Prace Instytutów i Laboratoriów Badawczych Przemysłu Spożywczego2009 t. 64

Transkrypt

1 WYKORZYSTANIE METODY PCR DO IDENTYFIKACJI RODZAJOWEJ SZCZEPÓW FUSARIUM IZOLOWANYCH Z ZIARNA PSZENICY Michalina Suchorzyńska, Maria Spera, Anna Misiewicz Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego Zakład Mikrobiologii ul. Rakowiecka 36, Warszawa suchorzynska@ibprs.pl Streszczenie Grzyby z rodzaju Fusarium są czynnikami wywołującymi poważne choroby u roślin, ludzi oraz zwierząt. Szybka identyfikacja patogenów jest możliwa przy pomocy narzędzi biologii molekularnych. Różne techniki molekularne oparte o reakcję łańcuchowej polimerazy (PCR) pozwalają na uzyskanie powtarzalnych wyników w krótkim czasie. Celem pracy była analiza 12. izolatów należących do rodzaju Fusarium z wykorzystaniem 2. różnych par starterów: uniwersalnych starterów oraz specyficznych starterów. Badania potwierdziły przynależność badanych szczepów do rodzaju Fusarium. Słowa kluczowe: Fusarium sp., PCR, rdna, ITS1, ITS2, identyfikacja THE USE OF PCR METHOD TO IDENTIFICATION STRAINS OF FUSARIUM GENUS ISOLATED FROM WHEAT SEEDS Summary Fungi belonging to Fusarium genus are major factors in plant, human and animal diseases. The ability for rapid detection and identification of these pathogens is possible with molecular tools. Various molecular techniques allow to get rapid results. These methods are based on polymerase chain reaction (PCR). The aim of the study was to check of 12 isolates belonging to Fusarium genus using two primer pairs: universal fungal primers ITS1, ITS4 and specific primers P58SL, P28SL. In the study we confirmed isolates to Fusarium sp Key words: Fusarium sp., PCR, rdna, ITS1, ITS2, identification I. Wprowadzenie Grzyby z rodzaju Fusarium są najczęściej występującymi patogenami grzybowymi na świecie [Golińska 2002]. Są to kosmopolityczne grzyby, które w środowisku mogą występować jako organizmy saprofityczne lub patogeny, zarówno roślin, ludzi jak i zwierząt [Kwaśna i in. 1991, Nelson i in. 1994, Golińska 2002]. Określa się je mianem organizmów glebowych, ponieważ zasiedlają głównie glebę, Mogą rozwijać się też w wodzie, organach roślinnych, zwierzęcych i ludzkich [Morrison i in. 1993, Nelson i in. 1994, Hennequin i in.1997, Golińska 2002]. Wśród tej grupy mikroorganizmów, do najbardziej powszechnych, agresywnych i niebezpiecznych należą: F. culmorum, F. graminearum, F. nivale, F. avenaceum, F. sporotrichioides, F. poae, F. oxysporum, F. solani oraz F. verticillioides [Miller 1994, Parry i in. 1995, Magan 2002]. Z wyżej wymienionych gatunków aż trzy: F. solani, F. oxysporum i F. verticillioides są sprawcami ponad 95% chorób u ludzi, zaś 5% chorób wywołanych jest obecnością F. dimerum [Guarro, Gene 1992, Hennequin i in. 1997]. Grzyby te powodują grzybice 57

2 paznokci, skóry, choroby rogówki oka. [Nelson i in. 1994]. Są przyczyną infekcji przy przeszczepach szpiku, osłabiają odporność w terapiach klinicznych [Nelson i in. 1994, Boutati 1997, Hennequin i in. 1997]. Większość gatunków Fusarium sp. można spotkać w środowisku jako patogeny roślin. Konsekwencje wynikające z zakażeń upraw widoczne są na świecie [Golińska 2002]. Straty ekonomiczne i gospodarcze wynikające z porażeń upraw są ogromne biednych, rozwijających się, także bogatych i wysoce uprzemysłowionych [Bennett, Klich 2003]. W USA w wyniku porażenia pszenicy i jęczmienia odnotowano 3 mld dolarów w 1990r [Golińska 2002] Do rodzaju Fusarium zostały uznane za najgroźniejsze spośród innych rodzajów grzybów pleśniowych [Polley, Turner 1995]. Patogeny z tej grupy infekują rośliny o podstawowym znaczeniu dla ludzi, jak zboża drobnoziarniste (pszenica, żyto, jęczmień, owies i pszenżyto), ziemniaki, kukurydze, a także chmiel i truskawki [Chełkowski 1985, Kwaśna i in. 1991, Leslie i Summerell 2006]. Rośliny są porażane w różnych fazach rozwojowych, co prowadzi do rozwoju chorób przed i powschodowych [Kiecana 1986, Łacicowa i Wagner 1989]. Choroby tj. zamieranie ziarna, fuzaryjna zgorzel podstawy źdźbła i korzeni, choroby podsuszkowe czy fuzaryjna zgorzel kłosów, powodowane są przez złożone kompleksy patogenów. Na terenie Polski dominują Fusarium culmorum i Fusarium graminearum [Kobras, Horoszkiewicz-Janka 2007], Warunki klimatyczne, które panują w Polsce są dogodne dla wzrostu różnych grzybów z rodzaju Fusarium. Bywają lata, w których odnotowuje się dominację F. poae czy F. sporotrichioides [Arseniuk, Góral 2005]. Obecność ich jest zmienna w każdym roku, w zależności od warunków środowiska [Arseniuk i Góral 2005, Chełkowski 1985, Parry i in. 1995]. Wynikiem porażenia upraw jest zmniejszenie ich wartości [Bechtel i in. 1985, Parry i in. 1995]. Poza tym z obecności patogenów wynika niebezpieczeństwo możliwości syntezy wysoce toksycznych związków, zwanych mikotoksynami [Ławiecki, Kobras 2002]. Mikotoksyny to wtórne metabolity, które produkowane są głównie przez trzy rodzaje grzybów: Aspergillus, Penicillium, i Fusarium. Wykazują różnorodne działanie toksyczne: cytotoksyczne, genotoksyczne, hepatotoksyczne [Bennett, Klich 2003, Packa 2006]. Z punktu ekonomicznego i toksykologicznego wyróżniono aż 5 klas mikotoksyn o największym znaczeniu: aflatoksyny tworzone przez Aspergillus, ochratoksyny przez Penicillium oraz zearalenon, trichoteceny i fumonizyny przez Fusarium sp. [Arseniuk, Góral 2005, Creppy 2002, Edwards i in. 2002, Packa 2006]. Mikotoksyny wytwarzane przez Fusarium sp. nazwano mikotoksynami fuzaryjnymi. Wpływają one na ludzi i zwierzęta prowadząc do zaburzeń m. in. układu pokarmowego, odpornościowego, na rośliny hamując ich wzrost, kiełkowanie nasion. Indukują abberacje chromosomowe, apoptozy, nekrozy, obniżają aktywność enzymów. Spożywanie zakażonej żywności może powodować biegunki, krwotoki, zaniki łaknienia, uszkodzenia nerek, nowotwory (przełyku, wątroby), doprowadzając do śmierci [Edwards i in. 2002, Magan 2002, Packa 2006]. W celu uniknięcia strat upraw powodowanych przez Fusarium sp. oraz szybkiego wykrycia przyczyn infekcji u ludzi i zwierząt, wykorzystuje się metody biologii molekularnej [Atkins i Clark 2004]. Wynik uzyskany tymi metodami jest obiektywny. Opiera się na stałej strukturze DNA, niezależnej od warunków termicznych i stanu fizjologicznego organizmu [Nelson i in. 1994, Guarro, Gene 1995, Leslie i Summerell 2006]. Identyfikacja szczepów do rodzaju umożliwia szybką i wstępną ocenę zagrożenia biologicznego. Specyficzne startery są konstruowane na podstawie stabilnych sekwencji obejmujących geny rybosomalne RNA: 18S, 5,8S oraz 28S, które występują w formie jednostek transkrypcyjnych, jako wielokrotne powtórzenia w genomie [Yao i in. 1991, Hibbett 1992]. Zawierają one miejsca wysoce konserwatywne dzięki czemu można wykorzystać je do wykrywania i identyfikacji grzybów. Geny rdna są powszechnie stosowane do identyfikacji grzybów, w badaniach taksonomicznych czy do określania 58

