Spis treści Neuroendokrynologia doświadczalna i jej implikacje kliniczne historia i perspektywy

Transkrypt

1

2

3 3 Spis treści Marek Pawlikowski... 5 Neuroendokrynologia doświadczalna i jej implikacje kliniczne historia i perspektywy Experimental neuroendocrinology and its clinical implications history and perspectives Paweł Wojtkiewicz, Agnieszka Stępień, Jan Chojnacki Zmiany czynności mioelektrycznej żołądka u osób z depresją i objawami dyspeptycznymi Gastric myoelectrical abnormalities in depressive patients with dyspeptic symptoms Paulina Młudzik, Jacek Pietrzak, Lias Saed, Damian Wodziński, Ida Franiak Pietryga, Marek Mirowski Elektroforetyczna identyfikacja proteinaz cysteinowych w surowicach pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (PBL) z wykorzystaniem biotynylowanego jodoacetamidu Electrophoretic method of cysteine proteinase identification in the sera of patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) based on biotinylated iodoacetamide Andrzej Kierstan, Zbigniew Jabłonowski, Marek Sosnowski Wyniki leczenia operacyjnego raka nerki w I Klinice Urologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi w latach Results of surgical treatment of kidney cancer in the Department of Urology, Medical University of Lodz in Kinga Rośniak Bąk, Marek Łobos Przydatność kliniczna i diagnostyczna oznaczeń D dimeru w różnych stanach chorobowych Clinical and diagnostic usefulness of D dimer measurements in various illnesses

4

5 Folia Medica Lodziensia, 2016, 43/1:5 16 Neuroendokrynologia doświadczalna i jej implikacje kliniczne historia i perspektywy Experimental neuroendocrinology and its clinical implications history and perspectives MAREK PAWLIKOWSKI Zakład Immunoendokrynologii, Katedra Endokrynologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Streszczenie Neuroendokrynologia jest interdyscyplinarną dziedziną wiedzy biomedycznej, której obszarem działania są strukturalne i czynnościowe związki między dwoma układami: nerwowym i dokrewnym. Wyróżniamy neuroendokrynologię doświadczalną oraz jej implikacje kliniczne. Za pioniera neuroendokrynologii powszechnie uważany jest Ernest Scharrer, który już w 1928 roku opisał cytologiczne oznaki wydzielania w jądrach podwzgórza minoga i zjawisko to nazwał neurosekrecją. Dalsze badania prowadzone przez Scharrera wspólnie z jego żoną Bertą, a następnie z Wolfgangiem Bargmannem, pozwoliły na opisanie neurosekrecji u różnych zwierząt bezkręgowych i kręgowców łącznie z człowiekiem. Kamieniem milowym było wykazanie, że neurosekrecja w jądrach nadwzrokowych i przykomorowych podwzgórza wiąże się z syntezą wazopresyny i oksytocyny (W. Bargmann i E. Scharrer). Dalszym kamieniem milowym było wykazanie przez Geoffreya Harrisa, że podwzgórze steruje czynnością wydzielniczą przysadki za pośrednictwem czynników humoralnych docierających do przedniego płata poprzez połączenia naczyniowe zwane przysadkowym układem wrotnym. Zapoczątkowało to liczne badania zmierzające do izolacji wspomnianych czynników humoralnych z podwzgórza i określenie ich struktury. Ustalenie budowy chemicznej pierwszego podwzgórzowego czynnika uwalniającego TRH (tyreoliberyna ang. thyrotropin releasing hormone) powiodło się w 1969 roku zespołom Andrew Schally ego i Rogera Guillemina, za co otrzymali w 1977 nagrodę Nobla. W kolejnych latach zidentyfikowano wiele dalszych neurohormonów podwzgórzowych. Ustalenie ich struktury i synteza Adres do korespondencji: prof. dr hab. n. med. Marek Pawlikowski, Zakład Immunoendokrynologii, Katedra Endokrynologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi; ul. Sterlinga 3; Łódź; e mail: marek.pawlikowski@umed.lodz.pl

6 6 Neuroendokrynologia doświadczalna i jej implikacje kliniczne historia i perspektywy pozwoliło na zbadanie właściwości, a także rozprzestrzenienia neurohormonów podwzgórzowych w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym oraz w innych obszarach. Implikacje kliniczne badań z zakresu doświadczalnej neuroendokrynologii są oczywiste. Postępy neuroendokrynologii zmieniły podejście diagnostyczne endokrynologów klinicystów do chorób przysadki, wskazując na możliwość ich podwzgórzowych przyczyn. Po wtóre, neurohormony podwzgórzowe i ich analogi znalazły szerokie zastosowanie w testach diagnostycznych i terapii, m.in. w leczeniu niektórych nowotworów. Obecnie jest rozważanych szereg nowych perspektyw klinicznego zastosowania neurohormonów i ich analogów. Słowa kluczowe: neurohormony podwzgórzowe, historia odkrycia, zastosowanie kliniczne. Abstract Neuroendocrinology is an interdisciplinary field of the biomedical science exploring structural and functional relation between two systems: nervous and endocrine. We distinguish experimental neuroendocrinology and its clinical implications (clinical neuroendocrinology). A German scientist Ernst Scharrer is considered the pioneer of neuroendocrinology. As early as in 1928 he revealed the cytological features of secretion in hypothalamic nuclei of a fish (minogue) and called the above phenomenon neurosecretion. Scharrer himself attributed the role of the pioneer of neuroendocrinology to a Polish scientist Stefan Kopeć, who in the twenties of 20th century discovered the hormonal function of the brain in insects. The further studies of Scharrer together with his wife Berta and later with Wolfgang Bargmann led to the description of neurosecretion in numerous invertebrate and vertebrate animals including a man. The milestone was the finding that the neurosecretion in supraoptic and paraventricular hypothalamic nuclei is connected with vasopressin and oxytocin synthesis (W. Bargmann and E. Scharrer,). The further milestone in the development of neuroendocrinology was the discovery of Geoffrey Harris that the hypothalamus governs the secretory function of the anterior pituitary by means of humoral factors reaching the anterior lobe via vascular connections called the hypophyseal portal system. The numerous studies of hypothalamic neurohormones leading to the isolation and recognition of their structure were initiated. The recognition of amino acid structure of

7 Marek Pawlikowski 7 the first hypothalamic releasing factor (hormone) TRH succeeded in 1969 by the teams of Andrew Schally and Roger Guillemin, who were awarded the Nobel prize in In the next years several other hypothalamic neurohormones were identified. The recognition of their structure and synthesis allowed to search their properties and their distribution in the central and peripheral nervous systems, diffuse neuroendocrine cells and in adrenal medulla. The clinical implications of experimental neuroendocrinology are obvious and numerous. Firstly, the approach of clinical endocrinologists to diseases of the pituitary gland was changed; the possibility of hypothalamic disturbances as the primary cause of pituitary disease were taken into consideration. Secondly, numerous hypothalamic neurohormones and their analogs found the application in diagnostic tests and therapy, among others, the therapy of different tumors. At present, several new perspectives of the therapeutic application of neurohormones and their analogs are under consideration. Key words: hypothalamic neurohormones, history of discovery, clinical application. Wprowadzenie Neuroendokrynologia jest interdyscyplinarną dziedziną wiedzy biomedycznej, której obszarem działania są strukturalne i czynnościowe związki między dwoma układami: nerwowym i hormonalnym (wewnątrzwydzielniczym). Wyróżniamy neuroendokrynologię doświadczalną oraz jej implikacje kliniczne (neuroendokrynologię kliniczną). Za pioniera neuroendokrynologii powszechnie uważany jest niemiecki uczony (który wyemigrował do Stanów Zjednoczonych) Ernest Scharrer. Już w 1928 roku opisał on cytologiczne oznaki wydzielania w jądrach podwzgórza minoga i zjawisko to nazwał neurosekrecją [1]. Sam Scharrer przypisywał rolę prekursora neuroendokrynologii polskiemu uczonemu Stefanowi Kopciowi ( ; zginął rozstrzelany przez niemieckich nazistów w Palmirach), który w latach dwudziestych XX wieku odkrył hormonalną czynność mózgu u owadów. Dalsze badania prowadzone przez Scharrera wspólnie z jego żoną Bertą, a następnie z Wolfgangiem Bargmannem, pozwoliły na opisanie neurosekrecji u różnych zwierząt bezkręgowych i kręgowców łącznie

8 8 Neuroendokrynologia doświadczalna i jej implikacje kliniczne historia i perspektywy z człowiekiem [2]. Ważnym kamieniem milowym było wykazanie, że neurosekrecja w jądrach nadwzrokowych i przykomorowych podwzgórza wiąże się (choć nie wyłącznie) z syntezą wazopresyny i oksytocyny (W. Bargmann i E. Scharrer) [3]. Dalszym kamieniem milowym w rozwoju neuroendokrynologii było wykazanie przez Geoffreya Harrisa w pomysłowym i dość prostym eksperymencie, że podwzgórze steruje czynnością wydzielniczą przysadki za pośrednictwem czynników humoralnych docierających do przedniego płata poprzez połączenia naczyniowe zwane przysadkowym układem wrotnym [4]. Ryc. 1. Droga od odkrycia aktywności w wyciągach podwzgórzowych do zastosowań klinicznych neurohormonów podwzgórzowych i ich analogów. Fig. 1. The way from the discovery of activity in hypothalamic extracts to clinical applications of hypothalamic neurohormones and their analogs

9 Marek Pawlikowski 9 Odkrycie neurohormonów podwzgórzowych, ich synteza oraz badania rozmieszczenia i właściwości Tok badań nad tymi substancjami, które doprowadziły do ich zastosowania klinicznego został przedstawiony na ryc. 1. Pierwszym etapem było wykrycie odpowiedniej aktywności w wyciągach podwzgórza, a następnie wyizolowanie aktywnego czynnika, ustalenie jego budowy chemicznej i synteza. W początko wej fazie tych badań swój wkład mieli m.in. Eugeniusz Domański ( ) i Kazimierz Kochman, którzy dokonali częściowego oczyszczenia czynnika uwalniającego lutropinę (LH ang. luteinizing hormone) [5]. Izolacja i ustalenie struktury aminokwasowej pierwszego podwzgórzowego czynnika (hormonu) uwalniającego tyreoliberyny (TRH) czyli czynnika uwalniającego tyreotropinę powiodło się w 1969 roku zespołom Andrew Schally ego i Rogera Guillemina [6 8], za co otrzymali w 1977 roku nagrodę Nobla. W kolejnych latach zidentyfikowano wiele dalszych neurohormonów podwzgórzowych [9 11] (patrz Tabela I). Ustalenie ich struktury chemicznej i syntezy pozwoliło na zbadanie szerokiego rozprzestrzenienia w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym, w rozproszonych komórkach neuroendokrynnych (ang. diffuse neuroendocrine cells), opisanych wcześniej przez F. Feyrtera w 1938 roku [12 14] jako układ komórek jasnych. Następnie A.G.E. Pearse opisał je pod nazwą układu APUD (ang. amine precursors uptake and decarboxylation) [15]. Tabela I. Odkrycie struktury neurohormonów podwzgórzowych. Table I. The discovery of the structure of "hypothalamic" neurohormones. Rok odkrycia Nazwa neurohormonu Skrót neurohormonu Pozycja piśmiennictwa 1969 Tyreoliberyna TRH [6] 1971 Gonadoliberyna GnRH [7, 8] 1973 Somatostatyna SST [9] 1981 Kortykoliberyna CRF/CRH [10] 1982 Somatoliberyna GHRH [11]

10 10 Neuroendokrynologia doświadczalna i jej implikacje kliniczne historia i perspektywy Wykazanie obecności neurohormonów peptydowych w obwodowym układzie nerwowym [16] potwierdziło hipotezę neurosekrecji obwodowej, sformułowaną na początku lat sześćdziesiątych minionego stulecia przez autora tego artykułu [17, 18]. Neurohormony peptydowe występują także w rdzeniu nadnerczy. Już w 1938 roku Tadeusz Pawlikowski ( ) na podstawie swoich badań histologicznych sugerował wydzielanie odmiennego od adrenaliny hormonu (hormonów) przez rdzeń nadnerczy [19, 20]. Dziś wiemy, że rdzeń nadnerczy jest źródłem wielu neuropeptydów oddziałujących na korę tego narządu, co jest głównie zasługą badań Gastona Nussdorfera, Ludwika Malendowicza i ich współpracowników [21, 22]. Dostępność syntetycznych neurohormonów peptydowych oraz ich analogów umożliwiła także zbadanie szerokiego spektrum aktywności tych substancji. Między innymi zespół, którym miałem zaszczyt kierować, badał wpływ neuropeptydów na proliferację komórkową, co pozwoliło na wykrycie stymulującego wpływu TRH [23] i hamującego wpływu somatostatyny (SST ang. somatostatin) na komórki przysadki i tarczycy [24, 25]. Prowadziliśmy także badania wpływu neuropeptydów na układ immunologiczny, które zaowocowały wykazaniem działania immunomodulacyjnego takich neurohormonów, jak SST [26], somatoliberyna (GHRH ang. growth hormone releasing hormone), kortykoliberyna (CRF ang. corticotropin releasing hormone) [27] oraz TRH [28, 29]. Inne kierunki badań w neuroendokrynologii doświadczalnej Równolegle prowadzono badania nad strukturą i działaniem neuropeptydów odmiennych niż klasyczne neurohormony podwzgórzowe takich, jak substancja P, wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP ang. vasoactive intestinal polypeptide), bombezyna i wiele innych. Do czołowych badaczy w tym zakresie w Polsce należał m.in. Władysław Traczyk ( ) [30]. Odkrycie melatoniny przez Lernera w 1958 roku [31] zapoczątkowało burzliwy rozwój badań nad szyszynką, swego czasu uważaną za narząd szczątkowy. Z polskich badaczy tego gruczołu na wymienienie zasługują zwłaszcza Michał Karasek ( ) [32] i Jan Guzek ( ) [33].

11 Marek Pawlikowski 11 Implikacje kliniczne neuroendokrynologia kliniczna Implikacje kliniczne badań z zakresu neuroendokrynologii doświadczalnej są oczywiste i liczne. Po pierwsze, postępy neuroendokrynologii doświadczalnej zmieniły podejście endokrynologów klinicystów do chorób przysadki, wskazując na możliwość ich podwzgórzowych przyczyn. Po wtóre, neurohormony podwzgórzowe i ich analogi znalazły szerokie zastosowanie w testach diagnostycznych oraz terapii różnych stanów chorobowych. Prekursorem stosowania neurohormonów podwzgórzowych w terapii był Rudolf Klimek, który stosował nieoczyszczony wyciąg z tylnego płata przysadki (tzw. tabaczkę) do leczenia zaburzeń miesiączkowania pochodzenia podwzgórzowego [34]. Tabela II. Zastosowania kliniczne neurohormonów podwzgórzowych. Table II. Clinical application of "hypothalamic" neurohormones. Neurohormon Zastosowanie kliniczne TRH GnRH CRH GHRH Test diagnostyczny dla oceny wydzielania TSH z przysadki (wykorzystywany przez wiele lat jako test diagnostyczny w nadczynności tarczycy) Test diagnostyczny do oceny wydzielania gonadotropin Leczenie niepłodności Leczenie raka prostaty (analogi) Test diagnostyczny dla oceny wydzielania ACTH z przysadki Test diagnostyczny dla oceny wydzielania GH z przysadki SST (analogi) Leczenie akromegalii i guzów neuroendokrynnych W tabeli II zestawiono główne zastosowania neurohormonów podwzgórzowych w diagnostyce i terapii. Przypomnijmy tutaj, że test z TRH był w swoim czasie podstawową próbą diagnostyczną dla rozpoznania nadczynności tarczycy, zanim został wyparty przez oznaczanie podstawowego stężenia tyreotropiny (TSH ang. thyroid stimulating hormone) za pomocą superczułych metod. Obecnie długo działające analogi SST są rutynowo stosowane w leczeniu akromegalii, jako uzupełnienie lub nawet alternatywa leczenia chirurgicznego. Są one także wykorzystywane w leczeniu guzów neuroendokrynnych. Szczególne

12 12 Neuroendokrynologia doświadczalna i jej implikacje kliniczne historia i perspektywy znaczenie ma leczenie za pomocą analogów SST połączonych z radionuklidem emitującym promieniowanie beta o dużej energii (tzw. terapia radioreceptorowa). Tak zmodyfikowane cząsteczki łącząc się z receptorami somatostatynowymi na komórkach nowotworowych powodują ich niszczenie [35, 36]. Analogi gonadoliberyny (GnRH ang. gonadotropin releasing hormone) stosowane są rutynowo w leczeniu raków prostaty. Jest tu wykorzystywane zjawisko desensytyzacji przysadkowych receptorów GnRH w wyniku ciągłego podawania superaktywnych analogów tego neurohormonu, co prowadzi do zahamowania wydzielania gonadotropin przez przysadkę. To z kolei równoznaczne jest z zahamowaniem czynności hormonalnej komórek Leydiga i regresją androgeno zależnych raków prostaty. Perspektywy Obecnie jest rozważanych szereg nowych możliwości klinicznego zastosowania neurohormonów i ich analogów. Tutaj wskażę jedynie niektóre z nich. Rozważa się zastosowanie nowych analogów SST w leczeniu guzów przysadki innych niż somatotropinoma (np. guzów nieczynnych hormonalnie) [37]. Prowadzone są także liczne badania przedkliniczne nad zastosowaniem nowych analogów SST (przegląd piśmiennictwa patrz pozycja 38) i antagonistów GHRH [39 43] jako leków przeciwnowotworowych. Obiecującym pomysłem jest łączenie analogów GHRH, a także innych analogów neuropeptydów, z cytotoksycznymi chemioterapeutykami, jako potencjalnych leków w nowotworach wykazujących ekspresję odpowiednich receptorów [39 41]. W ostatnich latach stwierdzono, że superaktywne analogi GHRH aktywują procesy naprawcze myocardium po doświadczalnym zawale mięśnia sercowego [42, 43], co otwiera pole ich zastosowań w kardiologii. Zachęcające wyniki dały również wstępne próby kliniczne podawania długo działających analogów SST w opornych na leczenie przypadkach reumatoidalnego zapalenia stawów [44]. Artykuł ten stanowi rozszerzoną wersję wykładu wygłoszonego na XXI Zjeździe Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego w Katowicach we wrześniu 2016 roku.

13 Marek Pawlikowski 13 Piśmiennictwo 1. Scharrer E. Die Lichtempfindlichkeit blinder Elritzen. Untersuchungen über das Zwischenhirn der Fische. Z vergl Physiol. 1928; 7: Scharrer E, Scharrer B. Uber Drusen nervenzellen und neurosekretorische Organe bei Wirbellosen und Wirbeltieren. Biol Rev. 1937; 12: Bargmann W, Scharrer E. The site of origin of the hormones of the posterior pituitary. Amer Scientist. 1951; 39: Harris GW. Neural control of the pituitary gland. Arnold, London Domański E, Kochman K. Badania nad oczyszczeniem czynników podwzgórzowych, mających zdolność uwalniania hormonów gonadotropowych z przysadki. Acta Physiol Pol. 1969; 20: Bowers CY, Schally AV, Enzmann F, Boler J, Folkers K. Porcine thyrotropin releasing hormone is (pyro)glu His Pro NH2. Endocrinology. 1970; 86: Amoss M, Burgus R Blackwell R, Vale W, Fellows R, Guillemin R. Purification, amino acid composition and N terminus of the hypothalamic luteinizing hormone release in factor (LRF) of ovine origin. Biochem Biophys Res Commun. 1971; 44: Baba Y, Matsuo H, Schally AV. Structure of the porcine LH and FSJ releasing hormones. confirmation of the proposed structure by conventional sequential analysis. Biochem Biophys Res Commun. 1971; 44: Brazeau P, Vale W, Burgus R, Ling N, Butcher M, Riwier J i wsp. Hypothalamic polypeptide that inhibits the secrtion of immunoreactive pituitary growth hormone. Science. 1973; 179: Vale W, Spiess J, Rivier C, Rivier J. Characterization of 41 residue ovine hypothalamic peptide that stimulates secretion of corticotropin and beta endorphin. Science. 1981; 213: Rivier J, Spiess J, Thorner M, Vale W. Characterization of growth hormone releasing factor from a human pancreatic islets tumour. Nature. 1982; 300: Feyrter F. Über diffuse epitheliale Organe. Leipzig Pawlikowski T. Komórki jasne nowe zagadnienie w endokrynologii. Post Hig Med Dośw. 1956; 16: Pawlikowski T, Stępień H. Zagadnienie komórek jasnych i tzw. komórek serii APUD. Endokr Pol. 1974; 25:

14 14 Neuroendokrynologia doświadczalna i jej implikacje kliniczne historia i perspektywy 15. Pearse AGE. The cytochemistry and ultrastructure of polypeptide hormone producing cells of the APUD series and the embryologic, physiologic and pathologic implications of the concept. J Histochem Cytochem. 1969; 17: Larsson LI. Occurrence of nerves containing vasoactive intestinal polypeptide immunoreacivity in the male genital tract. Life Sci. 1977; 21: Pawlikowski M. Badania nad neurosekrecją obwodową. I. Morfologia i topografia neurosekrecji w zwojach układu autonomicznego niektórych ssaków. Endokrynol Pol. 1962; 13: Pawlikowski M. Badania nad neurosekrecją obwodową. II. Porównania histochemiczne neurosekrecji układu podwzgórzowo przysadkowego i podobnych zjawisk w obwodowym układzie autonomicznym. Endokrynol Pol. 1963; 14: Pawlikowski T. Z badań nad tkanką chromochłonną adrenalinogenną nadnerczy kręgowców. Poznańskie Tow Przyjaciół Nauk, Prace Komisji Lekarskiej. 1938; 5: Pawlikowski T. Badania nad drugim hormonem części rdzennej nadnerczy. Endokrynol Pol. 1951; 2: Nussdorfer GG, Malendowicz LK, Belloni AS, Mazzocchi G, Rebuffat P. Effects of substance P on rat adrenal glomerulosa in vivo. Peptides. 1988; 9: Neri G, Malendowicz LK, Andreis P, Nussdorfer GG. Thyrotropin releasing hormone inhibits glucocorticoid secretion of rat adrenal cortex: in vivo and in vitro studies. Endocrinology. 1993; 133: Kunert Radek J, Pawlikowski M. The effect of thyrotropin releasing hormone on cell proliferation in the anterior pituitary gland of thyroidectomized rats. Neuroendocrinology. 1975; 17: Pawlikowski M, Kunert Radek J, Stępień H. Somatostatin inhibits the mitogenic effect of thyroliberin. Experientia. 1978; 34: Żerek Mełeń G, Lewiński A, Pawlikowski M, Sewerynek E, Kunert Radek J. Influence of somatostatin and epidermal growth factor (EGF) on the proliferation of follicular cells in the organ cultured rat thyroid. Res Exp Med. 1987; 187: Pawlikowski M, Stępień H, Kunert Radek J, Żelazowski P, Schally AV. Immunomodulatory action of somatostatin. Ann NY Acad Sci. 1987; 496: Pawlikowski M, Żelazowski P, Dohler K, Stępień H. Effects of two neuropeptides, somatoliberin (GRF) and corticoliberin (CRF) on human lymphocyte natural killer activity. Brain, Behavior and Immunity. 1988; 2:

15 Marek Pawlikowski Pawlikowski M, Komorowski J, Stępień H, Winczyk K. Thyroliberin (TRH) and thyrotropin (TSH) as immunopotentializing hormones. Int J Thymol. 1996; 4, suppl. 1: Komorowski J, Stępień H, Pawlikowski M. The evidence of thyroliberin/ triiodothyronin control of TSH secretory response from human peripheral blood monocytes cultured in vitro. Neuropeptides. 1993; 25: Pawlikowski M. Prof. zw. dr hab. n.med. Władysław Zygmunt Traczyk ( ). Sprawozdania z czynności i posiedzeń naukowych Łódzkiego Towarzystwa Naukowego, Łódzkie Tow. Naukowe. 2009; 63: Lerner AB, Case JD, Takahashi Y Lee TH, Mori W. Isolation of melatonin, the pineal gland factor that lightens melanocytes. J Amer Chem Soc. 1958; 80: Pawlikowski M. Profesor Michał Karasek ( ) życie i działalność naukowa. Folia Medica Lodzenia. 2010; 37: Juszczak M. Jan W. Guzek. Sprawozdania z czynności i posiedzeń naukowych Łódzkiego Towarzystwa Naukowego. Łódzkie Tow. Naukowe. 2003; 57: Klimek R, Pawlikowski M. Neuroendokrynologia kliniczna. PZWL Warszawa Krenning EP, Valkerna R, de Jong M. Radiolabeled somatostatin analogue(s) peptide receptor radionuclide therapy: risk and promises. W: Lamberts SWJ (red) Octreotide: a new decade, Bioscientifica, Bristol. 1999: Królicki L, Kubikowksa J, Bąk MI. Radiolabeled somatostatin analogs in diagnosis and therapy of neuroendocrine tumors. W: Pawlikowski M. (red) Somatostatin analogs in diagnostics and therapy, Landes Bioscience, Austin. 2007; Gruszka A, Kunert Radek J, Radek A Pisarek H, Taylor J, Dong JZ i wsp. The effect of selective sst1, sst2, sst5 somatostatin receptor agonists, a somatostatin/dopamine (SST/DA) chimera and bromocriptine on clinically non functioning pituitary adenomas in vitro. Life Sci. 2006; 78: Melen Mucha G, Pawlikowski M. Somatostatin analogs new perspectives. W: Pawlikowski M. (red) Somatostatin analogs in diagnostics and therapy. Landes Bioscience, Austin. 2007; Perez R, Schally AV, Popovics P Cai R, Sha W, Rincon R i wsp. Antagonistic analogs of growth hormone releasing hormone increase the efficacy of treatment of triple negative breast cancer in nude mice with doxorubicin. A preclinical study. Oncoscience. 2014; 1: Szalontay L, Schally AV, Popovics P, Vidaurre I, Krishan A, Zarandi M i wsp. Novel GHRH antagonists suppress the growth of human malignant melanoma by restoring p27 function. Cell Cycle. 2014; 13:

16 16 Neuroendokrynologia doświadczalna i jej implikacje kliniczne historia i perspektywy 41. Jaszberenyi M, Rick FG, Popovics B, Block NL, Zarandi M, Cai RZ i wsp. Potentiation of cytotoxic chemotherapy by growth hormone releasing hormone agonists. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111: Florea V, Majid SS, Kanashiro Takeuchi RM, Cai RZ, Block NL Schally AV i wsp. Agonists of growth hormone releasing hormone stimulate self renewal of cardiac stem cells and promote their survival. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111: Cai R, Schally AV, Cui T Szalontay L, Halmar G, Sha W i wsp. Synthesis of new potent agonistic analogs of growth hormone releasing hormone (GHRH) and evaluation of their endocrine and cardia actvities. Peptides. 2014; 52: Koseoglu F, Koseoglu. T. Long acting somatostatin anlogue for the treatment of refractory rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2002; 61:

17 Folia Medica Lodziensia, 2016, 43/1:17 34 Zmiany czynności mioelektrycznej żołądka u osób z depresją i objawami dyspeptycznymi Gastric myoelectrical abnormalities in depressive patients with dyspeptic symptoms PAWEŁ WOJTKIEWICZ¹, AGNIESZKA STĘPIEŃ², JAN CHOJNACKI³ ¹Oddział Gastroenterologii, Szpital Marynarki Wojennej w Gdańsku ²Klinika Gastroenterologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi ³Zakład Żywienia Klinicznego i Diagnostyki Gastroenterologicznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Streszczenie Wstęp: U chorych z depresją często występują bóle i dyskomfort w nadbrzuszu. Patogeneza tych dolegliwości jest złożona i nie w pełni poznana. Celem badań była ocena czynności mioelektrycznej żołądka w tej grupie chorych. Materiał i metody: Badania przeprowadzono w grupie 90 osób, w tym 71 kobiet i 19 mężczyzn (średni wiek 38,0±8,1 lat). Spośród nich wyodrębniono trzy grupy osoby zdrowe (grupa K, n=30), pacjenci z depresją i dyspepsją (grupa II, n=30), pacjenci z depresją i zakażeniem Helicobacter pylori (grupa III, n=30). U wszystkich oceniono stan emocjonalny z użyciem Skali Depresji Hamiltona, a aktywność mioelektryczną żołądka (Polygraph Medtronic A/S, Denmark) rejestrowano przez 120 minut przed i po posiłku płynnym. Wyniki: W porównaniu do osób zdrowych (grupa K), u pacjentów z depresją (grupa II i III) odsetek normogastrii przedposiłkowej był niższy; 79,5±8,1% vs 73,6±8,7% (p<0,01) i 79,5±8,1% vs 68,4±9,9 (p<0,001). Podobne różnice stwierdzono w okresie poposiłkowym. Wartość ilorazu mocy (PR) była również mniejsza niż u osób zdrowych odpowiednio 3,5±0,7 (K), 1,6±0,7 (grupa II, p<0,001) i 1,7±0,8 (grupa III, p<0,001). Wnioski: U osób z depresją czynność mioelektryczna żołądka jest zaburzona, co może być przyczyną przewlekłych dolegliwości dyspeptycznych. Słowa kluczowe: depresja, dyspepsja, elektrogastrografia. Adres do korespondencji: prof. dr hab. n. med. Jan Chojnacki; Zakład Żywienia Klinicznego i Diagnostyki Gastroenterologicznej, Uniwersytet Medyczny; Łódź, Pl. Hallera 1, tel , e mail: jan.chojnacki@umed.lodz.pl

18 18 Elektrogastrografia u osób z depresją Abstract Introduction: A chronic or recurrent pain and discomfort in the upper abdomen occurs frequently in depressive patients. The pathogenesis of these symptoms is complex and not fully understood. The aim of the study was to estimate the gastric myoelectrical activity in this group of patients. Material and methods: The study group consisted of 90 subjects, including 71 women and 19 men (mean age 38.0±8.1). Among them three groups were divided: healthy subjects (K, n=30), depressive patients with dyspepsia (group II, n=30) and depressive patients with Helicobacter pylori infection (group III, n=30). All the subjects completed Hamilton Depression Scale and the gastric myoelectrical activity examination with Polygraph Medtronic A/S (Denmark) was done before and after a liquid meal for 120 minutes. Results: Preprandial normogastria in depressive patients (group II, III) compared to healthy subjects (group K) was lower 79.5±8.1% vs 73.6±8.7% (p<0.01) and 79.5±8.1% vs 68.4±9.9 (p<0.001). The similar differences were recorded during postprandial time. Power ratio scale (PR) was also lower in depressive patients than in healthy subjects: 3.5±0.7 (K), 1.6±0.7 (group II), 1.7±0.8 (group III) p<0.001, p<0.001 respectively. Conclusions: In depressive patients gastric myoelectrical activity is disturbed and probably causes chronic dyspepsia symptoms. Key words: depression, dyspepsia, electrogastrography. Wstęp Przewlekły ból i dyskomfort w nadbrzuszu często występują u osób z depresją. Objawy te kwalifikowane są do dyspepsji czynnościowej, gdyż nie są uwarunkowane zmianami organicznymi w górnym odcinku przewodu pokarmowego [1]. Rozpoznanie opiera się głównie na analizie dolegliwości subiektywnie odczuwanych przez pacjentów [2]. W nowej klasyfikacji chorób czynnościowych (Kryteria Rzymskie IV z roku 2016), w ich patogenezie uwzględnia się interakcje różnych czynników, w tym obiektywnych. Do nich należą: zmiany mikrobiomu jelitowego, nietolerancja produktów żywnościo

19 Paweł Wojtkiewicz i wsp. 19 wych, zaburzenia immunologiczne w przewodzie pokarmowym i inne [3, 4]. Niemniej, nie kwestionuje się roli ośrodkowego i trzewnego układu nerwowego w tych procesach [5]. Uwzględnia się wpływ emocji i stresu na pracę przewodu pokarmowego. Uznaje się, że główną przyczyną przewlekłego bólu jest nadwrażliwość trzewna [6]. Bodźce bólowe z narządów układu trawiennego transmitowane są do ośrodkowego układu nerwowego, gdzie zachodzi ich interpretacja i modulacja. Ważny wpływ na powstawanie i przetwarzanie bólu mają czynniki emocjonalne. Ból jest zjawiskiem psychosomatycznym, dlatego jego percepcja w dużym stopniu zależy od czynników psychicznych. Emocje mają wpływ na próg tolerancji bólu, zwiększając lub zmniejszając jego odczucie [7]. Najczęstszym zaburzeniem nastroju, który współistnieje z przewlekłym bólem jest depresja mogąca intensyfikować doznania bólowe [8]. W aktualnych kryteriach chorób czynnościowych wśród czynników patogenetycznych uwzględniane są zaburzenia motoryki przewodu pokarmowego, z odniesieniem także do żołądka. Ich wykładnikiem są zaburzenia czynności mioelektrycznej, które można bezinwazyjnie rejestrować metodą elektrogastrografii. Jednak, dotychczas nie ustalono ostatecznie jej kryteriów i przydatności diagnostycznej u osób z depresją, co stało się inspiracją do podjęcia własnych badań. Celem badań była ocena podstawowych parametrów elektrogastrografii u osób z depresją odczuwających przewlekłe dolegliwości w nadbrzuszu. Materiał i metody Badania przeprowadzono w grupie 90 osób, w tym 71 kobiet i 19 mężczyzn, u których rozpoznano łagodną i umiarkowaną depresję. Wiek badanych wynosił od 20 do 59 lat (średnia wieku 38,0±8,09 lat). Rekrutację i opiekę lekarską nad pacjentami prowadzono w Poradni Zdrowia Psychicznego przy Szpitalu Marynarki Wojennej w Gdańsku Oliwie oraz w Poradni Konsultacyjnej Gastro w Łodzi. Badania elektrogastrograficzne wykonywano w Zakładzie Żywienia Klinicznego i Diagnostyki Gastroenterologicznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi.

20 20 Elektrogastrografia u osób z depresją Spośród wybranych pacjentów wyodrębniono trzy grupy: grupa I kontrolna 30 osób osoby zdrowe bez dolegliwości dyspeptycznych grupa II badana 30 osób pacjenci z depresją i zespołem bólowym nadbrzusza grupa III badana 30 osób pacjenci z depresją, zespołem bólowym nadbrzusza i zakażeniem Helicobacter pylori. Kryteria włączenia Do badań zakwalifikowano pacjentów z zespołem bólowym nadbrzusza, u których metodami endoskopowymi, obrazowymi (ultrasonografia i tomografia komputerowa brzucha), histologicznymi oraz laboratoryjnymi wykluczono ich organiczną przyczynę. Wszyscy badani zostali poinformowani o celu badań i możliwości odstąpienia od nich na każdym etapie ich realizacji, na co wyrazili pisemną zgodę. Na przeprowadzenie badań uzyskano także pisemną zgodę Komisji Bioetyki Uniwersytetu Medycznego w Łodzi (nr RNN/596/11/KB). Kryteria wykluczenia Z badań wykluczono osoby: z chorobami organicznymi, psychicznymi i zapalnymi z alergią i nietolerancją pokarmową po zabiegach chirurgicznych narządów jamy brzusznej nadużywające alkohol palące tytoń przyjmujące przewlekle leki; w szczególności niesteroidowe leki przeciwzapalne, leki przeciwpłytkowe, przeciwkrzepliwe i środki antykoncepcyjne. W przypadku pacjentów przyjmujących leki przeciwdepresyjne lub leczonych inhibitorami pompy protonowej, leki te odstawiono przed badaniem na okres sześciu tygodni.

21 Paweł Wojtkiewicz i wsp. 21 Postępowanie diagnostyczne Przed włączeniem pacjentów do badań przeprowadzono dokładny wywiad, zwracając w szczególności uwagę na charakter zgłaszanych objawów, czas ich trwania, zależność od przyjmowanych posiłków, porę dnia i roku, ich nasilenie i nawrotowość. Oceny nasilenia dolegliwości bólowych dokonywano przy użyciu 10 stopniowej skali wzrokowo analogowej (Visual Analog Scale, VAS). Ocenę nastroju psychicznego wykonano przy użyciu Skali Depresji Hamiltona [9]. Do badań kwalifikowano pacjentów wyłącznie o umiarkowanym i średnio ciężkim nasileniu objawów mieszczących się w granicach punktów. Pacjentów z bardzo ciężką depresją (powyżej 30 pkt.), wymagających stałej opieki psychiatrycznej i przyjmowania przewlekle leków przeciwdepresyjnych wykluczono z badania. Zakażenie Helicobacter pylori wykrywano enzymatycznym testem ureazowym przy użyciu podłoża produkowanego przez Instytut Żywienia i Żywności w Warszawie. Ponadto, intensywność kolonizacji oceniano testem oddechowym, przy użyciu mocznika znakowanego nieradioaktywnym izotopem węgla 13 C i analizatora FANci 2 firmy Fischer Analyzer Instruments GmbH. Elektrogastrografię wykonywano aparatem czterokanałowym Polygraf ID firmy Medtronic A/S, Denmark. Rejestrację czynności mioelektrycznej żołądka rozpoczynano rano na czczo i kontynuowano zapis przez 60 min. Po tym czasie osoba badana otrzymywała płynny posiłek testowy, tj. Nutridrink (Nutricia) w objętości 200 ml, wartość energetyczna 300 kcal, zawierający 11,4 g białka, 41,4 g węglowodanów, 10,2 g tłuszczów, 1,05 g błonnika. Posiłek spożywany był w pozycji siedzącej, po którym dokonywano kolejnego 60 minutowego zapisu poposiłkowego. Badania przeprowadzane były w godzinach porannych między 8.00 a Pomieszczenie, w którym wykonywano badanie miało odpowiednią temperaturę otoczenia, oświetlenie oraz zapewniało spokój w trakcie badania. Pacjenci podczas całego okresu zapisu leżeli na plecach na płaskiej leżance, zalecono im odpoczynek, nie mogli w tym czasie spać, czytać książek, ani innych lektur. Do pracowni nie był przynoszony sprzęt elektroniczny, w tym telefony komórkowe, aby nie zakłócały zapisu badania. Rozmieszczenie elektrod zostało wykonane zgodnie z instrukcją urządzenia załączoną do aparatu [10]. Analiza

22 22 Elektrogastrografia u osób z depresją zapisów wykonana została za pomocą oprogramowania ElectroGastroGram Software, Gastrosoft (EGG). Analiza dotyczyła następujących parametrów: normogastrii, bradygastrii, tachygastrii, arytmii, ilorazu mocy. Za normogastrię uznawano pobudzenia o częstotliwości fal wolnych od 2 do 4 cykli na minutę (CPM ang. cycle per minute), bradygastrię od 0 do 2 CPM, a tachygastrię od 4 do 10 CPM, zgodnie z instrukcją oprogramowania załączoną przez producenta. Za prawidłowy zapis EGG uznawano, gdy normogastria stanowiła 70% i więcej zapisu w okresie przed i poposiłkowym, a iloraz mocy (PR) wynosił 1,5. W analizie statystycznej do porównania zastosowano test t Studenta przy normalnym rozkładzie cech lub test nieparametryczny Manna Whitney a dla porównania dwóch cech niezależnych. Obliczenia dokonano z wykorzystaniem programu Statistica 9.1. Wyniki Dobór pacjentów pod względem wieku, płci, nasilenia depresji i objawów dyspeptycznych był właściwy, a różnice nie wykazywały znamienności statystycznej (Tabela I). W porównaniu do osób zdrowych (grupa K) odsetek normogastrii przedposiłkowej u pacjentów z depresją (grupa II i III) był znamiennie niższy odpowiednio 79,5±8,1% vs 73,6 8,7% (p<0,01) i 79,5±8,1% vs 68,4±9,9% (p<0,001, ryc. 1). Podobne różnice dotyczyły normogastrii poposiłkowej odpowiednio w grupach: 79,9±4,9% vs 73,9±8,0% (p<0,01) i 79,9±4,95% vs 72,7±12,9% (p<0,05, ryc. 2). W zapisie przed posiłkiem w grupie II rozkład bradygastrii i tachygastrii był podobny i wynosił odpowiednio 5,2±3,2% i 6,4±3,9%, natomiast w grupie III przed posiłkiem dominowała tachygastria 2,6±1,9% (bradygastria) vs 6,1±3,9% (tachygastria) (p<0,05); różnica ta utrzymywała się również w zapisie poposiłkowym. Niestabilność zapisu elektrogastrografii z arytmią w okresie przedposiłkowym u osób z depresją była znamiennie większa niż u osób zdrowych i wynosiła odpowiednio w grupach K, II, III 10,1±6,5%, 15,1±6,2% (p<0,01) oraz 22,9±7,8% (p<0,001, ryc. 3).

23 Paweł Wojtkiewicz i wsp. 23 Podobne różnice stwierdzono w okresie poposiłkowym odpowiednio 7,0±4,5%, 14,5±6,1% (p<0,001), 18,2±11,6% (p<0,001, ryc. 4). Iloraz mocy fal wolnych w grupie kontrolnej wynosił 3,5±0,7, w grupie II 1,6±0,7 (p<0,001), a w grupie III 1,7±0,8 (p<0,001, ryc. 5). Tabela I. Charakterystyka osób włączonych do badań. Table I. Characteristic of subjects included in the study. Parametry Grupa I (n=30) Grupa II (n=30) Grupa III (n=30) Wiek (lata) 38,1±8,18 37,8±9,78 38,2±7,33 Płeć M Płeć K Nasilenie depresji (pkt) 23,1±4,66 24,2±4,53 Nasilenie dyspepsji (pkt) 7,30±1,66 7,33±1,74 UBT 13 C ( ) 14,6±6,9 Grupa I osoby zdrowe (healthy subjects); grupa II osoby z depresją i dyspepsją (depressive patients with dyspepsia); grupa III osoby z depresją i dyspepsią zakażone Helicobacter pylori (depressive patients with dyspepsia and H. pylori infection); nasilenie depresji (index of depression); nasilenie dyspepsji (index of dyspepsia); M mężczyźni (men), K kobiety (women), UBT 13 C mocznikowy test oddechowy (urea breath test).

24 24 Elektrogastrografia u osób z depresją Ryc. 1. Odsetek normogastrii w okresie przedposiłkowym (N1 %) u osób zdrowych (grupa K), u osób z depresją i dyspepsją (grupa II) oraz u osób z depresja i dyspepsją, zakażonych Helicobacter pylori (grupa III). Różnice statystyczne: K vs II p<0,01; K vs III p<0,001; II vs III p<0,05 Fig. 1. The percentage of preprandial normogastria (N1 %), in healthy subjects (group K), depressive patients with dyspepsia (group II) and depressive patients with dyspepsia and Helicobacter pylori infected (group III). Statistical differences: K vs II p<0.01; K vs III p<0.001; II vs III p<0.05

25 Paweł Wojtkiewicz i wsp. 25 Ryc. 2. Odsetek normogastrii w okresie poposiłkowym (N2 %) u osób zdrowych (grupa K), u osób z depresją i dyspepsją (grupa II) oraz u osób z depresja i dyspepsją, zakażonych Helicobacter pylori (grupa III). Różnice statystyczne: K vs II p<0,01; K vs III p<0,001; II vs III p<0,05 Fig. 2. The percentage of postprandial normogastria (N2 %), in healthy subjects (group K), depressive patients with dyspepsia (group II) and depressive patients with dyspepsia and Helicobacter pylori infection (group III). Statistical differences: K vs II p<0.01; K vs III p<0.001; II vs III p>0.05

26 26 Elektrogastrografia u osób z depresją Ryc. 3. Odsetek arytmii w okresie przedposiłkowym (A1 %) u osób zdrowych (grupa K), u osób z depresją i dyspepsją (grupa II) oraz u osób z depresja i dyspepsją, zakażonych Helicobacter pylori (grupa III). Różnice statystyczne: K vs II p<0,01; K vs III p<0,001; II vs III p>0,05 Fig. 3. The percentage of preprandial arythmia (A1 %), in healthy subjects (group K), depressive patients with dyspepsia (group II) and depressive patients with dyspepsia and Helicobacter pylori infection (group III). Statistical differences: K vs II p<0.01; K vs III p<0.001; II vs III p>0.05

27 Paweł Wojtkiewicz i wsp. 27 Ryc. 4. Odsetek arytmii w okresie poposiłkowym (A2 %) u osób zdrowych (grupa K), u osób z depresją i dyspepsją (grupa II) oraz u osób z depresja i dyspepsją, zakażonych Helicobacter pylori (grupa III). Różnice statystyczne: K vs II p<0,01; K vs III p<0,001; II vs III p>0,05 Fig. 4. The percentage of postprandial normogastria (A2 %), in healthy subjects (group K), depressive patients with dyspepsia (group II) and depressive patients with dyspepsia and Helicobacter pylori infection (group III). Statistical differences: K vs II p<0.01; K vs III p<0.001; II vs III p>0.05

28 28 Elektrogastrografia u osób z depresją Ryc. 5. Wartość ilorazu mocy (PR) u osób zdrowych (grupa K), u osób z depresją i dyspepsją (grupa II) oraz u osób z depresja i dyspepsją, zakażonych Helicobacter pylori (grupa III). Różnice statystyczne: K vs II p<0,001; K vs III p<0,001; II vs III p>0,05 Fig. 5. The value of power ratio (PR) in healthy subjects (group K), depressive patients with dyspepsia (group II) and depressive patients with dyspepsia and Helicobacter pylori infection (group III). Statistical differences: K vs II p<0.001; K vs III p<0.001; II vs III p>0.05 Dyskusja W badaniach nad zależnością między zapisem fal wolnych, opróżnianiem żołądkowym i objawami dyspeptycznymi stwierdzano różne zaburzenia czynności motorycznej żołądka, w tym obniżony odsetek normogastrii na czczo

29 Paweł Wojtkiewicz i wsp. 29 i w nocy w porównaniu z grupą kontrolną oraz wydłużony czas połowiczego opróżniania żołądka [11 13]. U osób z gastroparezą u 50 75% badanych stwierdzano różne zmiany w zapisie EGG, najczęściej pod postacią redukcji procentowej ilości fal wolnych oraz wzmożonej dysrytmii [14 16]. Nieprawidłowy zapis EGG może wskazywać na zaburzenia opróżniania żołądkowego, ale zapis prawidłowy nie przesądza o skuteczności opróżniania. Riezzo [17] stwierdził, że tylko około 50% pacjentów z dyspepsją ma opóźnione opróżnianie żołądkowe, ale jeśli występują zaburzenia czynności mioelektrycznej, to objawy dyspepsji są bardziej nasilone. Parkman i wsp. [18] uważają, że u osób z dyspepsją i opóźnionym opróżnianiem żołądkowym zmiany w zapisie EGG, zarówno w okresie przed jak i poposiłkowym, występują częściej niż u osób z prawidłowym opróżnianiem. Występujące nudności oraz dyskomfort poposiłkowy w dyspepsji tłumaczą obecnością dysrytmii, w tym tachygastrii, mającej charakter migotania i prowadzącej do paraliżu czynnościowego [18, 19]. Podobnie inni badacze objawy dyspepsji czynnościowej wiązali z obecnością tachygastrii i dysrytmii [20, 21]. Rzadziej w tej chorobie stwierdzano przewagę przed i poposiłkowej bradygastrii [22]. Bortolotti i wsp. [23] u osób z gastroparezą obserwowali związek bradygastrii i bradyarytmii z obniżoną motoryką antrum. Foryś i wsp. [24] u osób z dyspepsją czynnościową stwierdzili zaburzenia czynności mioelektrycznej żołądka także z przewagą dysrytmii, a szczególnie bradygastrii. Bradygastria dominowała w zespole bólu w nadbrzuszu, a w zespole dyskomfortu poposiłkowego oprócz bradygastrii obserwowano istotny udział tachygastrii. Rudnicki i wsp. [25] w podobnych badaniach u osób z dyspepsją czynnościową stwierdzili odsetkową normogastrię zbliżoną do wyników uzyskanych u osób zdrowych. Zwrócili jednak uwagę na obniżoną wartość ilorazu mocy w obu postaciach klinicznych dyspepsji czynnościowej. Podobne obserwacje poczynili inni badacze i wiązali to z występowaniem objawów takich, jak nudności, wzdęcia i bóle w nadbrzuszu [26, 27]. Iloraz mocy większość badaczy uznaje za parametr, który jest pośrednim wykładnikiem sprawności opróżniania żołądkowego [28 30]. Z powyższych badań klinicznych wynika, że zarówno tachygastria, jak i bradygastria może osłabiać czynność skurczową żołądka i być przyczyną dolegliwości dyspeptycznych. Wyniki badań własnych potwierdzają taką opinię, gdyż

30 30 Elektrogastrografia u osób z depresją zaburzenia czynności mioelektrycznej żołądka u osób z czynnościowym zespołem bólu i dyskomfortu w nadbrzuszu okazały się znacznie nasilone. Najniższy odsetek normogastrii przedposiłkowej stwierdzono u pacjentów ze współistniejącym zakażeniem Helicobacter pylori. Natomiast, różnice te zacierały się w zapisie EGG po spożyciu posiłku testowego, co wskazuje na udział także innych czynników w regulacji czynności mioelektrycznej żołądka. W porównianiu do osób zdrowych, w obu grupach pacjentów z depresją w zapisie EGG występował znacznie wyższy odsetek dysrytmii pod postacią naprzemiennych epizodów tachy i bradygastrii. Jest to dowodem złożonych zaburzeń czynności mioelektrycznej tego narządu, mogących być przyczyną przewlekłych dolegliwości dyspeptycznych. Prawdopodobnie jednym z niekorzystnych czynników są zaburzenia emocjonalne i zmiany homeostazy neuroprzekaźników, które biorą udział w regulacji czynności motorycznej przewodu pokarmowego. Osobnym zagadnieniem jest wpływ czynników emocjonalnych na zapis EGG. Wykazano, m.in., że stres wywiera hamujący wpływ na czynność mioelektryczną żołądka [31, 32]. Nie stwierdzono natomiast innych różnic w zapisie EGG u osób z dyspepsją czynnościową w zależności od współistniejących objawów depresji [33, 34]. Na zapis EGG istotny wpływ mogą wywierać leki przeciwdepresyjne. Jonderko i wsp. [35] wykazali, że jednorazowa dawka 25 mg doksepiny u zdrowych ochotników zmniejsza dominującą siłę fal wolnych w zapisie EGG. W innych badaniach Wu i wsp. [36] u osób z dyspepsją czynnościową i obniżeniem nastroju stwierdzili istotne niższy odsetek normogastrii z przewagą tachygastrii zarówno na czczo, jak i po posiłku. Pacjentom zalecono przyjmowanie przez miesiąc fluoksetyny w dawce dziennej 20 mg, ale nie uzyskano istotnej poprawy w zapisie EGG. Rudnicki i wsp. [37] u osób z dyspepsją czynnościową stwierdzili obniżony iloraz mocy w EGG, który wrócił do normy po 6 tygodniach leczenia zarówno fluoksetyną (20 mg dziennie), jak i tianeptyną (3x12,5 mg). W zespole bólu w nadbrzuszu u leczonych fluoksetyną uzyskano redukcję bradygastrii i wzrost normogastrii już po 24 godzinach i efekt ten utrzymywał się po sześciu tygodniach leczenia. Podobny, korzystny efekt uzyskano w grupie leczonych tianeptyną, ale różnica była znamienna dopiero po sześciu tygodniach i dotyczyła głównie bradygastrii. Wynika z tego, że leki modulujące zwrotny

31 Paweł Wojtkiewicz i wsp. 31 wychwyt serotoniny mogą być przydatne w leczeniu dyspepsji czynnościowej u osób z depresją. Warto podkreślić, że ciągle trwają prace nad udoskonaleniem technicznym oprogramowań komputerowych, ujednoliceniem warunków badania oraz przyjęciem porównywalnych kryteriów [38 40]. Niemniej, istnieją wystarczające dowody na to, że elektrogastrografia jest przydatnym badaniem w procesie diagnostyczno terapeutycznym chorób czynnościowych przewodu pokarmowego. Wyniki własnych badań wskazują, że czynność mioelektryczna żołądka jest zaburzona także u osób z depresją, co może być jedną z przyczyn uporczywych dolegliwości dyspeptycznych w tej grupie chorych. Piśmiennictwo 1. da Silva RA, Pinheiro RT, da Silva RA, Horta BL, Moraes I, Faria AD. Functional dyspepsia and depression as an associated factor. Arq Gastroenterol. 2006; 43(4): Jamil O, Sarwar S, Hussain Z, Fiaz RO, Chaudary RD. Association Between Functional Dyspepsia and Severity of Depression. J Coll Physicians Surg Pak. 2016; 26(6): Drossman DA. Functional Gastrointestinal Disorders: History, Pathophysiology, Clinical Features and Rome IV. Gastroenterology Feb 19. pii: S (16) Ebling B, Jurcic D, Barac KM, Bilic A, Bajic I, Martinac M i wsp. Influence of various factors on functional dyspepsia. Wien Klin Wochenschr. 2016; 128(1 2): Rollman GB1, Gillespie JM. The role of psychosocial factors in temporomandibular disorders. Curr Rev Pain. 2000; 4(1): Drossman DA, Hasler WL. Rome IV Functional GI Disorders: Disorders of Gut Brain Interaction. Gastroenterology. 2016; 150(6): De la Roca Chiapas JM, Solís Ortiz S, Fajardo Araujo M, Sosa M, Córdova Fraga T, Rosa Zarate A. Stress profile, coping style, anxiety, depression, and gastric emptying as predictors of functional dyspepsia: a case control study. J Psychosom Res. 2010; 68(1): Van Oudenhove L, Vandenberghe J, Vos R, Fischler B, Demyttenaere K, Tack J. Abuse history, depression, and somatization are associated with gastric sensitivity

32 32 Elektrogastrografia u osób z depresją and gastric emptying in functional dyspepsia. Psychosom Med. 2011; 73(8): Hamilton M. A rating scale for depression. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1960; 23: Rossi Z, Forlini G, Fenderico P, Cipolla R, Nasoni S. Electrogastrography. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2005; Suppl 1: Soykan I, Lin Z, Jones S, Chen J, McCallum RW. Gastric myoelectrical activity, gastric emptying and correlations with dyspepsia symptoms in patients with gastroesophageal reflux. J Investig Med. 1997; 45: Jackson A L, Rashed H, Cardoso S, Wong F, Werkman R, Thompson J i wsp. Assessment of gastric electrical activity and autonomic function among diabetic and nondiabetic patients with symptoms of gastroesophageal reflux. Dig Dis Sci. 2000; 45: Kudara N, Chiba T, Suzuki K. Gastric emptying and electrogastrography in reflux esophagitis: results in patients showing endoscopically erosive esophagitis under proton pump inhibitor therapy. Hepatogastroenterology. 2010; 57: Bortolotti M, Sarti P, Barara L, Brunelli F. Gastric myoelectric activity in patients with chronic idiopathic gastroparesis. Neurogastroenterol Motil. 1990; 2: Chen J, McCallum RW. Gastric slow wave abnormalities in patients with gastroparesis. Am J Gastroenterol. 1992; 87: Rothstein RD, Alavi A, Reynolds JC. Electrogastrography in patients with gastroparesis and effect of long term cisaptide. Dig Dis Sci. 1993; 38: Riezzo G. Clinical applications of cutaneous electrogastrography. Neurogastroenterology. 2001; 1: Parkman HP, Miller MA, Trate D, Knight LC, Urbain JL, Maurer AH i wsp. Electrogastrography and gastric emptying scintigraphy are complementary for assessment of dyspepsia. J Clin Gastroenterol. 1997; 24: Pytrus T, Iwańczak B. Znaczenie elektrogastrografii (EGG) w zaburzeniach czynnościowych przewodu pokarmowego u dzieci. Terapia. 2002; 116: Sha W, Pasricha PJ, Chen JD. Rhythmic and spatial abnormalities of gastric slow waves in patients with functional dyspepsia. J Clin Gastroenterol. 2009; 43: You C H, Chey WY, Lee KY, Menguy R, Bortoff A. Gastric and small intestinal myoelectric dysrhythmia associated with chronic intractable nausea and vomiting. Ann Intern Med. 1981; 95: Pytrus T, Matkowska A, Kremens K, Iwaoczak B. Ocena czynności mioelektrycznej żołądka w niestrawności czynnościowej u dzieci. Pediatr Współ Gastroentrol Hepatol Żyw Dz. 2003; 5:

33 Paweł Wojtkiewicz i wsp Bortolotti M, Sarti P, Barara L, Brunelli F. Gastric myoelectric activity in patients with chronic idiopathic gastroparesis. Neurogastroenterol Motil. 1990; 2: Foryś S, Rudnicki C, Walecka Kapica E, Chojnacki J. Elektrogastrografia w różnych postaciach klinicznych dyspepsji czynnościowej. Pol Merk Lek. 2009; 26: Rudnicki C, Kulig G, Foryś S, Śmigieliski J, Chojnacki C, Klupińska G. The effect of fluoxetine on gastric myoelectric activity in subjects with functional dyspepsia. Clin Exp Med Lett.2009; 50: Kayar Y, Danalioglu A, Kafee AA, Okkesim S, Senturk H. Gastric myoeleectrical abnormalities of elektrogastrography in patients with functional dyspepsia. Turk J Gastroenterol. 2016; 27(5): Sha W, Pasricha PJ, Chen JD. Rhythmic and spatial abnormalities of gastric slow waves in patients with functional dyspepsia. J Clin Gastroenterol. 2009; 43: Tarnowski W, Bielecki K. Zaburzenia czynności mioelektrycznej i motorycznej żołądka. Gastroenterol Pol. 2004; 11: Sha W, Pasricha PJ, Chen JD. Correlations among electrogastrogram, gastric dysmotility, and duodenal dysmotility in patients with functional dyspepsia. J Clin Gastroenterol. 2009; 43: Jamer T. Multichannel electrogastrography in pediatrics progress in standarisation and clinical application. Dev Period Med.2014; 18(3): Homma S. Local differences in electrogastrographic responses to the stress of the mirror drawing test (MDT) as determined by multichannel electrogastrography. J Smooth Muscle Res. 2012; 48: Homma S. Correlations between anxiety and the stress responses of electrogastrography (EGG) induced by the mirror drawing test (MDT). J Smooth Muscle Res. 2014; 50: Chou LT, Wu Y, Chen HP, Chang C S, Wong PG, Ko CW i wsp. The correlation of depression and gastric dysrhythmia in functional dyspepsia. J Clin Gastroenterol. 2001; 33: Homma S, Mashima I, Muramatsu Y, Gejyo F. Electrogastrographic responses to the stress of a mirror drawing test in outpatients consulting a psychosomatic clinic. J Smooth Muscle Res. 2009; 45:

34 34 Elektrogastrografia u osób z depresją 35. Jonderko K, Kotuła I, Kasicka Jonderko A, Waluga M, Błoska Fajfrowska B. Dichotomy between the effects of doxepine on gastric myoelectrical activity and gastric emptying in humans. Gut. 2002; 51(Suppl III): A Wu CY, Chou L, Chen H, Chang CS, Wong PG, Chen GH. Effect of fluoxetine on symptoms and gastric dysrhythmia in patients with functional dyspepsia. Hepatogastroenterology. 2003; 50: Rudnicki C. Wpływ fluoksetyny i tianeptyny na czynność mioelektryczną żołądka u osób z dyspepsją czynnościową. Rozprawa doktorska. UM. Łódź Krusiec Świdergoł B, Jonderko K, Pudełko M. Przeszłość i teraźniejszość elektrogastrografii rozwój metody. Ann Acad Med Siles 2007; 61: Komorowski D, Pietraszek S, Tkacz E, Provaznik I. The extraction of the new components from elegrogastrogram (EGG), using both adaptive filtering and electrocardiographic (ECG) derived respiration signal. Biomed eng Online. 2015; 14: O'Grady G, Abell TL. Gastric arrhythmias in gastroparesis: low and high resolution mapping of gastric electrical activity. Gastroenterol Clin North Am. 2015; 44:

35 Folia Medica Lodziensia, 2016, 43/1:35 52 Elektroforetyczna identyfikacja proteinaz cysteinowych w surowicach pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (PBL) z wykorzystaniem biotynylowanego jodoacetamidu Electrophoretic method of cysteine proteinase identification in the sera of patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) based on biotinylated iodoacetamide PAULINA MŁUDZIK 1, JACEK PIETRZAK 1, LIAS SAED 1, DAMIAN WODZIŃSKI 1, IDA FRANIAK PIETRYGA 2, MAREK MIROWSKI 1 1 Zakład Biochemii Farmaceutycznej i Diagnostyki Molekularnej z Pracownią Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki, Międzywydziałowa Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej i Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Medyczny w Łodzi 2 Zakład Genetyki Klinicznej, Katedra Genetyki Klinicznej i Laboratoryjnej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Streszczenie Wstęp: Proteinazy cysteinowe są enzymami regulującymi liczne procesy fizjologiczne oraz patologiczne w organizmie człowieka. Zaburzenie ich aktywności może przyczyniać się do wystąpienia wielu chorób. Pełnią one ważną rolę w procesie kancerogenezy, uczestnicząc w inwazji, transformacji nowotworowej, angiogenezie, apoptozie oraz powstawaniu przerzutów. Celem pracy było opracowanie elektroforetycznej metody identyfikacji proteinaz cysteinowych w surowicach pacjentów z przewlekłą białaczką w oparciu o jodoacetamid biotynylowany. Materiał i metody: Badania wstępne przeprowadzono na handlowym preparacie papainy (EC ), dobrze poznanej i szeroko stosowanej roślinnej proteinazy cysteinowej o masie cząsteczkowej 23,4 kda. Badania wykonano na próbach surowicy uzyskanych z pełnej krwi pobranej od pacjentów chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową (PBL) oraz surowicach kontrolnych uzyskanych Adres do korespondencji: prof. dr hab. n. farm. Marek Mirowski, Zakład Biochemii Farmaceutycznej i Diagnostyki Molekularnej z Pracownią Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki, Międzywydziałowa Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej i Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Medyczny w Łodzi; ul. Muszyńskiego 1; Łódź; tel./fax: ; e mail: marek.mirowski@umed.lodz.pl

36 36 Elektroforetyczna identyfikacja proteinaz cysteinowych od dawców. Surowice po wstępnej inkubacji z jodoacetamidem mieszano z buforem do prób i poddawano rozdziałowi elektroforetycznemu w żelu poliakrylamidowym zawierającym dodecylosiarczan sodu (SDS PAGE). Rozdzielone elektroforetycznie białka po transferze na nitrocelulozową membranę, poddawano dalszej analizie za pomocą streptawidyny skoniugowanej z peroksydazą chrzanową (HRP). Użycie substratu dla HRP, czterochlorowodorku 3,3 diaminobenzydynyny (DAB), umożliwiało identyfikację biotynylowanego jodoacetamidu, a przez to związanych z nim w sposób nieodwracalny proteinaz cysteinowych obecnych w badanych surowicach. Wyniki: Analiza porównawcza surowic pobranych od pacjentów chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową w odniesieniu do surowic kontrolnych pozwoliła na identyfikację dodatkowego białka o charakterze proteinazy cysteinowej o masie cząsteczkowej wynoszącej około 37 kda, które nie występowało lub było obecne w niewielkiej ilości w surowicach kontrolnych. Wnioski: Opracowana metoda umożliwia wykrywanie proteinaz cysteinowych w surowicach kontrolnych, jak i u pacjentów chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową. Słowa kluczowe: proteinazy cysteinowe, jodoacetamid, elektroforeza, przewlekła białaczka limfocytowa. Abstract Introduction: Cysteine proteases are enzymes that regulate numerous physiological and pathological processes in the human body. Disorders of their activity can lead to a number of diseases. They play an important role in the process of carcinogenesis, participating in the invasion, transformation, angiogenesis, apoptosis and metastasis. The aim of this study was to elaborate the electrophoretic method of cysteine proteinases identification in the sera of patients suffering from chronic lymphocytic leukemia based on biotinylated iodoacetamide. Material and methods: Preliminary studies were carried out on the commercially available papain (EC ) well known and widely used plant cysteine protease with a molecular weight 23,4 kda. The study was conducted on the blood samples taken from patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and control sera from healthy donors. The sera after the preincubation with

37 Paulina Młudzik i wsp. 37 iodoacetamide were mixed with the sample buffer followed by electrophoresis on polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS PAGE). The separated proteins were electrophoretically transferred to the nitrocellulose membranes and subjected to the further analysis using streptavidin conjugated with horseradish peroxidase (HRP). The use of substrate for HRP 3,3 - diaminobenzidine tetrachloride (DAB) allows the biotinylated iodoacetamide and thereby cysteine proteinase identification. Results: The comparative analysis of the sera from the patients with chronic lymphocytic leukemia and the control sera led to the identification of additional protein with a cysteine protease characteristic having a molecular weight of about 37 kda, which did not occur or was present in a smaller amount of the control sera. Conclusions: The developed method allows the detection of cysteine proteases which are present in the control sera and the sera of patients with chronic lymphocytic leukemia. Key words: cysteine proteases, iodoacetamide, electrophoresis, chronic lymphocytic leukemia. Wstęp Nowotwory należą do jednych z najgroźniejszych chorób współczesnej cywilizacji. Mimo dużego postępu medycyny oraz sięgania po coraz nowocześniejsze metody diagnostyki i terapii wciąż stanowią poważny problem. Dlatego tak bardzo istotne jest wdrażanie nowych metod szybkiej diagnostyki i skutecznego leczenia. Duże znaczenie wśród technik diagnostyki laboratoryjnej ma oznaczanie we krwi pacjenta aktywności enzymów oraz stężenia markerów nowotworowych [1]. Wykazano, że oznaczanie aktywności proteinaz cysteinowych oraz ich inhibitorów może być pomocne w diagnostyce i monitorowaniu przebiegu chorób nowotworowych oraz ich terapii [2]. Proteinazy cysteinowe, nazywane inaczej proteinazami tiolowymi lub sulfhydrylowymi, są szeroko rozpowszechnioną grupą enzymów proteolitycz nych, występujących we wszystkich żywych organizmach. W warunkach fizjologicznych zlokalizowane są wewnątrzkomórkowo. Ich główną rolą jest

38 38 Elektroforetyczna identyfikacja proteinaz cysteinowych nieselektywna degradacja białek [3]. Zaangażowane są w wiele procesów fizjologicznych oraz patologicznych. Enzymy te uczestniczą m.in. w apoptozie, prezentacji antygenu, przemianie tkanki chrzęstnej i kostnej [4, 5] oraz aktywują wiele proenzymów, prohormonów i neuroprzekaźników [6]. Zwiększona aktywność i nieprawidłowa lokalizacja proteinaz cysteinowych może prowadzić do rozwoju wielu chorób tj. reumatoidalnego zapalenia stawów i zapalenia kości, choroby Alzheimera, stwardnienia rozsianego oraz dystrofii mięśniowej [7]. Liczne badania potwierdziły także ich znaczący udział w procesie nowotworzenia [8, 9]. Proteinazy cysteinowe zaangażowane są w proces kancerogenezy na wielu poziomach uczestniczą w inwazji, transformacji nowotworowej, angiogenezie, apoptozie i powstawaniu przerzutów [10]. Współdziałając z innymi enzymami proteolitycznymi, powodują degradację struktur macierzy pozakomórkowej i błony podstawnej otaczającej nowotwór, ułatwiając w ten sposób komórkom nowotworowym proliferację i rozsiewanie [5, 11]. Proteazy cysteinowe przyczyniają się również do uodpornienia komórek nowotworowych na działanie układu immunologicznego, chroniąc je przed lizą, dzięki czemu komórki nabywają zdolność do przerzutowania [12]. W trakcie rozwoju nowotworu, katepsyny, proteazy lizosomalne w większości zaliczane do proteaz cysteinowych, często przemieszczają się na powierzchnię komórek nowotworowych lub są wydzielane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, gdzie mogą promować inwazję guza [11]. Wykrycie tych białek w płynach pozakomórkowych może być podstawą rozpoznania choroby, czynnikiem prognostycznym [6], a także może pomóc w ocenie odpowiedzi na stosowaną terapię [2]. Podwyższona ekspresja proteinaz cysteinowych zarówno w tkankach nowotworowych, jak i surowicy pacjentów, często towarzyszy zwiększonej agresywności guza, gotowości do naciekania i tworzenia przerzutów [13]. Aktywność proteinaz regulowana jest przez ich inhibitory [3]. Nieodwracalnym i nieselektywnym inhibitorem wszystkich enzymów zawierających cysteinę w centrum aktywnym, stosowanym często w biologii molekularnej jest m.in. jodoacetamid [14]. Jest to związek alkilujący, wykorzystywany przy mapowaniu białek [15]. Ma on postać białych lub żółtych kryształów i jest rozpuszczalny w wodzie lub etanolu. Tworzy kowalencyjne wiązanie z grupą tiolową reszty cysteiny [14, 15]. Celem pracy było opracowanie elektroforetycznej metody

39 Paulina Młudzik i wsp. 39 identyfikacji proteinaz cysteinowych w surowicach pacjentów z przewlekłą białaczką w oparciu o jodoacetamid biotynylowany. Materiał i metody W badaniach wykorzystano handlowy preparat jodoacetamidu znakowanego biotyną (Sigma), papainę (Sigma) oraz 30 surowic uzyskanych z krwi pobranej do badań rutynowych do probówek z aktywatorem wykrzepiania od pacjentów Kliniki Hematologii Wojewódzkiego Wielospecjalistycznego Centrum Onkologii i Traumatologii im. M. Kopernika w Łodzi ze zdiagnozowaną przewlekłą białaczką limfocytową (PBL) oraz 30 surowic kontrolnych pochodzących od dawców krwi. Na badania uzyskano zgodę Komisji Bioetyki nr RNN/102/16/KE. W celu określenia mas cząsteczkowych wyznakowanych i rozdzielonych w żelach poliakrylamidowych proteinaz cysteinowych użyto wzorca mas cząsteczkowych Perfect Color Protein Ladder firmy EURx. Wzorzec ten zawiera 10 typów rekombinowanych białek, które po rozdziale elektroforetycznym wykazują masę cząsteczkową 7, 15, 20, 25, 35, 70, 100, 140 i 240 kda. Przygotowanie biotynylowanego jodoacetamidu. Roztwór podstawowy jodoacetamidu użyty w badaniach przygotowano rozpuszczając 8 mg liofilizowanego preparatu w 400 µl 0,05M buforu Tris HCl o ph 7,4, po czym sporządzono jego 5, 10, 100 i 1000 krotne rozcieńczenia. Streptawidyna wyznakowana peroksydazą chrzanową (Biokom). Liofilizat streptawidyny wyznakowanej peroksydazą chrzanową (HRP) przygotowano rozpuszczając 1 mg liofilizatu w 20 ml 0,05M buforu Tris HCl o ph 7,4. Papaina, EC (Sigma). Papaina jest proteinazą cysteinową o masie cząsteczkowej 23,4 kda. Roztwór papainy przygotowano rozpuszczając 4 mg preparatu w 500 µl 0,05 M buforu Tris HCl o ph 7,4. Przygotowanie preparatów znakowanych biotynylowanym jodoacetamidem do analizy elektroforetycznej. Do badanych surowic dodano biotynylowany jodoacetamid w stosunku 1:1 (4 µl surowicy mieszano z 4 µl roztworu biotynylowanego jodoacetamidu). Mieszaninę inkubowano przez 30 min w łaźni lodowej. Następnie dodano 8 µl buforu do prób bez merkaptoetanolu (2,5 ml 1M buforu Tris HCl o ph = 6,8; 2 ml etanolu, 4 ml glicerolu, 920 mg SDS oraz 400 µl 0,1% wodnego roztworu

40 40 Elektroforetyczna identyfikacja proteinaz cysteinowych błękitu bromofenolowego). Próby nanoszono do studzienek przygotowanego żelu poliakrylamidowego bez uprzedniego ogrzewania. W przypadku papainy, przygotowanie próby do elektroforezy przebiegało identycznie, jedyną różnicą była początkowa ilość roztworu papainy (10 µl roztworu papainy, 10 µl roztworu biotynylowanego jodoacetamidu inkubacja 30 min w łaźni lodowej; 20 µl buforu do prób bez merkaptoetanolu). Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym zawierającym SDS (SDS PAGE). Elektroforezę przeprowadzono w aparacie MiniProtean (BioRad). Przygotowywano 12,5% żele rozdzielające i 5% żele zatężające. Do studzienek nanoszono po 4 µl przygotowanych preparatów surowic, 10 µl przygotowanego preparatu papainy (preinkubowanych z biotynylowanym jodoacetamidem i buforem do prób). Elektroforezę prowadzono przy stałym napięciu 200V w czasie ok. 60 min. Transfer białek. Rozdzielone elektroforetycznie białka transferowano na nitrocelulozową membranę w czasie jednej godziny przy napięciu 100V (MiniProtean, BioRad). Detekcja biotynylowanego jodoacetamidu. Po przeprowadzonym transferze, membranę z przeniesionymi na nią białkami, płukano trzykrotnie przez 10 minut w 0,05M buforze Tris HCl o ph 7,4, a następnie inkubowano przez noc w 5% roztworze odtłuszczonego mleka w proszku w tym samym buforze, na kołysce laboratoryjnej w celu zablokowania miejsc niespecyficznego wiązania streptawidyny. Nitrocelulozową membranę ponownie płukano trzykrotnie po 10 min w buforze Tris HCl, po czym inkubowano przez jedną godzinę w roztworze streptawidyny wyznakowanej peroksydazą chrzanową. Po ponownym, trzykrotnym przemyciu, membrany zanurzano w roztworze czterochlorowodorku 3,3 diaminobenzydyny DAB (Sigma) do momentu pojawienia się brązowo zabarwionych pasm białkowych skoniugowanych z biotynylowanym jodoacetamidem. Reakcję stopowano poprzez przemywanie membran wodą destylowaną.

41 Paulina Młudzik i wsp. 41 Wyniki W badaniach wstępnych ustalono najbardziej korzystne stężenia handlowego preparatu papainy, białek surowicy, czasów inkubacji, wpływu obecności 2 merkaptoetanolu i ogrzewania prób na możliwość oddziaływania biotynylowanego jodoacetamidu z proteinazami cysteinowymi zawartymi w analizowanym materiale. W celu zweryfikowania możliwości tworzenia wiązań kowalencyjnych pomiędzy biotynylowanym preparatem jodoacetamidu a proteinazami cysteinowymi analizie poddano preparat papainy, proteinazy cysteinowej o masie cząsteczkowej 23,4 kda. Żel z rozdzielonymi po elektroforezie białkami wybarwiono błękitem Coomassie, a następnie odbarwiono w roztworze etanolu i kwasu octowego. Na analizowanym elektroforegramie (ryc. 1A) widoczne jest dominujące pasmo o masie cząsteczkowej 23,4 kda odpowiadające papainie i kilka frakcji o wyższych i niższych masach cząsteczkowych, które są prawdopodobnie zanieczyszczeniami preparatu handlowego enzymu. W celu sprawdzenia skuteczności wiązania biotynylowanego jodoacetamidu przez enzym, przygotowano roztwory papainy, które inkubowano 30 minut w temperaturze łaźni lodowej z rozcieńczeniami podstawowego roztworu jodoacetamidu. Analizę elektroforetyczną prowadzono po dodaniu do mieszaniny buforu do prób (bez merkaptoetanolu i bez standardowego ogrzewania próby przez 1 min w temperaturze 100 C). Rozdzielone elektroforetycznie białka transferowano na nitrocelulozową membranę, którą poddawano dalszej analizie techniką Western blot z wykorzystaniem streptawidyny znakowanej peroksydaza chrzanową. W wyniku analizy otrzymano dobrze widoczną (zabarwioną na brązowo) frakcję białkową lokującą się w elektroforegramie w regionie odpowiadającym masie cząsteczkowej papainy, która wynosi 23,4 kda. Lokujące się poniżej, mniej widoczne frakcje, również związane z biotynylowanym jodoacetamidem, są prawdopodobnie produktami degradacji enzymu (ryc. 1B).

42 42 Elektroforetyczna identyfikacja proteinaz cysteinowych Ryc. 1 A. Rozdział elektroforetyczny preparatu papainy w 12,5% żelu poliakrylamidowym zawierającym SDS (SDS PAGE) po wybarwieniu błękitem Coomassie. 1 wzorzec mas cząsteczkowych; 2 papaina 12,8 mg; 3 6 malejące ilości preparatu papainy (25,6; 12,8; 6,4; 3,2 µg) Fig. 1. A. Electrophoretic separation of papain in 12.5% polyacrylamide gel with SDS (SDS PAGE) after staining with Coomassie blue. 1 molecular weight standards; 2 papain 12.8 mg; 3 6 decreasing amount of papain (25.6; 12.8; 6.4; 3.2 µg)

43 Paulina Młudzik i wsp. 43 Ryc. 1 B. Analiza techniką Western blot preparatu papainy po uprzedniej inkubacji z biotynylowanym jodoacetamidem z następującą elektroforezą w 12,5% żelu poliakrylamidowym i transferem na membranę nitrocelulozową. 1 7 wzrastające ilości preparatu papainy (0; 0,8; 1,6; 3,2; 6,4; 12,8; 25,6 µg) inkubowanego z 10 krotnie rozcieńczonym roztworem podstawowym jodoacetamidu; 8 wzorzec mas cząsteczkowych Fig. 1. B. Western blot analysis of papain prior to the incubation with biotinylated iodoacetamide followed by electrophoresis in 12.5% polyacrylamide gel and transferred to nitrocellulose membrane. 1 7 increasing amounts of papain (0; 0.8; 1.6; 3.2; 6.4; 12.8; 25.6 µg) incubated with 10 fold diluted stock solution of iodoacetamide; 8 molecular weight standards W celu wykrycia obecnych w surowicy proteinaz cysteinowych, w eksperymentach wstępnych ustalono stężenia dodawanego do surowicy biotynylowanego jodoacetamidu, a pozostałe warunki reakcji były identyczne jak w przypadku przeprowadzonej analizy dla papainy. Przygotowano roztwór podstawowy biotynylowanego jodoacetamidu (patrz Materiały i metody ), po czym sporządzono jego 5, 10, 100 i 1000 krotne rozcieńczenia i określono najkorzystniejsze jego stężenie. Najlepszym okazało się 10 krotne rozcieńczenie roztworu podstawowego (ryc. 2).

44 44 Elektroforetyczna identyfikacja proteinaz cysteinowych Ryc. 2. Analiza techniką Western blot z zastosowaniem streptawidyny znakowanej peroksydazą chrzanową (HRP) białek surowicy kontrolnej po ich uprzedniej inkubacji z biotynylowanym jodoacetamidem z następującą elektroforezą w 12,5% żelu poliakrylamidowym i transferem na nitrocelulozową membranę. Analiza z użyciem różnych rozcieńczeń roztworu podstawowego jodoacetamidu. 1, 5 surowica kontrolna (1 µl) poddana inkubacji z roztworem podstawowym jodoacetamidu (80 µg); 2, 6 surowica kontrolna (1 µl) poddana inkubacji z 10 krotnie rozcieńczonym roztworem podstawowym jodoacetamidu (8 µg); 3, 7 surowica kontrolna (1 µl) poddana inkubacji z 100 krotnie rozcieńczonym roztworem podstawowym jodoacetamidu (0,8 µg); 4, 8 surowica kontrolna (1 µl) poddana inkubacji z 1000 krotnie rozcieńczonym roztworem podstawowym jodoacetamidu (0,08 µg) Fig. 2. Western blot analysis using streptavidin labeled horseradish peroxidase (HRP) of control serum proteins that were previously incubated with biotinylated iodoacetamide followed by electrophoresis in 12.5% polyacrylamide gel and transferred to nitrocellulose membrane. Analysis using different dilutions of the stock solution of iodoacetamide. 1, 5 control serum (1 μl) incubated with a stock solution of iodoacetamide (80 μg); 2, 6 control serum (1 μl) incubated with 10 fold diluted stock solution of iodoacetamide (8 μg); 3, 7 control serum (1 μl) incubated with 100 fold diluted stock solution of iodoacetamide (0.8 μg); 4, 8 control serum (1 μl) incubated with 1000 fold diluted stock solution of iodoacetamide (0.08 μg)

45 Paulina Młudzik i wsp. 45 Surowice kontrolne, jak i pochodzące od pacjentów ze zdiagnozowaną PBL poddano 30 minutowej inkubacji z 10 krotnie rozcieńczonym roztworem podstawowym biotynylowanego jodoacetamidu. Czas i warunki inkubacji oraz elektroforezę, transfer i analizę elektroforegramu za pomocą streptawidyny z peroksydazą chrzanową opisano w Materiałach i metodach. W pierwszym etapie prowadzonych doświadczeń badaniom poddano 30 surowic krwi pobranej od pacjentów ze zdiagnozowaną PBL oraz 30 surowic kontrolnych uzyskanych od zdrowych dawców. Surowice te pochodziły z kolekcji Zakładu Biochemii Farmaceutycznej i Diagnostyki Molekularnej, przechowywanej w temperaturze 20 C. Przeprowadzone badania wykazały różnicę w uzyskiwanych po elektroforezie i analizie techniką Western blot wzorach prążkowych surowic pacjentów z PBL i surowic kontrolnych (ryc. 3). W analizie surowic pobranych od pacjentów chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową i surowic kontrolnych zidentyfikowano kilka frakcji białkowych o charakterze proteinaz cysteinowych (reagujących z biotynylowa nym jodoacetamidem) lokujących się w elektroforegramie w szerokim zakresie mas cząsteczkowych od 37 do 240 kda. Najlepiej widoczne białka lokowały się w zakresie mas cząsteczkowych wynoszących około 37, 80 i 240 kda. O ile wyznakowane pasma białkowe o masach cząsteczkowych 80 i 240 kda były widoczne w obu analizowanych surowicach, choć wykazywały większą intensywność w surowicy pacjentów z PBL, o tyle pasmo o masie cząsteczkowej 37 kda było widoczne jedynie w surowicy pacjentów chorych na białaczkę.

46 46 Elektroforetyczna identyfikacja proteinaz cysteinowych Ryc. 3. Przykładowa analiza techniką Western blot białek surowic pochodzących od pacjentów z przewlekłą białaczką limfatyczną i zdrowych dawców po ich uprzedniej inkubacji z biotynylowanym jodoacetamidem z następującą elektroforezą w 12,5% SDS PAGE i transferem na nitrocelulozową membranę. 1 wzorzec mas cząsteczkowych (5 µl); 2, 4, 6, 8, 10 surowice pochodzące od pacjentów z przewlekłą białaczką limfatyczną (4 µl); 3, 5, 7, 9 surowice kontrolne pochodzące od zdrowych dawców (4 µl) Fig. 3. Exemplary of Western blot analysis of proteins of the sera from patients with chronic lymphocytic leukemia and healthy donors that were previously incubated with biotinylated iodoacetamide followed electrophoresis in 12.5% SDS PAGE and transfer to nitrocellulose membrane. 1 molecular weight standard (5 μl); 2, 4, 6, 8, 10 sera from patients with chronic lymphocytic leukemia (4 μl); 3, 5, 7, 9 control sera from healthy donors (4 μl)

47 Paulina Młudzik i wsp. 47 Analiza surowic pacjentów chorych na PBL i surowic kontrolnych, które bezpośrednio po pobraniu zostały zamrożone w 80 C wykazała obecność wyznakowanych jodoacetamidem frakcji białkowych o masach cząsteczkowych wynoszących około 37, 80 i 240 kda. Reakcja z biotynylowanym jodoacet amidem dla frakcji o m.cz. 80 i 240 kda charakteryzowała się podobną intensywnością. Należy jednak zwrócić uwagę na zdecydowanie większą intensywność wyznakowanej frakcji odpowiadającej m.cz. 37 kda dla surowic uzyskanych od pacjentów z PBL w porównaniu z surowicami kontrolnymi (ryc. 4). Ryc. 4. Przykładowa analiza techniką Western blot białek surowic pochodzących od pacjentów z przewlekłą białaczką limfatyczną i surowic kontrolnych pochodzących od zdrowych dawców zamrożonych bezpośrednio po pobraniu w 80 C po ich inkubacji z biotynylowanym jodoacetamidem z następującą elektroforezą w 12,5% żelu poliakrylamidowym i transferem na nitrocelulozową membranę. 1, 3, 5, 7, 9 surowice pochodzące od pacjentów z przewlekłą białaczką limfatyczną (4 µl); 2, 4, 6, 8 surowice kontrolne pochodzące od zdrowych dawców (4 µl); 10 wzorzec mas cząsteczkowych (5 µl) Fig. 4. Exemplary of Western blot analysis of the sera from patients with chronic lymphocytic leukemia and control sera from healthy donors frozen immediately after collection in the 80 C. They were incubated with biotinylated iodoacetamide followed electrophoresis in 12.5% polyacrylamide gel and they were transferred to nitrocellulose membrane. 1, 3, 5, 7, 9 sera from patients with chronic lymphocytic leukemia (4 μl); 2, 4, 6, 8 control sera from healthy donors (4 μl); 10 molecular weight standard (5 μl)

48 48 Elektroforetyczna identyfikacja proteinaz cysteinowych Dyskusja Proteinazom cysteinowym przypisuje się istotny udział w patomechanizmie chorób nowotworowych [16, 17]. Z tego względu, celem niniejszej pracy było opracowanie elektroforetycznej metody identyfikowania proteinaz cysteinowych, z wykorzystaniem jodoacetamidu biotynylowanego. Analizując dostępne piśmiennictwo nie znaleziono publikacji opisujących wykrywanie proteinaz cysteinowych w oparciu o znakowane ich inhibitory z następującą analizą elektroforetyczną i reakcją typu Western blot. Standaryzację metody rozpoczęto od wyboru procentowości żelu poliakrylamidowego, najkorzystniejszego do rozdziału proteinaz cysteinowych. Ustalono, że najszersze spektrum wykrywanych proteinaz cysteinowych uzyskuje się po elektroforezie w 12,5% żelu poliakrylamidowym. Następnie, przeprowadzono doświadczenia mające na celu wybór odpowiedniego buforu do prób. Wstępne wyniki wykazały, że użycie buforu bez merkaptoetanolu pozwala na uzyskanie dobrze widocznych, wyznakowanych białek o charakterze proteinaz cysteinowych. Natomiast, mieszanie preparatów surowic z buforem do prób zawierającym merkaptoetanol oraz ogrzewanie próbki przez jedną minutę w 100 C, powodowało powstawanie smug w obrazie rozdziału elektroforetycznego i niejednorodność prążków (dane niezamieszczone). Mogło być to spowodowane redukcją wiązań disiarczkowych przez merkaptoetanol [18]. Kolejnym krokiem standaryzacji metody było dobranie optymalnego stężenia roztworu jodoacetamidu, który jest nieodwracalnym inhibitorem proteinaz cysteinowych [19]. Najlepszym stężeniem okazało się 10 krotne rozcieńczenie roztworu podstawowego (1 mg/ml). Jodoacetamid jest substancją o bardzo małej masie cząsteczkowej wynoszącej ok. 185 Da, dlatego poddany rozdziałowi elektroforetycznemu lokuje się w czole elektroforegramu, co potwierdzono analizą z wykorzystaniem streptawidyny skoniugowanej z peroksydazą chrzanową poddając uprzednio próbę roztworu podstawowego jodoacetamidu oraz jego rozcieńczeń rozdziałowi z następującym transferem na membranę azotanu celulozy (dane niezamieszczone). W celu wstępnej weryfikacji skuteczności metody, do badań pilotowych użyto handlowego preparatu papainy, która jest najlepiej poznaną i scharakteryzowaną roślinną proteinazą cysteinową o masie cząsteczkowej ok. 23,4 kda, pochodzącą z Carica papaya (melonowiec właściwy), a w bazie MEROPS, klasyfikującej

49 Paulina Młudzik i wsp. 49 proteinazy cysteinowe w oparciu o homologię sekwencji i podobieństwo trójwymiarowej struktury, zaklasyfikowana jest do klanu CA i rodziny C1 [14]. Zarówno w otrzymanym elektroforegramie po wybarwieniu błękitem Coomassie, jak i po reakcji Western blot z użyciem streptawidyny skoniugowanej z HRP, uzyskano dobrze widoczne pasmo białkowe o masie cząsteczkowej 23,4 kda, odpowiadające papainie oraz słabiej zaznaczone frakcje o niższych masach cząsteczkowych, będące prawdopodobnie produktami degradacji enzymu. Doświadczenie to potwierdziło, że opracowana metoda wykorzystująca biotynylowany jodoacetamid może być wykorzystana do analizy proteinaz cysteinowych. W następnym etapie przystąpiono do analizy prób surowic krwi pobranych od pacjentów leczonych w Klinice Hematologii Wojewódzkiego Wielospecjalistycznego Centrum Onkologii i Traumatologii im. M. Kopernika w Łodzi z powodu zdiagnozowanej przewlekłej białaczki limfocytowej. Surowice pobrane od zdrowych dawców, pochodzące z kolekcji Zakładu Biochemii Farmaceutycznej i Diagnostyki Molekularnej, wykorzystano jako kontrole. W analizie surowic pobranych od pacjentów chorych na PBL i surowic kontrolnych zidentyfikowano kilka frakcji białkowych o charakterze proteinaz cysteinowych (reagujących z biotynylowanym jodoacetamidem) lokujących się w elektroforegramie w szerokim zakresie mas cząsteczkowych od 37 do 240 kda. Interesująca wydaje się wyznakowana jodoacetamidem proteinaza o masie cząsteczkowej 37 kda, ponieważ w surowicach przechowywanych w temperaturze 20 C ujawniała się ona jedynie w surowicach pacjentów cierpiących na białaczkę. W surowicach kontrolnych, które poddano analizie bezpośrednio po pobraniu lub przechowywano je w 80 C frakcja ta była również widoczna, ale charakteryzowała się niewielką intensywnością w porównaniu z analogiczną analizą przeprowadzoną na świeżych bądź przechowywanych w 80 C surowicach pacjentów z PBL. Odnosząc się do danych dostępnych w piśmiennictwie można przypuszczać, iż wyznakowana proteinaza cysteinowa o m. cz. 37 kda może być proenzymem katepsyny K [20] lub katepsyny B [21]. W celu ostatecznej identyfikacji, niezbędne wydaje się przeprowadzenie dalszych analiz polegających na próbie weryfikacji immunologicznej lub podjęciu próby częściowego jej zsekwencjonowania.

50 50 Elektroforetyczna identyfikacja proteinaz cysteinowych Wyniki zaprezentowane w niniejszej pracy jednoznacznie wskazują, że opracowana metoda wykorzystująca biotynylowany jodoacetamid znany, nieodwracalny inhibitor proteinaz cysteinowych może być przydatna do identyfikacji proteinaz cysteinowych w materiale biologicznym. Należy jednak podkreślić, że przechowywanie surowic w temperaturze 20 C oraz ich wielokrotne rozmrażanie i zamrażanie powoduje częściową utratę aktywności proteinaz cysteinowych. Surowice do tego typu analiz powinny być przechowywane w 80 C w małych porcjach i po rozmrożeniu użyte jednorazowo. Praca zrealizowana w ramach działań statutowych Zakładu Biochemii Farmaceutycznej i Diagnostyki Molekularnej 503/ / oraz finansowania dla młodych naukowców z funduszy Dziekana Wydziału Farmaceutycznego nr / / Piśmiennictwo 1. Ullah MF, Aatif M. The footprints of cancer development: Cancer biomarkers. Cancer Treat Rev. 2009; 35: Olson OC, Joyce JA. Cysteine cathepsin proteases: Regulators of cancer progression and therapeutic response. Nat Rev Cancer. 2015; 15; Dulemba J, Matuszewska A, Stefaniuk D, Jaszek M. Perspektywy wykorzystania proteaz cysteinowych i ich inhibitorów w biotechnologii i medycynie. Postępy w naukach medycznych, Lublin 2013: Berdowska I. Cysteine proteases as disease markers. Clin Chim Acta. 2004; 342: Vasiljeva O, Turk B. Dual contrasting roles of cysteine cathepsins in cancer progression: Apoptosis versus tumour invasion. Biochimie. 2008; 2: Turk V, Stokaa V, Vasiljevaa O, Renkoa M, Suna T. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Biochim Biophys Acta. 2012; 1824:

51 Paulina Młudzik i wsp Turk B, Turk D, Turk V. Lysosomal cysteine proteases: more than scavengers. Biochim Biophys Acta. 2000; 1477: Berdowska I, Siewiński M, Zarzycki Reich A, Jarmułowicz J, Noga L. Activity of cysteine protease inhibitors in human brain tumors. Med Sci Monit. 2001; 7: Siewiński M, Berdowska I, Mikulewicz W, Wnukiewicz J, Gutowicz J. Activity of cysteine proteases and their inhibitors in the lymph nodes of larynx cancer patients. Med Sci Monit. 2002; 8: Turk V, Kos J, Turk B. Cysteine cathepsins (proteases) On the main stage of cancer? Cancer Cell. 2004; 5: Gocheva V, Joyce JA. Cysteine Cathepsins and the Cutting Edge of Cancer Invasion. Cell Cycle. 2007; 6: Mai J, Finley R, Waisman D, Sloane B. Human Procathepsin B Interacts with the Annexin II Tetramer on the Surface of Tumor Cells. J Biol Chem. 2000; 275: Berdowska I, Siewiński M. Rola katepsyn cysteinowych oraz ich inhibitorów w procesach fizjologicznych i nowotworowych. Postępy Biochemii. 2000; 46: Findeisen P, Costina V, Yepes D, Hofheinz R. Functional protease profiling with reporter peptides in serum specimens of colorectal cancer patients: demonstration of its routine diagnostic applicability. J Exp Clin Canc Res. 2012; 10: Młudzik P, Mirowski M. Charakterystyka i znaczenie proteinaz cysteinowych w procesie nowotworzenia. Folia Medica Lodziensia. 2015; 42/2: Gawlik K, Poręba W, Gutowicz J. Cystatyny, tyropiny i inhibitory homologiczne do propeptydów proteaz cysteinowych. Postępy Biochemii. 2005; 51(3): Kwas M, Bucholc B, Ślusarczyk J. Zastosowanie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (SDS PAGE) do oceny struktury cząsteczek IgG głównego składnika preparatów ludzkich immunoglobulin do stosowania dożylnego. Medycyna doświadczalna. 2000; 52: Szajda S, Snarska J, Skrzydlewski Z, Zwierz K. Nowotworowy prokoagulant (CP) w chirurgicznej diagnostyce onkologicznej. Współczesna Onkologia. 2005; 9(10):

52 52 Elektroforetyczna identyfikacja proteinaz cysteinowych 20. Hou W, Brömme D, Zhao Y, Mehler E, Dushey C, Weinstein H. Characterization of novel cathepsin K mutations in the pro and mature polypeptide regions causing pycnodysostosis. J Clin Invest 1999; 103(5): Ellis R, Earnhardt J, Hayes R, Wang K, Anderson D. Cathepsin B mrna and protein expression following contusion spinal cord injury in rats. J Neurochem. 2004; 88:

53 Folia Medica Lodziensia, 2016, 43/1:53 68 Wyniki leczenia operacyjnego raka nerki w I Klinice Urologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi w latach Results of surgical treatment of kidney cancer in the Department of Urology, Medical University of Lodz in ANDRZEJ KIERSTAN, ZBIGNIEW JABŁONOWSKI, MAREK SOSNOWSKI I Klinika Urologii, III Katedra Chirurgii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Streszczenie Wstęp i cel badań: Standardowym leczeniem raka nerki jest nefrektomia radykalna z lub bez limfadenektomii i adrenalektomii. Guzy nerki o średnicy < 4 cm, operuje się metodami oszczędzającymi miąższ nerkowy (NSS). Celem badań była retrospektywna analiza wyników leczenia chorych na raka nerki poddanych w/w zabiegom operacyjnym. Porównano wyniki leczenia operowanych z dostępów przezotrzewnowego i pozaotrzewnowego. Materiały i metody: Grupę badaną stanowiło 238 chorych na raka nerki operowanych w latach Ocenie poddano 107 kobiet oraz 131 mężczyzn, w tym u 15 z nich stwierdzono przerzuty. Nefrektomię z dostępu przezotrzewnowego wykonano u 69 chorych, a z zaotrzewnowego u 108 i dodatkowo NSS u 55. Duże guzy > 6 cm usuwano głównie z dostępu przezotrzewnowego. Pozostałych chorych, również z guzami < 4, cm ze względu na zabiegi NSS operowano z dostępu lędźwiowego. Oceniano okres śródoperacyjny i pooperacyjny, czas trwania operacji, powikłania, czas pobytu w szpitalu, leczenie przeciwbólowe, przeżycie całkowite. Wyniki: Średni pobyt operowanych w szpitalu wynosił 11 dni, średni czas operacji około 168 minut. Największe, śródoperacyjne utraty krwi odnotowano u chorych z guzami nerki > 10 cm operowanych z dostępu przezotrzewnowego, ale w większości operacji była ona bez znaczenia klinicznego. Trzydziestu trzem chorym uzupełniano krew w okresie pooperacyjnym, w tym u 21,74% operowanych z dostępu przezotrzewnowego oraz u 10,65% operowanych z dostępu lędźwiowego. U operowanych z dostępu przezotrzewnowego użyto większych ilości leków przeciwbólowych w przebiegu pooperacyjnym niż Adres do korespondencji: prof. dr hab. n. med. Marek Sosnowski; I Klinika Urologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, USK im. WAM CSW; ul. Żeromskiego 113, Łódź; e mail: marek.sosnowski@umed.lodz.pl

54 54 Wyniki leczenia operacyjnego raka nerki u chorych operowanych z dostępu lędźwiowego. W badaniu histopatologicznym usuniętych guzów rozpoznano raka jasnokomórkowego u 85% pacjentów, a u 15% występował rak chromofobowy i brodawkowaty. Stopień złośliwości według skali Fuhrmana był następujący: Fuhrman 1 7,98%, Fuhrman 2 61,38%, Fuhrman 3 9,66%, Fuhrman 4 5,88%. Stopień 3 i 4 skali Fuhrmana występował częściej u chorych operowanych z dostępu przezotrzewnowego. Stopień zaawansowania miejscowego wg klasyfikacji TNM; rak nerki w stadium pt1 u 156 chorych, w stadium pt2 u 52 i pt3 u 1 chorego. U pacjentów operowanych z dostępu lędźwiowego i przezotrzewnowego rozkład tych rozpoznań i stadiów był podobny. Wyniki leczenia określono oceniając przeżycia 5 letnie w podgrupie 115 chorych operowanych w latach Uzyskane dane wykazały, że 5 7 letnie przeżycie w tej podgrupie wynosiło 58,3%, a zmarło 48 operowanych tj. 41,7%,w tym wszyscy operowani w stadium przerzutowym choroby. Wnioski: W leczeniu raka nerki w przypadku dużych guzów > 6 cm preferowane było wykonanie nefrektomii z dostępu przezotrzewnowego. U pozostałych chorych operacje przeprowadzano z dostępu lędźwiowego, w tym zabiegi oszczędzające nerkę. Agresywny rak jasnokomórkowy nerki w 3 i 4 stopniu skali Furhmana występuje częściej u chorych z dużymi guzami operowanych z dostępu przezotrzewnowego. Liczba powikłań w okresie śród i pooperacyjnym jest podobna dla obu grup operowanych z różnych dostępów. Zastosowanie dostępu przezotrzewnowego jest związane z podawaniem zwiększonej ilości leków przeciwbólowych w przebiegu pooperacyjnym oraz dłuższym czasem zabiegu i pobytem w szpitalu. Ogólne 5 letnie przeżycie dla podgrupy 115 chorych operowanych w latach wynosiło 58,3%. Słowa kluczowe: rak nerki, leczenie operacyjne. Abstract Introduction. Aim of the study: The only effective treatment method for all forms of the kidney cancer is surgery with possible subsequent institution of neoadjuvant treatment. The standard management involves nephrectomy with or without lymphadenectomy and adrenalectomy. In patients with kidney tumors up to 4 cm in diameter, surgical procedures saving the renal parenchyma (Nephron-Sparing Surgery NSS) are currently performed. The objective was the retrospective analysis of the treatment results obtained in renal cancer patients

55 Andrzej Kierstan i wsp. 55 who had undergone surgical procedures. The results of the treatment following nephrectomy performed from transperitoneal and retroperitoneal approach were compared with those obtained after NSS type procedures. Material and methods: The study was carried out in 238 patients: 107 women and 131 men with kidney cancer, operated on in the years In 15 patients distant metastases were found. The nephrectomy was performed in 69 patients from transperitoneal access and in 105 patients from retroperitoneal access with NSS procedures in 55 patients. The transperitoneal approach was used in patients with large tumors ranging > 6 cm size. Other patients were operated on with lumbar access, also those with tumors < 4 cm, since that approach was used for NSS procedures. The intraoperative and postoperative period, the duration of the surgery, complications, hospitalization time, analgesic treatment and overall survival were evaluated. Results: The operated patients were hospitalized for 11 days on the average, and the mean time of the surgical procedure was ca. 168 minutes. Intraoperative blood loss during most of the performed procedures was without clinical significance but the largest blood loss during the operation was reported in the patients with kidney tumors > 10 cm during transperitoneal access surgery. The blood loss was compensated in 33 cases by the administration of RBC preparations in 21.74% of the patients after transperitoneal access surgeries and 10.65% of those after lumbar access. Retroperitoneal access was associated with the use of larger quantities of analgesic medications in the postoperative period. Histopathological investigations resulted with clear cell carcinoma in 85% of the patients, in other 15% of the cases, most commonly diagnosed with chromophobe and papillary carcinomas. The malignancy grade of RCC according to Fuhrman scale; Fuhrman %, Fuhrman %, Fuhrman %, Fuhrman %. Fuhrman grades 3 and 4 were, however, more common in the patients with the big tumors undergoing transperitoneal access. The local advancement of the removed kidney tumors according to TNM classification: stage pt1 in 156 patients, stage pt2 in 52 and pt3 in 1 patient. The distribution of diagnoses and staging was similar for both surgical approaches. The results of kidney cancer treatment were reflected by the assessment of 5 year survival of the patients. Such analysis was possible only in the subgroup of 115 patients who had undergone the surgery in the years The obtained data indicated the overall 5 year survival

56 56 Wyniki leczenia operacyjnego raka nerki rate amounting to 58.3% of the reviewed subgroup, whereas 48 patients, i.e. 41.7% died. The causes of death were not possible to know. It is noteworthy that the group of deaths included all the patients operated on at the metastatic stage of the disease. Conclusions: In large renal tumors > 6 cm size, transperitoneal access nephrectomy was preferred. In the remaining patients lumbar access procedures were performed, including kidney-sparing surgery. Fuhrman grade 3 and 4 clear cell tumors are predominant in the patients operated on with transperitoneal access. The number of intra- and postoperative complications is similar in both groups. The use of transperitoneal access is associated with an increase in the amount of analgesics administered in the postoperative course, longer duration of the surgical procedure and longer hospitalization time. The overall 5 year survival rate for the group of 115 patients operated on in the years was 58.3%. Key words: kidney cancer, surgical treatment of kidney cancer. Wstęp Rak nerki stanowi od 3% do 4% wszystkich nowotworów złośliwych ludzi dorosłych. Występuje częściej u mężczyzn niż u kobiet, w stosunku 3:2, zwykle w 6 7 dekadzie życia. Liczba nowych zachorowań rośnie rocznie o około 2 3%. W Polsce w 2011 roku, zachorowania na raka nerki u 2702 mężczyzn stanowiły 3,8% wszystkich nowotworów, natomiast zgony 1546 przypadków tj. 2,7% wszystkich nowotworów. U kobiet odpowiednio 1813 przypadków tj. 2,5% w strukturze zachorowań oraz 998 przypadków zgonów. Rak nerki posiada największy 5 letni współczynnik śmiertelności wśród nowotworów urologicz nych wynoszący w granicach 40%. U około 25% chorych z rozpoznanym rakiem nerki choroba ma charakter uogólniony, a u 25% 30% miejscowo zaawansowany [1]. Postępowanie terapeutyczne jest uzależnione w istotny sposób od stopnia zaawansowania klinicznego. Jedynym skutecznym sposobem leczenia ograniczonej postaci raka nerki jest leczenie operacyjne, a dla postaci z przerzutami nefrektomia z ewentualnym wdrożeniem leczenia adjuwantowego.

57 Andrzej Kierstan i wsp. 57 Standardowym postępowaniem jest wykonanie nefrektomii radykalnej z lub bez limfadenektomii i adrenalektomii. U chorych z guzami nerki o średnicy do 4 cm, wykonuje się zabiegi oszczędzające miąższ nerkowy (NSS). Nefrektomię radykalną czy zabieg NSS coraz częściej wykonuje się metodą laparoskopową, a jej skuteczność porównywalna jest z klasycznymi otwartymi metodami chirurgicznymi [2]. Celem badania była retrospektywna analiza wyników operacyjnego leczenia chorych na raka nerki. Porównano wyniki leczenia po zastosowaniu nefrektomii radykalnej z dostępu przezotrzewnowego i pozaotrzewnowego oraz wyniki leczenia za pomocą operacji oszczędzającej narząd (NSS). Materiał i metody Badaniom poddano 238 chorych na raka nerki rozpoznanego na podstawie dodatkowych badań obrazowych, operowanych w latach w I Klinice Urologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. Wśród ocenianych osób było 107 kobiet oraz 131 mężczyzn. U 15 chorych stwierdzono przerzuty odległe, a najczęstszym miejscem ich lokalizacji były płuca (9 chorych), nadnercze (5 chorych) oraz kości (4 chorych). Operacje nefrektomii wykonywano z dostępu przezotrzewnowego oraz z dostępu zaotrzewnowego lędźwiowego (nefrektomia i NSS). W pierwszej grupie 183 chorych wykonano nefrektomię radykalną, w tym 69 operowano z dostępu przezotrzewnowego (25 kobiet oraz 44 mężczyzn), a 169 zabiegów z dostępu lędźwiowego (82 kobiety i 87 mężczyzn), w tym u 55 chorych wykonano zabieg NSS. Z dostępu przezotrzewnowego operowano chorych z dużymi guzami nerek od 6 cm do 15 cm, a pozostałych pacjentów z dostępu lędźwiowego, w tym również metodą NSS w przypadku guzów < 4 cm. Usunięte guzy nerek oceniane były w Zakładzie Patomorfologii i Cytopatologii Klinicznej UM w Łodzi. W ocenie wyników leczenia tych dwóch grup chorych operowanych z różnych dostępów uwzględniano: a/ parametry śródoperacyjne; czas trwania zabiegu, utratę krwi, uszkodzenia narządów sąsiednich, b/ parametry pooperacyjne; czas pobytu w szpitalu, ilość i rodzaj stosowanych środków przeciwbólowych, czas gojenia rany pooperacyjnej. Poddano ocenie również wyniki leczenia grupy chorych poddanych zabiegom NSS, w której uwzględniono w/w parametry. Dla oceny stopnia zaawansowania klinicznego nowotworu

58 58 Wyniki leczenia operacyjnego raka nerki wykorzystano klasyfikację TNM wg UICC (ang. Union for International Cancer Control), a stopień złośliwości raka nerki oceniano na podstawie skali podanej przez Fuhrmana. Na podstawie danych uzyskanych z Wydziału Udostępniania Informacji Departamentu Spraw Obywatelskich MSWiA oceniono 5 letnie przeżycie chorych operowanych w latach Następnie uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej. Na przeprowadzenie w/w badań klinicznych otrzymano pozytywną opinię Komisji Bioetyki Uniwersytetu Medycznego w Łodzi (RNN/61/10/KB). Wyniki Wszyscy chorzy przeżyli zabieg operacyjny i nie obserwowano zgonów w przebiegu śród i pooperacyjnym. Średni pobyt operowanych w szpitalu wynosił 11 dni, a średni czas wykonywanych operacji około 168 minut (Tabela I). Tabela I. Czas trwania zabiegu i pobytu w szpitalu. Table I. The duration of the surgery and hospital stay. Czas trwania zabiegu w min Pobyt w szpitalu w dniach N (liczba chorych) 238,0 238,0 średnia 168,7 11,0 mediana 165,0 10,5 minimum 75,0 6,0 maximum 380,0 32,0 kwartyl 25% 140,0 8,0 kwartyl 75% 180,0 12,0 rozstęp (min max) 305,0 26,0 odch.stand. 43,8 5,4 W grupie chorych poddanych leczeniu organooszczędzającemu nie było konieczności stosowania leczenia nerkozastępczego (dializoterapii). Obserwo wano jedynie przejściowe podwyższenie parametrów nerkowych, które ulegało obniżeniu i normalizacji po kilku dniach. Śródoperacyjna utrata krwi była bez znaczenia klinicznego, ale u 25 chorych wynosiła > 300 ml i u 33 tj. 13,8% operowanych uzupełniano krew w okresie pooperacyjnym. Największą utratę

59 Andrzej Kierstan i wsp. 59 krwi w trakcie operacji odnotowano u chorych z guzami nerki > 10 cm operowanych przezotrzewnowo (17 chorych 21,7%) oraz operowanych z dostępu lędźwiowego (18 chorych 10,6%) (Tabela II). Tabela II. Przetaczanie krwi po nefrektomii w zależności od dostępu. Table II. Blood transfusion after nephrectomy depending on the access. DOSTĘP przezotrzewnowy lędźwiowy Razem nie % kolumny 78,26% 89,35% tak % kolumny 21,74% 10,65% Razem Dla uśmierzenia i łagodzenia bólu w okresie pooperacyjnym stosowano leki przeciwbólowe, z których najczęściej podawano Tramal i Perfalgan oraz Ketonal (Ryc. 1). Ryc. 1. Stosowane leki p/bólowe. Fig. 1. Drugs used against pain.