A u t o r e f e r a t

Transkrypt

1 Załącznik nr 2a A u t o r e f e r a t DR LIDIA IRZYKOWSKA Zakład Fitopatologii Katedra Fitopatologii i Nasiennictwa (Katedra Fitopatologii do r.) Wydział Ogrodnictwa i Architektury Krajobrazu Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu POZNAŃ 2014

2 SPIS TREŚCI 1. Życiorys naukowy strona 3 2. Opis osiągnięcia naukowego będącego podstawą do złożenia wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego 4 3. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych Bibliometryczne podsumowanie dorobku naukowego

3 1. Życiorys naukowy Wykształcenie 1993 magister biologii, specjalność biologia molekularna ( r.) Zakład Biochemii Biopolimerów, Wydział Biologii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu Tytuł pracy dyplomowej: Wpływ insercji jednego nukleotydu do ramienia antykodonowego na modyfikację U 35 w pre-trna Tyr Arabidopsis thaliana Promotor: prof. dr hab. Jacek Augustyniak 2002 doktor nauk rolniczych w dziedzinie agronomii - genetyka roślin ( r.) Pracownia Analizy Genomu, Instytut Genetyki Roślin PAN w Poznaniu Tytuł rozprawy doktorskiej: Konstruowanie mapy sprzężeń oraz lokalizacja loci warunkujących wybrane cechy ilościowe (QTL) u Pisum sativum L. Promotor: prof. dr hab. Bogdan Wolko Rozprawa doktorska została wyróżniona przez Radę Naukową IGR PAN Inne formy edukacji 1999 Kurs I i II stopnia grafiki komputerowej w Wielkopolskim Centrum Komputerowym 2000 Egzamin międzynarodowy z j. angielskiego (FCE of the University of Cambridge) 2004 Ukończone Zaoczne Studium Przygotowania Pedagogicznego (2003/04) Wydział Ekonomiczno-Społeczny Akademii Rolniczej w Poznaniu Przebieg pracy zawodowej technik, od 1993 st. technik w Zakładzie Enzymologii, Katedrze Biochemii i Biotechnologii Akademii Rolniczej w Poznaniu asystent, od 2002 adiunkt w Pracowni Analizy Genomu, Instytutu Genetyki Roślin PAN w Poznaniu od 1. X.2002 adiunkt w Katedrze Fitopatologii (od Katedrze Fitopatologii i Nasiennictwa) Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu - 3 -

4 2. Opis osiągnięcia naukowego będącego podstawą do złożenia wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego Zgodnie z art. 16 ust. 2 ustawy z dn r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 z późniejszymi zmianami) przedkładam osiągnięcie naukowe pt.: Charakterystyka zróżnicowania genetycznego oraz wybranych cech Gaeumannomyces graminis (Sacc.) Arx & Olivier var. tritici i Fusarium culmorum (W.G. Smith) Sacc. udokumentowane monotematycznym cyklem siedmiu publikacji naukowych: H1. Weber Z., Irzykowska L., Bocianowski J Analysis of Mycelial Growth Rates and RAPD-PCR Profiles in a Population of Gaeumannomyces graminis var. tritici Originating from Wheat Plants Grown from Fungicide-treated Seed. Journal of Phytopathology 153: H2. Irzykowska L Molecular detection and comparison of Gaeumannomyces graminis var. tritici isolates originating from wheat and rye. Journal of Plant Protection Research 47 (3): H3. Irzykowska L., Bocianowski J Genetic variation, pathogenicity and mycelial growth rate differentiation between Gaeumannomyces graminis var. tritici isolates derived from winter and spring wheat. Annals of Applied Biology 152: H4. Irzykowska L., Baturo A Genetic polymorphism of Fusarium culmorum isolates originating from roots and stem bases of barley. Journal of Plant Protection Research 48 (3): H5. Irzykowska L., Kosiada T Molecular identification of mating type genes in asexually reproducing Fusarium oxysporum and Fusarium culmorum. Journal of Plant Protection Research 51(4): H6. Irzykowska L Sequencing evidence for genetic differentiation of Gaeumannomyces graminis var. tritici isolates originated from wheat and rye. Annals of Microbiology 62: H7. Irzykowska L., Bocianowski J., Baturo-Cieśniewska A Association of matingtype with mycelium growth rate and genetic variability of Fusarium culmorum. Central European Journal of Biology 8(7): Oświadczenia Współautorów prac dotyczące ich indywidualnego wkładu w powstanie publikacji zawiera Załącznik nr 6. Żadna z w/w prac nie była częścią monotematycznego cyklu prac w innym postępowaniu habilitacyjnym

5 Omówienie celu naukowego w/w prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Przedmiotem badań omówionych w pracach dokumentujących osiągnięcie naukowe były dwa gatunki grzybów chorobotwórczych dla roślin w uprawach ogrodniczych i rolniczych oraz zasiedlające rośliny w terenach zieleni. Zarówno Gaeumannomyces graminis (Sacc.) Arx & Olivier jak i Fusarium culmorum (W.G. Smith) Sacc. są gatunkami polifagicznymi, powszechnymi przede wszystkim w regionach o klimacie umiarkowanym. Ich znaczna szkodliwość znajduje odzwierciedlenie w powodowanych stratach ekonomicznych. Obydwa gatunki często konkurują o tę samą niszę ekologiczną i w konsekwencji zasiedlają rośliny kompleksowo, co utrudnia zarówno diagnostykę jak i wdrożenie efektywnych strategii zwalczania (Irzykowska 2006). Gaeumannomyces graminis jest ektotroficznym grzybem infekującym system korzeniowy i podstawę pędów roślin. W obrębie gatunku G. graminis wyróżnia się cztery odmiany różniące się przede wszystkim zakresem roślin żywicielskich, patogenicznością i niektórymi cechami morfologicznymi: G. graminis var. graminis, G. graminis var. maydis, G. graminis var. avenae oraz najgroźniejszą w naszej strefie klimatycznej odmianę G. graminis var. tritici (Ggt). Identyfikacja gatunków należących do kompleksu Gaeumannomyces-Phialophora oraz diagnostyka odmian G. graminis na podstawie objawów chorobowych czy cech morfologicznych patogena jest trudna i czasochłonna (Hornby et al. 1998). Bardzo niewiele prac poświęcono efektywnemu wykrywaniu patogena w tkankach korzeni i próbkach gleby (Freeman i Ward 2004). Ggt infekuje rośliny jednoliścienne, zarówno liczne gatunki traw (np. Agrostis spp.) jak i zboża, zwłaszcza uprawiane w monokulturach. Brak zmianowania sprzyja dużemu nagromadzeniu patogena i sprawia, że izolaty bardziej agresywne zaczynają dominować. Ggt jako typowy ektotrof najpierw szybko kolonizuje korzenie obrastając je grubymi strzępkami zabarwionymi melaniną. Następnie patogen powoduje nekrozy korzeni i podstawy pędów, a delikatne strzępki wrastające do wiązek przewodzących uszkadzają floem i blokują ksylem złogami przypominającymi gumę. Wczesne porażenie prowadzi do zahamowania krzewienia siewek i ich wzrostu. Po wykłoszeniu rośliny przedwcześnie zamierają, są wyraźnie zbielałe, skarłowaciałe, z niedorozwiniętymi kłosami. W kłosach chorych roślin ziarniaki są niedorozwinięte, lub w ogóle nie powstają. Skutkuje to przede wszystkim ogromnymi stratami ekonomicznymi w uprawach zbóż (nawet 50-80%) oraz znaczącym obniżeniem walorów użytkowych i estetycznych trawników w miejskich założeniach zieleni, boisk sportowych czy pól golfowych. Stosowanie chemicznych zapraw nasiennych ogranicza rozwój patogena tylko w początkowych fazach wzrostu roślin. Pomimo prowadzenia badań nad Ggt od połowy XX wieku, nadal pozostaje wiele niewiadomych dotyczących biologii i genetyki tego patogena. Pewien postęp w badaniach przyniosło zastosowanie metod molekularnych, bardzo użytecznych w ocenie bioróżnorodności. Populacje Ggt występujące w wielu regionach USA oraz w Wielkiej Brytanii są od lat wnikliwie badane i szczegółowo charakteryzowane, w ostatnich latach między innymi także pod względem zróżnicowania genetycznego, co świadczy o istotności tego zagadnienia. W chwili rozpoczęcia badań opisanych w publikacjach stanowiących - 5 -

