METODY ANALIZY OBRAZU W BADANIU KRZYWEJ WZROSTU GRZYBA TRICHODERMA HARZIANUM

Transkrypt

1 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (3) 2009 METODY ANALIZY OBRAZU W BADANIU KRZYWEJ WZROSTU GRZYBA TRICHODERMA HARZIANUM WYSTĘPUJĄCEGO W UPRAWIE PIECZARKI DWUZARODNIKOWEJ AGARICUS BISPORUS (LANGE/IMBACH) RADOSŁAW J. KOZŁOWSKI 1, ROMUALD GÓRSKI 2, MARIA KOZŁOWSKA 3 Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu 1 Instytut Inżynierii Rolniczej, Zakład Informatyki Stosowanej Wojska Polskiego 50, Poznań rkozlowski@up.poznan.pl 2 Katedra Metod Ochrony Roślin Zgorzelecka 4, Poznań rgorski@up.poznan.pl 3 Katedra Metod Matematycznych i Statystycznych Wojska Polskiego 28, Poznań markoz@up.poznan.pl I. WSTĘP Obserwowany w ostatnich latach postęp w rozwoju nowoczesnych technologii informatycznych oraz spadek cen sprzętu komputerowego, umożliwia zastosowanie coraz większego wachlarza metod badawczych korzystających z dużych mocy obliczeniowych komputerów. Wyposażenie komputera w urządzenie peryferyjne w postaci skanera płaskiego pozwala na zastosowanie go w badaniach doświadczalnych, które wymagają uzyskania informacji na temat właściwości badanego materiału biologicznego. Informacje te uzyskujemy na podstawie obrazów badanych obiektów (Wojnar i Majorek 1994; Rataj 2000). Metody komputerowej analizy obrazów znajdują szerokie zastosowanie w zagadnieniach badawczych realizowanych w ramach nauk biologicznych (Hader 1992). W rolnictwie stosowane są one między innymi w badaniach związanych z ochroną roślin, w tym identyfikacją szkodników i chorób, oceną skuteczności działania substancji aktywnych, oceną jakości produktów rolniczych, itp. (Kulikowski 1993; Glasbey i Horgan 1995). Znajdują także zastosowanie w technice rolniczej, gdzie są integralną częścią wielu procesów technologicznych (Frączek 2005).