3 przynależności szczepów do rodzaju Fusarium [O Donnell 1992, Abd-Elsalam i in. 2003] oraz innych rodzajów grzybów np. Verticillium [Nazar i in. 1991, Schilling i in. 1996]. W niniejszej pracy sprawdzono metodą PCR ze specyficznymi starterami (SCAR) izolaty grzybów pleśniowych w celu określenia ich przynależności do rodzaju Fusarium. II. MATERIAŁY I METODY BADAŃ Materiałem badawczym wykorzystanym w niniejszej pracy było 106 izolatów grzybów pleśniowych pozyskanych z próbek ziarna pszenicy. W celu wyizolowania badanych kultur szczepów Fusarium użyto podłoża selektywne DRBC, DCPA, które posłużyły do otrzymania czystych kultur szczepów Fusarium. Podłoże glukozowo-ziemniaczane z agarem (PDA) wykorzystano do identyfikacji otrzymanych szczepów metodą klasyczną na podstawie cech morfologicznych za pomocą kluczy mikologicznych (Nelson). Bulion glukozowoziemniaczany PDB (SIGMA-Aldrich), został wykorzystany jako podłoże namnażające do izolacji DNA. Spośród 106 wyizolowanych szczepów, oznaczonych przy pomocy kluczy mikologicznych na podstawie ich cech morfologicznych 84 sklasyfikowano jako Fusarium sp., natomiast w przypadku 22 izolatóii. identyfikacja była wątpliwa. Przeprowadzono identyfikację rodzajową otrzymanych izolatów przy użyciu starterów P28SL i P58SL:, w części badań wykorzystano tylko 12 spośród wszystkich szczepów przy zastosowaniu uniwersalnych starterów ITS1 i ITS4. W badaniach molekularnych, jako szczepów kontrolnych użyto szczepów z Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych (KKP, jako kontrole pozytywne zastosowano szczepy z rodzaju Fusarium: Fusarium sp. KKP 760, F. avenaceum KKP 756, F. oxysporum KKP 458, F. verticillioides oraz kontrole negatywne szczepy z rodzaju Trichoderma: Trichoderma harzianum KKP 534, T. viride KKP795 Trichoderma sp. KKP 788 oraz z rodzaju Aspergillus: Aspergillus awamori KKP 40. A. IZOLACJA DNA Ekstrakcja DNA została przeprowadzona przy pomocy zmodyfikowanej procedury opisanej przez [Don Liu i in. 2000]. Szczepy Fusarium sp. rosły w temperaturze 25 C przez 5-7 dni, w bulionie glukozowo-ziemniaczanym PDB (SIGMA-Aldrich). Wyrosłą grzybnię przenoszono sterylnie do krioprobówek (NALGENE) i przechowywano w ciekłym azocie przez minimum godzinę. Zamrożony materiał przenoszono do probówek typu Eppendorf o obj. 1,5ml i ucierano za pomocą sterylnych tłuczków (SIGMA-Aldrich) do momentu homogenności grzybni. Rozdrobniony materiał oczyszczano przez dwukrotne wirowanie w 500µl wody redestylowanej (10 tys. rpm, 10 min). Do osadu dodawano 500µl buforu lizującego (Tris-HCl ph 8,0, EDTA ph 8,0, NaCl, SDS) i inkubowano 10 min w temperaturze pokojowej. Po dodaniu 150 µl octanu potasu ph 4,8 próbki wirowano (14 tys. rpm, 2min). W kolejnych etapach izolacji do uzyskanego supernatantu dodawano izopropanol w stosunku 1:1 i wirowano (14 tys. rpm, 5 min). Osad przemywano 300 µl, 70%-wego etanolu, wirowano (14 tys. rpm, 10 min), osuszano i zawieszano w 50 µl wody redestylowanej. Zawartość i czystość DNA badanych szczepów zmierzono przy pomocy fluorospektrofotometru (NanoDrop). W celu uzyskania optymalnych produktów w reakcjach PCR, próbki zostały rozcieńczone tak, aby stężenie końcowe zawiesiny DNA wynosiło ng/ µl. 59

4 B. STARTERY Do określenia przynależności rodzajowej badanych izolatów Fusarium wykorzystano 2 pary starterów. Pierwsza para P58SL i P28SL zaprojektowana przez [Hue i in. 1999] o sekwencji: - P58SL 5 -AGT ATT CTG GCG GGC ATG CCT GT-3 - P28SL 5 -ACA AAT TAC AAC TCG GGC CCG AGA-3 Drugą parę stanowiły uniwersalne startery ITS1, ITS4 specyficzne dla grzybów strzępkowych opracowane przez [White i in. 1990] o sekwencji: - ITS1 5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 - ITS4 5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3. C. AMPLIFIKACJA DNA Reakcje PCR przeprowadzono w objętości 25 µl zawierającej w odpowiednich ilościach: 2,5 każdego ze starterów, o stężeniu 2µM; 13 µl H 2 O; 2,5 µl dntps, każdy o stężeniu 2,5µM; 2,5 µl buforu Run 10-razy stężonego; 1U 1 µl polimerazy Run (A&ABiotechnology); 1 µl badanego DNA. Amplifikację wykonano przy pomocy termocyklera (Termocykler Px2 Thermo ELECTRON CORPORATION) według zoptymalizowanych programów w stosunku do każdej pary starterów. Szczegóły dotyczące warunków PCR podano w tabeli 1. TABELA 1. Charakterystyka warunków reakcji PCR Startery Warunki PCR dla każdej z pary starterów Wielkość produktu P58SL, P28SL ITS1, ITS4 94ºC 5 min, [94ºC- 1 min, 68ºC 1 min, 72ºC 1min]x30, 72ºC 10 min 94ºC 5 min, [94ºC- 30 s, 53ºC 30 s, 72ºC 1 min ]x8, [94 ºC - 30 s, 56ºC 30 s, 72ºC 1 min]x22 68ºC 15 min 329 pz pz Produkty uzyskane po reakcjach PCR zostały poddano rozdziałowi elektroforetycznemu na żelu agarozowym (1,5%) z dodatkiem bromku etydyny w buforze 0,5% TBE. Dodatkowo do badań zastosowano marker 50 Ladder (Fermentas), szczepy z kolekcji KKP oraz kontrole negatywne nie zawierające DNA. III. WYNIKI I DYSKUSJA Przynależność do rodzaju Fusarium badanych szczepów została najpierw określona metodami klasycznymi. W celu potwierdzenia tego oznaczenia oraz określenia specyficzności zastosowanych starterów przeprowadzono analizy z wykorzystaniem reakcji PCR. W pierwszej reakcji PCR zastosowano startery P58SL i P28SL. Otrzymany obraz na żelu po rozdziale elektroforetycznym (rys. 1, rys. 2) przedstawiał produkt o wielkości 329pz dla wszystkich badanych prób. Uzyskano produkty dla wszystkich kontroli z rodzaju Fusarium, brak produktu dla szczepu Aspergillus awamori. W wyniku amplifikacji otrzymano produkty u 2 spośród 3 badanych szczepów z rodzaju Trichoderma. Spośród 106 izolatów na podstawie obserwacji morfologicznych do rodzaju Fusarium zakwalifikowano 84, zaś 22 izolaty budziły wątpliwości. Po reakcji PCR ze starterami P58SL i P28SL tylko 6 izolatów nie należało do rodzaju Fusarium sp., natomiast u 16 wynik molekularny potwierdził przynależność do rodzaju Fusarium 60

5 Wynik analizy dla wybranych 12 badanych szczepów oraz kontorli pozytywnych i negatywnych. z tymi starterami został zamieszczony na rys. 1 i 2. Otrzymany wynik świadczył, o niepełnej specyficzności i skuteczności wybranych starterów. M pz RYSUNEK 1. Weryfikacja przynależności szczepów do Fusarium ze starterami P58SL i P28SL. Studzienki 1-12 badane izolaty Fusarium; studzienka 13- F. verticillioides rodzaju M pz RYSUNEK 2. Weryfikacja przynależności szczepów do Fusarium ze starterami P58SL i P28SL. Studzienki 1-Fusarium sp., 2-F. oxysporum, 3-F. avenaceum; 4- A.awamori; 5- T. harzianum; 6-Trichoderma sp.; 7-T. viride; 8-kontrola negatywna rodzaju Przeprowadzono drugą analizę PCR tym razem z wykorzystaniem uniwersalnych primerów opisanych przez [White i in. 1990] oznaczonych jako ITS1 i ITS4. Na żelu agarozowym (rys. 3, rys.4) uzyskano produkty o różnych wielkościach, charakterystycznych dla każdego z wybranych do reakcji rodzajów grzybów. Dla rodzaju Fusarium produkty miały wielkość pz, dla Aspergillus pz, a dla Trichoderma pz. Otrzymany wynik świadczył o prawidłowym oznaczeniu badanych grzybów i specyficzności starterów ITS1, ITS4. 61

6 M pz RYSUNEK 3. Weryfikacja przynależności szczepów do rodzaju Fusarium ze starterami ITS1 i ITS4. Studzienki 1-12 badane izolaty Fusarium; 13- F. verticillioides M pz RYSUNEK 4. Weryfikacja przynależności szczepów do różnych rodzajów grzybów ze starterami ITS1, ITS4. Studzienkai 1-Fusarium sp., 2-F. oxysporum, 3-F. avenaceum; 4- A.awamori; 5- T. harzianum;6 Trichoderma sp.; 7-T. viride; 8-kontrola negatywna W niniejszej pracy zastosowano metodę PCR ze specyficznymi starterami do identyfikacji szczepów grzybów pleśniowych należących do rodzaju Fusarium. Metoda SCAR jest wysoce specyficzna i czuła do wykrywania różnych patogenów z rodzaju Fusarium. Zastosowane w startery (P58SL i P28SL) zostały zaprojektowane przez [Hue i in. 1999], w oparciu o stabilne sekwencje rdna, charakterystyczne dla rodzaju Fusarium. Startery te miały przyłączać się do jednostek 5,8SRNA i 28SRNA różnych gatunków z rodzaju Fusarium. W wyniku reakcji PCR z tymi starterami uzyskano produkty reakcji dla badanych szczepów Fusarium, co potwierdziło skuteczność danych starterów w stosunku do Fusarium sp. Uzyskano również niespecyficzne produkty reakcji PCR dla większości z wykorzystanych w badaniu szczepów z rodzaju Trichoderma, co może świadczyć o niepełnej specyficzności starterów. W swoich badaniach [Hue i in. 1999] wykorzystali powyższe startery do wykrywania szczepów Fusarium sp. powodujących infekcje u ludzi. [Kulik i in. 2004] wykorzystali w swoich badaniach startery P58SL i P28SL, uzyskując pozytywne wyniki. Otrzymali produkty 62

7 tylko dla izolatów z rodzaju Fusarium. Wielkość produktu, którą uzyskali różniła się jednak od tej, którą otrzymali [Hue i in. 1999] o 10pz. W pracy [Hue i in. 1999] uzyskano obrazy żeli po rozdziale elektroforetycznym na których widoczne były niewielkie różnice w wysokościach otrzymanych produktów, jednakże stwierdzili oni, że różnice te nie miały istotnego znaczenia. Podobne różnice również uzyskano w niniejszej pracy. Do określania przynależności rodzajowej wykorzystać można inne startery bazujące na konserwatywnych regionach w genomie. [Hennquin i in. 1999] zaprojektowali startery (Fus1, Fus2) na podstawie regionu 28S rdna, sprawdzając różnice i podobieństwa wśród badanego rodzaju. [Abd-Elsalam i in. 2003] opracowali startery, które również miały na celu detekcję szczepów z rodzaju Fusarium. Otrzymali pozytywne wyniki dla wszystkich badanych izolatów. Wyniki te potwierdzili w reakcji PCR z uniwersalnymi starterami ITS1 i ITS4. [Abd-Elsalam i in. 2003] nie uzyskali produktu dla szczepów przynależnych do innych rodzajów grzybów. Wykorzystana w pracy technika SCAR okazała się skutecznym narzędziem, które pozwoliło na identyfikację szczepów do rodzaju Fusarium. W niniejszej pracy wykazano jednakże niespecyficzność starterów P58SL i P28SL, dlatego dla rutynowego wykorzystania tych starterów w reakcji PCR należałoby przeprowadzić kolejne badania potwierdzające czułość metody, aby przy ich pomocy wykrywać tylko szczepy z rodzaju Fusarium. IV.WNIOSKI 1. Metoda z wykorzystaniem reakcji PCR jest skutecznym narzędziem do określania przynależności rodzajowej patogenów grzybowych z rodzaju Fusarium z wykorzystaniem starterów P28SL i P58SL oraz ITS! I ITS4. 2. Dodatkowo uzyskano niespecyficzny produkt dla szczepów z rodzaju Trichoderma ze starterami P28SL i P58SL, co wskazuje na potrzebę modyfikacji starterów i dalsze analizy molekularne. V. PIŚMIENNICTWO 1. Abd-Elsalam K. A., Guo J. R., Schnieder F., Asran Amal A. M.,., Verreet J. A., 2003: PCR identification of Fusarium genus based on nuclear ribosomal-dna sequence data. Afr. J. Biotech. vol.2(4), pp Arseniuk E., Góral T., http//:1, 2005: Fuzarioza kłosów czynniki sprawcze i gospodarcze znaczenie choroby. IHAR w Radzikowie Atkins S. D., Clark I. M., 2004: Fungal molecular diagnostics: a mini review. J. Appl. Genet. 45(1): Bechtel D. B., Kaleikan L.A., Gaines R. L., Seitz L. M., 1985: The effects of Fusarium graminearum infection on wheat kernels. Cereal. Chem. 62: Bennett J. W., Klich M., 2003: Mycotoxins. Clin Microbiol Rev 16: Boutati E. I., Anaissie E. J., 1997: Fusarium, a significant emerging pathogen in patients with hematologic malignancy: ten years experiance at a cancer center and implications for management. Blood 90: Chełkowski J., 1985: Mikotoksyny, wytwarzające je grzyby i mikotoksykozy. Warszawa: SGGW-AR, 8. Creppy E. E., 2002: Update of survey, regulation and toxic effects of mycotoxins in Europe Toxicol. Lett. 127:

8 9. Edwards S. G., O Callaghan J., Dobson D. W., 2002: PCR-based detection and quantification of mycotoxigenic fungi-review. Mycol. Res. 106: Golińska B., Narożna D., Mądrzak C. J., 2002: Zastosowanie metod molekularnych do wykrywania, identyfikacji i charakterystyki grzybów z rodzaju Fusarium. Biotechnologia 3 (58): Guarro J., Gene J., 1992: Fusarium infections. Criteria for the identification of the responsible species. Mycoses 35: Guarro J., Gene J., 1995: Opportunistic fusarial infections in human. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 14: Hennequin C., Lavarde V., Poirot J. L., Rabodonirina M., Datry A., Aractingi S., Dupouy C. J., Caillot D., Grange F., Kures L., Morin O., Lebeau B., Bretagne S., Guigen C., Basset D., Grillot R., 1997: Invasive Fusarium infections: a retrospective survey of 31 cases. The French Groupe d Etudes des Mycoses Opportunistes. J. Med. Vet. Mycol. 35: Hennequin C., Abachin E., Symoens F., Lavarde V., Reboux G., Nolard N., Berche P., 1999: Identification of Fusarium species involved in human infections by 28S rrna gene sequencing. J. Clin. Microbiol. p Hibbett D. S., 1992: Ribosomal RNA and fungal systematics. Trans. Mycol. Soc. 33: Hue F.-X., Huerre M., Rouffault M. A., De Bievre C., 1999: Specific detection of Fusarium species in blood and tissues by a PCR technique. J. Clin. Microbiol. Vol. 37 (8): Leslie J. F., Summerell B. A., 2006: The Fusarium Laboratory Manual. Blackwell Publishing Professional, first edition. 18. Łacicowa B., Wagner A., 1989: Grzyby towarzyszące Gaumannomyces graminis w tkankach pszenicy i pszenżyta. Zesz. Prob. Post. Nauk Rol. 374: Ławiecki T., Kobras M., 2002: Reakcje wybranych odmian jęczmienia browarnego na porażenie kłosów grzybami z rodzaju Fusarium. Progress Plant Pathol. 42: Kiecana I., 1986: Fuzarioza kłosów pszenżyta. Rocz. Nauk Rol. Seria E, 16: Kobras M., Horoszkiewicz-Janka J., 2007: Znaczenie i możliwości ograniczenia szkodliwych metabolitów pochodzenia grzybowego. Progress Plant Protec., 47 (2). 22. Kulik T., Fordoński G., Pszczółkowska A., Płodzień K., Łapiński M., 2004: Development of PCR assay based on ITS2 rdna polymorphism for the detection and differentiation of Fusarium sporotrichioides. FEMS Microbiol. Lett. 239, Kwaśna H., Chełkowski J., Zajkowski P., 1991: Flora polska. Vol. 22. Grzyby (Mycota). Warszawa: Inst Botaniki PAN, 24. Magan N., Hope R., Colleate A., Baxter E. S., 2002: Relationship between growth and mycotoxin production by Fusarium species, biocides and environment. Eur. J. Plant Pathol. 108: Miller J. D., 1994: Epidemiology of Fusarium graminearum diseases of wheat and corn. In Mycotoxins in grain: compounds other than aflatoxins (Miller J., D., Trenholm H. L., eds.) Eagon Press, St Paul, MN. s.: Morrison V. A., Haake R. J., Weisdorf D. J., 1993: The spectrum of non-candida fungal infections following bone marrow transplantation. Medicine 72: Nazar R. N., Hu X., Schmidt J., Culham D., Robb J., 1991: Potential use of PCRamplified ribosomal intergenic sequences in the detection and differentiation of Verticillium wilt pathogens. Physiol. Mo. Plant Pathol. 39: Nelson P. E., Dignani M. C., Anaissie J., 1994: Taxonomy, biology, and clinical aspects of Fusarium species. Clin. Microbiol. Rev 7:

9 29. O Donnell K., 1992: Ribosomal DNA internal transcribed spacers are highly divergent in the phytopathogenic ascomycete Fusarium sambucinum (Gibberella pulicaris). Curr. Genet. 22: Packa D., 2006: Mikotoksyny zagrożeniem dla ludzi, zwierząt i roślin. Rolnicze ABC 11(196): 5-6 XI Parry D. W., Jenkinson P., McLeod L., 1995: Fusarium ear blight (scab) in small grain cereals a review. Plant Pathol. 44: Polley R. W., Turner J.A., 1995: Surveys of stem base diseases and Fusarium ear diseases in winter wheat in England, Wales and Scotland, Ann. Appl. Biol. 126: Schilling A.G., Moller E. M., Geiger H. H., 1996: Polymerase chain reaction-based assays for species-specific detection of Fusarium culmorum, F. graminearum and F. avenaceum. Phytopathology 86: White T. J., Bruns T., Lee. S., Taylor J. W., 1990: Amplication and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: A Guide to methods and Applications, eds. Innis, MA, Gelfand D. H., Sninsky J.J., White T.J., New York: Academic Press, Inc.,, pp Yao C., Frederiksen R. A., Magil C. W., 1992: Length heterogeneity in ITS2 and the methylation status of CCGG and GCGC sites in the rrna genes of the genus Peronosclerospora. Curr. Genet. 22: