Praca oryginalna Original Article

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2011 Volume 47 Number Praca oryginalna Original Article Laboratoryjna ocena odpowiedzi na leczenie kwasem acetylosalicylowym (ASA) u pacjentów w ostrej fazie udaru niedokrwiennego mózgu zastosowanie agregometrii przepływowej (PFA-100) i impedancyjnej (Multiplate) Laboratory evaluation of the response to ASA treatment in patients in acute phase of ischemic stroke application of flow (PFA-100) and impedance (Multiplate) aggregometry Maria Jastrzębska 1, Aldona Siennicka 1, Kornel Chełstowski 1, Andrzej Ciechanowicz 1, Przemysław Nowacki 2, Aneta Wódecka 2 1 Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej i Medycyny Molekularnej, 2 Klinika Neurologii, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie Streszczenie Wstęp: U znacznej części leczonych ASA obserwuje się zjawisko tzw. aspirynooporności, definiowanej jako osobnicze ograniczenie zdolności hamowania funkcji płytek krwi, pomimo stosowania leków przeciwpłytkowych. Podejmuje się próby zdefiniowania aspirynooporności laboratoryjnej, ale wybór metody pomiarowej, punktu odcięcia oraz różnice populacyjne to wszystko wpływa na wynik i jego interpretację. Cel: Postanowiliśmy ocenić dawkozależną (150 vs 300 mg/d) odpowiedź na leczenie ASA w grupie chorych z ostrą fazą udaru niedokrwiennego mózgu, określając aspirynooporność równocześnie za pomocą agregometrii przepływowej (PFA-100) i impedancyjnej (Multiplate) oraz zmieniając arbitralnie cut off (w ramach klinicznej akceptowalności nowej kwalifikacji). Materiał i metody: Badaniami objęto 172 chorych z ostrym udarem niedokrwiennym mózgu, w tym 71 kobiet i 101 mężczyzn, w wieku 63,2 ± 12,6 lat. Po 7 dniach leczenia ASA zidentyfikowano osoby wrażliwe i oporne na ASA. Osobom opornym, dla przełamania oporności podano dawkę 300 mg/d; nadal opornym zmieniono leczenie na tienopirydyny. Analizę statystyczną przeprowadzono przy pomocy pakietu Statistica PL, v Wyniki i wnioski: Częstość aspirynooporności laboratoryjnej w ostrym udarze niedokrwien-nym mózgu, definiowana czasem okluzji (CEPI-CT) < 250s w pomiarze PFA-100 i wartością pola pod krzywą (ASPItest - AU x min) > 300 w pomiarze Multiplate, tylko w niewielkim stopniu zależna jest od dawki ASA. Brak przełamania oporności dawką 300 mg/d powinien skłaniać do zmiany leku na tienopirydyny. Obniżenie wartości cut off z 250 do 150s pozwoliło na wykrywanie zjawiska aspirynooporności laboratoryjnej z podobną częstością w obydwu metodach agregometrii (46% wg PFA-100 oraz 42% wg Multiplate). Summary Introduction: In a considerable number of treated patients the so-called aspirin nonresponsivenesss phenomenon is observed and defined as individual deficiency of the ability to restrain functions of blood platelets even though antiplatelet drugs are being taken. Attempts are made to define laboratory resistance to oral antiplatelet drugs, but the choice of measurement method, the cut-off point and population differences all these influence the result and its interpretation. Aim: We decided to assess the dose dependent (150 vs 300 mg/d) response to ASA treatment in the group of patients with acute phase of ischemic stroke, defining aspirin resistance by both flow (PFA-100) and impedance (Multiplate) aggregometry and by changing the arbitrary cut-off (in the scope of clinical acceptance of the new definition). Material and methods: The research was extended to 172 patients with acute ischemic stroke, including 71 women and 101 men, in the range of 63,2 to 12,6 yrs of age. After 7 days of ASA therapy, ASA respondent and nonrespondent persons were identified. To overcome the nonreponsiveness, a dose of 300 mg/d was applied to the nonresponders; treatment of the persistent nonreponders was changed to tienopirydynes. The statistical analysis was carried out using the Statistica PL,v.9.0. package. 155

2 Laboratoryjna ocena odpowiedzi na leczenie kwasem acetylosalicylowym (ASA) u pacjentów w ostrej fazie udaru... Results and conclusions: The frequency of laboratory aspirin nonresponsiveness in acute ischemic stroke, defined by the closure time (CEPI-CT)<250s in PFA-100 method and by the area value under the curve (ASPItest - AU x min) > 300 in Multiplate measurement, is dependent on the ASA dose only to a small extent. The failure to overcome the nonresponsiveness with a dose of 300 mg/d should prompt a therapy switch to tienopirydynes. The lowering of the cut-off value from 250 to 150s made it possible to keep detecting the phenomenon of laboratory aspirin nonresponsiveness with similar incidence in both aggregometry methods (46% per PFA-100 and 42% per Multiplate). Słowa kluczowe: udar mózgu, aspirynooporność, PFA-100, Multiplate, funkcja płytek krwi, tromboksan B2, czynnik von Willebranda Key words: ischemic stroke, aspirin resistance, PFA-100, Multiplate, platelet function, tromboxane B2, von Willebrand factor Wstęp Kwas acetylosalicylowy (ASA) należy do leków przeciwpłytkowych najczęściej stosowanych we wtórnej prewencji chorób sercowo-naczyniowych. Największe korzyści z leczenia ASA odnoszą pacjenci z grupy wysokiego ryzyka, gdzie redukcja ryzyka wystąpienia ponownego epizodu wieńcowego lub mózgowego szacowana jest na 25% [1]. Jednak u znacznej części tej grupy obserwuje się zjawisko oporności na kwas acetylosalicylowy, czyli aspirynooporności. Zjawisko to opisywane jest szeroko w piśmiennictwie i definiowane jako osobnicze ograniczenie zdolności hamowania funkcji płytek krwi, pomimo stosowania leków przeciwpłytkowych, mające często związek z ostrymi incydentami mózgowymi i wieńcowymi [14, 29, 30]. Jego częstość waha się w szerokich granicach, 5 40 %, w zależności od badanej populacji oraz od rodzaju użytego testu laboratoryjnego [16, 25], a więc jest ważna klinicznie. Stąd w ostatnich latach dużym zainteresowaniem cieszą się próby poprawnego zdefiniowania aspirynooporności laboratoryjnej [30]. W testach laboratoryjnych ograniczone hamowanie funkcji płytek krwi charakteryzuje się niepełnym zablokowaniem adhezji i agregacji, mierzonych różnymi metodami agregometrii, ograniczoną zdolnością wydłużenia czasu krwawienia oraz brakiem wyraźnego spadku stężenia trombokasanu B2 (TXB2), wynikającego z niedostatecznego hamowania aktywności cyklooksygenazy płytkowej (COX-1) [5, 6, 7, 9,19, 28]. Stopień hamowania aktywności COX-1 w dużej mierze zależy od dawki kwasu acetylosalicylowego. W długoterminowej prewencji epizodów sercowo-naczyniowych zaleca się stosowanie niższych dawek ASA ( mg/d), które jednak powodują częstsze występowanie zjawiska aspirynooporności laboratoryjnej, głównie wśród chorych z chorobą niedokrwienną serca ze współistniejącymi czynnikami ryzyka (dyslipidemia, otyłość centralna, cukrzyca, stan zapalny) [3, 8, 24]. W tych i innych szczególnych sytuacjach klinicznych (ostre incydenty wieńcowe i mózgowe) rekomenduje się wyższe dawki ASA 300 do 325 mg/d [4]. Niektórzy uważają, że stosowanie wyższych dawek ASA, na przykład u chorych w ostrej fazie udaru mózgu, może prowadzić do zlikwidowania przełamania aspirynooporności laboratoryjnej, wykrywanej podczas przyjmowania niższych dawek tego leku [2]. Jednakże wyniki zdecydowanej większości badań nie dowodzą powiązania pomiędzy dawką ASA a aspirynoopornością laboratoryjną. Stąd, jak do tej pory, nie rekomenduje się dostosowywania dawek ASA w zależności od wyników testów i rutynowego monitorowania leczenia aspiryną, tym bardziej że brak standaryzacji badań laboratoryjnych [27]. Według Grupy Roboczej (The Opinion of the Working Group) do oszacowania przeciwpłytkowego efektu ASA należy stosować głównie metody agregometrii z użyciem kwasu arachidonowego, jako agonisty indukującego agregację płytek krwi, a najbardziej rekomendowanymi metodami oceniającymi stopień zahamowania funkcji płytek krwi podczas leczenia lekami przeciwpłytkowymi jest agregometria optyczna (transmisyjna) i impedancyjna oraz badania przyłóżkowe typu point of care [22]. Badaniem tego typu, szeroko stosowanym do detekcji funkcji płytek krwi (jednoczesny pomiar funkcji adhezyjno-agregacyjnej) podczas leczenia aspiryną, jest m.in. metoda agregometrii przepływowej (kapilarnej), realizowana w analizatorze płytkowym PFA-100, z użyciem kartridży kolagen/epinefryna (CEPI) [5, 6, 7, 14, 29, 32]. Za pomocą tej metody można określić tzw. czas okluzji (Closure Time, CT), tj. czas niezbędny do zamknięcia kapilary, imitującej naczynie krwionośne, przez wytworzony czop płytkowy. Warunkiem koniecznym powstania tego czopu jest odpowiedni poziom hemostatyczny czynnika von Willebranda. Istnieją doniesienia wskazujące na zależność czasu okluzji (CT) od dawek ASA [31], co potencjalnie mogłoby być wykorzystane do monitorowania efektów leczenia ASA. Z kolei agregometria impedancyjna ( np. aparat Multiplate) pozwala na ocenę funkcji płytek poprzez zmiany oporu elektrycznego zachodzące, podczas agregacji, między elektrodami naczynia pomiarowego zawierającego pełną krew lub osocze bogatopłytkowe. Wynik podawany jest jako pole pod krzywą zmian oporu w funkcji czasu [19]. Jak z powyższego wynika, dostępne na rynku aparaty, służące do badania agregacji płytek krwi, wykorzystują różne mechanizmy aktywacji płytek krwi, co częściowo tłumaczy, że wyniki uzyskane za ich pomocą często nie korelują ze sobą. Z powodu takich różnic metodologicznych w agregometrii dla oceny efektów leczenia przeciwpłytkowego aspiryną zaleca się także metody biochemiczne, stanowiące niejako uzupełnienie metod agregometrycznych. Najbardziej odpowiednim testem biochemicznym dla agregometrii przepływowej jest oznaczanie w osoczu aktywności czynnika von Willebranda jako że pełni on rolę kofaktora w procesie adhezji płytek do kolagenu [11, 20]. Natomiast dla agregometrii impedancyjnej ważne jest oznaczanie stężenia metabolitów kwasu arachidonowego, tj. tromboksanu 156

3 M. Jastrzębska i inni B2 w osoczu lub 11-dehydro TXB2 w moczu [5, 9, 22]. Z wyborem metody pomiarowej wiąże się też wybór punktu odcięcia (cut off), który przyjmuje się najczęściej na poziomie dwóch odchyleń standardowych od średniej arytmetycznej dla badanej populacji, albo wg zaleceń producenta aparatu i metody pomiarowej, czy też do pewnego stopnia arbitralnie [7]. Tak więc wybór aparatu czy metody pomiarowej, punktu odcięcia oraz różnice populacyjne to wszystko wpływa na wynik i jego interpretację, a zatem ogranicza przydatność kliniczną badań laboratoryjnych. Mając to na uwadze postanowiliśmy ocenić dawkozależną (150 mg/d vs 300 mg/d) odpowiedź na leczenie kwasem acetylosalicylowym (ASA) w dobrze zdefiniowanej grupie chorych, z ostrą fazą udaru niedokrwiennego mózgu, równocześnie za pomocą agregometrii przepływowej i impedancyjnej. Przyjęliśmy założenie, że dodatkowy, równoczesny pomiar aktywności kofaktorowej czynnika von Willebranda i stężenia tromboksanu B2 w osoczu pozwoli lepiej ocenić mechanizmy aspirynooporności laboratoryjnej i powiązać ją z obrazem klinicznym. Innym celem pracy było porównanie częstości występowania aspirynooporności laboratoryjnej wykrywanej za pomocą agregometrii przepływowej i impedancyjnej oraz ocena zgodności obu metod. Postanowiliśmy sprawdzić, czy zmieniając arbitralnie cut off (w ramach klinicznej akceptowalności nowej kwalifikacji) można tę zgodność poprawić. Materiał i metody Badaniami objęto 172 chorych z ostrym udarem niedokrwiennym mózgu, w tym 71 kobiet i 101 mężczyzn, w wieku 63,2 ± 12,6 lat. Byli to chorzy z pierwszym w życiu udarem mózgu stwierdzonym na podstawie badania klinicznego i potwierdzonym tomografią komputerową. Chorych z badań wykluczało: zakwalifikowanie do leczenia trombolitycznego, przeciwwskazanie do stosowania ASA, leczenie przeciwkrzepliwe, przyjmowanie regularnie lub doraźnie (w ciągu 2 tygodni przed i w trakcie hospitalizacji) steroidów i niesteroidowych leków przeciwzapalnych, zabieg operacyjny w ciągu ostatnich 3 miesięcy, świeży zawał serca, niestabilna dusznica bolesna, choroby zapalne i infekcyjne, udokumentowane choroby immunologiczne, choroby nerek i wątroby, nie wyrównane choroby endokrynologiczne inne niż cukrzyca i choroby hematologiczne. U wszystkich chorych hospitalizowanych (czas hospitalizacji < 48 godz.), spełniających kryteria włączenia (ocena stanu klinicznego za pomocą skali NIHSS określenie stopnia deficytu neurologicznego), wykonano rutynowe badania biochemiczne i włączono leczenie kwasem acetylosalicylowym w dawce 150 mg/d. Po 7 dniach leczenia ASA, w zależności od wyników badań agregometrycznych (pomiar agregacji płytek krwi metodą przepływową w PFA-100 i impedancyjną w Multiplate), zidentyfikowano osoby wrażliwe i oporne na ASA. W zależności od identyfikacji utrzymano dawkę ASA 150 mg/d (osoby wrażliwe) lub zwiększono dawkę ASA do 300 mg/d (osoby oporne). W przypadku braku przełamania oporności po dawce 300 mg/d dokonywano zmiany leczenia antypłytkowego z ASA na tienopirydyny. Charakterystykę hospitalizowanych pacjentów zawiera tabela I, a schemat postępowania w określaniu aspirynooporności rycina 1. Tabela I Charakterystyka ogólna i wyniki podstawowych badań pacjentów przyjętych do leczenia z rozpoznaniem udaru niedokrwiennego mózgu. Parametry ; n Płeć (K/M) 71/101 wiek 63,2 ± 12,6 Palenie (T/N) 83/89 Fb (g/l) 3,75 ± 0,88 CRP (mg/l) 5,94 ± 6,32 HCT (%) 43,3 ± 4,0 Chc (mg/dl) 219 ± 50 TG (mg/dl) 162 ± 102 LDL (mg/dl) 138 ± 42 HDL (mg/dl) 48 ± 14 HbA1c (%) 6,2 ± 1,3 NIHSS 1 5,2 ± 3,4 NIHSS 2 2,9 ± 2,7 Rycina 1. Schemat postępowania w określaniu aspirynooporności u chorych w ostrej fazie udaru niedokrwiennego mózgu. Do oceny odpowiedzi na leczenie ASA zastosowano: 1. Oznaczanie zdolności adhezyjno-agregacyjnych płytek krwi wyrażonej pomiarem czasu okluzji (CT) metodą agregometrii przepływowej z użyciem agonistów kolagen/epinefryna (kartridż CEPI) za pomocą analizatora funkcji płytek PFA- 100 (Siemens). Krew do badań pobierano na zbuforowany 3,2 % cytrynian sodu w stosunku 1:9 (1 część cytrynianu, 9 części krwi), a badanie wykonano we krwi pełnej w czasie 2 godz. od pobrania krwi. W celu wykrycia aspirynooporności po dawce 150 mg/d przyjęto punkt odcięcia dla CT <250 s (osoby oporne) punkt odcięcia przyjęty arbitralnie (uśrednienie wartości cytowanych w piśmiennictwie i zalecanych przez producenta). Punkt odcięcia < 250 s utrzymano rów- 157

4 Laboratoryjna ocena odpowiedzi na leczenie kwasem acetylosalicylowym (ASA) u pacjentów w ostrej fazie udaru... nież w sytuacji braku przełamania oporności po dawce 300 mg/d. W obliczeniach statystycznych dotyczących oceny występowania aspirynooporności po dawce 150 mg/d zastosowano dodatkowy punkt odcięcia dla CT wynoszący <150 s (zakres dwóch odchyleń standardowych). 2. Oznaczanie zdolności agregacjnej płytek krwi wyrażonej pomiarem pola pod krzywą (AU x min) metodą agregometrii impedancyjnej z użyciem agonisty kwasu arachidonowego (ASPI test) za pomocą analizatora Multiplate (Dynabyte medical). Krew do badań pobierano na hirudynę (r-hirudin, S-Monovette, Sarstedt) a badanie wykonano we krwi pełnej w czasie 2 godz. od pobrania krwi. W celu wykrycia aspirynooporności po dawce 150 mg/d przyjęto punkt odcięcia dla AU x min >300 (osoby oporne) punkt odcięcia przyjęty wg zaleceń producenta. 3. Oznaczanie aktywności kofaktorowej czynnika von Willebranda (vwf R:Cof) w osoczu metodą immunoturbidymetryczną z użyciem zestawu testowego BC vwf Reagent (Siemens). 4. Oznaczanie stężenia tromboksanu B2 w osoczu metodą immunoenzymatyczną (EIA) z użyciem zestawu testowego Thromboxane B2 Express EIA Kit (Cayman Chemical). Krew do oznaczeń vwf i TXB2 pobierano na 3,2 % cytrynian sodu w stosunku 1:9, następnie wirowano w celu pozyskania osocza ubogopłytkowego (15 min przy 2000 g), a uzyskane osocze mrożono w temp. 30 o C do chwili wykonania analiz (maksymalny czas mrożenia próbek wynosił 2 miesiące). Próbki osocza przeznaczone do oznaczania TXB2, przed wykonaniem analiz, ekstrahowano przy użyciu kolumienek (Bakerbond spe TM ), a uzyskany eluent suszono w atmosferze azotu. Analizę statystyczną przeprowadzono przy pomocy pakietu Statistica PL, v. 9.0 firmy StatSoft. Zmienne ciągłe przedstawiono jako średnią arytmetyczną i odchylenie standardowe, a zmienne jakościowe poprzez liczebności i stosowne procenty (frakcje). Średnie arytmetyczne porównano testem t-studenta, a frakcje testem chi 2 Pearsona. Oszacowano wzajemne korelacje niektórych zmiennych, obliczając współczynnik korelacji liniowej r Pearsona i jego istotność statystyczną. Zgodność metod wykrywania oporności na ASA oceniano testem porządku rang Spearmana: wielkość i istotność współczynnika R były miarą tej zgodności. Poziom istotności przyjęto dla p<0,05. Wyniki Tabela II przedstawia występowanie oporności laboratoryjnej na ASA według pomiaru PFA-100. Po leczeniu ASA w dawce 150 mg/d 107 osób zakwalifikowano jako oporne, co stanowiło 62% badanych; tym samym 65 osób (38%) wykazało wrażliwość na działanie ASA. Wartości czasu okluzji (CEPI-CT) w grupie opornych były istotnie krótsze w stosunku do grupy wrażliwych (138 ± 44 vs 297 ± 9s, p<0,001). W grupach wyłonionych według pomiaru PFA-100 agregacja oceniana wielkością pola pod krzywą (ASPItest) dała w grupie opornych istotnie wyższe wartości pola pod krzywą Tabela II Pomiar agregacji metodą PFA-100 u pacjentów leczonych ASA w dawce 150mg/d dla uzyskania podziału na opornych i wrażliwych na ASA; porównanie wyników w wyłonionych grupach. Parametr oporni (n=107) wrażliwi (n=65) p < CEPI-CT (s) 138 ± ± 9 0,001 vwf (%) 195 ± ± 84 0,002 ASPI test (AU x min) 360 ± ± 138 0,001 TXB 2 (pg/ml) 554 ± ± 296 NS w stosunku do grupy wrażliwych (360 ± 166 vs 264 ± 138 AUxmin, p< 0,001). Ponadto stwierdzono istotnie wyższą aktywność vwf w grupie opornych w stosunku do wrażliwych (195 ± 91 vs 150 ± 84 %, p<0,002). Natomiast co do stężenia TXB2 nie zanotowano istotnych różnic pomiędzy rozważanymi tu grupami. Na uwagę zasługuje stwierdzenie istotnej ujemnej korelacji pomiędzy CEPI-CT a vwf (r = - 0,286; p<0,001) po leczeniu dawką 150 mg/d (rycina 2). Wyniki badań zamieszczone w tabeli III przedstawiają występowanie aspirynooporności laboratoryjnej na ASA wg pomiaru Multiplate. Po leczeniu ASA w dawce 150 mg/d 57 osób za- Rycina 2. Korelacja wyników agregacji mierzonej metodą przepływową (PFA- 100) i poziomu czynnika von Willebranda (vwf) po leczeniu aspiryną (dawka 150 mg/d) w całej grupie badanej. kwalifikowano jako oporne (43% badanych); 77 osób (57%) wykazało wrażliwość na działanie ASA. Wartości agregacji, wyrażone wielkością pola pod krzywą (ASPI test), w grupie opornych były istotnie wyższe w stosunku do grupy wrażliwych (470 ± 149 vs 222 ± 59 AU x min, p<0,001). W tym podziale (wg Multiplate) wartości CEPI-CT w grupie opornych były istotnie krótsze w stosunku do grupy wrażliwych (147 ± 70 vs 220 ± 81s, p<0,001); pozostałe mierzone parametry (TXB2, vwf) nie różniły się istotnie. Spośród 107 osób opornych na ASA po dawce 150 mg/d, u większości chorych 158

5 M. Jastrzębska i inni Tabela III Pomiar agregacji metodą Multiplate u pacjentów leczonych ASA w dawce 150mg/d dla uzyskania podziału na opornych i wrażliwych na ASA; porównanie wyników w wyłonionych grupach. Parametr oporni (n=57) wrażliwi (n=77) p < ASPI test (AU x min) 470 ± ± 59 0,001 TXB 2 (pg/ml) 574 ± ± 277 NS CEPI-CT (s) 147 ± ± 81 0,001 vwf (%) 182 ± ± 85 NS Tabela V Pomiar agregacji Multiplate u pacjentów leczonych ASA w dawce 300mg/d dla uzyskania podziału na nadal opornych na ASA i z przełamaną opornością ; porównanie wyników w wyłonionych grupach. Parametr nadal oporni (n=33) z przełamaną opornością (n=26) p < ASPI test (AU x min) 438 ± ± 58 0,001 TXB 2 (pg/ml) 477 ± ± 222 NS CEPI-CT (s) 172 ± ± 85 NS vwf (%) 186 ± ± 66 NS (75 osób) wdrożono leczenie ASA dawką 300 mg/d (próba przełamania oporności ) tabela IV. Według pomiaru PFA- 100 tylko u 17 chorych wyniki wskazują na przełamanie oporności (23%); pozostałe 58 osób (77%) było nadal opornych. Wartości czasu okluzji były podobne jak przy dawce 150 mg/d i wynosiły: w grupie nadal opornych 140 ± 42s, a w grupie z przełamaną opornością 294 ± 12s (p<0,001). Nie stwierdzono natomiast istotnych statystycznie różnic co do pozostałych parametrów. Wyniki badań wg Multiplate zamieszczone w tabeli V wskazują na przełamanie oporności dawką 300 mg/d u 26 chorych (44%); nadal opornych pozostało 33 pacjentów Tabela IV Pomiar agregacji metodą PFA-100 u pacjentów leczonych ASA w dawce 300mg/d dla uzyskania podziału na nadal opornych na ASA i z przełamaną opornością ; porównanie wyników w wyłonionych grupach. Parametr nadal oporni (n=58) z przełamaną opornością (n=17) CEPI-CT (s) 140 ± ± 12 <0,001 vwf (%) 190 ± ± 73 NS ASPI test (AU x min) 362 ± ± 139 NS TXB 2 (pg/ml) 520 ± ± 227 NS p (56%). Wartości agregacji wyrażone wielkością pola pod krzywą (ASPI test) były bardzo podobne jak przy dawce 150 mg/d i wynosiły: w grupie nadal opornych 438 ± 118 AUxmin, w grupie z przełamaną opornością 225 ± 58 AUxmin (p<0,001). Nie stwierdzono istotnych różnic pomiędzy grupami nadal opornych i z przełamaną opornością, wg pomiaru Multiplate, co do wartości CEPI-CT a także parametrów biochemicznych (vwf, TXB2). Porównanie występowania oporności na ASA, wykrywanej obydwoma metodami (PFA-100 vs Multiplate), przedstawiono na rycinie 3 (A po dawce 150 mg/d, B po dawce 300 mg/d). Jak obrazuje rycina 3A, oporność na ASA po dawce 150 mg/d wykrywana była równocześnie na obydwu aparatach u 36,5 % chorych, natomiast wrażliwość u 27,5 %, co daje łączną zgodność wyników w 64%. Pozostałe 36% to Rycina 3. Porównanie występowania aspirynooporności po dawce ASA 150 mg/d (A) oraz po dawce ASA 300 mg/d (B), wykrywanej metodą agregometrii przepływowej (PFA-100) i impedancyjnej (Multiplate) u chorych w ostrej fazie udaru mózgu. Objaśnienia (Rycina 3A): Wykrywanie oporności na ASA wg PFA- 100: 66,5%; wykrywanie oporności wg Multiplate: 42,5%; p< 0,001. Test korelacji rang Spearmana : R=0,356; p<0,001 (zgodność obu metod) Objaśnienia (Rycina 3B): Wykrywanie oporności na ASA wg PFA- 100: 73,0%; wykrywanie oporności wg Multiplate: 56,0%; p=0,047. Test korelacji rang Spearmana: R=0,106; p=0,439 (brak zgodności obu metod) 159

6 Laboratoryjna ocena odpowiedzi na leczenie kwasem acetylosalicylowym (ASA) u pacjentów w ostrej fazie udaru... wyniki niezgodne, wskazujące na występowanie oporności wg PFA-100, a wrażliwości wg Multiplate (30,0 %), i odwrotnie wrażliwości wg PFA-100, a oporności wg Multiplate (6%). Metoda PFA-100 w tym przypadku istotnie częściej wykrywała oporność na ASA (66,5%) niż metoda Multiplate a (42,5%); p<0,001. Wyniki analizy porównawczej obu metod definiowania laboratoryjnej oporności na ASA okazały się znamienne statystycznie (R=0,356; p<0,001) i wskazują na umiarkowaną zgodność obu metod. Innym istotnym aspektem dotyczącym powiązania tych dwóch odmiennych metodologii było występowanie ujemnej korelacji pomiędzy czasem okluzji (CEPI-CT w PFA-100) a wielkością agregacji wyrażonej polem pod krzywą (ASPItest w Multiplate) w grupie wszystkich osób leczonych ASA w dawce 150 mg/d (r = - 0,343; p<0,001) (rycina 4). Rycina 3B obrazuje to samo zestawienie porównawcze, ale po dawce 300 mg/d. Oporność na ASA wykrywana była równocześnie na obydwu aparatach u 43% chorych, natomiast wrażliwość tylko u 14%, co dawało łączną zgodność wyników w 57%. Pozostałe 43% to wyniki niezgodne, wskazujące na występowanie oporności Rycina 5. Porównanie występowania aspirynooporności po dawce ASA 150 mg/d, wykrywanej metodą agregometrii przepływowej (PFA-100, punkt odcięcia <150 s) i impedancyjnej (Multiplate) u chorych w ostrej fazie udaru mózgu. Objaśnienia: Wykrywanie oporności na ASA wg PFA-100: 46,0%; wykrywanie oporności wg Multiplate: 42,0%; p=ns. Test korelacji rang Spearmana: R=0,426; p<0,001 (dobra zgodność obu metod) wyników w 72%. Pozostałe 28% to wyników niezgodne, czyli występowanie oporności wg PFA-100 a wrażliwości wg Multiplate (16,0 %), i odwrotnie wrażliwości wg PFA-100 a oporności wg Multiplate (12%). Metoda PFA-100 i metoda Multiplate w tym przypadku z podobną częstością ujawniały oporność na ASA (46% vs 42%; p=ns). Wyniki analizy porównawczej obu metod definiowania laboratoryjnej oporności na ASA okazały się znamienne statystycznie (R=0,426, p<0,001) i wskazują na ich dobrą zgodność. Rycina 4. Korelacja wyników agregacji mierzonej metodą przepływową (PFA- 100) i impedancyjną (Multiplate) po leczeniu aspiryną (dawka 150 mg/d) w całej grupie badanej. w PFA-100 a wrażliwości w Multiplate (30 %), i odwrotnie wrażliwości w PFA-100 a oporności w Multiplate (13%). Metoda PFA-100 w tym przypadku też istotnie częściej wykrywała oporność na ASA (73%) niż metoda Multiplate a (56%); p=0,047. Porównanie statystyczne obu metod nie wykazało już ich zgodności (R=0,106; p = 0,439). Nie wykryto też, dla tej dawki ASA, istotnej korelacji pomiędzy parametrami funkcji płytek mierzonymi rozważanymi tu metodami. Rycina 5 prezentuje wyniki badań porównawczych dotyczących stwierdzenia aspirynooporności po dawce 150 mg/d, ale po arbitralnym przesunięciu punktu odcięcia dla CEPI- CT z 250s do 150s, przy niezmienionym cut off dla ASPItest tj. 300 AUxmin. Oporność, wykryta równocześnie na obydwu aparatach, występowała u 30 % chorych, natomiast wrażliwość u 42,0%, co dawało łączną zgodność Dyskusja Każda z metod, zastosowanych przez nas dla oceny funkcji płytek krwi po leczeniu kwasem acetylosalicylowym, pozwoliła na wyodrębnienie dwóch grup pacjentów: opornych i wrażliwych na działanie ASA. Dodatkowo, w wyłonionych grupach można było oszacować stężenie wybranych czynników biochemicznych (vwf i TXB2), które mogą interferować z parametrami funkcji płytek, mierzonymi tymi dwoma odmiennymi metodami. Jak opisano wcześniej, w naszych badaniach parametrami funkcji płytek krwi był, dla pomiaru PFA-100, czas okluzji wyrażony w sekundach (s), jako miara zdolności adhezyjno-agregacyjnych płytek pod wpływem kolagenu i epinefryny (CEPI-CT), oraz, dla pomiaru Multiplate, wartość agregacji wyrażona wielkością pola pod krzywą (AUxmin), jako miara zdolności agregacyjnych płytek krwi pod wpływem kwasu arachidonowego (ASPI test). W naszych badaniach obserwowaliśmy, podobnie jak inni badacze [11, 18, 20], znamienną ujemną korelację pomiędzy vwf a CEPI -CT. W grupie chorych opornych na ASA w dawce 150 mg/d (62% badanych miało wartości CT < 250s) aktywność vwf była istotnie wyższa w stosunku do grupy osób wrażliwych na ASA. Sugeruje to, że wartości CEPI-CT w pewnej mierze 160

7 M. Jastrzębska i inni uwarunkowane są aktywnością vwf. Powyższą obserwację potwierdzają także wyniki innych badań, w których wykazano, że pacjenci z niepełną odpowiedzią na ASA, mierzoną metodą PFA-100, cechują się wyższą aktywnością kofaktorową vwf [7,14,17,21]. Co więcej, wykazano też, że niepełna odpowiedź płytek krwi na leczenie ASA, wg pomiaru PFA-100 przy cut off <300s, cechowała pacjentów z wyjściowymi podwyższonymi wartościami vwf: później zanotowano u nich 3-krotnie wyższe ryzyko ponownych incydentów wieńcowych [14]. Na podstawie opisanych tu badań można przyjąć, iż aktywność kofaktorowa czynnika von Willebranda w istotny sposób warunkuje zdolność adhezyjno-agregacyjną płytek krwi po leczeniu ASA, co uwzględnia wynik pomiaru CT, uzyskany na aparacie PFA-100. Nie udało się natomiast w naszych badaniach powiązać CEPI-CT i stężenia TXB2 w osoczu. Wydaje się to dość oczywiste pomiar funkcji płytek wg PFA-100 jest tylko pośrednią metodą oceny aktywności cyklooksygenazy płytkowej, a zatem i stężenia TXB2; potwierdzają to też inni badacze [5, 13, 32]. Biorąc pod uwagę metodologię pomiaru agregacji impedancyjnej, gdzie do agregacji płytek użyto kwasu arachidonowego jako agonisty, zakładano występowanie powiązań pomiędzy wielkością pola pod krzywą (ASPItest) a stężeniem metabolitu kwasu arachidonowego, jakim jest tromboksan B2; wbrew oczekiwaniom w naszych badaniach nie znaleziono takich powiązań. Okazało się, że w grupie opornych na ASA w dawce 150 mg/d (43% badanych miało wartości AUxmin > 300) stężenie TXB2 w osoczu nie było podwyższone w stosunku do grupy wrażliwych. Niektórzy badacze podkreślają, że zjawiska oporności aspirynowej, wykrywanej pomiarem agregacji indukowanej kwasem arachidonowym, nie można wyjaśnić poprzez aktywność cyklooksygenazy płytkowej i osoczowe stężenie TXB2, bowiem istnieją inne drogi sygnałowe aktywacji płytek podczas leczenia ASA [26]. Oznacza to, że podczas leczenia ASA można wyodrębnić grupy osób opornych i wrażliwych w pomiarze Multiplate, nieróżniących się stężeniem TXB2. W badaniach naszych nie wykryto również zależności korelacyjnej pomiędzy wartościami pola pod krzywą (ASPItest) w pomiarze Multiplate i stężeniem TXB2 w osoczu. Tu wyjaśnieniem może być fakt, iż agregometria jest badaniem ex vivo, mierzącym głównie płytkową aktywność COX-1, natomiast oznaczanie TXB2 w osoczu badaniem in vivo. Zatem brak spadku TXB2 w grupie osób wrażliwych na ASA, wg pomiaru Multiplate, w stosunku do opornych, mógłby wynikać z pozapłytkowej produkcji TXB2 (komórki śródbłonka, monocyty, makrofagi) lub z nieenzymatycznych szlaków aktywności COX-1, niewrażliwych na stosowanie ASA, co potwierdzają także wyniki innych badań [10, 13, 15, 26]. Dlatego wydaje się, że oznaczanie TXB2 w osoczu nie jest optymalnym wskaźnikiem tzw. resztkowej syntezy TXB2 po zablokowaniu COX-1 w płytkach przez kwas acetylosalicylowy. W naszej pracy interesujące są wyniki badań związane ze zjawiskiem przełamywania oporności 2-krotnie wyższą dawką ASA (300 mg/d). Zastosowanie tej dawki tylko w niewielkim stopniu spowodowało uwrażliwienie płytek na działanie ASA: w metodzie PFA % leczonych, w wyższym w metodzie Multiplate 44% leczonych. Przełożyło się to na wyższe rozpowszechnienie oporności aspirynowej (77% badanych wg PFA-100 oraz 56% badanych wg Multiplate), co znajduje potwierdzenie w innych tego typu doniesieniach [7, 23]. Niektórzy badacze łączą częstsze wykrywanie oporności po dawce 300 mg/d z homozygotyczną odmianą genotypową Leu-33 (P1 A1 ) w obrębie podjednostki GPIIIa płytkowego receptora integrynowego [23]. Istnieją doniesienia, że mimo stosowania wyższych dawek ASA nadal zachodzi generowanie TXB2 (wzrost wydalania z moczem metabolitu 11-dehydro TXB2), co może skutkować nasilaniem się zjawiska oporności i zwiększonym ryzykiem epizodów sercowo-naczyniowych [9]. Postuluje się także istnienie nowego patomechanizmu oporności aspirynowej ujawniającego się w miarę trwania leczenia i stosowania wyższej dawki ASA na drodze niezależnej od cyklooksygenazy, powiązanego z reaktywacją płytek krwi zależną od ADP uwalnianego z ziarnistości gęstych płytek [13]. Dlatego też brak efektywnej odpowiedzi na leczenie ASA w niższych dawkach powinno skłaniać do zmiany leczenia antypłytkowego: na tienopirydyny zamiast wyższych dawek ASA [2, 9, 19]. Sugeruje się, by wyższe dawki ASA (>150 mg/d) stosować głównie w populacji cukrzyków, w której częstość wykrywania aspirynooporności jest relatywnie najwyższa [8]. Są też doniesienia wyraźnie wskazujące na lepszą odpowiedź płytek po wyższej dawce ASA. Wykazano tam, że odsetek chorych opornych na ASA, wśród leczonych dawką 325 mg/d, był dokładnie o połowę mniejszy (28%) niż leczonych dawką 81 mg/d (56%), co może mieć korzystny wpływ na rokowanie [2]. Trudno dokładnie oszacować częstość występowania dawkozależnej oporności na ASA ze względu na brak ścisłych kryteriów i ustalonej metodyki jej diagnozowania (wykrywania). W naszych badaniach próbowano to określić dokonując statystycznych porównań dwóch całkowicie odmiennych metodologii (PFA-100 vs Multiplate). Jak się okazało, istotnie częściej wykrywano aspirynooporność w metodzie agregacji przepływowej (PFA-100) niż impedancyjnej (Multiplate) i dotyczyło to zarówno dawki 150 mg/d (66,5% vs 42,5%) jak i dawki 300 mg/d (73% vs. 56%). Natomiast, co do porównania zgodności obu metod (sumaryczna liczba wyników opornych i wrażliwych ) występowała ona tylko dla dawki 150 mg/d (64% zgodnych wyników); co nie oznacza, że zgodność ta jest zadawalająca dla lekarza klinicysty. Niezgodność obu metod dla dawki 300 mg/d przełożyła się w naszych badaniach również na brak korelacji pomiędzy parametrami funkcji płytek mierzonymi tymi dwoma metodami (CEPI-CT: ASPItest), gdzie korelacja ta występowała dla dawki 150 mg/d. Warto podkreślić, iż cytowane w piśmiennictwie wyniki badań dotyczące metodologii wykrywania aspirynooporności na ogół nie są zgodne. Uwarunkowane jest to głównie różnymi przyjętymi punktami odcięcia (cut off) i wynikającymi z tego różnicami w czułości i swoistości diagnostycznej różnych testów laboratoryjnych [2, 5, 6, 32]. 161

