Zastosowanie w doborze immunologicznym do przeszczepu nerki

Transkrypt

1 ALLOPRZECIWCIAŁA ANTY-HLA W NOWOCZESNEJ DIAGNOSTYCE TRANSPLANTACYJNEJ Zastosowanie w doborze immunologicznym do przeszczepu nerki Hanna Zielińska Laboratorium Immunologii Klinicznej, Transplantacyjnej i Hematologii ogii Uniwersyteckie Centrum Kliniczne w Gdańsku 1

2 Obecna Transplantacyjna diagnostyka immunologiczna przed przeszczepieniem nerki PRA-CDC co 3 miesiące Dobór HLA locus A, B, DR Próba krzyżowa CM-CDC (FCXM u zimmunizowanych?) Brak możliwości przeszczepu biorcy z powtórzoną niezgodnością!!!...? Przeciwciała anty-hla dawcy (MM) tylko u 10% biorców Punkty za immunizację: PRA 50-79%: 7 pkt PRA >80%: przeszczep obligatoryjny Brak diagnostyki posttransplantacyjnej

3 BADANIE STOPNIA ZIMMUNIZOWANIA - DZIŚ PRA /metodą CDC/ Zalety Panel odzwierciedla fenotyp HLA regionu (vpra też) Poziom detekcji odzwierciedlający reakcję alloprzeciwciał in vivo (główna zaleta CM, wykluczenie odrzutu nadostrego) Selektywne wykrywanie alloprzeciwciał wiążących dopełniacz (flow wykrywa IgG) Wady Wynik badania ściśle uzależniony od panelu (zmienność odsetku PRA pochodną zmienności panelu?) Problem pacjentów nowozgłoszonych (obserwacja) NISKA CZUłOŚĆ NA POZIOMIE CM-CDC (pacjenci do retransplantacji, w trakcie terapii, leki, monitorowanie po tx) Wykrywamy tylko przeciwciała anty-hla klasa I Fałszywie (+) r-cje od IgM.

4 Screening: LABScreenMixed Wynik (-) Wynik (+) Powtótka co 6 tyg. (około 60%) LABScreen PRA kl. I i/lub II Proponowany algorytm badawczy monitorowania immunizacji PRA 1-80 % PRA > 80 % (17 pacjentów) Powtórka co 6 tyg Single Antigen Programy HS

5 PROBLEM IMMUNIZACJI CHORYCH ~ 20% Oczekujących cych (~ 500 osób, PRA>50: 100 osób) Dostęp p do przeszczepu zimmunizowanych: [PRA>10%] ~15% przeszczepów w od zmarłych dawców, w, [PRA>80%] ~ 3% [wg UNOS 2007] Czas oczekiwania (Poltransplant,, 2009r) Niezimmunizowani: : ~ 2 lata 8,5 m-cam Zimmunizowani PRA [80-100%]: 6 lat, 11 m-cy Prawie 2x krótszy czas przeżycia przeszczepu 5

6 PROBLEM IMMUNIZACJI CHORYCH - koszty Czas oczekiwania - aspekt finansowy Niezimmunizowani: 33 miesiące Zimmunizowani [HS] PRA [80-100%]: 83 miesiące Koszt miesięcznej dializy 1 osoby: 400 złz x 3(tyg) x 4 = 4800 złz Koszt dializy HS: 83 miesiące x 4800 zł z = złz Koszt nie HS: 33 m-ce x 4800 zł z = złz Różnica: złz ~20 pacjentów: 240 tys. x 20 = 4 mln 800 tys. złz Brak środków w na diagnostykę??? 6

7 Algorytm badawczy Zimmunizowani [PRA>0%, min 2x]: Określenie grupy ryzyka z danym dawcą => badania: FCXM, FlowC4d Wysokozimmunizowani [cpra>80% = PRA-CDC >50%?] I. Efekty wdrożenia programów dla wysokozimmunizowanych na świecie II. Praktyka: Identyfikacja aloprzeciwciał anty-hla: testy typu Single Antigen podstawy, różnice z PRAScreen 7

8 ZIMMUNIZOWANI (PRA( PRA-CDC > 0% min. 2x) Próba krzyżowa z wykorzystaniem cytometru przepływowego miernikiem ryzyka ostrego odrzucania Przyjęcie obligatoryjnego (-) wyniku FCXM nie miałoby sensu z uwagi na wyłączenie z szansy transplantacji 28% biorców, u których w 1-szym roku graft funkcjonuje dobrze, bez incydentów AR.ale 8

9 ZIMMUNIZOWANI Próba krzyżowa z wykorzystaniem cytometru przepływowego miernikiem ryzyka ostrego odrzucania OSTRE ODRZUCANIE ok % W grupie pacjentów z (+) FCXM dochodzi dwukrotnie częś ęściej do odrzucania naczyniowego (n=455): 28,9% z (+) FCXM vs. 12,6% z (-) FCXM; Roczne przeżycie przeszczepu 10% niższe (84% vs. 94%) Ilham M.A. et.al.: Clinical significance of a positive flow crossmatch on the outcomes of cadaveric renal transplants. Transplant. Proc. 2008; 40(6):

10 % n=688 n= % 5,2% n=733 n= ,8% T-B+ 1,8%%; 6,5% T-B+ 2,4%%; 5,3% 10

11 Lityczność przeciwciał [C4d]FlowPRA 11

12 Zimmunizowani: wnioski Diagnostyka AR: wzrost kreatyniny następuje dopiero przy obniżeniu o połowę wartości GFR i aż 1/3 potwierdzonych histologicznie epizodów AR w pierwszych trzech miesiącach przebiega subklinicznie, tzn. przy prawidłowych wartościach kreatyniny, stąd (+) FCXM może stanowić niezależny czynnik ryzyka ostrego odrzucania (AR) wskazując grupę, która najbardziej skorzysta z indukcji (+) FCXM wiąże się ze zwiększonym ryzykiem przewlekłego odrzucania 12

13 Wysokozimmunizowani PRA > 80% I. Efekty wdrożenia programów dla wysoko zimmunizowanych na świecie II. Identyfikacja aloprzeciwciał anty-hla: testy typu Single Antigen podstawy, różnice z PRAScreen 13

14 Farmakologiczne Biologiczne Algorytm Emory USA, UNOS HLA-matchmaker z AM Programme (ET-KIDNEY ALLOCATION SYSTEM), FAMHS (Find Acceptable Mischmatches for Highly Sensitized Patients), Barcelona British Transplantation Society Inne: paired donor exchange, proxy donation 14

15 EMORY ALGORITHM FlowPRA Identyfikacja alloprzeciwciał Swoistości (odpowiedniki MM) wprowadzane do bazy danych UNET HLA dawcy porównywane z bazą UNET => 0 MM => kwalifikacja wytypowanego biorcy do transplantacji (tzw. wirtualny CM) Cross-match (FCXM T, B) w ośrodku przeszczepiającym cym 15

16 EMORY ALGORITHM Dostęp p do przeszczepu zimmunizowanych (PRA>30%): 25% vs.. 12% w tym samym czasie w UNOS n=220 tx zimmunizowanym,, 5 lat Czas przeżycia przeszczepu (5 lat): PRA>30%: 69% vs.. 70% w grupie niezimmunizowanych PRA>80%: brak statystycznie znamiennej różnicyr Schemat immunosupresji identyczny jak w grupie nie obarczonej ryzykiem 16

17 Eurotransplant AMP (Acceptable ( Mischmatch Program) + HLAMatchmaker vpra Kryteria włączenia: 1. Wynik testu PRA > 85% stwierdzony co najmniej dwukrotnie w teście virtual PRA + potwierdzona lityczność przeciwciał w klasycznym PRA-CDC z panelem 50 populacji limfocytów) 2. Wykluczenie obecności autoprzeciwciał anty-hla u biorcy (próba autologiczna) oraz przeciwciał klasy IgM (test mikrolimfocytotoksyczny PRA z dodatkiem DTT) 3. Dobór w zakresie HLA-A,B,C,DR,DQ 17

18 Programy dla pacjentów w wysoko zimmunizowanych Eurotransplant Określenie akceptowalnych niezgodności (Acceptable Mismstch) przez ETRL: 1. Analiza HLA dawców z panelu PRA z (-) reakcjami w PRA-CDC 2. Testy typu Single Antigen 3. Program HLA-Matchmaker HLA pacjenta (biorcy): A24, 31; B27, 51; DR4, 8 AM: A25, 26; B44; DR 9 HLA potencjalnych dawców (test PRA) A25, 31; B27, 51; DR4, 8 A26, 31; B27, - ; DR4, 8 A25, 26; B44, 51; DR4, 9 A24, 26; B27, 51; DR4, 8 A24, 25; B27, 51; DR4, 8 A24, 31; B44, 51; DR4, - A24, 31; B27, 44; DR4, 8 A25, 31; B44, 51; DR4, 8 A25, 31; B44, 51; DR4, 9 A25, 31; B44, 51; DR8, 9 Standards for Histocompatibility Testing, wersja 5.6, kwiecień 2008; punkt G Akredytacja EFI lub ASHI 18

19 Virtual PRA 19

20 ET: Acceptable Mischmatch Program Dostęp p do przeszczepu W pierwszym roku przeszczepiono 68 z 129 wysoko zimmunizowanych. W tym 57 z 68 pacjentów otrzymało nerkę z programu ET-AMP (średnia oczekiwania 9,7 miesięcy, w tym większość znalazła odpowiedniego dawcę w pierwszych sześciu miesiącach). W oparciu o klasyczne zasady ET-KAS, dokonano 11-tu transplantacji (średnia oczekiwania 18,6 miesięcy). 20

21 ET: Acceptable Mischmatch Program Czas przeżycia przeszczepu 21

22 ET: AMP + HLAMatchmaker Zwyczajowo stopień doboru mierzony ilością niezgodnych z dawcą antygenów HLA-A, B, DR (0-6 MM: mismatch) Dlaczego obserwuje się tak duży rozrzut w funkcjonowaniu nerek o 5-6 MM u biorców przeszczepu? 22

23 ET: HLAMatchmaker Algorytm doboru pary na poziomie analizy podobieństwa epitopów (antygenowość + immunogenność), nie antygenów. Każdy antygen HLA przedstawiony w postaci ciągu krótkich sekwencji peptydowych (EAA: eplets amino acid), opisujących regiony polimorficzne zdolne do indukcji powstawania przeciwciał HLA-A2 23

24 ET: HLAMatchmaker Rodzaj wytwarzanych przez biorcę przeciwciał zależy od jego własnych HLA Każda nerka jest inaczej immunogenna względem danego biorcy o takiej samej liczbie niezgodnych HLA 24

25 HLAMatchmaker Polimorficzne epitopy HLA-B51(5) Immunogenność HLA-B51dawcy dla haplotypu biorcy: HLA-A2, 68; HLA-B27, 44 HLA-A2, 68; HLA-B35, 44 HLA-A2, 24; HLA-B7, 8 α1 peptyd α2 α2 α1 β2m α3 25

26 Immunogenność. Czy są różnice w immunogenności HLA-B8? Biorca 1: HLA-A2,A30; B18,B27; Cw2,Cw4 Biorca 2: HLA-A2,A31; B42,B53; Cw2,Cw7 26

27 Biorca 1: HLA-A2,30; A2,30; B18, 27; Cw2,w A02 lrg A S W K R T T tkh W aah ahv L A A30 lrg A S G N R T I tqr W aar arw L A B18 lrg A P G N S T I tqr W aar arv L A B27 llr A P G N S T I tqr W aar arv L A Cw2 lrg A P G N R T I tqr W aar are W A Cw4 lrg D P G N R T I tqr W aar are R A Donor HLA B8 lrg A P G N R T I tqr W aar arv D A A02 T Ew Y Et Q A K Av A S A V Q A30 T Ew Y Et Q P K Pi A G A V E B18 T Ew H Et Q P K Pi A G A V E B27 E* Ew Y Et Q P K Pi A G A V E Cw2 E* Ew Y Et Q Eh K Pv A G A V E Cw4 T Ew Y Et Q Eh K Pv A G A V E Donor HLA B8 T Ew Y Dt E P K Pi A G A V E 27

28 Biorca 1: HLA-A2,30; A2,30; B18, 27; Cw2,w4 Patient HLA A02 A*0201 F sv R gr A Me G Ge rkv ahs H Vd gtl A30 A*3001 S sv R gs A Me R Qe rnv aqs D Vd gtl B18 B*1801 H sv R GR A Te G Rn qis tnt Y Es rnl B27 B*2705 H sv R gr A Ee G Re qic aka D Ed rtl Cw2 Cw*0202 Y av R sr A Ge G Re qky rqa D Vn rnl Cw4 Cw*0401 S sv W gr A Ge G Re qky rqa ad Vn rnl Donor HLA B8 B*0801 D am R gr A Ee G Rn qif tnt D Es rnl Biorca 1: względem HLA-B8 ma 6 niezgodnych tripletów 28

29 Transplantation Apr 27;77(8): THE NUMBER OF AMINO ACID TRIPLET DIFFERENCES BETWEEN PATIENT AND DONOR IS PREDICTIVE FOR THE ANTIBODY REACTIVITY AGAINST MISMATCHED HUMAN LEUKOCYTE ANTIGENS 29

30 Biorca 2: HLA-A2, 31; B42, 53; Cw2, w7 HLA-B8 nie jest niezgodnością dla biorcy nr 2 30

31 HLAMatchmaker a pacjenci HS: Przykład: Pacjent PRA=94% o genotypie HLA-A24,-;B38,35;Cw4,-. PFD na znalezienie dawcy wynoszą PFD=0,007% (1 na dawców bez ryzyka immunologicznego). Zastosowanie aplikacji HLAMatchmaker w połączeniu z PRA-CDC (panel 50-dawców o znanych HLA), PFD zwiększa do 0,115% (1 na 870 dawców). źródło: Transpl. Vol. 75, , No. 6,

32 HLAMatchmaker korzyści: Możliwość określenia najmniej immunogennej pary dawca biorca Określenie dodatkowych, akceptowalnych niezgodności dla zimmunnizowanych pacjentów Ograniczanie liczby zimmunizowanych po przeszczepie Poprawa przeżycia przeszczepu Pacjenci zgłoszeni do retransplantacji: Możliwość przeszczepiania z powtórzonym MM 32

33 Wysokozimmunizowani Efekty programów dla wysoko zimmunizowanych wdrożone na świecie Programy skierowane głównie do pacjentów wysoko zimmunizowanych (HS) celem: Poprawy dostępu do przeszczepu Wydłużenia czasu przeżycia przeszczepu 33

34 II. IDENTYFIKACJA ALLOPRZECIWCIAŁ w praktyce Grupy testów serii LABScreen Screening PRA Single Antigen HLA-A2 PE anty- human IgG HLA-B7 HLA-A2 HLA-A24 HLA-B27 HLA-B44 HLA-Cw1 HLA-Cw5 34

35 Screening: LABScreenMixed Wynik (-) Wynik (+) Powtótka co 6 tyg. (około 60%) LABScreen PRA kl. I i/lub II Proponowany algorytm badawczy monitorowania immunizacji PRA 1-80 % PRA > 80 % (17 pacjentów) Powtórka co 6 tyg Single Antigen Programy HS

36 IDENTYFIKACJA ALLOPRZECIWCIAŁ 20 µl surowicy 5µl beadsów klasa I i /lub klasa II (lub wariant combo) Inkubacja 30 min, RT 3x płukanie + PE-anty IgG, 30 min RT Luminex 2x płukanie

37 Zielony laser oznacza ilość analitu Czerwony laser wykrywa i identyfikuje mikrokulkę, badany analit 37

38 IDENTYFIKACJA ALLOPRZECIWCIAŁ Single Antigen Rozdzielczość => Ponad 155 specyficzności klasy I, II Patient Typing Abs Produced A*0302 A*0301 A*2403 A*2402 Sandra Rosen-Bronson, Ph.D; Georgetown University; OLI Visuals, 2003 DRB1*1337 DRB1*1301 Carol Pancoska, Ph.D, DIP; The Sharing Network; OLI Visuals, 2003

39 HLA Fusion Software kalkulacja wyników w dla alloprzeciwciał

40

41

42 NBG Ratio = Normalized Background ratio [Sample bead#n - Sample bead#nc (001)] [LSNC bead#n - LSNC bead#nc (001)] Normalization by Subtraction

43 = 1.661

44 Zasada kwalifikacji reakcji (+/-) NBG (normalized background ratio) dla wariantu LS-NC (alternate BG) NBG > 1,6: pozytywne. NBG pomiędzy = szary kolor NBG < 1.2: negatywne Wszystkie beadsy muszą być negatywne aby kwalifikowały się jako (-) Nie wszystkie beadsy z danym Ag muszą być (+) aby kwalifikować alloswoistość jako obecną.

45 SPOSÓB OKREŚLANIA SPECYFICZNOŚCI PRZEZ OPROGRAMOWANIE EPITOPE ALGORITHM w wariancie LABScreenPRA

46 Wstęp Ogon (Tail analysis) powinien być traktowany jako wstęp do właściwej analizy specyficzności obecnych w surowicy, ma jednak podstawy teoretyczne. Algorytm wykorzystywany w OLI rozwinął się podczas 8th International Histocompatibility Workshop : Formuła statystyczna odpowiednia do analizy wieloswoistych surowic (opracowanie na podstawie analogii z panelami komórkowymi)

47 TAIL ANALYSIS Częstości antygenów obecnych na mikrosferach = częstościom w populacji (odzwierciedlenie panelu) np. HLA-A2 vs. HLA-A66 dlatego Alloprzeciwciała anty-a2, A1, A3 lub Cw są oceniane bardziej restrykcyjnie, wg algorytmu R-value (nie wg [% positive] czy [Stranght]) R-value. (Rvalue= Χ²/N gdzie Χ²=N[(ad-bc)-N/2]²/[(a+b)(c+d)(a+c)(b+d)]) gdzie (a)=rreal positive, (b)=false positive, =false negative, (d)=true negative.

48 Algorytm naśladuje manualne kreowanie ogona => 61 surowic: wykryto łącznie 166 specyficzności alloab, 136 wykryto poprawnie (zgodność 83%). (Potwierdzenie na single antigen) Nie ma w 100% poprawnego algorytmu poliklonalna odpowiedź, wysokie miana: testy typu single antigen.

49 Przykład 1 (Cz. M) PRA (panel 43): 27% Prawdopodobne źródła immunizacji: ciąż ąże (brak przetoczeń) 1. Screen: klasa I (+++) klasa II (++) => 2. Identyfikacja: Alloprzeciwciała anty-hla klasa I, II (mix, wskazana analiza single antigen)

50 ANALIZA ALLOPRZECIWCIAŁ KLASA I

51 KLASA I CREG A1,11,9(23,24)

52 WYNIK: silna reakcja (MFI tys) z antygenami HLA kl. I PRA: 25 % (reakcja pozytywna w 25% analizowanych beadsów) SWOISTOŚCI POZYTYWNIE REAGUJĄCYCH AG: HLA A 23(9), 24(9)

53 ANALIZA ALLOPRZECIWCIAŁ KLASA II

54 WYNIK: silna reakcja (MFI 8-15 tys) z antygenami HLA kl. II PRA: 26 % (reakcja pozytywna w 26% analizowanych beadsów) SWOISTOŚCI POZYTYWNIE REAGUJĄCYCH AG: HLA DR 7, 9 (Ostrożnie z całą grupą CREG DR4,7,9 )

55

56 RODZAJ ODPOWIEDZI HUMORALNEJ A. mono swoisty

57 RODZAJ ODPOWIEDZI HUMORALNEJ A. poli swoisty korzyści: określenie akceptowalnych antygenów

58 Dziękuję za uwagę 58