PL B1. ZACHODNIOPOMORSKI UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNY W SZCZECINIE, Szczecin, PL BUP 21/13

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12P 7/00 ( ) C07C 31/22 ( ) B01D 61/36 ( ) (54) Sposób prowadzenia fermentacji glicerolu i układ do prowadzenia fermentacji glicerolu (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 21/13 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 11/15 (73) Uprawniony z patentu: ZACHODNIOPOMORSKI UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNY W SZCZECINIE, Szczecin, PL (72) Twórca(y) wynalazku: MAREK GRYTA, Szczecin, PL WIRGINIA TOMCZAK, Bydgoszcz, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Renata Zawadzka

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób prowadzenia fermentacji glicerolu w bioreaktorze z wykorzystaniem bakterii oraz układ do prowadzenia fermentacji glicerolu. Podczas produkcji biopaliw, jako produkt odpadowy powstaje glicerol, o stężeniu 75 98%. Metodą biokonwersji można otrzymać z niego diole, jak 1,3-propanodiol, które są poszukiwanym surowcem do wytwarzania polimerów. Do fermentacji glicerol należy rozcieńczyć wodą, uzyskując 5 10% roztwór, a jego ubytek podczas fermentacji uzupełnia się dodając do bioreaktora porcje stężonego glicerolu (proces okresowy-dolewowy). Produkty fermentacji są często toksyczne dla mikroorganizmów, co wymusza okresową wymianę brzeczki w bioreaktorach i w efekcie zmniejsza ich efektywność. Ograniczono to w fermentacji ciągłej, gdzie z bioreaktora odprowadza się część brzeczki, a powstające ubytki uzupełnia się roztworem glicerolu. W obydwu przypadkach do prowadzenia procesu stosuje się duże ilości czystej wody, którą trzeba sterylizować. Mikroorganizmy wytwarzają z glicerolu różne związki chemiczne, jak alkohole i kwasy karboksylowe, dlatego otrzymaną po fermentacji mieszaninę poddaje się rozdziałowi i oczyszczaniu. W patencie WO 2004/ do oczyszczania roztworu 1,3-propanodiolu zastosowano trójetapową filtrację (mikro-, a po niej ultrafiltrację i nanofiltrację), a następnie wymianę jonową i klasyczną kolumnową destylację. Po tych operacjach woda stanowi jeden ze składników roztworów odpadowych, których jednak nie można zawrócić do bioreaktora. Toksyczny wpływ metabolitów ograniczono stosując mikroorganizmy wykazujące większą odporność lub dobierając odpowiednie warunki fermentacji. W zgłoszeniu WO 2011/ zaproponowano zastosować bioreaktory z wypełnieniem, na powierzchni, którego mikroorganizmy tworzą ochronną błonę biologiczną. W patencie CN wskazano jak negatywnie działa 3-hydroksy propanodial, co ograniczono redukując jego wytwarzanie przez dobranie odpowiedniego stężenia glicerolu i tlenu w brzeczce. Do innych znanych silnych inhibitorów należy powstający podczas fermentacji alkohol oraz kwas octowy. Najlepszym rozwiązaniem jest selektywne wydzielanie trujących metabolitów z bioreaktora. W przypadku lotnych produktów, jak alkohole, można je selektywnie wydzielić przez membrany a mikroorganizmy, substraty i pożywki zawrócić do bioreaktora. Do metod separacji selektywnej należy perwaporacja (PV). Przykłady jej zastosowania przedstawiono w patentach: US oraz US W procesie PV stosuje się nieporowate membrany, których materiał wykazuje selektywną sorpcję alkoholu, a w znikomym stopniu chłonie wodę. Membrany PV mają także duże powinowactwo do wydzielania innych składników organicznych, co może ograniczać wykorzystanie PV w przypadku fermentacji glicerolu. Z opisu patentowego PL znany jest układ do fermentacji połączony z destylacją membranową (MD), którą zastosowano do ciągłego wydzielania etanolu z fermentującej brzeczki. Ze zgłoszenia patentowego P znany jest sposób fermentacji glicerolu w bioreaktorze polegający na tym, że fermentację prowadzi się w bioreaktorze membranowym równocześnie z procesem destylacji membranowej, w którym powstające podczas fermentacji lotne produkty częściowo usuwa się z fermentującego roztworu. Zastosowanie procesu MD pozwoliło z fermentującego roztworu glicerolu wydzielić szereg lotnych metabolitów (jak kwas octowy), co korzystnie wpłynęło na rozwój mikroorganizmów. W efekcie możliwa była dłuższa, półciągła eksploatacja bioreaktora. Znaną i stosowaną metodą ograniczenia negatywnego wpływu produktów fermentacji jest zmniejszenie ich stężenia w brzeczce przez odprowadzanie z bioreaktora części fermentującego roztworu i dodanie równoważnych objętości roztworu surowców. W tym rozwiązaniu tracimy jednak część nieprzereagowanych surowców oraz musimy dostarczać nowe porcje sterylnej wody. W patencie WO 01/25178 odprowadzany z bioreaktora roztwór poddano mikrofiltracji, a następnie wydzielono zawarte w nim składniki za pomocą ich sorpcji na złożach zeolitowych sit molekularnych. Ciecz wypływającą z kolumn sorpcyjnych zaproponowano zawrócić do bioreaktora, co pozwoliłoby ograniczyć ilość zużywanej świeżej wody. To rozwiązanie wymaga jednak okresowej regeneracji złóż zeolitowych. Wydzielane z bioreaktora roztwory można rozdzielić przez destylację. Odparowaną wodę skrapla się, ale kondensat nadal zawiera zbyt dużo szkodliwych lotnych związków organicznych, co ogranicza jego wykorzystanie do sporządzenia nowej brzeczki. Problem ten rozwiązano oczyszczając otrzymywane kondensaty metodą odwróconej osmozy (E. Morin-Couallier, L.T. Payot, A. Pastore Bertin, and M.L. Lameloise, Recycling of distillery effluents in alcoholic fermentation, Applied Biochemistry and Biotechnology, 133 (2006) ). To rozwiązanie wymaga jednak energochłonnego od-

3 PL B1 3 parowania wywaru i zbudowania obok bioreaktorów dodatkowej wysokociśnieniowej instalacji membranowej. Sposób fermentacji glicerolu według wynalazku prowadzonej w bioreaktorze z wykorzystaniem bakterii, charakteryzuje się tym, że roztwory odbierane z bioreaktora odwadnia się metodą osmotycznej destylacji membranowej, w której jako roztwór osmotyczny stosuje się stężony glicerol. Glicerol pochłaniając wodę z roztworów odbieranych z bioreaktora ulega rozcieńczeniu i następnie wykorzystuje się go jako surowiec do fermentacji. W procesie osmotycznej destylacji membranowej stosuje się roztwór osmotyczny zawierający powyżej 50% glicerolu. W przypadku, kiedy fermentację prowadzi się równocześnie z procesem destylacji membranowej w bioreaktorze wyposażonym w moduł membranowy, metodą osmotycznej destylacji membranowej odwadnia się destylat odbierany z bioreaktora membranowego. Sposób można stosować także w przypadku tradycyjnej fermentacji. Wówczas metodą osmotycznej destylacji membranowej odwadnia się brzeczkę pofermentacyjną. W procesie osmotycznej destylacji membranowej stosuje się niezwilżalne porowate membrany o grubości ścianki przynajmniej 0,4 mm. Układ według wynalazku do fermentacji glicerolu w bioreaktorze z wykorzystaniem bakterii zawierający bioreaktor, zbiornik koncentratu, zbiornik glicerolu, pompy obiegowe, charakteryzuje się tym, że zbiornik koncentratu połączony jest wlotem do modułu osmotycznej destylacji membranowej, z którego wylot jest połączony z drugim wlotem do zbiornika koncentratu. Wylot i wlot z przestrzeni między kapilarnej modułu osmotycznej destylacji membranowej połączone są ze zbiornikiem glicerolu, który połączony jest z bioreaktorem. Korzystnie bioreaktor wyposażony jest w moduł membranowy do bezpośredniej kontaktowej destylacji membranowej. W tym przypadku bioreaktor połączony jest z zaworem spustowym poprzez układ chłodzący zawierający zbiornik destylatu i chłodnicę, przy czym wylot z modułu membranowego połączony jest z wlotem do zbiornika destylatu, a wlot do modułu membranowego z wylotem chłodnicy. Zaletą rozwiązania według wynalazku jest odzyskiwanie wody w procesie fermentacji glicerolu. Stosując osmotyczną destylację membranową wydzieloną z roztworów pofermentacyjnych wodę adsorbuje się w stężonych roztworach glicerolu, uzyskując w ten sposób rozcieńczony roztwór, przydatny jako surowiec do fermentacji. Sposób według wynalazku objaśniono w przykładach wykonania, natomiast układ przedstawiono na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat układu do fermentacji tradycyjnej, fig. 2 przedstawia schemat układu do fermentacji z bioreaktorem wyposażonym w moduł membranowy do destylacji membranowej. P r z y k ł a d 1 Układ do fermentacji z odzyskiwaniem wody składa się z bioreaktora 1, wewnątrz którego umieszczono moduł membranowy 2 do bezpośredniej kontaktowej destylacji membranowej (DCMD) w wersji zanurzeniowej, bez obudowy zewnętrznej. Wylot modułu podłączono do zewnętrznego obiegu składającego się ze zbiornika destylatu 3 połączonego poprzez chłodnicę 4 z wlotem do modułu 2. Zbiornik destylatu 3 posiada także wylot z zaworem, który połączono ze zbiornikiem koncentratu 5, stanowiącego element obiegu cieczy, z której odzyskuje się wodę. Zbiornik koncentratu 5 posiada również drugi wylot z zaworem odcinającym. Zbiornik koncentratu 5 połączono z wlotem i wylotem modułu 6 do osmotycznej destylacji membranowej (OMD). Drugi wlot i wylot modułu 6 połączono ze zbiornikiem glicerolu 7 wyposażonym w dozownik stężonego glicerolu oraz odprowadzenie roztworu glicerolu do bioreaktora 1. Bioreaktor składał się z termostatowanej w łaźni wodnej szklanej kolby kulistej o pojemności 0,002 m 3, wewnątrz której umieszczono moduł DCMD. Moduł wykonano z kapilarnych membran polipropylenowych Accurel PP S6/2 (Membrana GmbH, Niemcy). Średnica kapilar d w /d z = 1,8/2,6 mm, średni rozmiar porów 0,22 m, porowatość 73%. W module zamontowano dwie kapilary, o długości 0,5 m każda, co odpowiadało powierzchni zewnętrznej modułu F zew = 0,00817 m 2. Membrany ułożono w bioreaktorze w pozycji horyzontalnej. Wlot i wylot modułu połączono poprzez korek zamykający kolbę z zewnętrznym obiegiem destylatu, w którym ciecz tłoczono pompą perystaltyczną. W chwili startowej obieg ten wypełniony był znaną ilością wody destylowanej (0,2 0,3 kg). Z pomiarów zamian masy i stężeń obliczono strumienie poszczególnych składników w procesie. Średnia temperatura w obiegu chłodzącym wynosiła 295 K, a natężenie przepływu recyrkulowanej cieczy wynosiło 0,15 kg/min. Temperatura fermentacji 308 K.

4 4 PL B1 Do procesu OMD zastosowano moduł kapilarny o powierzchni 0,019 m 2. W szklanej rurowej obudowie o średnicy 0,0175 m umieszczono 18 polipropylenowych membran Accurel PP S6/2, o długości czynnej 0,185 m. Do badań zastosowano czysty glicerol (POCh). Analizę jakościową i ilościową związków w badanych roztworach przeprowadzono przy pomocy chromatografu jonowego 850 Professional IC (Herisau Metrohm AG, Szwajcaria). W chromatografie zamontowano kolumnę analityczną Hamilton PRP-X300; 250x4,1 mm (Hamilton Company, USA). Fazę ruchomą (eluent) przygotowano z koncentratu dla chromatografii jonowej (HCIO 4 ) firmy Fluka (Szwajcaria). Zmiany ilości komórek bakterii w brzeczce badano stosując standardową metodę posiewów na sterylnej zestalonej pożywce MRS, dla rozcieńczeń w zakresie Kolonie liczono po 24 h inkubacji w temperaturze 313 K za pomocą licznika koloni POL-EKO LKB2002. Liczbę bakterii przeliczono na standardową wartość podawaną w liczbie jednostek bakterii formujących kolonię z 1 ml dozowanego do posiewu roztworu CFU/ml (ang. Colony Forming Units). Do fermentacji glicerolu zastosowano bakterie Leuconostoc mesenteroides. Roztwór do fermentacji (brzeczkę) przygotowano ze sterylnej wody demineralizowanej, do której dodano: pepton K (10 kg/m 3 ); glicerol (10 kg/m 3 ) oraz ekstrakt drożdżowy (5 kg/m 3 ). Brzeczkę zaszczepiono dodając 0,00018 m 3 inakulatu, uzyskanego po 48 h hodowli bakterii na podłożu MRS (50 kg/m 3 ). Podczas fermentacji, co 24 h pobierano próby do analizy (25 ml) i dodawano do brzeczki nową porcję glicerolu (10 kg/m 3 ) rozpuszczonego w takiej ilości sterylnej wody demineralizowanej, aby utrzymać stały poziom cieczy w danej hodowli. Po 6 dniach fermentacji połączonej z DCMD, destylatem zebranym w zbiorniku 3 napełniono zbiornik koncentratu 5, a do zbiornika glicerolu 7 wlano 0,5 kg glicerolu i uruchomiono proces OMD. Po dobie jego trwania objętość w zbiorniku glicerolu 7 wzrosła dwukrotnie, a uzyskany roztwór dozowano do bioreaktora. Z takim dozowaniem proces fermentacji kontynuowano przez kolejne 8 dni, nie stwierdzając istotnych różnic w jego przebiegu. Gdy stężenie glicerolu zmniejszyło się do 48 50%, zawartość zbiornika glicerolu 7 wymieniano na nowy stężony glicerol (ok. 100%). Zbierany destylat ze zbiornika destylatu 3 codziennie przelewano do zbiornika koncentratu 5. Gromadzony w zbiorniku koncentratu 5 koncentrat, co drugi dzień usuwano poprzez drugi wylot z zaworem odcinającym. Wyniki badań przedstawiono w Tabeli 1. T a b e l a 1. Dzień DCMD [dm 3 /m 2 doba] Destylat kwas octowy [kg/m 3 ] 17,2 16,3 15,4 14,6 14,7 14,9 15,9 14,7 15,2 14,2 0,03 0,022 0,018 0,018 0,023 0,043 0,063 0,03 Log CFU/ml 8,9 9,1 9,7 10,6 8,6 8,5 9,3 8,2 8,8 9,8 Podczas badań brzeczka w bioreaktorze zawierała kwasy [kg/m 3 ]: octowy (0,9 1,2), mlekowy (1,5 6,8), mrówkowy (0,1 0,42), cytrynowy (0,14 0,18) oraz bursztynowy (0,05 0,11). Uzyskany po procesie OMD rozcieńczony roztwór glicerolu zawierał także kwas octowy (0,0013 0,0083 kg/m 3 ) oraz kwas mrówkowy (poniżej 0,0005 kg/m 3 ). Ich stężenie było ponad 1000 razy mniejsze od występującego w brzeczce, stąd dodanie do niej uzyskanego roztworu glicerolu, korzystnie dla bakterii rozcieńczało obecne w bioreaktorze kwasy. P r z y k ł a d 2 Zastosowano instalację i warunki jak w przykładzie 1, z tą różnicą, że układ DCMD nie pracował (tradycyjna fermentacja), a zbiornik koncentratu 5 napełniono odwirowaną brzeczką uzyskaną po 9 dniach fermentacji glicerolu. Zawór 8 na wylocie ze zbiornika destylatu 3 był zamknięty. Do zbiornika 7 wprowadzono 0,5 kg stężonego glicerolu i prowadzono proces OMD aż do uzyskania rozcieńczenia glicerolu na poziomie 50%. Rozcieńczony po OMD glicerol zawierał kwas octowy (0,05 kg/m 3 ) oraz kwas mrówkowy (0,0015 kg/m 3 ). Uzyskanym roztworem zasilono bioreaktor, a przebieg fermentacji był zbliżony do opisanego w tabeli 1 w przykładzie 1. P r z y k ł a d 3 Roztwory zawracane do bioreaktora powinny zawierać jak najmniejsze ilości metabolitów, jak kwas octowy. Przeprowadzono badania procesu OMD wzorcowego roztworu kwasu octowego