8 Laboratoryjna ocena odpowiedzi na leczenie kwasem acetylosalicylowym (ASA) u pacjentów w ostrej fazie udaru... W naszej opinii niezgodność obu tych metod, przy dawce ASA 300 mg/d, przy zachowaniu tych samych punktów odcięcia jak dla dawki 150 mg/d, sugeruje rozejście się tych metod. Wstępna analiza wyników po leczeniu dawką 300 mg/d wykazała pojawienie się subpopulacji pacjentów z paradoksalnie skróconym czasem CEPI-CT, co mogło rzutować na niezgodność metody agregometrii przepływowej (PFA-100) z impedancyjną (Multiplate); jednak wymaga to dalszych badań. Wydaje się, że jest to dodatkowy argument przemawiający za rezygnacją z wyższych dawek ASA na korzyść wdrożenia leczenia innymi lekami antypłytkowym, o czym wcześniej już wspominano. W naszych badaniach najlepszą zgodność wyników, bo aż dla 72% badanych, oraz bardzo zbliżoną częstość wykrywania aspirynooporności tymi dwoma metodami (46% badanych wg PFA-100 i 42% badanych wg Multiplate) uzyskano przy obniżeniu punktu cut off dla PFA-100 z 250s do 150s. Przyjęcie punktu cut off < 150s dla PFA-100 spowodowało wzrost czułości diagnostycznej w zakresie wykrywania wrażliwości na działanie ASA. Tym samym zmniejszyła się częstość wykrywania oporności w pomiarze PFA-100, która omal zrównała się z częstością wykrywaną w pomiarze Multiplate. Nasze wyniki, dotyczące podobnej częstości wykrywania oporności na ASA metodą agegometrii przepływowej (przy cut off <150 s) i impedancyjnej są zgodne z wynikami innych badań, gdzie częstość ta mierzona tymi samymi lub podobnymi metodami wynosiła 36%, a dotyczyła również pacjentów z ostrym udarem niedokrwiennym mózgu leczonych ASA w dawce 150 mg/d [29]. Warto podkreślić, iż dla laboratoryjnej oceny odpowiedzi na leczenie antypłytkowe różnymi metodami agregometrii kluczowe znaczenie ma przyjęcie właściwego punktu odcięcia. W naszym przypadku obniżenie cut off dla jednej z metod znacząco zmniejszyło odsetek niezgodnych kwalifikacji. W innych tego typu badaniach kluczowe są obserwacje prospektywne chorych, w kierunku oceny ryzyka ponownych incydentów mózgowych czy wieńcowych [9, 14, 29, 30]. Dopiero takie obserwacje, mające na celu wykazanie zgodności oporności laboratoryjnej z opornością kliniczną, są sposobem dla ustalenia kryteriów poprawności laboratoryjnej kontroli leczenia kwasem acetylosalicylowym. Podsumowanie i wnioski 1. Częstość aspirynooporności laboratoryjnej w ostrym udarze niedokrwiennym mózgu, definiowana czasem okluzji (CEPI-CT) < 250s w pomiarze PFA-100 i wartością pola pod krzywą (ASPItest - AU x min) > 300 w pomiarze Multiplate, tylko w niewielkim stopniu zależna jest od dawki kwasu acetylosalicylowego (ASA). Brak wyraźnego przełamania oporności po dawce 150 mg/d, stwierdzany w obydwu metodach, dawką 2-krotnie wyższą (300 mg/d) powinien skłaniać do zmiany leku na tienopirydyny. 2. Wykrycie aspirynooporności laboratoryjnej po leczeniu dawką 150 mg/d, wg PFA-100, w istotny sposób uwarunkowane jest aktywnością kofaktorową czynnika von Willebranda (vwf R:Cof), natomiast pomiar wg Multiplate nie wykazuje związku z osoczowym stężeniem tromboksanu B2 (TXB2). Wynik otrzymany metodą agregometrii przepływowej (PFA-100) powinien być skorygowany poprzez oznaczenie aktywności vwf R:Cof, w celu uzyskania efektywnej oceny klinicznej. 3. Większa częstość wykrywania aspirynooporności metodą agregometrii przepływowej (66,5 % wg PFA-100), przy cut off < 250s, niż impedancyjnej (42,5% wg Multiplate), przy cut off > 300 AUxmin, wynika z niższej czułości diagnostycznej pomiaru PFA-100 dla wykrywania efektywnej odpowiedzi na działanie kwasu acetylosalicylowego. Zwiększenie czułości diagnostycznej, poprzez obniżenie wartości cut off z 250 do 150 s, pozwoliło na wykrywanie zjawiska aspirynooporności laboratoryjnej z podobną częstością w obydwu metodach agregometrii (46% wg PFA-100; 42% wg Multiplate). Piśmiennictwo 1. Antithrombotic Trialists Collaboration. Collaborative meta-analysis of randomised trials of antiplatelets therapy for prevention of death, myocardial infarction, and stroke in high risk patients. BMJ, 2002; 324: Alberts MJ, Bergman DL, Molner E i wsp. Antiplatelet effect of aspirin in patients with cerebrovascular disease. Stroke 2004; 35: Anfossi G, Russo I, Trovati M. Platelet dysfunction in central obesity. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2009; 19: Antiplatelet Trialists Collaboration. Collaborative overview of randomised trials of antiplatelet therapy, I:prevention of death, myocardial infarction, and stroke by prolonged antiplatelet therapy in various categories of patients. BMJ 1994; 308: Chakroun T, Addad F, Abderazek F i wsp. Screening for aspirin resistance in stable coronary artery patients by tree different tests. Thromb Res 2007; 121: Chang YW, Liao ChH, Day YJ. Platelet function analyzer (PFA- 100 ) offers higher sensitivity and specificity than thromboelastography (TEG ) in detection of platelet dysfunction. Acta Anaestesiol Taiwan 2009; 47: Crescente M, Di Castelnuovo A, Lacoviello L i wsp. Response variability to aspirin as assessed by the platelet function analyzer (PFA)-100. Thromb Haemost 2008; 99: DiChiara J, Bliden KP, Tantry US i wsp. The effect of aspirin dosing on platelet function in diabetic and nondiabetic patients. Diabetes 2007; 56: Eikelboom JW, Hankey GJ, Thom J i wsp. Incomplete inhibition of thromboxane biosynthesis by acetylsalicylic acid. Circulation 2008; 118: Faraday N, Yanek LR, Mathias R i wsp. Heritability of platelet responsiveness to aspirin in activation pathways directly and indirectly related to cyclooxygenase-1. Circulation 2007; 115: Favaloro EJ. The utility of the PFA-100 in identification of von Willebrand disease: a concise review. Semin Thromb Hemost 2006; 32: Frelinger AL, Furman MI, Linden MD i wsp. Residual arachidonic acid induced platelet activation via an adenosine diphosphate dependent but cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2 independent pathway. A 700 Patient Study of Aspirin Resistance. Circulation 2006; 113: Frelinger AL, Li Y, Linden MD i wsp. Association of cyclooxygenase-1 dependent and independent platelet function assays with adverse clinical outcomes in aspirin treated patients presenting for cardiac catheterization. Circulation 2009; 120: Fuchs I, Frossard M, Spiel a i wsp. Platelet function in patients 162

9 M. Jastrzębska i inni with acute coronary syndrome (ACS) predicts reccurrent ACS. J Thromb Haemost 2006; 4: Guthikondal S, Mangalpally K, Vaduganathan M i wsp. Increased platelet sensitivity among individuals with aspirin resistance platelet aggregation to submaximal concentration of arachidonic acid predicts response to antiplatelet therapy. Thromb Haemost 2008; 100: Hankey GJ, Eikelboom JW. Aspirin resistance [Review]. Lancet 2006; 367: Harrison P, Keeling D.: Platelet hyperactivity and risk of recurrent thrombosis. J Thromb Haemost 2006; 4: Hayward CP, Harrison P, Cattaneo M i wsp. Platelet function analyzer (PFA-100) closure time in the evaluation of platelet disorders and platelet function. J Thromb Haemost 2006; 4: Ivandic BT, Giannitsis E, Schlick P i wsp. Determination of aspirin responsiveness by use of whole blood platelet aggregometry. Clin Chem 2007; 53: Jilma B.: Platelet function analyzer (PFA-100): a tool to quantify congenital or acquired platelet dysfunction. J Lab Clin Med 2001; 138: Kilanowska J, Favaloro EJ, Lippi G. Aspirin responsiveness, non-responsiveness or resistance: a putative role for von Willebrand factor? Blood Coagul Fibrinolysis 2008; 19: Kuliczkowski W, Witkowski A, Poloński L i wsp. Interindividual variability in the response to oral antiplatelet drugs: a position paper of the Working Group on antiplatelet drugs resistance appointed by the Section of Cardiovascular Interventions of the Polish Cardiac Society, endorsed by the Working Group on Thrombosis of the European Society of Cardiology. Eur Heart J 2009; 30: Macchi L, Christiaens L, Brabant S i wsp. Resistance in vitro to low-dose aspirin is associated with platelet P1 A1 (GPIIIa) polymorphism but not with C807T (GPIa/IIa) and C-5T Kozak (GPIbα) polymorphism. J Am Coll Cardiol 2003; 42: Markuszewski L, Rosiak M, Golański J i wsp. Reduced blood platelet sensitivity to aspirin in coronary artery disease: are dyslipidaemia and inflammatory states possibile factors predisposing to suboptimal platelet response to aspirin? BCPT 2006; 98: Mason PJ, Freedman JE, Jacobs AK. Aspirin resistance: current concepts [Review]. Rev Cardiovasc Med 2004; 5: Ohmori T, Yatomi Y, Nonaka Y i wsp. Aspirin resistance detected with aggregometry cannot be explained by cyclooxygenase activity: involvement of other signaling pathway (s) in cardiovascular events of aspirin-treated patients. J Thromb Haemost 2006; 4: Patrono C, Baigent C, Hirsh J i wsp. Antiplatelet drugs: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines (8 th Edition). Chest 2008; 133: 199S-233S. 28. Pedersen SB, Grove EL, Nielsen HL i wsp. Evaluation of aspirin response by Multiplate whole blood aggregometry and light transmission aggregometry. Platelets 2009; 20: Sobol AB, Mochecka A, Selmaj K, Loba J. Is the relationship between aspirin responsiveness and clinical aspects of ischemic stroke? Adv Clin Exp Med 2009; 18: Tran HA, Anand SS, Hankey GJ i wsp. Aspirin resistance. Thromb Res 2007; 120: Wuillemin W, Gasser KM, Zeerleder SS i wsp. Evaluation of a platelet function analyzer (PFA-100) in patients with a bleeding tendency. Swiss Med Wkly 2002; 132: Żytkiewicz M, Giełwanowska L, Wojtasińska E i wsp. Resistance to acetylsalicylic acid in patients after ischemic stroke. Pol Arch Med Wewn 2008; 118; Praca wykonana w ramach grantu MNiSW : N N Adres do korespondencji: Maria Jastrzębska Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej i Medycyny Molekularnej Szczecin, Al. Powstańców Wlkp. 72 tel. (91) fax (91) lub mariajas@pum.edu.pl Zaakceptowano do publikacji: