Gdański Uniwersytet Medyczny Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej. Anna Ronowicz

Transkrypt

1 Gdański Uniwersytet Medyczny Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Anna Ronowicz Zmiany liczby kopii DNA i mutacje genów warunkujących stabilność genomową w nienowotworowej tkance gruczołu sutkowego, guzach pierwotnych i przerzutach do węzłów chłonnych od pacjentek z rakiem piersi Praca wykonana w Katedrze i Zakładzie Biologii i Botaniki Farmaceutycznej Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego Promotor dr. hab. n. farm. Arkadiusz Piotrowski, prof. nadzw. GUMed Gdańsk 2016

2 Streszczenie Mutacje germinalne w genach predyspozycji odpowiadają za około 5-10% przypadków nowotworów piersi (dziedziczny rak piersi), podczas gdy zdecydowana większość nowotworów złośliwych gruczołu piersiowego to przypadki sporadyczne (90-95%), charakteryzujące się wysokim stopniem heterogeniczności pod względem klinicznym, histopatologicznym oraz molekularnym. Mimo, że etiologia sporadycznego raka piersi nie jest w pełni wyjaśniona, to dotychczasowe wyniki badań naukowych dowodzą, iż zmiany odpowiedzialne za rozwój sporadycznych nowotworów złośliwych obejmują, w większości, somatyczne rearanżacje strukturalne o charakterze zmian liczby kopii DNA (ang. Copy Number Alternations, CNAs ), oraz somatyczne mutacje genów kierujących (ang. driver genes). Niemniej jednak, nie można jednoznacznie wykluczyć istnienia germinalnej komponenty genetycznej, która w różnym stopniu wpływać może na ryzyko rozwoju nowotworu, m.in. poprzez zwiększenie niestabilności genomu. Istniejące przesłanki wskazują, że do destabilizacji genomu może dochodzić we wczesnych etapach procesu nowotworzenia, tj. w pozornie zdrowej, nienowotworowej tkance gruczołu sutkowego. Dlatego pierwszym celem pracy była próba identyfikacji i oceny somatycznych, niezrównoważonych genomowych rearanżacji strukturalnych, tj. zmian liczby kopii DNA, z uwzględnieniem zjawiska mozaicyzmu (ang. somatic mosaicism for DNA copy-number alterations, SMC-CNAs), w nienowotworowej tkance gruczołu piersiowego od pacjentek z rakiem piersi, w porównaniu do guzów pierwotnych i przerzutów do węzłów chłonnych. Materiał kliniczny obejmował zamrożone skrawki tkanek gruczołu sutkowego, pozyskane od 59 pacjentek z nowotworem piersi, bez rodzinnej historii choroby wg wywiadu rodzinnego, które nie zostały poddane terapii neoadiuwantowej. Skrawki pochodziły z nienowotworowej tkanki gruczołu sutkowego (n=59), guzów pierwotnych (n=59) i przerzutów do węzłów chłonnych (n=59). Ponadto, jako materiał referencyjny użyto DNA wyizolowane z leukocytów krwi obwodowej pacjentek (n=30), a w przypadku braku próbki krwi pacjentki, zastosowano DNA wyizolowane z połączonych prób leukocytów krwi obwodowej pochodzących od kobiet z populacji ogólnej. Analiza zmian liczby kopii DNA została wykonana metodą porównawczej hybrydyzacji genomowej (ang. array based Comparative Genomic Hybridization, acgh) z zastosowaniem mikromacierzy oligonukleotydowych (NimbleGen-Roche). W 10% (n=6/59) próbek nienowotworowej tkanki gruczołowej zidentyfikowano od 1 do 359 dużych SMC-CNAs (odcięcie: >500 kpz, średnia: 1328 kpz, mediana: 961 kpz). Zmiany te znajdowały się w znacznej ilości komórek ( 10%, z czego ponad połowa występowała w 45% komórek) tkanek gruczołu piersiowego. Zdecydowana większość wykrytych SMC-CNAs wykazywała charakter stochastyczny, wskazując na destabilizację genomu, o czym świadczy tylko częściowe pokrycie profilów CNAs nienowotworowej tkanki gruczołu piersiowego (H), guzów pierwotnych (T) oraz przerzutów do węzłów chłonnych (M) (średnio 50% H vs T, 17% H vs M, 28% T vs M), a także znaczny międzyosobniczy rozrzut lokalizacji CNAs. Czterdzieści pięć wykrytych SMC-CNAs poddano

3 weryfikacji niezależną metodą, qpcr, która wykazała zgodność z wynikami uzyskanymi metodą acgh na poziomie 87% (potwierdzono n=39/45 zmian). Na podstawie wyników acgh postawiono kolejną hipotezę, że obserwowana destabilizacja genomu nienowotworowej tkanki gruczołu sutkowego może mieć związek z mutacjami genów odpowiedzialnych za utrzymanie stabilności genomu. Dlatego próby, w których wykryto duże SMC- CNAs, zakwalifikowano do sekwencjonowania znanych genów predyspozycji lub somatycznych genów kierujących w raku piersi. Analizę tę wykonano metodą celowanego sekwencjonowania następnej generacji (ang. next generation sequencing,ngs). Wyniki NGS wykazały obecność mutacji punktowych oraz rzadkich wariantów (MAF<0,005) w genach uczestniczących w procesach utrzymania integralności genomu: BRCA1 (p.gln1756profs*74, p.arg504cys), BRCA2 (p.asn3124ile), NCOR1 (p.pro1570glnfs*45), PALB2 (p.ser500pro) i TP53 (p.arg306*). Wykazano, że duże SMC-CNAs, a także mutacje punktowe, lub rzadkie warianty w genach predyspozycji lub somatycznych genach kierujących mogą być obecne i koegzystować w znacznej części komórek nienowotworowej tkanki gruczołu piersiowego. Ta obserwacja sugeruje czasowy i przestrzenny potencjał nowotworowy pozornie zdrowej tkanki gruczołowej w patogenezie raka piersi. Ponadto, podczas realizacji zasadniczych celów rozprawy doktorskiej opracowano oryginalne rozwiązanie techniczne, tj. metodę regeneracji mikromacierzy oligonukleotydowych, wraz z optymalizacją procesu znakowania DNA. Metoda regeneracji umożliwia nawet czterokrotne użycie jednej mikromacierzy w procedurze acgh, bez zauważalnego wpływu na jakość uzyskanych wyników. Optymalizacja znakowania DNA poprawiła wydajność procesu, a w konsekwencji umożliwiła redukcję zużycia odczynników o połowę w stosunku do ilości zalecanej przez producenta. Optymalizacja znakowania DNA wraz z regeneracją mikromacierzy przyczyniły się do redukcji kosztów badań zawartych w rozprawie, a także innych projektów naukowych.

4 Abstract Germline mutation in breast cancer predisposition genes account for 5 10% of cases of this neoplasm. The majority of invasive cancers are sporadic cases (90-95%) that are characterized by high level of heterogeneity of clinical, histological and molecular features. Although the etiology of sporadic breast cancer remains largely unclear, available experimental evidence indicates that somatic structural rearrangements in the form of Copy Number Alternations (CNAs) and somatic mutations in driver genes are the major causal factors in sporadic invasive cancers. Nevertheless, contribution of germline factors cannot be unambiguously excluded from carcinogenesis of sporadic cancers. Carcinogenesis may be, to varying degrees, influenced by constitutional genetic background, e.g. by increasing genomic instability. Moreover, it has been reported that development of genomic instability may occur early in cancer initiation, i.e. in seemingly healthy, non-tumor uninvolved mammary glandular tissue. Therefore, the first aim of the thesis was to identify and characterize somatic mosaicism for DNA copy-number alterations (SMC-CNAs) in uninvolved mammary glandular tissue from breast cancer patients, and collate the genomic profiles with those of corresponding primary tumors and auxiliary lymph node metastases. DNA was isolated from snap frozen material from invasive breast cancer cases, including primary tumors (n=59), lymph node metastases (n=59), and healthy glandular tissue (n=59). Individuals selected for the study received no neoadjuvant therapy and were reportedly sporadic, based on medical history and phenotypic checklist. Peripheral blood DNA from the same patient was used as the preferred reference. If blood DNA was unavailable, tumor samples were hybridized versus unaffected glandular tissue from the same individual. Subsequently, glandular tissue was hybridized versus pool of blood DNA from healthy female individuals (Promega). The analyses were carried out using array based Comparative Genomic Hybridization (acgh) on oligonucleotide microarrays (NimbleGen-Roche). Microarray hybridization experiments showed 10% (6/59) of patients harbored one to 359 large SMC-CNAs (mean: 1,328 kbp; median: 961 kbp) in a substantial portion of glandular tissue cells ( 10%, over half of which occurred in 45% of cells), distal from the primary tumor site. SMC-CNAs were partially recurrent in tumors and uninvolved mammary glandular tissue (an overlap: 50% H vs T, 17% H vs M, 28% T vs M), albeit with considerable contribution of stochastic SMC-CNAs indicating genomic destabilization. Furthermore considerable inter-individual dispersion of CNAs localization was also noted. Independent validation of 45 selected CNAs was carried out with qpcr using relative quantification and resulted in the confirmation of 39/45 CNAs, corresponding to an 87% concordance rate between acgh and qpcr results. Based on acgh results, another hypothesis was formulated that mutations in genes participating in maintenance of genomic stability predetermine the observed genomic destabilization in the uninvolved mammary glandular tissue. Therefore, the samples which harbored large SMC-CNAs

5 were subjected to targeted resequencing of known breast cancer predisposition loci as well as somatic driver genes. The analyses were carried out using next generation sequencing (NGS). NGS results showed mutations and rare variants (MAF < 0.005) in genes related to maintenance of genomic integrity: BRCA1 (p.gln1756profs 74, p.arg504cys), BRCA2 (p.asn3124ile), NCOR1 (p.pro1570glnfs 45), PALB2 (p.ser500pro), and TP53 (p.arg306 ). In conclusion, the results demonstrate that gross DNA CNAs as well as point mutations or rare variants in crucial cancer predisposing or driver genes, which are related to maintenance of genomic stability, may be present and co-occur in a substantial portion of uninvolved glandular tissue cells. This raises the question of the temporal and spatial neoplastic potential of uninvolved glandular tissue in the pathogenesis of breast cancer. Moreover, an added value to the primary aims of the thesis, was development of regeneration method of comparative genomic hybridization oligonucleotide microarrays with dimethylurea and optimalization of DNA labeling procedure. This method provides reproducible detection of genomic aberrations in up to four hybridization rounds using regenerated microarray slides. The improved DNA fluorescent labeling protocol has high efficiency, hence reducing the amount of expensive labeling reagents by half compared to the original protocol. This procedure of array regeneration was validated using an array CGH analysis platform in the present thesis. However, in subsequent collaborative projects, the method was shown as applicable to other types of microarray hybridization experiments.