2 1286 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (3) 2009 Metody analizy obrazów w porównaniu do metod tradycyjnych, wykorzystujących często podstawowe narzędzia pomiarowe oraz przybliżone modele matematyczne, cechuje większa dokładność pomiarów, co pozwala na dokładniejsze przebadanie analizowanych procesów. Wielu badaczy zauważyło niewątpliwe zalety tej metody i od kilku lat można zaobserwować próby jej wykorzystania w badaniach prowadzonych w ramach wielu dziedzin nauki (Čermák i wsp. 2006). W uprawie grzybów jadalnych znaczące straty powodowane są przez grzyby z rodzaju Trichoderma. W produkcji pieczarek, boczniaka i shiitake grzyby te stanowią duże zagrożenie (Benhamou i Chet 1993; Ziombra 1995; Sharma i wsp. 1999; Ziombra 2001; Samuels i wsp. 2002; Szczech 2005). Są one sprawcami zielonej pleśni (Chet i Inbar 1994; Agosin i Aguilera 1998; Hermosa i wsp. 2000) ujemnie wpływającej na wysokość plonu. Badania nad wpływem wybranych preparatów na wzrost grzyba Trichoderma harzianum występującego w uprawie pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus bisporus Lange/Imbach) przeprowadzono w Katedrze Metod Ochrony Roślin i Zakładzie Informatyki Stosowanej Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, w 2007 i 2009 roku. Przebadano środek pochodzenia naturalnego, tj. 10% wyciąg wodny z ziela pokrzywy oraz fungicyd organiczny Sporgon 50 WP. Pomiary wykonano metodą komputerowej analizy obrazu. Celem badań było pozyskanie dokładnych pomiarów obserwowanych powierzchni kolonii grzyba i na ich podstawie weryfikacja dla badanych preparatów modelu wzrostu grzyba T. harzianum. II. MATERIAŁ I METODY W latach 2007 i 2009 przeprowadzono doświadczenia laboratoryjne na płytkach Petriego nad wpływem środka pochodzenia naturalnego, tj. 10% wyciągu wodnego z ziela pokrzywy oraz fungicydu organicznego Sporgon 50 WP na wzrost kolonii grzyba T. harzianum. Testowane środki dodawano do pożywki PDA (agar ziemniaczanoglukozowy), którą inokulowano izolatem grzyba T. harzianum. Użyty w doświadczeniu izolat T. harzianum został wyizolowany z podłoża na bazie słomy i kurzaka, w uprawie pieczarki dwuzarodnikowej w Mikulicach koło Turku. Do inokulacji użyto 5 mm krążków pożywki przerośniętej grzybnią. Krążki te pobierano z brzegu siedmiodniowych kultur grzyba wyhodowanych na agarze ziemniaczano-glukozowym. Inokulowane płytki inkubowano w temperaturze 23 o C, bez dostępu światła. Doświadczenia założono w 6 powtórzeniach i prowadzono w temperaturze pokojowej przy ograniczonym dostępie światła. Pomiarów wzrostu kolonii grzyba dokonywano codziennie do momentu całkowitego przerośnięcia płytki grzybnią. Do wykonywania pomiarów wykorzystano komputerowe metody analizy obrazu szalek z rozwijającą się kolonią T. harzianum. Do akwizycji obrazów wykorzystano zbudowane w tym celu stanowisko badawcze składające się ze skanera płaskiego A4 o dużej szybkości skanowania i rozdzielczości optycznej oraz komputera wyposażonego w autorski program FotoDetekt. Jednocześnie skanowano sześć obiektów, co znacznie przyspieszyło proces pozyskiwania obra-

3 Metody analizy obrazu w badaniu krzywej wzrostu T. harzianum 1287 zów, to spowodowało jednak konieczność rozbicia obrazu na fragmenty odpowiadające poszczególnym płytkom. Zdigitalizowane obrazy szalek zapisane zostały w formacie bezstratnym, tak aby zachować wszystkie istotne informacje zawarte w skanowanym obrazie. Kolejnym etapem było wyizolowanie poszczególnych szalek ze skanowanego obrazu. Wykorzystane w tym celu algorytmy detekcji krawędzi oraz erozji i dylatacji pozwoliły na uzyskanie segmentów obrazu, z których każdy zawierał dokładnie jedną kolonię namnażającego się grzyba. Tak wyizolowane próbki poddano analizie końcowej polegającej na oszacowaniu pola powierzchni kolonii grzyba. Pomiar rzeczywistego pola powierzchni poprzedzony był kalibracją wymiarów. Na podstawie liczby pikseli obrazu kolonii T. harzianum wyznaczano jego pole powierzchni (rys. 1). Wartości pól powierzchni dla analizowanych płytek Petriego gromadzone były w postaci arkusza danych, który wykorzystano w obliczeniach statystycznych. Zastosowano test t-studenta na poziomie istotności 0,05. Rys. 1. Pomiar powierzchni kolonii grzyba T. harzianum Fig. 1. Measurement of the area of fungus T. harzianum colony Dla porównania wpływu środowiska wzrostu kolonii T. harzianum, wyznaczono estymatory współczynników modelu wzrostu. Model opisujący wzrost kolonii T. harzianum został wyprowadzony w oparciu o badania z zastosowaniem fungicydu Bravo 500 SC i Bravo Plus 500 SC, w których obserwacje przeprowadzono metodą tradycyjną (Górski i Kozłowska 2008).

4 1288 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (3) 2009 III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Zastosowanie w badaniach zarówno środka pochodzenia naturalnego, tj. 10% wyciągu wodnego z ziela pokrzywy, jak i fungicydu Sporgon 50 WP w znacznym stopniu ograniczało wzrost grzyba T. harzianum. Zahamowanie wzrostu grzybni patogena w stosunku do kontroli w obu testach było statystycznie istotne. Na pożywce PDA bez dodatku badanych preparatów grzyb osiągnął powierzchnię płytki Petriego po 4 dniach od inokulacji, natomiast na pożywce z dodatkiem wyciągu z pokrzywy osiągnął ją po 9 dniach, a z dodatkiem fungicydu Sporgon 50 WP osiągnął 15,2% tej powierzchni po trzydziestu czterech dniach od inokulacji. Parametry modelu wzrostu kolonii T. harzianum o postaci y = a exp(bx) gdzie y oznacza pole powierzchni kolonii grzyba x oznacza dzień od inokulacji a parametr b oznacza współczynnik zwany półelastycznością, przedstawiono w tabeli 1. Wyznaczono je dla każdego środowiska dla ostatniego dnia badań. Świadczą one o zróżnicowanym przebiegu wzrostu kolonii T. harzianum przy stosowaniu w pożywce PDA dodatku 10% wyciągu z ziela pokrzywy, fungicydu Sporgon 50 WP lub przy nie stosowaniu dodatków. Tabela 1. Model wzrostu kolonii grzyba T. harzianum na pożywce PDA (kontrola) lub z dodatkiem fungicydu Sporgon 50 WP lub wyciągu z ziela pokrzywy. Estymatory parametrów modeli uzyskane WMNK Table 1. Model for T. harzianum growth on PDA medium without or with addition of the fungicide Sporgon 50 WP or extract of nettle. Weighted least squares method was used Modele Models Pożywki Media Sporgon 50 WP Pokrzywa Nettle Kontrola Control Semi-log model Współczynnik determinacji Coefficient of determination Błąd standardowy Standard error Półelastyczność Semi-elasticity y = 18,6 exp(0,123x) y = 92,96 exp(0,656x) y = 43,21 exp(1,29x) 97,3% 83,9% 92,3% 0,203 0,623 0,425 12,3% 65,6% 129% Porównując wpływ środowiska wzrostu kolonii T. harzianum stwierdzono, że podczas, gdy w kontroli przez 1 dzień powierzchnia kolonii wzrośnie o 129%, na pożywce PDA z dodatkiem wyciągu z ziela pokrzywy wzrośnie o 65,6%, to z dodatkiem preparatu Sporgon 50 WP powiększy się ona o zaledwie 12,3%. Wyznaczone parametry dopa-

5 Metody analizy obrazu w badaniu krzywej wzrostu T. harzianum 1289 sowania modelu, przedstawione w tabeli 1., świadczą o wysokim dopasowaniu modelu do wyników badań. Stąd wydaje się, że wyznaczenie modelu wzrostu dla kolejnych preparatów badanych pod kątem ich wpływu na wzrost kolonii T. harzianum jest znaczącym krokiem w poznawaniu tego procesu i oceny ich działania. IV. LITERATURA Agosin E., Aguilera J.M Industrial production of active propagules of Trichoderma for agricultural uses. s W: Trichoderma and Gliocladium. Vol. 2. Enzymes, Biological Control Commercial Applications (G.E. Harman, C.P. Kubicek, red.). London, Taylor and Francis. Benhamou N., Chet I Hyphal interactions between Trichoderma harzianum and Rhizoctonia solani: ultrastructure and gold cytochemistry of the mycoparasitic process. Phytopathology 83: Chet I., Inbar J Biological control of fungal pathogens. Appl. Bioch. Biotechnol. 48: Čermák P., Mazal P., Palovčíková D., Jankovský L Application of image analysis in plant pathology and forest protection. J. Forest Sci. 52 (7): Frączek J Cyfrowa analiza obrazu w technice rolniczej. Inżynieria Rolnicza 6 (66): Glasbey C.A., Horgan G.W Image Analysis for the Biological Sciences. John Wiley & Sons, Inc. New York, 218 ss. Górski R., Kozłowska M Wpływ fungicydów Bravo 500 SC i Bravo Plus 500 SC na model wzrostu grzyba Trichoderma harzianum występującego w uprawie pieczarki dwuzarodnikowej [Agaricus bisporus (Lange) Imbach]. Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 48 (4): Hader D.P Image Analysis in Biology. CRC Press. Inc., 384 ss. Hermosa M.R., Grondona I., Iturriaga E.A., Diaz-Minguez J.M., Castro C., Monte E., Garcia- Acha I Molecular characterization and identification of biocontrol isolates of Trichoderma. Appl. Environ. Microbiol. 66: Kulikowski J.L Komputery w Badaniach Doświadczalnych. PWN, Warszawa, 274 ss. Rataj V Analiza obrazu w eksperymentach w środowisku naturalnym. Inżynieria Rolnicza 7 (18): Samuels G.J., Dodd S.L., Gams W., Castlebury L.A., Petrini O Trichoderma species associated with the green mold epidemic of commercially grown Agaricus bisporus. Mycologia 94 (1): Sharma H.S.S., Kilpatrick M., Ward F., Lyynos G., Burns L Colonization of phase II compost by biotypes of Trichoderma harzianum and their effect on mushroom yield and quality. Appl. Microbiol. Biotech. 51: Szczech M Identyfikacja grzybów wywołujących zieloną pleśń w pieczarkarniach. Biul. Pieczarki 1: Wojnar L., Majorek M Komputerowa Analiza Obrazu. CSS Ltd., Warszawa, 159 ss. Ziombra M Czynniki warunkujące wzrost grzybni i plonowanie boczniaka. Konferencja Ogólnopolska Nowości w uprawie grzybów. Poznań, 3 4 listopada 1995: Ziombra M Grzyby pleśniowe w uprawach boczniaka. Biul. Pieczarki 1:

6 1290 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (3) 2009 RADOSŁAW J. KOZŁOWSKI, ROMUALD GÓRSKI, MARIA KOZŁOWSKA IMAGE PROCESSING METHODS IN STUDIES OF GROWTH MODEL OF THE FUNGUS TRICHODERMA HARZIANUM FOUND IN BUTTON MUSHROOM AGARICUS BISPORUS (LANGE/IMBACH) CULTIVATION SUMMARY In cultivation of button mushrooms, the fungus Trichoderma harzianum is a significant danger. The most effective substances are not permitted to be used in mushroom cultivation, due to the risk residues of active substance which may accumulate in the sporocarp. In the investigation to the analysis was subjected a substance of natural origin, namely a 10% aqueous extract of nettles and Sporgon 50 WP organic fungicide. Measurements of the growth of the fungus colony were made daily. Image processing method as measurement technique was used. The computerized method for analysing T. harzianum growth consisted of several stages. At all stages a standard set of working equipment, consisting of a computer, a flat scanner and an original computer program FotoDetekt, were used. The purpose of these studies was to verify the effect of applied measurement method on the growth model of T. harzianum. The model was defined on the base of results obtained by traditional methods. The tested extract of nettle and the organic fungicide Sporgon 50 WP inhibited the growth of T. harzianum to a significant degree. The inhibition of growth of pathogen mycelium with respect to the control was statistically significant. The areas of fungus colony, determined by computer, for particular repetitions in successive days after inoculation were used to verify the model for growth. These investigations indicated the compatibility of the growth model of the fungus colony subjected to the action of fungicide Sporgon 50 WP or to extract of nettles with the earlier defined model. Key words: image analysis, growth model of fungus, Trichoderma harzianum, Agaricus bisporus