6 przedłożone osiągnięcie populacje Ggt występujące w centralnej Europie (w tym w Polsce) były bardzo fragmentarycznie scharakteryzowane (Weber 2002, Freeman i Ward 2004). Drugi, będący przedmiotem badań patogen Fusarium culmorum jest jednym z najczęściej występujących gatunków Fusarium w klimacie umiarkowanym. Odznacza się niezwykle szerokim zakresem porażanych gatunków roślin, obejmującym między innymi trawy, zboża, szparagi, groch, fasolę, truskawkę, por, goździk, koniczynę, melisę lekarską i wiele innych. Szkody powodowane przez ten gatunek są wynikiem niszczenia siewek, systemu korzeniowego i podstawy pędów w różnych fazach wzrostu roślin a w przypadku zbóż także porażenia kłosów. F. culmorum obniża nie tylko wielkość plonu, ale także jako gatunek toksynotwórczy drastycznie obniża jego jakość. Patogen jest zdolny do biosyntezy trichotecenów tj. deoxynivalenolu (DON) i nivalenolu (NIV) - mykotoksyn szkodliwych dla ludzi i zwierząt. Zarówno w skali światowej jak i w Polsce na przestrzeni dwudziestu lat opublikowano wiele interesujących prac koncentrujących się na poznaniu genetycznych podstaw zdolności różnych gatunków rodzaju Fusarium do biosyntezy trichotecenów oraz analizie mechanizmów oddziaływania trichotecenów na organizmy żywe (Desjardins 2006; Chełkowski i in. 2012; Stępień 2013). Większość badań dotyczących mikotoksyn prowadzono na F. graminearum, jednym z ważnych patogenów w uprawach zbóż. W Polsce w ostatnich latach zaobserwowano znaczny wzrost częstości występowania F. culmorum, zwłaszcza w centralnej części kraju (Baturo-Cieśniewska i Suchorzyńska 2011). W momencie inicjacji badań, których wyniki zebrano w pracach stanowiących osiągnięcie, szczepy izolowane z korzeni innych niż pszenica gatunków były znacznie mniej zbadane, zwłaszcza pod względem ich wewnątrzgatunkowego zróżnicowania i wynikających z niego konsekwencji. W prezentowanych w ramach osiągnięcia pracach wykorzystano izolaty Ggt oraz F. culmorum wyosobnione z roślin jednoliściennych. Zarówno G. graminis jak i F. culmorum uważane są za gatunki bardzo szkodliwe, o znacznym potencjale infekcyjnym (Freeman i Ward 2004; Summerel i Lesllie 2011). Wśród najistotniejszych cech patogenów determinujących ich szkodliwość można wskazać zróżnicowanie genetyczne izolatów wpływające na możliwości adaptacyjne patogenów oraz ich patogeniczność, szybkość wzrostu grzybni, a w przypadku gatunku F. culmorum także toksynotwórczość i potencjalne możliwości reprodukcyjne. W części prezentowanego cyklu prac koncentrującej się na Ggt podjęto badania mające na celu: - zastosowanie metod molekularnych do prawidłowej i efektywnej detekcji patogena w tkankach roślin; - ocenę patogeniczności i szybkości wzrostu grzybni oraz weryfikację hipotezy o związku między tymi cechami; - ocenę wpływu pochodzenia izolatów z upraw niechronionych i chronionych chemicznie na tempo wzrostu grzybni oraz wpływu fungicydu siltiofam na wzrost grzybni in vitro; - ocenę zróżnicowania genetycznego izolatów Ggt pochodzących z różnych gatunków roślin-gospodarzy za pomocą markerów molekularnych skanujących genom w sposób losowy i wskazanie markerów potencjalnie związanych z wybranymi cechami patogena; - ocenę zróżnicowania genetycznego w oparciu o sekwencjonowanie konserwatywnych regionów genomu Ggt

7 W pracach dotyczących gatunku Fusarium culmorum badania miały na celu: - ocenę przydatności PCR-SCAR do identyfikacji izolatów F. culmorum pochodzących z Polski; - ocenę zróżnicowania wewnątrzgatunkowego F. culmorum metodami RAPD i SRAP; - ocenę dystrybucji każdego z potencjalnych typów płciowych w badanej puli izolatów - ocenę szybkości wzrostu grzybni i weryfikację hipotezy o występowaniu związku między tą cechą a obecnymi w genomie idiomorficznymi allelami MAT determinującymi potencjalny typ płciowy; - ocenę chemotypu badanych izolatów poprzez analizę genów Tri kluczowych w szlaku biosyntezy trichotecenów. Molekularna identyfikacja i detekcja w materiale roślinnym G. graminis var. tritici i F. culmorum (prace H2, H4) Identyfikacja gatunków grzybów infekujących rośliny poprzez system korzeniowy jest nieco utrudniona. Objawy obserwowane na początku procesu chorobowego mogą być podobne, a cechy morfologiczne patogenów muszą być dokładnie opisane. Diagnostyka molekularna stanowi dobre uzupełnienie klasycznej identyfikacji gatunku i znacząco przyspiesza badania. Prowadzone badania pozwoliły na zweryfikowanie użyteczności odmianowo specyficznych starterów, zaprojektowanych na podstawie sekwencji 18S rdna izolatów amerykańskich (Fouly i Wilkinson 2000), w identyfikacji izolatów Ggt pochodzących z polskich upraw pszenicy i żyta. Stwierdzono, że startery NS5 i GGT-RP doskonale nadają się zarówno do identyfikacji izolatów Ggt jak i do detekcji patogena w materiale roślinnym. Określono minimalną wykrywalną za pomocą PCR ilość DNA patogena na poziomie 1 pg (Fot. 1). Tak wysoka czułość metody wynika zapewne z tego, że sekwencje rdna występują w genomie Ggt w wielu powtórzeniach M Fot. 1 Czułość detekcji G. graminis var. tritici za pomocą PCR z gatunkowo-specyficznymi starterami. Produkt PCR amplifikowany z różnej ilości DNA patogena: ścieżka ng, ścieżka 2-10 ng, ścieżka 3-1 ng, ścieżka pg, ścieżka 5 10 pg, ścieżka 6 1 pg, ścieżka pg, M - marker długości (pz) Tę samą parę starterów wykorzystano następnie z sukcesem do detekcji patogena w korzeniach zarówno z wyraźnymi przebarwieniami jak i bez widocznych objawów chorobowych. Biorąc pod uwagę możliwość występowania mieszanych infekcji - 7 -

8 spowodowanych przez Ggt i F. culmorum jako dodatkową kontrolę specyficzności zastosowano DNA F. culmorum potwierdzając (brak produktu amplifikacji), że reakcja jest użyteczna także do różnicowania pomiędzy tymi dwoma patogenami (Fot. 2) M Fot. 2 Detekcja G. graminis var. tritici w tkankach roślin: ścieżka 1 kontrola negatywna, ścieżka 2 negatywna reakcja z DNA F. culmorum, ścieżki 3 i 4 detekcja w tkankach przed wystąpieniem objawów, ścieżki 5 i 6 detekcja w tkankach z wyraźnymi objawami chorobowymi, M- marker długości (pz) Prawidłowa identyfikacja gatunków z rodzaju Fusarium jest bardzo istotna we wszelkich pracach badawczych, z uwagi na odmienne profile toksynotwórczości. Tradycyjna identyfikacja oparta na charakterystyce morfologicznej jest często utrudniona ze względu na dużą zmienność wewnątrzgatunkową (O Donnell i Cigelnik 1997). W związku z tym w przeprowadzonych badaniach stosowano identyfikację opartą na charakterystyce cech morfologicznych oraz na diagnostyce molekularnej. Analiza DNA jest szczególnie użyteczna w przypadku gatunków, u których nie występuje rozmnażanie generatywne, co wiąże się ze stosunkowo małą pulą cech morfologicznych dostępnych do obserwacji. W badaniach zastosowano PCR z gatunkowo-specyficznymi starterami SCAR (Schilling i in. 1996). Biorąc pod uwagę trudności, jakie mogą wynikać z zastosowania tego typu starterów zoptymalizowano warunki reakcji w celu podniesienia jej specyficzności. W przeprowadzonych reakcjach uzyskano jeden specyficzny gatunkowo fragment DNA, co potwierdziło w 100% poprawność dokonanej tradycyjnie identyfikacji gatunku w oparciu o cechy morfologiczne i świadczyło jednocześnie o braku substytucji, insercji lub delecji w miejscu przyłączania startera. Charakterystyka wybranych cech G. graminis var. tritici (prace H1, H2, H3) W przeprowadzonych badaniach oceniano patogeniczność i szybkość wzrostu grzybni oraz wrażliwość na siltiofam izolatów Ggt pochodzących z Polski. Wyniki oceny patogeniczności badanych izolatów wskazują na znaczne zróżnicowanie pod względem nasilenia tej cechy. Wszystkie izolaty infekowały korzenie testowanej odmiany ( Izolda ) a aż 44% z nich wykazało bardzo wysoki stopień patogeniczności, co potwierdza powszechną w literaturze przedmiotu opinię o Ggt jako patogenie o znacznej szkodliwości (ang. take-all)

