalnego, który mógłby mieć wpływ na badane zależności, z analizy wykluczono pacjentów, u których stwierdzono poziom CRP >10 mg/l. Za osoby palące uznano osoby, które w czasie zbierania wywiadu deklarowały palenie papierosów >10 sztuk dziennie. Cukrzycę definiowano jako wystąpienie stężenia glukozy na czczo w surowicy >7 mmol/l, przyjmowanie leków hipoglikemizujących lub wywiad cukrzycowy bez względu na czas trwania choroby. Nadciśnienie tętnicze rozpoznawano, gdy przynajmniej 2 krotnie stwierdzono ciśnienie rozkurczowe >90 mm Hg lub skurczowe 140 mm Hg, albo gdy pacjent stosował leki obniżające ciśnienie przy dodatnim wywiadzie nadciśnieniowym. Pacjenci zażywający aspirynę przyjmowali kwas acetylosalicylowy w dawce 75 lub 150 mg/d co najmniej 3 dni przed włączeniem do badania. Wiek pacjentów w badanej grupie mieścił się w zakresie lat (śr. 66 lat); 104 badanych (77%) stanowili mężczyźni; 59 osób (44%) deklarowało palenie. Cukrzycę rozpoznano u 43 chorych (32%), wśród których 22 (16%) leczyło się insuliną; 116 badanych (86%) to chorzy na nadciśnienie tętnicze, a 108 osób (80%) przebyło zawał serca. Średni wskaźnik masy ciała (BMI) wynosił 27,7 kg/m 2 (5,33) (mediana ± rozstęp międzykwartylowy). W tabeli 1. przedstawiono dane kliniczne i wyniki badań laboratoryjnych. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu. Badanie uzyskało zgodę Komisji Bioetycznej działającej przy Uniwersytecie Jagiellońskim w Krakowie. Czynniki wpływające na generację trombiny mierzoną jako stężenie kompleksów

4 Badania laboratoryjne Krew do badań pobierano w ciągu godzin przed wykonaniem zabiegu CABG. U pacjentów wykonano rutynowe oznaczenia poziomu cholesterolu całkowitego, frakcji LDL, HDL i triglicerydów, CRP metodą immunoturbidymetryczną (Dimention Expand, Dade-Behring, Niemcy) i fibrynogenu (metoda Claussa). Poziom β-tromboglobuliny (βtg) oznaczono przy użyciu testu ELISA (Diagnostic Stago, Francja). Do badań koagulologicznych pozyskiwano PPP z krwi pobieranej do probówek z 3,2% roztworem cytrynianu i odwirowanej w temperaturze 4 o C przez 10 min (3000 g). Osocze przechowywano zamrożone w temperaturze 70 o C i rozmrażano przed oznaczeniem w temperaturze 37 o C. Oznaczanie aktywności trombiny Do oznaczenia poziomu trombiny w krwi żylnej posłużono się oznaczeniem stężenia TAT przy użyciu testu ELISA (Enzygnost TAT, Dade-Behring, Niemcy). Oznaczenie trombogramu wykonano przy użyciu testu CAT (Trominoscope BV, Holandia) zgodnie z zaleceniami producenta za pomocą 96-dołkowego fluorymetru płytkowego (Ascent Reader, Thermolabsystems OY, Finlandia) wyposażonego w zestaw filtrów o długości fali 390/460 nm, w temperaturze 37 o C. Do 80 µl osocza PPP dodano 20 µl reagentu-ppp zawierającego 5 pm rekombinowanego czynnika tkankowego, 4 SM fosfatydyloseryno/ fosfatydylocholino/ fosfatydyloetanolaminy w formie sonifikowanej oraz 20 µl substratu (HEPES, ph 7,35, 100 nm CaCl 2, 60 mg/ml albuminy wołowej i 2,5 mm Z-Gly- Gly-Arg-AMC). Pomiary wykonano w duplikatach, uzyskując powtarzalność metody 5,7%. Jednocześnie wykonywano oznaczenia w samej próbce PPP i w obecności kalibratora zawierającego 20 SI kompleksu α 2 -makroglobuliny z trombiną. Dane z pomiarów zanalizowano przy użyciu oprogramowania Trombinoscope, w załączeniu przedstawiono przykładowe zapisy pomiarów dla próbki z małym (ryc. 2A) i średnim (ryc. 2B) poziomem generacji trombiny. Wyniki przedstawiono jako maksymalne stężenie trombiny (C max ), czas opóźnienia reakcji generacji trombiny (T lag ) i pole pod krzywą przyrastania stężenia trombiny w czasie (ETP). Analiza statystyczna Normalność rozkładów sprawdzono za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa, wyniki przedstawiono w postaci median ± rozstęp międzykwartylowy. Różnice między grupami zbadano testem U Manna-Whitney a (analiza nieparametryczna), zależności między poszczególnymi zmiennymi sprawdzono stosując nieparametryczny model regresji Spearmana. Udział niezależnych predyktorów dla zmiennych TAT, ETP i C max sprawdzono stosując uogólniony model regresji liniowej. Analizy statystycznej dokonano za pomocą oprogramowania STATISTICA wersja 7.1 (StatSoft, Inc. 2005). WYNIKI Grupę zanalizowano pod kątem wpływu odstawienia leczenia aspiryną przed zabiegiem CABG na parametry opisujące aktywność trombinową osocza (tab. 2). Grupa pacjentów, którzy odstawili aspirynę co najmniej 3 dni przed zabiegiem, nie różniła się w sposób istotny statystycznie od grupy pacjentów zażywających aspirynę w dawce mg/d do dnia operacji pod względem poziomu TAT (3,12 ±1,05 vs 2,93 ±1,23 µg/l, nieznamienna statystycznie [NS]), C max (336 ±113 vs 313 ±108 µmol/l, NS), parametrów T lag i ETP (1,34 ±1 vs 1,67 ±0,67 min; 1696 ±544 vs 1712 ±722 mm*min, NS) oraz stężenia βtg (58,5 ±12 IU/ml vs 56,5 ±14 IU/ml, NS). Grupy nie wykazywały różnic pod względem parametrów klinicznych (tab. 1) poza wskaźnikiem BMI, który był statystycznie mniejszy w grupie z odstawioną aspiryną i wynosił odpowiednio 27,6 (4,99) vs 30,5 kg/m 2 (5,47), p = 0,028. Zależność między aktywacją trombiny (CAT) a poziomem TAT Analiza regresji liniowej Spearmana (tab. 3) pokazała, że dla stężenia kompleksu TAT w krwi obwodowej nie występują istotne statystycznie korelacje z parametrami opisującymi aktywność trombiny, takimi jak C max, T lag i ETP zarówno w grupie pacjentów kontynuujących leczenie aspiryną, jak i w grupie z odstawionym leczeniem. Współczynnik korelacji (r) między TAT a ETP dla pacjentów zażywających aspirynę wynosi r = 0,36, nie wykazuje jednak istotności statystycznej. U pacjentów po odstawieniu aspiryny stwierdzono istotną statystycznie korelację między C max a wartością czasu opóźnienia: r = 0,22 (p = 0,034). Zależności takiej nie zaobserwowano u pozostałych chorych (tab. 3). Występowała silna korelacja między C max a ETP dla obu grup (r = 0,74; p <0,001 vs r = 0,75, p <0,001). Pozostałe zmienne nie wykazywały istotnych statystycznie zależności. Zależność między aktywacją płytek krwi a generacją trombiny W badanej grupie wartość parametru opisującego stopień aktywacji płytek (βtg) nie wykazywała zależności z takimi czynnikami ryzyka miażdżycy, jak fibrynogen, CRP ani stężenie TAT (dane niepokazane). Nie stwierdzono też korelacji między βtg a parametrami CAT takimi jak T max i ETP. Stwierdzono jedynie odwrotną zależność między βtg a czasem opóźnienia (r = 0,20; p = 0,02), a u pacjentów nie zażywających aspiryny w okresie przedoperacyjnym współczynnik korelacji był większy i wynosił: r = 0,30 (p = 0,005) (tab. 3). Nie zaobserwowano podobnych zależności w grupie chorych przyjmujących aspirynę. Dla markera aktywacji płytek βtg niezależnymi predyktorami były współwystępujące: płeć męska oraz odstawienie aspiryny: β = 0,46 (p = 0,01). 300 POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2007; 117 (7)

5 Ryc. 2. Przykładowe zapisy pomiarów dla próbki z małym (A) i średnim (B) poziomem generacji trombiny w osoczu przy użyciu metody CAT A B Zależność między czynnikami ryzyka choroby wieńcowej a generacją trombiny Uogólniony model regresji liniowej pokazał, że najsilniejszymi predyktorami poziomu TAT w krwi obwodowej były wiek oraz płeć męska i współwystępowanie cukrzycy, odpowiednio: β = 0,5 (p <0,0001) oraz β = 0,36 (p = 0,02). Duży poziom CRP i leczenie aspiryną były słabszymi predyktorami, wykazywały jednak istotność statystyczną, odpowiednio: β = 0,17 (p = 0,04) i β = 0,24 (p = 0,03). U chorych na cukrzycę leczonych insuliną istniała podobna zależność jak dla całej grupy ze zdiagnozowaną cukrzycą: β = 0,38 (p = 0,03). W przypadku zastosowania metody CAT niezależnymi predyktorami dla C max były: stężenie fibrynogenu i płeć męska łącznie z cukrzycą; β-standaryzowane wynosiły odpowiednio: β = 0,21 (p = 0,039) i β = 0,4 (p = 0,023). W przypadku leczenia insuliną zależność ta traciła istotność: β = 0,02 (NS). Nie stwierdzono zależności między poziomem CRP a wartością C max. W przypadku ETP jako zmiennej zależnej, niezależnym predyktorem był duży poziom CRP (β = 0,22; p = 0,029) oraz płeć męska z współwystępującą cukrzycą (β = 0,38; p = 0,035). Po wyróżnieniu leczenia insuliną zależność między występowaniem cukrzycy a ETP traciła na istotności. Czynniki wpływające na generację trombiny mierzoną jako stężenie kompleksów

6 Tabela 1. Charakterystyka pacjentów Zmienna Grupa Leczenie aspiryną zakończone Leczenie aspiryną kontynuowane n = 135 n = 115 n = 20 wiek, lata (min. maks.) 66 (42 80) 66 (42 80) 69 (52 79) mężczyźni, n (%) 104 (77) 90 (78) 14 (70) cukrzyca, n (%) w tym leczeni insuliną 43 (32) 22 (16) 37 (32) 20 (17) 6 (32) 2 (10) palenie papierosów, n (%) 59 (44) 50 (44) 9 (44) nadciśnienie tętnicze, n (%) 116 (86) 99 (86) 17 (86) przebyty zawał, n (%) 108 (80) 92 (80) 16 (84) aspiryna, n (%) 20 (15) β-blokery, n (%) 125 (93) 107 (93) 18 (90) statyny, n (%) 124 (92) 107 (93) 17 (85) BMI (kg/m 2 ) 27,7 (5,33) 27,6 (4,99)* 30,5 (5,47)* fibrynogen (g/l) 4,02 (1,62) 4,06 (1,62) 3,70 (1,52) CRP (mg/l) 2,34 (2,66) 2,42 (2,61) 2,19 (2,51) cholesterol całkowity (mmol/l) 4,88 (1,32) 4,88 (1,24) 4,85 (1,47) cholesterol LDL (mmol/l) 3,00 (1,21) 3,00 (1,22) 3,07 (1,11) cholesterol HDL (mmol/l) 1,30 (0,28) 1,30 (0,26) 1,26 (0,47) TG (mmol/l) 1,51 (0,55) 1,47 (0,62) 1,55 (0,33) * p = 0,028 BMI wskaźnik masy ciała, CRP białko C-reaktywne, HDL lipoproteiny o dużej gęstości, LDL lipoproteiny o małej gęstości, TG triglicerydy Nie stwierdzono związku między nadciśnieniem tętniczym a procesem aktywacji trombiny w badanej grupie. OMÓWIENIE W przedstawionej pracy oceniono poziom i kinetykę generacji trombiny in vitro w osoczu pobranym z krwi żylnej pacjentów z zaawansowaną chorobą wieńcową. Zastosowano 2 metody pomiaru generacji trombiny: oznaczanie kompleksów TAT (trombina-antytrombina) i metodę automatycznego skalibrowanego trombogramu (CAT). Pomiar TAT w krwi żylnej odzwierciedla poziom wiązania endogennego inhibitora trombiny (antytrombiny) do enzymatycznie czynnej trombiny. Wynik tego pomiaru zależy od stężenia aktywnej trombiny zdolnej do związania inhibitora i od dostępności inhibitora w osoczu. Zwiększone poziomy TAT w krwi obwodowej zaobserwowano u chorych na krytyczne niedotlenienie kończyn [22], przewlekłą niewydolność serca [23], ze wstrząsem wywołanym posocznicą [24] i z ostrym niedokrwiennym udarem mózgu [25]. Stwierdzono również, że zwiększony poziom TAT może być predyktorem zgonu u chorych na przewlekłą niewydolność serca po uwzględnieniu klasycznych czynników ryzyka [23]. W naszym badaniu poziom TAT w krwi obwodowej pacjentów z zaawansowaną chorobą naczyń wieńcowych wynosił 3,07 ±1,06 µg/l i nie różnił się u chorych zażywających aspirynę i u chorych nie zażywających aspiryny przed zabiegiem CABG. Poziom ten był porównywalny ze średnim stężeniem TAT obserwowanym w grupie kontrolnej w badaniu Ono i wsp. [25] (2,94 ±0,42 µg/l), mimo że można było oczekiwać zwiększonych poziomów TAT. Wyrównane stężenie TAT może być powodowane tym, że w badanej grupie 92% chorych przyjmowało regularnie statyny, w większości simwastatynę w dawce 20 mg/d. Badania Undas i wsp. [26] wykonane na modelu uszkodzenia mikrokrążenia udowodniły, że taka dawka leku wpływa na zmniejszenie generacji trombiny (mierzonej jako tworzenie fragmentów F1+2 protrombiny) u pacjentów z zaawansowaną chorobą naczyń wieńcowych. Zaobserwowano także zmniejszenie stężenia TAT po 3-dniowym zażywaniu simwastatyny w dawce 40 mg/d [27]. Badana grupa wykazywała zróżnicowanie pod względem czynników ryzyka takich jak: wiek, płeć, cukrzyca, nadciśnienie tętnicze, stężenie CRP i fibrynogenu (tab. 1), dlatego poddano analizie wpływ tych czynników na stężenie TAT i kinetykę generacji trombiny oznaczaną przy użyciu metody CAT. Zaobserwowano, że najsilniejszymi predyktorami poziomu TAT były wiek i płeć męska. Wpływ wieku na zwiększoną generację trombiny potwierdza wcześniejsze obserwacje 302 POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2007; 117 (7)

7 Tabela 2. Porównanie średnich wartości parametrów generacji trombiny i aktywacji płytek u pacjentów poddanych CABG leczonych aspiryną i z odstawionym leczeniem aspiryną co najmniej 3 dni przed zabiegiem Zmienna Grupa n = 135 Leczenie aspiryną zakończone n = 115 Leczenie aspiryną kontynuowane n = 20 TAT żylny (µg/l) 3,07 (1,06) 3,12 (1,05) 2,93 (1,23) C max (µmol/l) 337 (116) 336 (113) 313 (108) T lag (min) 1,34 (1) 1,34 (1) 1,67 (0,67) ETP (mm*min) 1704 (583) 1696 (544) 1712 (722) βtg (IU/ml) 48 (12) 58,5 (12) 56,5 (14) βtg β-tromboglobulina, CABG zabieg pomostowania aortalno-wieńcowego, C max maksymalne stężenie trombiny, ETP pole pod krzywą przyrastania generacji trombiny w czasie, TAT kompleks trombina-antytrombina, T lag czas opóźnienia reakcji generacji trombiny Tabela 3. Wartości współczynników korelacji (r) między parametrami opisującymi poziom generacji trombiny i aktywacji płytek w osoczu krwi żylnej u pacjentów poddanych CABG leczonych aspiryną i z odstawionym leczeniem aspiryną co najmniej 3 dni przed zabiegiem. Model regresji liniowej Spearmana Leczenie aspiryną zakończone Leczenie aspiryną kontynuowane C max (µmol/l) T lag (min) ETP (mm*min) C max (µmol/l) T lag (min) ETP (mm*min) TAT (µg/l) 0 0,07 0,07 0,18 0,11 0,36 C max (µmol/l) 0,22* 0,74* 0,38 0,75* T lag (min) 0,22* 0,12 0,38 0,18 ETP (mm*min) 0,74* 0,12 0,75* 0,18 βtg (IU/ml) 0,07 0,30* 0,07 0,06 0,09 0,25 * p <0,05 Skróty jak w tabeli 2 dokonane na grupie kontrolnej [15] i na grupie chorych z udarem niedokrwiennym mózgu [25]. Brak jest danych na temat znaczenia, jakie może mieć płeć w procesie generacji trombiny u pacjentów kierowanych do CABG. Być może większe znaczenie mają tutaj czynniki współistniejące z płcią, takie jak styl życia, palenie papierosów czy otyłość. Nie zaobserwowano silnej zależności między wiekiem a parametrami oznaczanymi metodą CAT. Jedynymi niezależnymi predyktorami dla C max były: stężenie fibrynogenu i płeć męska. W literaturze nie ma doniesień na temat związku stężenia fibrynogenu z generacją trombiny poza jedną pracą, w której wykazano, że zmniejszenie poziomu generacji trombiny (mniejsze C max i ETP) uzyskane po spożywaniu wielonienasyconych kwasów tłuszczowych omega-3 korelowało ze zmniejszeniem poziomu fibrynogenu w osoczu [28]. Efekt ten był determinowany występowaniem polimorfizmu genu α-fibrynogenu (Thr312Ala). W badanej grupie stężenie CRP okazało się niezależnym predyktorem poziomu TAT oraz ETP. Wcześniej zaobserwowano, że CRP wpływa na proces generacji trombiny i funkcję fibrynogenu [29], a także na fibrynolizę [30]. Nasza obserwacja sugeruje, że CRP ogrywa rolę w procesie formowania skrzepu na wielu poziomach: aktywności trombiny i być może dostępności substratu lub inhibitora trombiny. Może to mieć wpływ na strukturę skrzepu: podatność na lizę i przepuszczalność [31]. Nie stwierdzono korelacji między poziomem TAT a parametrami C max i ETP, co powodowane jest zapewne różnicami w metodyce pomiarów. Jedyne obserwowane korelacje wynikają z oczywistych zależności miedzy C max a ETP i T lag (tab. 3). W przypadku metody CAT mierzony jest przyrost produktów konwersji egzogennego drobnocząsteczkowego substratu trombiny po aktywacji TF. Technologia ta opiera się na kinetycznych pomiarach sygnału pochodzącego od endogennej trombiny osocza i kalibratora, względem którego dokonuje się przeliczenia stężenia trombiny. Zatem zmierzona tą metodą ilość trombiny w osoczu jest pewną estymacją, wynikającą z tego, że obecne w osoczu endogenne substraty dla trombiny (w tym i sama protrombina) konkurują z substratem egzogennym o aktywne miejsce w cząsteczce enzymu. Tym samym, wraz ze wzrostem stężenia substratu, czas opóźnienia generacji trombiny wydłuża się, a wyliczone pod krzywą przyrostu stężenia trombiny ETP zwiększa się [32]. Gdy ma się na uwadze wymienione różnice pomiędzy obiema metodami, nie dziwi, że oznaczenia uzyskane w wyniku pomiaru TAT nie korelują w sposób znamienny z pomiarami wykonanymi przy użyciu Czynniki wpływające na generację trombiny mierzoną jako stężenie kompleksów

8 metody CAT. Nie można zatem stosować tych metod zamiennie, a wprowadzenie CAT do rutynowej diagnostyki wymaga walidacji także na grupach zróżnicowanych pod względem chorób obciążających. Mała liczebność poddanych badaniu grup (115 chorych z odstawionym leczeniem aspiryną przed zabiegiem i 20 chorych kontynuujących leczenie aspiryną) nie pozwala na ocenę, czy różnią się one między sobą pod względem zależności od parametrów opisujących proces generacji trombiny (porównanie współczynników korelacji). Można wnioskować jedynie o istotności statystycznej wyliczonych współczynników korelacji dla poszczególnych grup. W badaniu uzyskano istotne korelacje między T lag a C max dla grupy z odstawioną aspiryną (mimo małej wartości współczynnika korelacji: r = 0,22) oraz duże i istotne wartości współczynników korelacji między EPT a C max dla obu grup. Sugeruje to, że w obu grupach proces generacji trombiny in vitro przebiega z jednakową kinetyką, nie można natomiast ocenić, czy odstawienie aspiryny na okres 3 dni może na tę kinetykę wpłynąć. Przy normalnym obrocie płytek nawet po 3 dniach od odstawienia aspiryny przynajmniej 50% płytek (jeśli nie więcej) ma osłabioną aktywację na skutek działania leku. Można się zatem spodziewać, że mimo odstawienia aspiryny proces aktywacji i generacji trombiny jest osłabiony. Utrzymanie się stężenia kompleksu TAT w grupie z odstawioną aspiryną na poziomie porównywalnym z grupą kontynuującą leczenie może być zatem spowodowane procesem aspirynizacji. Innym procesem, jaki może wpływać na poziom TAT w sposób niezależny od hamowania COX-1, jest specyficzna acetylacja białek osocza, w tym AT [33]. Zaobserwowano istotną statystycznie zależność między poziomem βtg (markera degranulacji płytek), a czasem opóźnienia mierzonym metodą CAT (r = 0,30; p = 0,005) u chorych z odstawioną aspiryną. Zależność tę można uzasadnić efektem zablokowania aktywności COX-1 (a tym samym zahamowania degranulacji płytek) u pacjentów leczonych aspiryną. Może to mieć wpływ na zniesienie efektu korelacji między aktywacją płytek a czasem opóźnienia generacji trombiny. W przypadku odstawienia aspiryny proces aktywacji nie jest regulowany przez obecność kwasu acetylosalicylowego, stąd obserwowana zależność. W naszej pracy zaobserwowano, że współistniejąca cukrzyca stanowi jeden z predyktorów generacji trombiny wyrażonej jako tworzenie kompleksów TAT oraz przyrost stężenia trombiny w czasie. Cukrzyca wpływa na wzmocnienie procesów zapalnych, które towarzyszą miażdżycy: zwiększa się między innymi produkcja reaktywnych form tlenu, a zmniejsza zdolność tworzenia tlenku azotu w płytkach [34,35]. U pacjentów z cukrzycą ta wzmocniona aktywność płytek objawia się zwiększoną generacją trombiny [17], co może być jedną z przyczyn powikłań zakrzepowo-zatorowych u chorych poddawanych zabiegowi CABG. Wiadomo też, że insulinooporność wiąże się ze zwiększoną generacją trombiny [14]. W naszej pracy zaobserwowaliśmy, że leczenie insuliną ma związek ze zwiększonym poziomem TAT, natomiast nie ma wpływu na parametry mierzone metodą CAT. W zastosowanym uogólnionym modelu regresji liniowej o udziale czynnika jakościowego (w tym przypadku jest to leczenie insuliną) decyduje siła oddziaływania pozostałych predyktorów ciągłych (fibrynogen, CRP). Zdaniem autorów, ich udział mógł wpłynąć na osłabienie zależności między leczeniem cukrzycy insuliną a C max i ETP w porównaniu do występowania cukrzycy. Podsumowując, w naszej pracy wykazaliśmy, że czynniki takie jak wiek, zwiększony poziom fibrynogenu i CRP (białka ostrej fazy), współwystępowanie cukrzycy i płeć męska wiążą się z ze zwiększeniem generacji lub aktywnością trombiny u chorych z zaawansowaną miażdżycą naczyń wieńcowych podanych zabiegowi CABG. Wykazaliśmy również, że pomiary generacji trombiny za pomocą metody CAT i oznaczenia stężenia kompleksu trombina-antytrombina u pacjentów z zaawansowaną chorobą wieńcową nie korelują ze sobą. Wynika to z odmiennych technik pomiaru i z różnic w parametrach opisujących proces generacji trombiny. PODZIĘKOWANIA Autorzy wyrażają podziękowanie dr. Timowi van Astenowi z Thrombinoscope BV w Holandii za użyczenie odczynników i aparatury, niezbędnych do wykonania pomiarów skalibrowanego automatycznego trombogramu (CAT) oraz za cenne uwagi dotyczące metody. Badanie sfinansowano z umowy Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego na wykonanie projektu badawczego nr N /2198. PIŚMIENNICTWO 1. Meade TW, Mellows S, Miller GJ, et al. Haemostatic function and ischaemic heart disease: principal results of the Northwick Park Hart Study. Lancet. 1986; 2: Folsom AR, Wu KK, Rosamond WD, et al. Prospective study of hemostatic factors and incidence of coronary heart disease: the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) study. Circulation. 1997; 96: Marmur JD, Thiruvikraman SV, Fyfe BS, et al. Identification of active tissue factor in human coronary atheroma. Circulation. 1996; 94: Ardissino D, Merlini PA, Bauer KA, et al. Thrombogenic potential of human coronary atherosclerotic plaques. Blood. 2001; 98: Páramo JA, Orbe J, Beloqui O, et al. Prothrombin fragment 1+2 is associated with carotid intima-media thickness in subjects free of clinical cardiovascular disease. Stroke. 2004; 35: Aleil B, Meyer N, Wolff V, et al. Plasma glycoprotein V levels in the general population: normal distribution, associated parameters and implications for clinical studies. Thromb Haemost. 2006; 96: Stępień E, Szułdrzyński K, Branicka A, et al. Allel PlA1/A2 beta3 integryny wiąże się ze zwiększoną generacją trombiny u pacjentów z chorobą wieńcową leczonych aspiryną wpływ leczenia statynami. Pol Arch Med Wewn. 2007; 1-2: Aronson DL, Stevan L, Ball AP, et al. Generation of the combined prothrombin activation peptide (F1-2) during the clotting of blood and plasma. J Clin Invest. 1977; 60: Hoek JA, Sturk A, Cats JW, et al. Laboratory and clinical evaluation of an assay of thrombin-antithrombin III complexes in plasma. Clin Chem. 1988; 34: Chuang YJ, Swanson R, Raja SM, et al. Heparin enhances the specificity of antithrombin for thrombin and factor Xa independent of the reactive center loop sequence. Evidence for an exosite determinant of factor Xa specificity in heparin-activated antithrombin. J Biol Chem. 2001; 276: de Bosch NB, Mosesson MW, Ruiz-Sáez A, et al. Inhibition of thrombin generation in plasma by fibrin formation (Antithrombin I). Thromb Haemost. 2002; 88: Bajzar L, Nesheim M, Morser J, et al. Both cellular and soluble forms of thrombomodulin inhibit fibrinolysis by potentiating the activation of thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J Biol Chem. 1998; 273: POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2007; 117 (7)

9 13. Undas A, Brummel-Ziedins KE, Mann KG. Antithrombotic properties of aspirin and resistance to aspirin: beyond strictly antiplatelet actions. Blood. 2007; 109: Romano M, Guagnano MT, Pacini G, et al. Association of inflammation markers with impaired insulin sensitivity and coagulative activation in obese healthy women. J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88: Bauer KA, Weiss LM, Sparrow D, et al. Aging-associated changes in indices of thrombin generation and protein C activation in humans. J Clin Invest. 1987; 80: Rosendaal FR, van Hylckama Vlieg HA, et al. Estrogens, progestogens and thrombosis. J Thromb Haemost. 2003; 1: Aoki I, Shimoyama K, Aoki N, et al. Platelet-dependent thrombin generation in patients with diabetes mellitus: effects of glycemic control on coagulability in diabetes. J Am Coll Cardiol. 1996; 27: Corseaux D, Ollivier V, Fontaine V, et al. Hemostasis imbalance in experimental hypertension. Mol Med. 2002; 8: Musiał J, Pająk A, Undas A, et al. Thrombin generation markers and coronary heart disease risk factors in a Polish population sample. Thromb Haemost. 1997; 77: Hemker HC, Wielders S, Kessels H, et al. Continuous registration of thrombingeneration in plasma, its use for the determination of the thrombin potential. Thromb Haemost. 1993; 70: Hemker HC, Giesen P, AlDieri R, et al. The calibrated automated thrombogram (CAT): a universal routine test for hyper- and hypocoagulability. Pathophysiol Haemost Thromb. 2002; 32: Cassar K, Bachoo P, Ford I, et al. Markers of coagulation activation, endothelial stimulation and inflammation in patients with peripheral arterial disease. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2005; 29: Marcucci R, Gori AM, Giannotti F, et al. Markers of hypercoagulability and inflammation predict mortality in patients with heart failure. J Thromb Haemost. 2006; 4: Psuja P, Zozulinska M, Turowiecka Z, et al. Plasma markers of hypercoagulability in patients with serious infections and risk of septic shock. Clin Appl Thromb Hemost. 2002; 8: Ono N, Koyama T, Suehiro A, et al. Clinical significance of new coagulation and fibrinolytic markers in ischemic stroke patients. Stroke. 1991; 22: Undas A, Brummel K, Musial J. Simvastatin depresses blood clotting by inhibiting activation of prothrombin, factor V, and factor XIII and by enhancing factor Va inactivation. Circulation. 2001; 103: Undas A, Celinska-Löwenhoff M, Brummel-Ziedins KE, et al. Simvastatin given for 3 days can inhibit thrombin generation and activation of factor V, and enhance factor Va inactivation in hypercholesterolemic patients. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005; 25: Vanschoonbeek K, Feijge MAH, Paquay M, et al. Variable hypocoagulant effect of fish oilintake in humans: modulation of fibrinogen level and thrombin generation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: Reganon E, Vila V, Martinez-Sales V, et al. Inflammation, fibrinogen and thrombin generation in patients with previous myocardial infarction. Haematologica. 2002; 87: Niccoli G, Biasucci LM, Biscione C, et al. Instability mechanisms in unstable angina according to baseline serum levels of C-reactive protein: The role of thrombosis, fibrinolysis and atherosclerotic burden. Int J Cardiol Jan 29; [Epub ahead of print]. 31. Undas A, Plicner D, Stępień E, et al. Altered fibrin clot structure in patients with advanced coronary artery disease: a role of C-reactive protein, lipoprotein(a) and homocysteine. J Thromb Haemost. 2007; 5: Butenas S, Mann KG. Caution in the interpretation of continuous thrombin generation assays. J Thromb Haemost. 2007; 5: Villanueva GB, Allen N. Acetylation of antithrombin III by aspirin. Semin Thromb Hemost. 1986; 12: Schaeffer G, Wascher TC, Kostner GM, et al. Alterations in platelet Ca2+ signalling in diabetic patients is due to increased formation of superoxide anions and reduced nitric oxide production. Diabetologia. 1999; 42: Rabini RA, Staffolani R, Fumelli P, et al. Decreased nitric oxide synthase activity in platelets from IDDM and NIDDM patients. Diabetologia. 1998; 41: Czynniki wpływające na generację trombiny mierzoną jako stężenie kompleksów