5 PL B1 5 (1,07 kg/m 3 ). Zastosowano układ OMD jak w przykładzie 1. Każdy pomiar prowadzono przez 22 h. Membrany kapilarne Accurel PP S6/2 mają grubość ścianki 0,4 mm. Wyniki badań zamieszczono w tabeli 2. Średnie stężenie glicerolu [%] T a b e l a 2. wody kwasu Współczynnik wzbogacenia 49,4 7,08 0,0069 1,06 53,4 7,66 0,0057 0, ,49 0,0051 0,38 88,9 21,7 0,0043 0,18 Stwierdzono, że po rozcieńczeniu roztworu osmotycznego do poziomu 50% glicerolu, dalsza kontynuacja procesu OMD spowodowała, że znacznie wzrastała wartość współczynnika wzbogacenia, co oznacza niekorzystne przechodzenie większych ilości kwasu octowego z odwadnianego roztworu do roztworu osmotycznego. P r z y k ł a d 4 Powtórzono badania separacji wzorcowych roztworów kwasu octowego jak w przykładzie 3, z tą różnicą, że do prowadzenia procesu OMD zamiast modułu kapilarnego zastosowano moduł płaski z membraną teflonową (PTFE) firmy Millipore o grubości 0,1 mm. Wyniki zamieszczono w tabeli 3. Średnie stężenie glicerolu [%] T a b e l a 3. wody kwasu Współczynnik wzbogacenia 42 14,0 0,014 1, ,26 0,0151 1, ,2 0,0143 0,91 73,5 23,3 0,0139 0,6 74,2 22,49 0,0135 0,56 Zastosowana membrana była 4 razy cieńsza od użytej w przykładzie 3, co spowodowało zmniejszenie oporów transportu masy i w efekcie większe ilości kwasu octowego przeszły z odwadnianego roztworu do roztworu osmotycznego (glicerolu). Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób fermentacji glicerolu w bioreaktorze z wykorzystaniem bakterii, znamienny tym, że roztwory odbierane z bioreaktora odwadnia się metodą osmotycznej destylacji membranowej, w której jako roztwór osmotyczny stosuje się stężony glicerol, który po rozcieńczeniu wykorzystuje się jako surowiec do fermentacji. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w procesie osmotycznej destylacji membranowej stosuje się roztwór osmotyczny zawierający powyżej 50% glicerolu. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że metodą osmotycznej destylacji membranowej odwadnia się destylat odbierany z bioreaktora membranowego, w którym fermentację prowadzi się równocześnie z procesem destylacji membranowej. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że metodą osmotycznej destylacji membranowej odwadnia się brzeczkę pofermentacyjną. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w procesie osmotycznej destylacji membranowej stosuje się niezwilżalne porowate membrany o grubości ścianki przynajmniej 0,4 mm.

6 6 PL B1 6. Układ do fermentacji glicerolu w bioreaktorze z wykorzystaniem bakterii zawierający bioreaktor, zbiornik koncentratu, zbiornik glicerolu, pompy obiegowe, znamienny tym, że bioreaktor (1) połączony jest poprzez zawór spustowy (8) ze zbiornikiem koncentratu (5), który połączony jest z wlotem do modułu (6) osmotycznej destylacji membranowej, z którego wylot jest połączony z drugim wlotem do zbiornika koncentratu (5), zaś wylot i wlot z przestrzeni międzykapilarnej modułu (6) osmotycznej destylacji membranowej połączone są ze zbiornikiem glicerolu (7), który połączony jest z bioreaktorem (1). 7. Układ według zastrz. 6, znamienny tym, że bioreaktor (1) wyposażony jest w zanurzeniowy moduł membranowy (2) i połączony z zaworem spustowym (8) poprzez układ chłodzący zawierający zbiornik destylatu (3) i chłodnicę (4), przy czym wylot z modułu membranowego (2) połączony jest z wlotem do zbiornika destylatu (3) a wlot do modułu membranowego (2) z wylotem chłodnicy (4). Rysunki Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)