9 W przypadku Ggt zasadniczym źródłem infekcji jest grzybnia, której strzępki wrastają do włośników i korzeni. W badaniach stwierdzono, że izolaty Ggt różniły się istotnie pod względem szybkości wzrostu grzybni we wszystkich testowanych temperaturach (22 C, 25 C i 28 C). Co więcej, izolaty, które rosły najszybciej w najniższej temperaturze rosły także najszybciej w temperaturze 28 C. Podsumowując, nie zaobserwowano w badanej puli izolatów ekotypów Ggt związanych z temperaturą środowiska. Co ciekawe, izolaty z odmian ozimych rosły szybciej niż pochodzące z odmian jarych. Natomiast, tempo wzrostu grzybni izolatów wyodrębnionych z odmian jarych było wyraźnie zahamowane w temperaturze 28 C. Nasunęło to przypuszczenie, że izolaty, które w warunkach naturalnych dokonują infekcji w temperaturze około 5 C przystosowały się do niższej temperatury i są bardziej wrażliwe na jej wzrost. Możliwości chemicznej ochrony pszenicy przed Ggt w momencie podejmowania badań były bardzo ograniczone. Jednym z wówczas zalecanych sposobów ochrony było stosowanie zaprawy nasiennej, której substancją aktywną jest siltiofam, związek tiofenokarboksyamidowy zakłócający procesy energetyczne w komórkach grzybów. Stosowanie siltiofamu przeciwko Ggt stanowi silną presję selekcyjną wywieraną na populacje patogena. Uzasadnionym było więc zbadanie izolatów pod względem wrażliwości na tą substancję aktywną. W wyniku przeprowadzonych analiz stwierdzono, że siltiofam hamował szybkość wzrostu grzybni Ggt, przy czym wrażliwość izolatów była bardzo zróżnicowana (wyodrębniono aż 22 grupy jednorodne). W puli 70 badanych izolatów znalazły się przede wszystkim izolaty bardzo wrażliwe, których wzrost w stosunku do kontroli był ograniczony przez siltiofam w ponad 80%. Jednak warto podkreślić, że w badanej populacji znaleziono także dwa izolaty całkowicie odporne, które pomimo dodanego do pożywki fungicydu rosły równie szybko jak na pożywce bez dodatku fungicydu. Chociaż skala tego zjawiska w przeprowadzonym doświadczeniu nie jest alarmująca, to jednak daje podstawy, aby przypuszczać, że wyewoluowanie większych populacji szczepów Ggt niewrażliwych na siltiofam jest tylko kwestią czasu, zwłaszcza biorąc pod uwagę ogromne zróżnicowanie genetyczne tego patogena. Charakterystyka wybranych cech F. culmorum (praca H5 i H7) Przeprowadzone badania obejmowały określenie chemotypu izolatów, ocenę szybkości wzrostu grzybni, oraz ujawnienie w genomie sekwencji warunkujących potencjalne typy płciowe. Zdolność do biosyntezy mikotoksyn jest jedną z ważniejszych cech determinujących szkodliwość F. culmorum. Biosynteza trichotecenów jest złożonym procesem, kontrolowanym przez kilkanaście genów Tri (Proctor i in. 1995). Wiele opublikowanych prac dotyczy oceny chemotypu izolatów powodujących fuzariozę kłosów. Jednakże, od kiedy stwierdzono, że deoxynivalenol (DON) może być transportowany z podstawy pędów do kłosów (Covarelli i in. 2012), określanie chemotypu szczepów izolowanych z korzeni z objawami fuzaryjnej zgorzeli stało się konieczne

10 W analizowanej puli izolatów pochodzących z korzeni jęczmienia chemotypy określano poprzez molekularną analizę wybranych genów Tri. Stwierdzono, że tylko dwa izolaty reprezentowały chemotyp NIV, natomiast u 94% izolatów ujawniono chemotyp 3ADON, podobnie jak w przypadku populacji występujących na pszenicy w innych krajach Europy (Fot. 3). Oznacza to, że prawie wszystkie izolaty pozyskane z korzeni jęczmienia można uznać za bardzo agresywne, ponieważ grzyby biosyntetyzujące DON są znacznie bardziej agresywne niż te, które tworzą NIV, a ponadto DON stymuluje proces rozprzestrzeniania się grzyba od miejsca zainicjowania infekcji (Desjardins i in. 1996, Bai i in. 2001) M Fot. 3. Amplifikacja sekwencji warunkujących chemotyp przykładowych izolatów F. culmorum Ścieżki 1-18 amplikon specyficzny dla chemotypu DON (483pz), 19 amplikon specyficzny dla chemotypu NIV (436 pz), M - marker długości (pz) Kolejną analizowaną podczas badań cechą było tempo liniowego wzrostu grzybni. F. culmorum powszechnie uważany jest za gatunek szybko rosnący. Badania dotyczące fuzariozy kłosów pszenicy sugerowały występowanie ekotypów w populacjach F. culmorum (Brennan i in. 2005). W przeprowadzonych badaniach stwierdzono istotne różnice w tempie wzrostu poszczególnych izolatów. Jednakże izolaty, które rosły najszybciej utrzymały tę przewagę we wszystkich testowanych temperaturach, co nie dostarcza dowodów na istnienie ekotypów w badanej puli izolatów. Podsumowując, wszystkie izolaty rosły bardzo szybko zwłaszcza w temperaturze 25 C, o wiele szybciej niż jakikolwiek z badanych izolatów Ggt. Jeżeli zatem doszłoby do jednoczesnego, kompleksowego zasiedlenia korzeni, to obecność Ggt stwierdzana tylko na podstawie oceny makroskopowej może być niezauważona, zwłaszcza we wczesnych stadiach choroby. W przypadku, gdyby szybkość wzrostu grzybni była jedyną cechą determinującą szkodliwość obu patogenów to F. culmorum można by uznać za gatunek zdecydowanie bardziej szkodliwy. W odrębnych doświadczeniach laboratoryjnych analizowano obecność w genomie sekwencji genów warunkujących występowanie potencjalnych typów płciowych izolatów F. culmorum pochodzących z pszenicy, żyta i jęczmienia. Geny te kodują białka odgrywające kluczową rolę w procesie specjacji komórek i morfogenezie płciowej jako regulatorowe czynniki transkrypcyjne (Yun i in. 2000). Chociaż stadium generatywne F. culmorum jak dotąd pozostaje nieznane, opisano dowody na istnienie rekombinacji w populacjach pochodzących z upraw polowych, co wskazuje na możliwość istnienia stadium generatywnego. Wiedza na temat sposobu rozmnażania jest istotna dla opracowania skutecznych strategii ochrony, które są odmienne dla mikroorganizmów rozmnażających się generatywnie i wegetatywnie (McDonald i Mc Dermott 1993)

11 Wśród izolatów pochodzących z Polski stwierdzono występowanie w genomie sekwencji charakterystycznych dla dwóch typów płciowych, co może sugerować heterotaliczne pochodzenie gatunku F. culmorum. Jest to zgodne z hipotezą wysuniętą przez Turgeon (1998) mówiącą o tym, że niektóre gatunki Fusarium mogą przechodzić ukryty i sporadyczny cykl płciowy. Za pomocą analizy molekularnej możliwe było określenie dystrybucji dwóch idiomorficznych alleli locus warunkującego potencjalny typ płciowy wśród badanych izolatów. Sekwencję MAT1-1 ujawniono u 40% izolatów, natomiast u pozostałych 60% izolatów obecny był idiomorf MAT1-2 (Fot. 4). Podobną dystrybucję idiomorficznych alleli (1:2) opisano uprzednio u F. verticillioides (Venturini i in. 2011) i F. oxysporum (Irzykowska i in. 2012). Uzyskane wyniki pozwoliły na wysunięcie przypuszczenia, że idiomorf MAT1-2 może dominować wśród polskich izolatów F. culmorum, jednak weryfikacja tej hipotezy będzie wymagała szeroko zakrojonych badań populacyjnych. Zagadnienie jest tym bardziej interesujące, że dominacja jednego typu płciowego może powodować ograniczenie lub brak rozmnażania generatywnego w populacji patogena M Fot. 4. Detekcja alleli idiomorficznych u przykładowych izolatów F. culmorum pochodzących z pszenicy i żyta Ścieżki 5, 7, 8, 12, 13 amplikon specyficzny dla MAT1-1 (200 pz), ścieżki 1 4, 6, 9 11, 14, 15 amplikon specyficzny dla MAT1-2 (260 pz), M - marker długości (pz) Ponadto, w przeprowadzonych badaniach po raz pierwszy wykazano związek pomiędzy potencjalnym typem płciowym a szybkością wzrostu grzybni. Izolaty posiadające idiomorf MAT1-1 rosły istotnie szybciej niż izolaty z idiomorfem MAT1-2 zarówno w temperaturze 15 C jak i 25 C. Charakter tego związku nadal pozostaje przedmiotem badań. Analiza zróżnicowania genetycznego G. graminis var. tritici i F. culmorum (prace H1, H2, H3, H4, H6 i H7) Zróżnicowanie genetyczne jest bardzo interesującym zagadnieniem badawczym szczególnie w przypadku Ggt i F. culmorum - gatunków często konkurujących ze sobą. Badając Ggt rozpatrujemy odmianę homotalicznego gatunku, w populacjach którego znajdowano bardzo nietypowe izolaty, a zakres polimorfizmu DNA wzbudzał wątpliwości, co do jednorodności odmiany. Natomiast, koncentrując się na F. culmorum oceniamy zróżnicowanie genetyczne patogena o nieznanym teleomorfie, choć w jego genomie znajdują się sekwencje genów warunkujących typy płciowe, czyli teoretycznie rozmnażanie generatywne z crossing-over generującym zmienność jest możliwe

12 Przeprowadzone badania miały na celu ocenę zakresu polimorfizmu DNA w badanych populacjach Ggt i F. culmorum i powiązanie obserwowanego zróżnicowania genetycznego z cechami patogenów istotnymi dla opracowywania skutecznych metod ochrony roślin. Opracowano wiele metod stosowanych do oceny zmienności patogenów. Są to zarówno metody oparte na analizie sekwencji konserwatywnych, jak i takie, które ujawniają polimorfizm DNA skanując genom w sposób losowy. W pracach składających się na prezentowane osiągnięcie do oceny zróżnicowania izolatów Ggt i F. culmorum zastosowano obydwa podejścia, tj. posłużono się metodą RAPD-PCR (random amplified polymorphic DNA) ze starterami o losowej sekwencji, SRAP-PCR (sequence-related amplified polymorphism) ze starterami zakotwiczonymi w sekwencjach kodujących i sekwencjonowaniem konserwatywnych regionów rdna. Analizując zróżnicowanie genetyczne populacji izolatów Ggt występujących na roślinach pszenicy w Wielkopolsce stwierdzono, że pula izolatów wyraźnie dzieli się na dwa odmienne genetycznie klastry na poziomie około 50% podobieństwa. Ponadto, izolaty najbardziej wrażliwe na siltiofam, czyli te, których wzrost na pożywce z fungicydem był ograniczony w ponad 80% w stosunku do kontroli grupowały się na dendrogramie w jednym klastrze. Statystyczna analiza danych uzyskanych po skanowaniu genomu metodą RAPD pozwoliła także na wskazanie markerów molekularnych związanych z wrażliwością Ggt na siltiofam, co może stanowić podstawę dla opracowania markerów specyficznych służących detekcji izolatów odpornych na ten fungicyd. Biorąc pod uwagę, że jedenaście markerów w stopniu statystycznie istotnym było związanych z wrażliwością Ggt na fungicyd można domniemywać obecność w jego genomie kilku genów, które modyfikują ekspresję badanej cechy. Następnie, ponownie posługując się metodą RAPD, przeanalizowano zróżnicowanie genetyczne izolatów pochodzących z jarej i ozimej odmiany pszenicy. Stwierdzono, że izolaty różnią się między sobą znacznie, ale nie zaobserwowano tworzenia się odrębnych klastrów grupujących izolaty z odmiany jarej i ozimej. Wskazano także kilka markerów molekularnych istotnie związanych zarówno z patogenicznością jak i szybkością wzrostu grzybni. Klasyczna interakcja gen na gen nie została jak dotąd stwierdzona w układzie Ggt-pszenica (Cook 2003). Prawdopodobnie patogeniczność i szybkość wzrostu grzybni, jak wiele cech ilościowych, są uwarunkowane poligenicznie. W kolejnych pracach poświęconych Ggt porównano szczepy pochodzące z pszenicy i żyta. Zastosowanie RAPD do badań polimorfizmu DNA izolatów bardzo łatwo ujawniło polimorfizm DNA w analizowanych obszarach genomu, ale nie zaobserwowano związku pomiędzy utworzonymi klastrami i pochodzeniem izolatów z rośliny gospodarza. Uwzględniając jednak, że wśród izolatów angielskich zaobserwowano uprzednio taki związek (Bryan i in. 1999), w kolejnych badaniach zastosowano inną metodę analityczną. Opierając się na wynikach analizy RAPD wybrano pulę izolatów Ggt z pszenicy i żyta i poddano je analizie sekwencyjnej. Zsekwencjonowano obszerny fragment rdna ( część 18S ITS1 5.8S ITS2 część 28S rybosomalnego RNA) każdego z izolatów, a uzyskane sekwencje porównano i wykorzystano do hierarchicznego grupowania Ggt. Stwierdzono, że izolaty pochodzące z pszenicy różnią się od tych wyizolowanych z żyta nawet w konserwatywnych obszarach genomu. Jest to szczególnie interesujące w świetle hipotezy wysuniętej w 2010 r. postulującej, że obserwowane w wielu badaniach dwie genetycznie

13 odmienne grupy izolatów Ggt mogą reprezentować dwa ukryte gatunki (Daval i in. 2010). Autorzy wskazywali także na istnienie pięciu haplotypów w analizowanej kolekcji Ggt. Warto zaznaczyć, że po porównaniu sekwencji analizowanych polskich izolatów z sekwencjami zdeponowanymi przez Daval a były one homologiczne (z wyjątkiem 1 izolatu) z haplotypem S1 (izolaty z pszenicy) lub haplotypem S4 (izolaty z żyta). Wydaje się, że zróżnicowanie genetyczne obserwowane w populacji Ggt jest tak znaczne, że prowadzone obecnie w wielu ośrodkach naukowych badania mogą stać się powodem zmiany statusu taksonomicznego patogena. Podczas analizy zróżnicowania genetycznego w obrębie konkurencyjnego dla Ggt gatunku F. culmorum poczyniono kilka interesujących obserwacji. Zróżnicowanie genetyczne F. culmorum w różnych regionach klimatycznych zwykle określane jest jako duże lub bardzo duże, a nietypowe izolaty obserwowano nawet w populacjach występujących na bardzo ograniczonym obszarze (Assigbetse i in. 1994). W światowej kolekcji F. culmorum szacuje się zróżnicowanie w obrębie gatunku na poziomie 47,7% (Mishra i in. 2003). Analiza zróżnicowania genetycznego izolatów F. culmorum pochodzących z korzeni i podstawy źdźbeł różnych odmian jęczmienia uprawianego w północnych i południowowschodnich województwach Polski pozwoliła na ocenę związku pomiędzy pochodzeniem geograficznym izolatów a polimorfizmem DNA. Stwierdzono, że izolaty pochodzące z upraw zlokalizowanych na Lubelszczyźnie różniły się od pozostałych na poziomie ok. 45% w analizowanych metodą RAPD obszarach genomu. Wydaje się, że pochodzą one z odrębnych pul genowych. Być może na izolaty pochodzące z Lubelszczyzny była wywierana inna presja selekcyjna niż na te, pochodzące z Warmi i Mazur oraz Pomorza. W wielu pracach dotyczących zróżnicowania genetycznego Fusarium spp. prezentowany jest pogląd, że zmiany klimatyczne potencjalnie mogą zmieniać fizjologię i morfologię zarówno patogena jak i gospodarza w dłuższych przedziałach czasowych (Assigbetse i in. 1994, Brennan i in. 2005, Edwards i in. 2002). W kolejnych badaniach ponownie oceniono zróżnicowanie genetyczne izolatów F. culmorum pochodzących z różnych plantacji jęczmienia zlokalizowanych w północnej, zachodniej i południowo-wschodniej Polsce. Porównano także efektywność sprawdzonej metody RAPD i stosowanej jak dotąd głównie w analizie genomów roślinnych metody SRAP preferencyjnie amplifikującej otwarte ramki odczytu (ORF). W wyniku przeprowadzonych analiz ujawniono polimorfizm DNA izolatów F. culmorum także w sekwencjach kodujących. Obie zastosowane odmiany PCR okazały się użyteczne w badaniu zróżnicowania genetycznego. Stwierdzono bardzo duże zróżnicowanie w puli analizowanych izolatów. Porównując izolaty pod względem podobieństwa amplifikowanych obszarów genomu wyodrębniono sześć grup różniących się na poziomie 33%. Możliwe było odróżnienie od siebie niemal wszystkich izolatów. Konkurencyjny wobec F. culmorum gatunek Ggt był jeszcze bardziej wewnętrznie zróżnicowany, ale jego zmienność była w pewnym stopniu związana z występującym rozmnażaniem generatywnym i towarzyszącą mu mejotyczną rekombinacją. Natomiast, obserwacja znacznego zróżnicowania genetycznego w populacjach patogena, u którego rozmnażanie generatywne zgodnie z obecną wiedzą nie występuje, nasuwa pytania o źródła tej zmienności. Dyskusja na temat roli transpozonów czy duplikacji niektórych regionów genomu w generowaniu zróżnicowania wewnątrzgatunkowego toczy się także w odniesieniu do innych gatunków rodzaju Fusarium (O Donnell i Cigelnik 1997, Irzykowska i in. 2012), jak dotąd jednak pozostaje więcej pytań niż odpowiedzi

14 Podsumowanie najważniejszych wyników dokumentujących osiągnięcie naukowe z uwzględnieniem ich aspektu praktycznego Z przeprowadzonych badań wypływają następujące najważniejsze konkluzje: 1. Po raz pierwszy w Polsce wykazano różnice w konserwatywnych sekwencjach rdna izolatów Ggt pochodzących z różnych gatunków roślin-żywicieli. 2. Wykazano, że izolaty Ggt pochodzące z pszenicy ozimej rosną znacząco szybciej niż pochodzące z pszenicy jarej, a wzrost ich grzybni jest silnie spowolniony w temperaturze wyższej od optymalnej, co może wskazywać na przystosowanie się subpopulacji Ggt do niższych temperatur typowych dla naturalnych infekcji zbóż ozimych. 3. Wykazano bardzo wysoki polimorfizm izolatów Ggt, co znacząco wpływa na możliwość występowania tego patogena na różnych gatunkach i odmianach roślin, a z drugiej strony utrudnia opracowanie skutecznych metod ochrony roślin. 4. W badanych populacjach Ggt pochodzących z polskich plantacji zbóż wykazano koegzystencję dwóch, genetycznie odmiennych grup izolatów, co było obserwowane także w USA i Wielkiej Brytanii. 5. Wskazano markery molekularne, które mogą być wykorzystane we wstępnej selekcji izolatów różniących się patogenicznością i szybkością wzrostu grzybni Ggt oraz szybkością wzrostu grzybni F. culmorum. 6. Po raz pierwszy posłużono się metodą SRAP w celu analizy zmienności w obrębie gatunku F. culmorum i udowodniono jej użyteczność (w dostępnej literaturze nie znaleziono prac dotyczących zastosowania metody SRAP w badaniach grzybów rodzaju Fusarium). 7. Izolaty F. culmorum były mniej zróżnicowane niż izolaty Ggt, co wydaje się świadczyć o przewadze Ggt pod względem potencjalnych możliwości adaptacyjnych. 8. Grzybnia F. culmorum rosła w testowanych temperaturach znacznie szybciej niż grzybnia Ggt. Fakt ten powinien być uwzględniany, gdy diagnozowanie chorób podsuszkowych odbywa się na podstawie objawów makroskopowych. 9. Po raz pierwszy stwierdzono istnienie związku pomiędzy determinującymi potencjalny typ płciowy idiomorficznymi allelami MAT i szybkością wzrostu grzybni F. culmorum (w dostępnej literaturze nie znaleziono prac dotyczących tego zagadnienia). 10. W oparciu o obserwację nierównomiernej dystrybucji idiomorficznych alleli MAT w badanej puli izolatów F. culmorum wskazano na konieczność prowadzenia szerokich badań populacyjnych w tym zakresie, ponieważ to właśnie dominacja jednego z typów płciowych może prowadzić do ograniczenia lub braku rozmnażania generatywnego

15 11. Wśród badanych izolatów F. culmorum pochodzących z polskich upraw jęczmienia zdecydowana większość reprezentowała chemotyp 3ADON (tylko dwa chemotyp NIV), co w sposób istotny dla producentów wskazuje na typ możliwego zanieczyszczenia mykotoksynami produktów uzyskiwanych z jęczmienia porażonego przez tego patogena. 12. Stwierdzenie dominacji chemotypu 3ADON F. culmorum powinno być brane pod uwagę przy podejmowaniu decyzji o doborze fungicydów do ochrony jęczmienia, ponieważ izolaty o tym chemotypie są bardziej agresywne niż te, które biosyntetyzują NIV. Cytowana literatura Assigbetse K.B., Fernandez D., Boubios M.P., Geiger J.P Differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum races on cotton by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Phytopathology 84: Bai G.H., Plattner R., Desjardins A., Kolb F., McIntosh R.A Resistance to Fusarium head blight and deoxynivalenol accumulation in wheat. Plant Breeding 120(1): 1-6. Baturo-Ciesniewska A., Suchorzyńska M Verification of the effectiveness of SCAR (sequence characterized amplified region) primers for the identification of Polish strains of Fusarium culmorum and their potential ability to produce B-trichothecenes and zearalenone. Journal of Food Microbiology 148(3): Brennan J.M., Egan D., Cooke B.M., Doohan F.M Effect of temperature on head blight of wheat caused by Fusarium culmorum and F. graminearum. Plant Pathology 54: Bryan G.T., Labourdette E., Melton R.E., Nicholson.P, Daniels M.J., Osbourn A.E DNA polymorphism and host range in take-all fungus, Gaeumannomyces graminis. Mycological Researches 103: Chełkowski J., Gromadzka K., Stępień Ł., Lenc L., Kostecki M., Berthiller F Fusarium species, zearalenone and deoxynivalenol content in preharvest scabby wheat heads from Poland. World Mycotoxin Journal 5: Cook R. J Take-all of wheat. Physiological and Molecular Plant Pathology 62: Covarelli L., Beccari G., Steed A., Nicholson P Colonization of soft wheat following infection of the stem base by Fusarium culmorum and translocation of deoxynivalenol to the head. Plant Pathology 61(6): Daval S., Lebreton L., Gazengel K., Guillerm-Erckelboudt A.Y., Sarniguet A Genetic evidence for differentiation of Gaeumannomyces graminis var. tritici into two major groups. Plant Pathology 59: Desjardins A.E Fusarium, mycotoxins, chemistry, genetics and biology. APS Press, St. Paul, USA. Edwards S.G., O Callaghan J., Dobson A.D.W PCR-based detection and quantification of mycotoxigenic fungi. Mycol. Res. 106 (9): Fouly HM, Wilkinson HT (2000) Detection of Gaeumannomyces graminis varieties using polymerase chain reaction with varietyspecific primers. Plant Disease 84: Freeman J., Ward E Gaeumannomyces graminis, the take-all fungus and its relatives. Molecular Plant Pathology 5(4): Hornby D Take-all disease of cereals. A regional perspective. CAB International, Oxon Irzykowska L Markery molekularne w diagnostyce chorób podstawy źdźbła i korzeni zbóż. Postępy Nauk Rolniczych 6: Irzykowska L., Bocianowski J., Waskiewicz A., Weber Z., Golinski P., Karolewski Z., Kostecki M., Irzykowski W Genetic variation of Fusarium oxysporum isolates forming fumonisin B 1 and moniliformin. Journal of Applied Genetics 53: McDonald B.A., McDermott J.M Population genetics of plant pathogenic fungi. Bioscience 43:

16 Mishra P., Fox R.T.V., Culham A Inter-simple sequence repeat and aggressiveness analyses revealed high genetic diversity, recombination and long-range dispersal in Fusarium culmorum. Annals of Applied Biology 143: Proctor R.H., Hohn T.M., Mc Cormick S.P Reduced virulence of Gibberella zeae caused by disruption of a trichothecene toxin biosynthetic gene, Molecular Plant Microbe Interaction 8: Turgeon B.G Application of mating type gene technology to problems in fungal biology. Annual Review in Phytopathology 36: Schilling A.G., Möller E.M, Geiger H.H Polymerase chain reaction-based assays for species specific detection of Fusarium culmorum, F. graminearum and F. avenaceum. Phytopathology 86(5): Stępień Ł The use of Fusarium secondary metabolite biosynthetic genes in chemotypic and phylogenetic studies. Critical Reviews in Microbiology 40(2): Summerell B.A., Leslie J.F Fifty years of Fusarium: how could nine species have ever been enough? Fungal Diversity 50: Venturini G., Assante G., Toffolatti S.L., Vercesi A Mating behavior of a Northern Italian population of Fusarium verticilioides associated with maize. Journal of Applied Genetics 52: Weber Z Some characteristics of Gaeumannomyces graminis var. tritici originated from Poznan region. Plant Protection Science 38: Yun S-H., Arie T., Kaneko I., Yoder O.C., Turgeon B.G Molecular organization of mating type loci in heterothalic, homothalic and asexual Gibberella/Fusarium species. Fungal Genetics and Biology 31(1): Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych Jestem absolwentką Wydziału Biologii UAM w Poznaniu. Pracę magisterską zatytułowaną Wpływ insercji jednego nukleotydu do ramienia antykodonowego na modyfikację U 35 w pre-trna Tyr Arabidopsis thaliana przygotowałam w Zakładzie Biochemii Biopolimerów pod kierunkiem Pana prof. dr hab. Jacka Augustyniaka. Przeprowadzone badania dotyczyły specyficzności syntazy pseudourydynowej. Celem pracy była konstrukcja zmutowanego genu tyrozynowego t-rna oraz ocena wpływu wprowadzonej mutacji na wydajność konwersji urydyny do pseudourydyny w pozycji 35 w pre-trna Tyr rzodkiewnika pospolitego. Badania realizowane w ramach pracy magisterskiej pozwoliły na wdrożenie się do realizacji badań związanych z analizą kwasów nukleinowych. Jeszcze jako studentka zostałam zatrudniona w Katedrze Biochemii i Biotechnologii Akademii Rolniczej w Poznaniu, gdzie uczestnicząc w realizacji projektu badawczego KBN nr miałam możliwość wzbogacenia warsztatu badawczego o metodykę stosowaną w analizie białek enzymatycznych. Badania dotyczyły wykorzystania analogów Ap 3 A jako substratów lub inhibitorów enzymów degradujących Ap 3 A tj. hydrolazy Ap 3 A z łubinu żółtego i E. coli oraz fosforylazy Ap 3 A/Ap 4 A z Acanthamoeba castellanii (praca D1). W związku z tym, że podjęta praca wymagała nabycia nowych umiejętności w zakresie frakcjonowania komórek i badania kinetyki reakcji enzymatycznych odbyłam staż w Zakładzie Genetyki Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie (Zalącznik nr 4). Po ukończeniu studiów kontynuowałam pracę naukowo-badawczą na etacie asystenta (a od 2002 roku adiunkta) w Instytucie Genetyki Roślin PAN w Poznaniu, w Pracowni Analizy Genomu kierowanej przez Pana prof. dr hab. Wojciecha K. Święcickiego. Tematyka badań, w których uczestniczyłam początkowo dotyczyła poszukiwania markerów cech

17 użytkowych istotnych w hodowli i uprawie Pisum sativum L. oraz oceny zmienności wewnątrzgatunkowej grochu (prace D2, D3, D4, D13, D16 i doniesienia na krajowych i zagranicznych konferencjach naukowych). W celu zaktualizowania wiedzy i wzbogacenia warsztatu badawczego odbyłam tygodniowy kurs praktyczny w Katedrze Mikrobiologii Politechniki Gdańskiej dotyczący klonowania DNA i innych technik rekombinacyjnych (Załącznik nr 4). Pod opieką promotora Pana prof. dr hab. Bogdana Wolko, dzięki zdobytemu finansowaniu (grant KBN nr 5P06A ) przygotowałam rozprawę doktorską zatytułowaną Konstruowanie mapy sprzężeń oraz lokalizacja loci warunkujących wybrane cechy ilościowe (QTL) u Pisum sativum L. Prowadzone przez kilka lat badania umożliwiły opracowanie pierwszej polskiej mapy genetycznej jądrowego genomu grochu złożonej z dziewięciu grup sprzężeń i obejmującej łącznie 204 markery morfologiczne, izoenzymatyczne i molekularne (STS, CAPS, ISSR, RAPD, AFLP). Otrzymane grupy sprzężeń odniesiono do chromosomów grochu za pomocą markerów kotwicznych. Ponadto, na utworzonej mapie genetycznej metodą mapowania interwałowego zlokalizowano 54 loci warunkujące 9 cech ilościowych związanych ze strukturą plonu i zawartością białka w nasionach. Każdemu QTL przypisano blisko sprzężone markery użyteczne w selekcji materiałów hodowlanych. Na wniosek recenzentów praca doktorska została wyróżniona przez Radę Naukową IGR PAN w Poznaniu, a także spotkała się z przychylnym przyjęciem w środowisku badaczy zajmujących się roślinami strączkowymi. Streszczenie pracy zostało umieszczone na łamach czasopisma Grain Legumes - The Magazine of The European Association for Grain Legume Research. Badania były też kontynuowane po obronie rozprawy doktorskiej, a uzyskane wyniki zamieszczono w kilku pracach opublikowanych zarówno przed jak i po uzyskaniu stopnia doktora (prace A1, D5, D6, D14, D20) oraz prezentowano na krajowych i międzynarodowych konferencjach naukowych. Po uzyskaniu stopnia naukowego doktora, w roku akademickim 2002/2003 rozpoczęłam pracę naukowo-dydaktyczną na Uniwersytecie Przyrodniczym w Poznaniu (wówczas Akademii Rolniczej w Poznaniu), jako adiunkt w kierowanej wówczas przez Pana prof. dr hab. Zbigniewa Webera Katedrze Fitopatologii (od Katedrze Fitopatologii i Nasiennictwa). Jednoczesna działalność dydaktyczna i naukowa w nowej dziedzinie wymagała znaczącego poszerzenia wiedzy i warsztatu badawczego oraz podniesienia kwalifikacji dydaktycznych (ukończenie Zaocznego Studium Przygotowania Pedagogicznego). Wyłączając tematykę ujętą w przedstawionym monotematycznym cyklu prac, w moich zainteresowaniach naukowych można wyodrębnić trzy główne nurty: - interdyscyplinarne badania nad grzybami z rodzaju Fusarium; - charakterystyka wybranych patogenów roślin jednoliściennych; - zastosowanie metod molekularnych do diagnostyki chorób roślin i grzybów uprawnych

18 Interdyscyplinarne badania nad grzybami z rodzaju Fusarium (załącznik nr 3 - prace: A3-A8, A11, A12, D9, D10, D19 oraz doniesienia na krajowych i zagranicznych konferencjach naukowych) Grzyby rodzaju Fusarium są przedmiotem licznych badań w wielu ośrodkach naukowych. Z uwagi na trudności w identyfikowaniu niektórych gatunków, jak również w związku ze zdolnością wielu przedstawicieli rodzaju Fusarium do biosyntezy szkodliwych dla ludzi i zwierząt mykotoksyn, prace badawcze mają często charakter wielokierunkowy. Pierwszym obiektem moich badań nad grzybami rodzaju Fusarium był gatunek F. oxysporum Schlechtend. emend. Snyder & Hansen, którego formy specjalne powodują choroby naczyniowe wielu gatunków roślin. Pulę analizowanych izolatów wyodrębniono z chorych roślin Dianthus caryophyllus, Gypsophila paniculata i Gypsophila repens oraz w celach porównawczych wzbogacono ją izolatami niepatogenicznymi. Podjęte prace obejmowały ocenę patogeniczności izolatów wobec goździka szklarniowego i gipsówki, a także określenie zróżnicowania genetycznego F. oxysporum. Zastosowanie analiz molekularnych dostarczyło markerów umożliwiających odróżnianie identycznych morfologicznie izolatów patogenicznych od niepatogenicznych. Kontynuację badań poświęconych przedstawicielom rodzaju Fusarium stanowił udział w interdyscyplinarnych studiach nad grzybami F. oxysporum i F. proliferatum (Matsus.) Nirenberg infekującymi szparag lekarski, realizowanych we współpracy z Katedrą Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu oraz Zakładem Fizyki Uniwersytetu Adama Mickiewicza w Poznaniu. Dzięki uzyskanemu finansowaniu (MNiSW NN ) przeprowadzono zakrojone na szeroką skalę badania mające na celu ustalenie, które gatunki Fusarium dominują w uprawie szparagów, jakie części rośliny zasiedlają, jaki jest profil biosyntetyzowanych przez nie metabolitów wtórnych i ich dystrybucja w roślinie. Dokonano również wstępnej oceny interakcji roślina-patogen. Efektywne uczestniczenie w tak różnorodnych badaniach było możliwe dzięki zdobywaniu nowych umiejętności w zakresie badań fitopatologicznych, ale także dzięki solidnym biologicznym podstawom zdobytym w czasie studiów magisterskich. Dodatkowo w 2008 r. odbyłam staż naukowy w Zakładzie Metod Instrumentalnych Katedry Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, w trakcie którego miałam sposobność zapoznać się z metodami ekstrakcji i oczyszczania mykotoksyn oraz występującymi w ich toku trudnościami. Szkolenie obejmowało również wykorzystanie technik chromatografii cieczowej do oznaczania profili metabolitów wtórnych biosyntetyzowanych przez różne gatunki grzybów rodzaju Fusarium. Wieloletnie, interdyscyplinarne badania pozwoliły na uzyskanie nowatorskich wyników, które stanowią istotny wkład w poznanie biologicznych procesów występujących w szparagu porażonym przez grzyby rodzaju Fusarium oraz warunków biosyntezy ksenobiotyków potencjalnie zagrażających zdrowiu konsumentów. Dzięki precyzyjnej identyfikacji gatunków, obejmującej m. in. sekwencjonowanie fragmentu genu kodującego elongacyjny czynnik translacyjny (1α-TEF) ustalono, że różne odmiany szparaga były zasiedlone przede wszystkim przez F. oxysporum i F. proliferatum. Izolaty charakteryzowano molekularnie, określając ich zróżnicowanie wewnątrzgatunkowe oraz wskazując markery molekularne związane z wysokim poziomem moniliforminy (Fot. 5) i fumonizyny B

19 Fot. 5. Amplifikacja DNA izolatów F. oxysporum ze starterem OPC-15. *marker istotnie związany z wysokim poziomem moniliforminy MM - marker długości, N - kontrola negatywna W przypadku izolatów gatunku F. oxysporum którego stadium generatywne nie jest znane, określono potencjalny typ płciowy poprzez amplifikację fragmentów idiomorfów MAT i stwierdzono nierównomierną dystrybucję MAT1-1 i MAT1-2 w analizowanej puli izolatów. Obecność F. oxysporum i F. proliferatum stwierdzono przede wszystkim w karpach i nasadzie wypustek, natomiast tworzone przez nie mykotoksyny wykryto zarówno w częściach zasiedlonych przez grzyby jak i w wypustkach wolnych od grzybni i pozbawionych jakichkolwiek objawów chorobowych. Ustalenia te i szereg dodatkowych analiz doprowadziły do wyciągnięcia wniosku, że prawdopodobnie mykotoksyny są biosyntetyzowane w zasiedlonych przez grzyby karpach a następnie transportowane w roślinie przez floem do części jadalnych. Warto podkreślić, że niektóre izolaty F. oxysporum zdolne były do biosyntetyzowania nie tylko moniliforminy, co jest powszechnie znane, ale także fumonizyny, z której syntezą wiązano dotąd inne gatunki rodzaju Fusarium. Informacja ta jest bardzo istotna w świetle postanowienia Międzynarodowej Agencji ds. Badań nad Rakiem włączającego fumonizynę B 1 do klasy 2B związków potencjalnie rakotwórczych dla ludzi. W przeprowadzonych badaniach monitorowano ponadto reakcję rośliny na inokulację izolatami F. oxysporum i F. proliferatum poprzez określenie poziomu indykatorów stresu oksydacyjnego i poziomu wolnych rodników. Wyniki badań opublikowano w licznych pracach naukowych, a także prezentowano podczas krajowych i zagranicznych konferencji i sympozjów. Przedmiotem mojego zainteresowania był także polifagiczny gatunek F. culmorum, badania nad którym omówiono w monotematycznym cyklu prac stanowiącym osiągnięcie. Charakterystyka wybranych patogenów roślin jednoliściennych (załącznik nr 3 - prace:a9, D7, D12, D1, D24, D25 oraz doniesienia na krajowych i zagranicznych konferencjach naukowych) Drugim nurtem badawczym były prace zogniskowane na patogenach wywołujących choroby roślin jednoliściennych. Spośród patogenów dokonujących infekcji poprzez system korzeniowy badano G. graminis i F. culmorum (ujęte w monotematycznym cyklu prac) oraz rzadziej analizowane w momencie podejmowania badań patogeny rodzaju Rhizoctonia

20 Rhizoctonia cerealis syn. Ceratorhiza cerealis (v.d. Hoeven) Moore i Rhizoctonia solani Kühn powodują ostrą plamistość oczkową występującą praktycznie we wszystkich strefach klimatycznych na zbożach i trawach. Celem podjętych badań była ocena patogeniczności izolatów Rhizoctonia spp. wobec wybranych odmian pszenicy oraz poszukiwanie markerów molekularnych związanych z patogenicznością. Przeprowadzono szereg badań laboratoryjnych i szklarniowych. Tradycyjne rozróżnianie R. solani i R. cerealis jest czasochłonne i wymaga barwienia jąder komórkowych w celu określenia ich liczby w komórkach grzybni. Wygodną alternatywą dla tej procedury okazało się zastosowanie analizy konserwatywnych sekwencji rdna, która pozwoliła na wiarygodne zweryfikowanie tradycyjnie przeprowadzonego oznaczenia gatunków. Na podstawie przeprowadzonych badań wskazano, najbardziej patogeniczne izolaty, udowodniono, że pszenica Almari była bardziej podatna na infekcję niż Eta. Za pomocą PCR ze starterem o losowej sekwencji uzyskano 33 polimorficzne produkty, z których 3 były wyraźnie związane z mniejszą patogenicznością izolatów Rhizoctonia spp. Wyniki badań zostały opublikowane jak również prezentowano je na konferencji krajowej. Kolejnym badanym patogenem infekującym rośliny jednoliścienne był workowiec Claviceps purpurea (Fries) Tulasne powodujący sporysz na ponad 400 gatunkach roślin z rodziny Poaceae. Badania nad tym patogenem są szczególnie istotne z uwagi na to, że sklerocja C. purpurea zawierają toksyczne dla ludzi i zwierząt alkaloidowe pochodne kwasu lizergowego, a skażenie ziarna żyta ergotoksynami znacząco obniża jego wartość żywieniową. W dostępnej literaturze nie ma szczegółowych informacji o odporności żyta na C. purpurea, ale wskazuje się na różnice w nasileniu choroby wynikające z długości okresu kwitnienia, który jest uwarunkowany genetycznie. Nawiązana współpraca ze Stacją Hodowli Roślin w Smolicach, Poznańską Hodowlą Roślin w Wiatrowie i Hodowlą Roślin Danko w Choryni zaowocowała uzyskaniem finansowania z MRiRW (nr HORhn /12 oraz nr HORhn /13) w ramach Postępu Biologicznego w Produkcji Roślinnej. Celem badań było między innymi poszukiwanie i wykorzystanie genetycznych źródeł odporności żyta na C. purpurea, poznanie interakcji pasożyt - żywiciel, ocena wpływu warunków środowiska na długość kwitnienia żyta oraz ocena zróżnicowania genetycznego i porównanie populacji C. purpurea pochodzących z poletek w Stacjach Hodowli Roślin oraz z pól produkcyjnych. Na podstawie badań przeprowadzonych w warunkach polowych i laboratoryjnych wysunięto szereg użytecznych i interesujących wniosków. Stosując metodę SRAP i RAPD do analizy zebranych izolatów C. purpurea stwierdzono, że populacja pochodząca z poletek doświadczalnych SHR była bardziej zróżnicowana genetycznie niż ta wyodrębniona z pól produkcyjnych, co sugeruje znaczący wpływ genotypu gospodarza na zróżnicowanie patogena. Ujawniono także istotne zróżnicowanie w konserwatywnych sekwencjach rdna i β-tubuliny, co stanowi głos w toczącej się dyskusji na temat specjacji w gatunku C. purpurea. W doświadczeniach polowych także poczyniono szereg interesujących obserwacji m in. dotyczących genotypów żyta o zmniejszonej podatności na sporysz. Wyniki badań częściowo opublikowano i prezentowano na konferencjach międzynarodowej i krajowej. W trakcie recenzji jest kolejna publikacja (pominięta w ocenie dorobku) złożona do czasopisma Phytoparasitica z listy JCR (Załącznik nr 3, praca AX) oraz przygotowywana jest praca dotycząca analizy sekwencji konserwatywnych

21 Uczestniczyłam także w niewielkim zakresie w badaniach laboratoryjnych poświęconych patogenom z rodzaju Ascochyta Lib. Gatunki należące do tego rodzaju, a występujące na roślinach jednoliściennych są nadal bardzo słabo poznane. Celem podjętych badań była ocena wrażliwości izolatów należących do gatunków A. agrostis, A. avenae, A. brachypodii, A. desmazieri, A. digraphidis, A. ducis-aprutii, A. festucae, A. graminea, A. hordei (var. americana, var. europea, var. hordei), A. melicae, A. skagwayensis, A. sorghi, A. stipa i A. zeicola na wybrane fungicydy stosowane w programach ochrony zbóż. Wykazano między innymi, że niektóre spośród analizowanych izolatów (A. stipae i A. diagraphidis) były wyraźnie odporne na zastosowane substancje aktywne. Wyniki badań opublikowano i prezentowano na konferencji krajowej. Zastosowanie metod molekularnych do diagnostyki chorób roślin i grzybów uprawnych (załącznik nr 3 - prace:a2,a10, D11, D14, D18, D23 oraz doniesienia na krajowych konferencjach naukowych) W swoich badaniach staram się włączyć do badań fitopatologicznych poznane w czasie studiów i w okresie przygotowywania rozprawy doktorskiej metody biologii molekularnej i elementy genetyki, co w wielu wypadkach przyczynia się do pełniejszego rozumienia obserwowanych zjawisk. Analizy molekularne dostarczają wielu cennych informacji zarówno na temat patogenów jak i infekowanych przez nie roślin. Prawidłowe zastosowanie odpowiednich metod analitycznych podnosi wiarygodność identyfikacji gatunków, dostarcza informacji o zróżnicowaniu genetycznym i dynamice populacji, pomaga uporządkować stosunki filogenetyczne i umożliwia znalezienie wygodnych markerów interesujących cech fizjologicznych czy biochemicznych. W badaniach dotyczących skórzastej zgnilizny owoców truskawki połączenie analiz mykologicznych z analizą RAPD i sekwencjonowaniem fragmentu genomu obejmującego ITS1-5.8S-ITS2 doprowadziło do stwierdzenia po raz pierwszy w Polsce (w 2005 r.) występowania Phytophthora citricola Sawada jako patogena truskawki. Do tej pory za jedynego sprawcę skórzastej zgnilizny owoców truskawki uważano powszechnie występujący w Europie gatunek Phytophthora cactorum (lebert & Cohn) Schroeter. Badania, które doprowadziły do tego odkrycia obejmowały ocenę morfologii kultur na pożywce, uzyskanie i ocenę mikroskopową sporangiów (Fot. 5), realizację postulatów Kocha oraz izolację DNA, DNA fingerprinting oraz PCR i sekwencjonowanie fragmentu rdna. Fot. 5. Sporangia P. citricola (z lewej) i P. cactorum (z prawej)

22 Fot. 6. Różnice w długości analizowanego fragmentu r DNA P. citricola (Pc3 i Pc8) i P. cactorum (pozostałe ścieżki); MW - marker długości Uzyskane sekwencje potwierdzające identyfikację gatunków zdeponowano w sekwencyjnej bazie danych (Gene Bank: accession number AY i AY670705), a wyniki opublikowano i prezentowano na konferencjach naukowych. Kolejnym wątkiem badawczym, do realizacji którego włączono analizy molekularne były prace dotyczące zdrowotności kasztanowców. Ich realizacja była możliwa dzięki finansowaniu przez Urząd Miasta Poznania projektu badawczego, którego byłam kierownikiem, a wyłonionego w drodze międzyuczelnianego konkursu Akademicki i Naukowy Poznań. W Poznaniu z ponad drzew zinwentaryzowanych przez Wydział Ochrony Środowiska Urzędu Miasta, ponad 10% stanowią kasztanowce. Od kilku lat występują istotne problemy związane z występowaniem szkodnika szrotówka kasztanowcowiaczka (Cameraria ohridella Deschka & Dimić), którego gąsienice niszczą miękisz liści i drastycznie obniżają walory estetyczne drzew w terenach zieleni, a z drugiej strony coraz częściej obserwuje się występowanie mączniaka prawdziwego powodowanego przez Erysiphe flexuosa (Peck) U. Braun & S. Takamatsu. Celem projektu było poszukiwanie nieinwazyjnych dla środowiska metod, służących monitorowaniu genotypów kasztanowców mniej podatnych na mączniaka prawdziwego oraz w mniejszym stopniu niszczonych przez szrotówka kasztanowcowiaczka. Rośliny mateczne o tak pożądanych cechach, wyodrębnione w toku badań, wprowadzone do zieleni miejskiej podnosiłyby walory estetyczne wielu reprezentacyjnych części miasta. W ramach realizacji projektu oceniano występowanie E. flexuosa i C. ohridella na biało kwitnących drzewach Aesculus hippocastanum L. i różowo kwitnących A. carnea Hayne, określono stopień porażenia/uszkodzenia liści, poprzez analizy DNA drzew oceniono zróżnicowanie genetyczne kasztanowców zdrowych oraz zaatakowanych przez patogena i/lub szkodnika, dokonano wstępnego wyboru markerów molekularnych związanych z mniejszą podatnością drzew na zasiedlenie przez szrotówka kasztanowcowiaczka oraz wskazano genotypy kasztanowców do szczepień i nasadzeń w zieleni miejskiej. Rezultaty realizacji projektu opublikowano i prezentowano na konferencjach naukowych, a badania są kontynuowane. Chociaż patogeny grzybów jadalnych nie znajdują się w głównym nurcie moich zainteresowań, to z uwagi na zaproszenie do uczestniczenia w realizacji projektu finansowanego przez MNiSW nr 2 P06RO8230 prowadziłam badania molekularne grzybów