BBL Crystal Identification Systems

Transkrypt

1 BBL Crystal Identification Systems U.S. Pat. 5,182,082 PRZEZNACZENIE System identyfikacji (ID) BBL Crystal Enteric/Nonfermenter (E/NF) s³u y do identyfikacji tlenowych bakterii Gram-ujemnych nale ¹cych do rodziny Enterobacteriaceae, jak równie niektórych czêœciej izolowanych Gram-ujemnych fermentuj¹cych i niefermentuj¹cych glukozy laseczek. STRESZCZENIE I OBJAŒNIENIE System BBL Crystal E/NF ID jest zminiaturyzowanym zestawem identyfikacyjnym. Wiele z u ytych testów to modyfikacje metod klasycznych. Obejmuj¹ one testy w kierunku fermentacji, utleniania, rozk³adu oraz hydrolizy ró nych substratów. Dodatkowo, w celu wykrycia enzymów, dziêki którym bakterie metabolizuj¹ ró ne substraty, u ywane s¹ substraty zwi¹zane z chromogenami 1-5. Zestaw BBL Crystal E/NF ID obejmuje: (i) pokrywki panelowe BBL Crystal E/NF, (ii) podstawki BBL Crystal oraz (iii) probówki z p³ynem inokulacyjnym (IF) BBL Crystal Enteric/Stool ID. Pokrywka zawiera 30 odwodnionych substratów na koñcówkach plastikowych z¹bków. Podstawka zawiera 30 studzienek reakcyjnych. Inokulum testowe sporz¹dzone jest z p³ynu inokulacyjnego i u ywane jest do wype³nienia wszystkich 30 studzienek w podstawce. Po dopasowaniu i zatrzaœniêciu pokrywki i podstawki inokulum testowe nas¹cza suche substraty i inicjuje reakcje testowe. Po up³ywie okresu inkubacji nale y sprawdziæ, czy nast¹pi³a zmiana koloru studzienek. Zmiana zabarwienia wynika z aktywnoœci metabolicznej drobnoustrojów. Otrzymany wzór 30 reakcji konwertowany jest do 10-cyfrowego numeru profilu, który u ywany jest jako podstawa identyfikacji 6. Wzory reakcji biochemicznych i enzymatycznych 30 substratów BBL Crystal E/NF ID dla rozmaitych drobnoustrojów przechowywane s¹ w bazie danych BBL Crystal E/NF ID. Identyfikacja wynika z analizy porównawczej wzorów reakcji badanych izolatów z tymi, które przechowywane s¹ w bazie danych. Kompletna lista grup taksonomicznych obejmuj¹ca obecn¹ bazê danych E/NF przedstawiona jest w tabeli 1 (strona 7). ZASADY PROCEDURY Testy u ywane w systemie BBLCrystal E/NF ID opieraj¹ siê na wykrywaniu za pomoc¹ systemów ró nych wskaÿników wykorzystania i rozk³adu przez bakterie okreœlonych substratów. Reakcje fermentacji wykrywaj¹ zdolnoœæ izolatów do metabolizowania wêglowodanów w warunkach braku dostêpu tlenu atmosferycznego, a reakcje utleniania oparte s¹ na zdolnoœci drobnoustrojów do metabolizowania substratu z udzia³em tlenu jako ostatecznego akceptora elektronu. Obie reakcje wykrywane s¹ zazwyczaj przy u yciu wskaÿnika ph znajduj¹cego siê w substracie testowym. Substraty chromogenne pod wp³ywem hydrolizy wywo³uj¹ zmianê zabarwienia, która mo e byæ wykryta wzrokowo. Dodatkowo istniej¹ inne testy, które wykrywaj¹ zdolnoœæ organizmu do hydrolizy, rozk³adu, redukcji lub innego sposobu wykorzystania substratu wchodz¹cego w sk³ad systemu BBL Crystal ID. Reakcje zaanga owane przez ró ne substraty oraz krótkie wyjaœnienie zasad stosowanych w niniejszym systemie opisane s¹ w czêœci Odczynniki. ODCZYNNIKI Panel BBL Crystal E/NF ID zawiera 30 enzymatycznych i biochemicznych substratów opisanych poni ej. Lokalizacja panelu oznacza rz¹d oraz kolumnê, w których umieszczona jest studzienka (na przyk³ad: 1J odnosi siê do rzêdu 1 w kolumnie J). Odczynniki oraz zasady testów wchodz¹cych w sk³ad systemu BBL Crystal E/NF ID System Lokalizacja panelu Sk³adnik aktywny Enteric/Nonfermenter ID Kit Iloœæ Kod przybli ona Dodatni Ujemny (g/10 ml) 4A Arabinoza ARA 3,5 z³oty/ ó³ty pomarañcz./czerw. 4B Mannoza MNS 3,0 z³oty/ ó³ty pomarañcz./czerw. 4C Sacharoza SUC 2,8 z³oty/ ó³ty pomarañcz./czerw. 4D Melibioza MEL 1,0 z³oty/ ó³ty pomarañcz./czerw. 4E Ramnoza RHA 3,0 z³oty/ ó³ty pomarañcz./czerw. 4F Sorbitol SOR 3,5 z³oty/ ó³ty pomarañcz./czerw. 4G Mannitol MNT 1,8 z³oty/ ó³ty pomarañcz./czerw. 4H Adonitol ADO 2,5 z³oty/ ó³ty pomarañcz./czerw. 4I Galaktoza GAL 1,5 z³oty/ ó³ty pomarañcz./czerw. 4J Inozytol INO 1,3 z³oty/ ó³ty pomarañcz./czerw. Zasada (Referencja) JAA 2007/06 Polski Utylizacja wêglowodanów powoduje obni enie ph oraz zmianê indykatora (czerwieñ fenolowa) 7-10.

2 Odczynniki oraz zasady testów wchodz¹cych w sk³ad systemu BBL Crystal E/NF ID System (ci¹g dalszy) Lokalizacja panelu Sk³adnik aktywny Iloœæ Kod przybli ona Dodatni Ujemny (g/10 ml) Œrodki ostro noœci: Do stosowania w diagnostyce in vitro. Po u yciu wszystkie materia³y zakaÿne, jak p³ytki, wymazówki, probówki z inokulum, papierowe filtry u ywane do testów na oksydazê lub indol oraz panele BBL Crystal musz¹ byæ przed usuniêciem lub spaleniem wyja³owione w autoklawie. PRZECHOWYWANIE I SPOSÓB POSTÊPOWANIA/DOPUSZCZALNY OKRES MAGAZYNOWANIA Po odebraniu zestaw BBL Crystal E/NF nale y przechowywaæ w temperaturze 2 25 C. NIE ZAMRA AÆ. Jeœli zestaw lub jego czêœci przechowywane s¹ w lodówce, to przed u yciem nale y doprowadziæ je do temperatury pokojowej. Pokrywki: Pokrywki pakowane s¹ pojedynczo i musz¹ byæ przechowywane nieotwarte. Nale y wzrokowo oceniæ opakowanie pod k¹tem dziur lub pêkniêæ foliowego opakowania. Nie nale y u ywaæ, jeœli opakowanie wygl¹da na uszkodzone. P³ytki znajduj¹ce siê w oryginalnym opakowaniu, przechowywane w zalecanych warunkach zachowaj¹ oczekiwan¹ reaktywnoœæ do daty wa noœci. Podstawki: Podstawki pakowane s¹ w dwa zestawy po dziesiêæ sztuk na tacach inkubacyjnych BBL Crystal. Podstawki ustawione s¹ stron¹ robocz¹ w dó³, aby zminimalizowaæ ryzyko zanieczyszczenia drog¹ powietrzn¹. Nieu ywane podstawki nale y przechowywaæ na tacy, w plastikowej torebce. Puste tace powinny byæ u yte do inkubacji paneli. P³yn inokulacyjny: P³yn inokulacyjny (IF) BBL Crystal Enteric/Stool ID pakowany jest w dwa zestawy po dziesiêæ probówek. Nale y wzrokowo oceniæ probówki pod k¹tem pêkniêæ, wycieków itd. Nie nale y ich u ywaæ, jeœli zauwa ony zostanie wyciek, uszkodzenie probówki lub nakrywki lub gdy widoczne s¹ oznaki zanieczyszczenia (np. brak przejrzystoœci, zmêtnienie). Data wa noœci podana jest na etykiecie probówki. P³yn inokulacyjny BBL Crystal Enteric/Stool ID mo e byæ u ywany zarówno z panelami BBLCrystal E/NF, jak i RS/E. POBIERANIE PRÓBEK I OBCHODZENIE SIÊ Z NIMI Systemy BBLCrystal ID nie s¹ przeznaczone do bezpoœredniego u ycia z próbkami klinicznymi. Nale y u ywaæ izolatów z p³ytek z pod³o em agarowym z krwi¹, takich jak Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood. Dopuszczalne jest stosowanie p³ytek z pod³o em MacConkey'a. Izolat testowy musi pochodziæ z czystej, nie starszej ni 24 h hodowli. Do przygotowania inokulum nale y u ywaæ wy³¹cznie bawe³nianych wymazówek, gdy niektóre wymazówki poliestrowe mog¹ powodowaæ problemy przy inokulacji paneli. (Zob. czêœæ Ograniczenia procedury.) Po wyjêciu pokrywek z zapieczêtowanych torebek nale y w celu zapewnienia odpowiedniej dok³adnoœci badania zu yæ je w ci¹gu 1 h. Pokrywki powinny pozostawaæ w plastikowym opakowaniu a do chwili u ycia. Stosowany inkubator powinien byæ wyposa ony w system nawil ania, aby zapobiec odparowaniu p³ynu ze studzienek w trakcie inkubacji. Zalecany poziom wilgotnoœci wynosi 40-60%. U ytecznoœæ systemów BBL Crystal ID lub jakiejkolwiek innej procedury diagnostycznej wykonywanej na próbkach klinicznych uzale niona jest od jakoœci samych próbek. Szczególnie zalecane jest stosowanie przez laboratoria metod omówionych w Podrêczniku mikrobiologii klinicznej dotycz¹cych pobierania próbek, transportu oraz inokulacji na pierwotnych pod³o ach izoluj¹cych Zasada (Referencja) 2A p-n-p-fosforan PHO 0,025 ó³ty bezbarwny Enzymatyczna hydroliza bezbarwnego arylu 2B p-n-p α-β-glukozyd BGL 0,025 ó³ty bezbarwny zast¹pionego glikozydem lub estrem 2C p-n-p-β-galaktozyd NPG 0,06 ó³ty bezbarwny fosforanowym powoduje uwolnienie ó³tego p-nitrofenolu D Nitroanilid proliny PRO 0,07 ó³ty bezbarwny 2E p-n-p bisfosforan BPH 0,02 ó³ty bezbarwny Enzymatyczna hydroliza bezbarwnego substratu amidowego powoduje uwolnienie ó³tej p-nitroaniliny F p-n-p-ksylozyd BXY 0,03 ó³ty bezbarwny Enzymatyczna hydroliza bezbarwnego 2G p-n-p-α-arabinozyd AAR 0,03 ó³ty bezbarwny arylu zast¹pionego glikozydem lub estrem fosforanowym powoduje uwolnienie 2H p-n-p-fosforylocholina PHC 0,03 ó³ty bezbarwny ó³tego p-nitrofenolu I p-n-p-β-glukuronid GLR 0,02 ó³ty bezbarwny 2J p-n-p-n-acetyloglukozaminid NAG 0,04 ó³ty bezbarwny 1A γ-l-glutamylo p-nitroanilid GGL 0,03 ó³ty bezbarwny Enzymatyczna hydroliza bezbarwnego substratu amidowego powoduje uwolnienie ó³tej p-nitroaniliny B 1C Eskulina p-nitro-dl-fenyloalanina ESC PHE 0,14 0,1 do pojawienia siê czarnego precypitatu 11. Oksydatywna dezaminacja fenyloalaniny z³oty/ ó³ty powoduje, w obecnoœci jonów elazowych, ciemnopomarañczowy br¹zowy/ jasny/ Hydroliza eskuliny doprowadza, kasztanowy s³omkowy w obecnoœci jonów elazowych,. wyst¹pienie br¹zowego zabarwienia 7,11. Hydroliza mocznika i powstaj¹cy amoniak 1D Mocznik URE 0,2 niebieskawozielony ó³ty/ powoduj¹ zmianê barwy wskaÿnika zielony ph (b³êkit bromotymolowy) 7,11,12. W wyniku degradacji glicyny powstaj¹ 1E Glicyna GLY 0,7 niebieskawozielony ó³ty/ alkaliczne metabolity zmieniaj¹ce barwê zielony wskaÿnika (b³êkit bromotymolowy) 13. W wyniku utylizacji cytrynianu powstaj¹ 1F Cytrynian CIT 0,8 niebieskawozielony ó³ty/ alkaliczne metabolity zmieniaj¹ce barwê zielony wskaÿnika (b³êkit bromotymolowy) 7,14. W wyniku utylizacji malonianu powstaj¹ 1G Kwas malonowy MLO 1,5 niebieskawozielony ó³ty/ alkaliczne metabolity zmieniaj¹ce barwê zielony wskaÿnika (b³êkit bromotymolowy) 11. 1H Chlorek trifenylotetrazolium TTC 0,15 ró owy/ jasny Redukcja reszt tetrazolium powoduje czerwony* powstanie czerwonego formazanu 13. 1I Arginina ARG 1,5 czerw./purpurowy ó³ty/br¹z. 1J Lizyna LYS 0,5 czerw./purpurowy ó³ty/br¹z. *Precypitat mo e nie byæ widoczny. Katabolizm w warunkach beztlenowych powoduje wzrost ph i zmianê barwy wskaÿnika (czerwieñ bromkrezolowa) 7,15.

3 PROCEDURA TESTOWA Dostarczane materia³y: Zestaw BBL Crystal Enteric/NF: 20 pokrywek panelowych BBL Crystal Enteric/NF, 20 podstawek BBL Crystal, 20 probówek z p³ynem inokulacyjnym BBL Crystal Enteric/Stool ID. W ka dej probówce znajduje siê oko³o 2,2 ± 0,1 ml p³ynu inokulacyjnego zawieraj¹cego: NaCl 8,50 g, kwas 3-morfolinopropanosulfonowy 0,8372 g, wodê oczyszczon¹ do 1000 ml. 2 tace inkubacyjne, 1 tablet wyników BBL Crystal E/NF Report Pad. Materia³y wymagane, ale niedostarczane: Ja³owe bawe³niane wymazówki (nie u ywaæ wymazówek poliestrowych); inkubator (35 37 C) bez obiegu CO 2 (wilgotnoœæ 40 60%); czytnik paneli BBLCrystal Light Box/Panel Viewer (zawiera diagram reakcji barwnych BBLCrystal Color Reaction Charts) oraz elektroniczn¹ ksi¹ kê kodów BBL Crystal ID System Electronic Codebook lub ksi¹ kê kodów BBL E/NF Manual Codebook (zobacz czêœæ Dostêpnoœæ ) lub automatyczne czytnik BBL Crystal AutoReader; nieselektywne pod³o e (np. agar sojowy Trypticase Soy Agar z 5% krwi owczej); BBL DMACA Indole Reagent Droppers (Zakraplacze z odczynnikiem indolowym); BBL Oxidase Reagent Droppers (Zakraplacze z odczynnikiem oksydazowym) (zobacz czêœæ Dostêpnoœæ"). Ponadto wymagane jest niezbêdne wyposa enie oraz sprzêt laboratoryjny u ywany do przygotowania i przechowywania próbek klinicznych oraz pracy z nimi. Procedura testowa: System BBL Crystal E/NF ID wymaga wyników testu oksydazy oraz indolu. Przed inokulacj¹ paneli BBL Crystal E/NF nale y wykonaæ test na oksydazê oraz indol, u ywaj¹c hodowli bakteryjnej z pod³o a nieselektywnego, nie starszej ni 24 h. Wykonaæ testy na oksydazê oraz indol zgodnie z instrukcjami znajduj¹cymi siê w ulotce do³¹czonej do niniejszych odczynników. Zobacz diagram z ilustracjami procedur, strona Wyj¹æ pokrywki z torebek. Wyrzuciæ œrodek poch³aniaj¹cy wilgoæ. Po usuniêciu z torebki os³oniête pokrywki powinny zostaæ zu yte w ci¹gu 1 h. Nie nale y u ywaæ panelu, jeœli w torebce nie ma œrodka poch³aniaj¹cego wilgoæ. Zobacz rys. A. 2. Probówkê inokulacyjn¹ oznaczyæ numerem próbki pobranej od pacjenta. Stosuj¹c siê do zasad aseptyki, koñcem sterylnej bawe³nianej wymazówki (nie u ywaæ wymazówek poliestrowych), drewnianego aplikatora lub jednorazowej plastikowej ezy pobraæ jedn¹ dobrze wyodrêbnion¹ du ¹ (œrednicy 2 3 mm lub wiêkszej) koloniê (lub 4 5 mniejszych kolonii o takim samym wygl¹dzie) z p³ytki z pod³o em zawieraj¹cym krew, takim jak na przyk³ad Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood. Dopuszczalne jest równie stosowanie p³ytek z pod³o em MacConkey a. 3. Wykonaæ zawiesinê kolonii w probówce z p³ynem inokulacyjnym BBL Crystal Enteric/Stool. 4. Ponownie zamkn¹æ probówkê i wirowaæ przez oko³o s. 5. Boczn¹ œciankê podstawki oznaczyæ numerem próbki pobranej od pacjenta. 6. Wlaæ ca³e inokulum do wyznaczonego miejsca w podstawce. Zobacz rys. B. 7. Trzymaj¹c podstwkê w obu d³oniach, delikatnie ni¹ poruszaj¹c, tak aby inokulum po wyznaczonym torze dotar³o do wszystkich studzienek. Zlaæ nadmiar p³ynu do miejsca docelowego i umieœæ podstawkê na szczycie stojaka. Zobacz rys. C. 8. Wyrównaæ pokrywkê, tak aby jej oznaczona krawêdÿ znalaz³a siê na szczycie miejsca docelowego podstawki. Zobacz rys. D. 9. Docisn¹æ, a bêdzie wyczuwalny lekki opór. Umieœciæ kciuki skierowane ku œrodkowi panelu na krawêdzi pokrywki po obu stronach panelu i równoczeœnie naciskaæ, a pokrywka zatrzaœnie siê w odpowiednim miejscu (bêd¹ s³yszalne dwa klikniêcia ). Zobacz rys. E. P³ytka kontrolna: U ywaj¹c sterylnej ezy, pobraæ niewielk¹ kroplê z probówki zawieraj¹cej p³yn inokulacyjny (przed inokulacj¹ pod³o a lub po niej) i wykonaæ posiew na skos agarowy lub p³ytkê (jakiekolwiek odpowiednie pod³o e) w celu sprawdzenia czystoœci. Usun¹æ probówkê z p³ynem inokulacyjnym oraz nakrêtkê do pojemnika na odpady stanowi¹ce zagro enie mikrobiologiczne. Inkubowaæ skos lub p³ytkê w inkubatorze bez obiegu CO 2 przez h w temperaturze C. Jeœli jest to wymagane, p³ytka kontrolna lub skos mog¹ byæ tak e wykorzystane do wykonania dodatkowych testów lub badañ serologicznych. Inkubacja: Umieœciæ inokulowane panele na tacach inkubacyjnych. Na jednej tacy mieœci siê 10 paneli (5 rzêdów po 2 panele). Wszystkie panele do inkubacji powinny byæ odwrócone (wiêksze okienka skierowane do góry; etykieta skierowana w dó³) i umieszczone w inkubatorze bez obiegu CO 2 przy wilgotnoœci 40 60%. Podczas inkubacji tace nie powinny byæ uk³adane w stos wy szy ni ich dwie wysokoœci. Czas inkubacji paneli E/NF wynosi h w temperaturze C. Zobacz rys. F. Odczytywanie: Po zalecanym okresie inkubacji wyj¹æ panele z inkubatora. Odczytu nale y dokonywaæ z odwróconych paneli (wiêksze okienka skierowane do góry, etykiety skierowane w dó³) przy u yciu BBL Crystal Light Box lub czytnika Panel Viewer. Zobacz rys. G. Aby zinterpretowaæ reakcje, zobacz diagram reakcji barwnej i (lub) diagram zamieszczony w czêœci Odczynniki. Zarejestrowaæ reakcje w tablecie wyników BBL Crystal E/NF Report Pad. Ewentualnie mo na odczytaæ panele za pomoc¹ automatycznego czytnika BBL Crystal AutoReader. BBLCrystal Odczyt numeru kodu (profilu): Ka dy wynik testu, który zostanie uznany za dodatni, otrzymuje wartoœæ 4, 2 lub 1, odpowiednio do rzêdu, w którym ten test siê znajduje. Wartoœæ 0 (zero) jest przyznawana wynikom ujemnym. Cyfry (wartoœci) wynikaj¹ce z ka dej pozytywnej reakcji w ka dej z kolumn dodawane s¹ do siebie. Generowana jest 10-cyfrowa liczba, która jest numerem profilu. psdpsd Przyk³ad: A B C D E F G H I J Profil

4 W celu uzyskania identyfikacji otrzymany numer profilu, a tak e wyniki testów dodatkowych (indolu i oksydazy) powinny zostaæ wprowadzone do komputera PC, w którym zainstalowano elektroniczn¹ ksi¹ kê kodów systemu BBL Crystal ID. Mo na równie u yæ podrêcznika kodów. Jeœli nie ma mo liwoœci u ycia komputera, w celu uzyskania pomocy w identyfikacji nale y skontaktowaæ siê z serwisem technicznym firmy BD. Jeœli u ywa siê automatycznego czytnika BBL Crystal AutoReader, komputer bêdzie identyfikowa³ drobnoustroje automatycznie. Kontrola jakoœci przez u ytkownika: Wykonanie poni szego testu kontroli jakoœci jest zalecane dla ka dej partii paneli. 1. Skonfigurowaæ panel BBL Crystal E/NF z Klebsiella pneumoniae ATCC zgodnie z zalecan¹ procedur¹ (zobacz czêœæ Procedura testowa ). 2. Inkubowaæ panel przez h w temperaturze C. 3. Odczytaæ panel przy u yciu BBL Crystal Light Box lub czytnika Panel Viewer oraz diagramu reakcji barwnych BBL Crystal E/NF Color Reaction Chart; odnotowaæ reakcje, u ywaj¹c tabletu wyników BBL Crystal E/NF Report Pad. Alternatywnie mo na u yæ automatycznego czytnika BBL Crystal AutoReader. 4. Porównaæ odnotowane reakcje z wymienionymi w tabeli 2 (strona 8). Jeœli otrzymano sprzeczne wyniki, potwierdziæ czystoœæ szczepu kontrolnego przed skontaktowaniem siê z obs³ug¹ techniczn¹ BD. Oczekiwane wyniki testów dodatkowej kontroli jakoœci szczepów testowych wyszczególniono w tabeli 2 (strona 8). OGRANICZENIA PROCEDURY System BBL Crystal E/NF ID jest zaprojektowany dla okreœlonych grup taksonomicznych E/NF. Niniejszy system nie jest przewidziany do stosowania do grup taksonomicznych innych ni wymienione w tabeli 1. W systemach identyfikacji BBL Crystal wykorzystano zmodyfikowane mikroœrodowisko, tak wiêc spodziewane wartoœci dla poszczególnych testów mog¹ ró niæ siê od informacji ustalonych uprzednio przy u yciu konwencjonalnych reakcji testowych. Dok³adnoœæ systemu identyfikacyjnego BBL Crystal E/NF oparta jest na statystycznym zastosowaniu specjalnie zaprojektowanych testów oraz na wyj¹tkowej bazie danych. W przypadku, gdy dostêpne s¹ antysurowice, identyfikacja biochemiczna wybranych drobnoustrojów, takich jak Salmonella, Salmonella podgrupa 3, Shigella, enteropatogenne szczepy Escherichia coli A-D oraz Vibrio cholerae, powinna zostaæ rozszerzona o analizê antygenow¹ 9,16. Do przygotowania zawiesiny inokulum nale y u ywaæ wy³¹cznie bawe³nianych wymazówek, gdy niektóre wymazówki poliestrowe mog¹ powodowaæ zwiêkszenie lepkoœci p³ynu inokulacyjnego. Mo e to spowodowaæ niewystarczaj¹ce wype³nienie studzienek przez p³yn inokulacyjny. Po wyjêciu pokrywek z zapieczêtowanych torebek nale y zu yæ je w ci¹gu 1 h w celu zapewnienia odpowiedniej dok³adnoœci badania. Pokrywki powinny pozostawaæ w plastikowym opakowaniu a do chwili u ycia. Inkubator, w którym umieszczono panele, powinien byæ wyposa ony w system nawil ania, aby zapobiec odparowaniu p³ynu inokulacyjnego ze studzienek w trakcie inkubacji. Zalecany poziom wilgotnoœci wynosi 40 60%. Inokulowane panele do inkubacji powinny byæ odwrócone (wiêksze okienka skierowane do góry, etykieta skierowana w dó³), aby maksymalnie zwiêkszyæ skutecznoœæ substratów. Kolonie powinny byæ pobierane z p³ytek z pod³o em agarowym z krwi¹, takich jak Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood. Dopuszczalne jest równie stosowanie p³ytek z pod³o em MacConkey a. Systemy identyfikacji BBL Crystal NIE S przeznaczone do bezpoœredniego u ycia z próbkami klinicznymi. CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŒCIOWA Odtwarzalnoœæ: W niezale nym badaniu, w którym udzia³ wziê³y trzy (3) laboratoria kliniczne, odtwarzalnoœæ reakcji (30) substratów E/NF badana by³a powtarzanymi testami. Odtwarzalnoœæ reakcji poszczególnych substratów wynosi³a od 96,3% do 100%. Ca³kowita odtwarzalnoœæ panelu BBL Crystal E/NF okreœlona zosta³a na 99,6%. Dok³adnoœæ identyfikacji: Dzia³anie systemu BBL Crystal E/NF ID zosta³o porównane z aktualnie dostêpnymi na rynku systemami przy u yciu izolatów z materia³u klinicznego i czystych kultur laboratoryjnych. W badaniu wewnêtrznym oceniono wydajnoœæ BBL Crystal E/NF. Przeanalizowano wyniki 169 jelitowych i niejelitowych izolatów testowych (reprezentuj¹cych 45 gatunków). Niezgodne identyfikacje objaœniano przy u yciu innych komercyjnych systemów. Wyniki podano poni ej: N =169 ID bez koniecznoœci ID z wykonaniem BRAK ID lub b³êdna wykonywania dodatkowych testów dodatkowych testów identyfikacja BBL Crystal E/NF 163 (96,4%) 167 (98,8%) 2 (1,2%) Wydajnoœæ testu BBL Crystal Enteric/Nonfermenter ID oceniona zosta³a w trzech niezale nych laboratoriach klinicznych 13. Do ustalenia cech wydajnoœci u yte zosta³y zarówno izolaty dostarczane do laboratorium klinicznego, jak równie izolaty uprzednio zidentyfikowane w oœrodkach bior¹cych udzia³ w badaniu i przez nie wybrane. Spoœród 299 œwie ych klinicznych izolatów testowych badanych przy u yciu dostêpnych w danych laboratoriach metod identyfikacyjnych, system BBLCrystal prawid³owo poda³ wyniki w 96,7% (289), w³¹czaj¹c w to 16 przypadków, w których zidentyfikowano dwa lub trzy organizmy i w których, w celu rozstrzygniêcia, wymagane by³o wykonanie dodatkowych testów. Spoœród 291 uprzednio zidentyfikowanych szczepów, których identyfikacja potwierdzona by³a przy u yciu dostêpnych w danych laboratoriach metod identyfikacyjnych, system BBL Crystal ID prawid³owo poda³ wyniki w 96,9% (282), w³¹czaj¹c w to 8 przypadków, w których zidentyfikowano dwa lub trzy drobnoustroje i w których, w celu rozstrzygniêcia, wymagane by³o wykonanie dodatkowych testów 13. 4

5 DOSTÊPNOŒÆ Nr kat. Opis Nr kat. Opis BBL Crystal Enteric/Nonfermenter ID Kit, zawiera po 20: BBL Crystal Enteric/NF Panel Lids, BBL Crystal Bases, probówek z p³ynem inokulacyjnym BBL Crystal Enteric/Stool ID (BBL Crystal Enteric/Stool ID Inoculum Fluid tubes) BBL Crystal Panel Viewer, model amerykañski, 110 V, 60 Hz BBL Crystal Panel Viewer, model europejski, 220 V, 50 Hz BBL Crystal Panel Viewer, model japoñski, 100 V, 50/60 Hz BBL Crystal Panel Viewer Longwave UV Tube BBL Crystal Panel Viewer White Light Tube BBL Crystal Identification Systems Enteric/Nonfermenter Manual Codebook BBL Crystal Enteric/Stool ID Inoculum Fluid, zawieraj¹ 10 sztuk BBL Crystal AutoReader Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood, pakowane po 20 p³ytek Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood, pakowane po 100 p³ytek BBL DMACA Indole Reagent Droppers, zawieraj¹ 50 sztuk BBL Oxidase Reagent Droppers, zawieraj¹ 50 sztuk. PIŒMIENNICTWO 1. Edberg, S.C., and C.M. Kontnick Comparison of β-glucuronidase-based substrate systems for identification of Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 24: Kampfer, P., O. Rauhoff, and W. Dott Glycosidase profiles of members of the family Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 29: Kilian, M., and P. Bulow Rapid diagnosis of Enterobacteriaceae 1: detection of bacterial glycosidases. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. B. 84: Manafi, M., W. Kneifel, and S. Bascomb Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiol. Rev. 55: Muytjens, H. L., J. van der Ros-van de Repe, and H. A. M. van Druten Enzymatic profiles of Enterobacter sakazakii and related species with special reference to the -glucosidase reaction and reproducibility of the test system. J. Clin. Microbiol. 20: Sneath, P.H.A The application of computers to taxonomy. J. Gen. Microbiol. 17: Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld Bailey and Scott s diagnostic microbiology, 10th ed. Mosby, Inc., St. Louis. 8. Cowan, S.T., and K.J. Steel Manual for the identification of medical bacteria. 2nd ed. Cambridge University Press, Cambridge, U.K. 9. Ewing, W.H Edwards and Ewing s identification of Enterobacteriaceae, 4th ed. Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York. 10. Le Minor, L Le Diagnostic de Laboratorie des Bacilles a Gram Negatif Enterobacteries. Tom. 1, 4th ed. Editions de La Tourelle, St. Mande-94, France. 11. MacFaddin, J.F Biochemical tests for identification of medical bacteria, 3rd Ed. Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore. 12. Ferguson, W.W., and A.E. Hook Urease activity of Proteus and Salmonella organisms. J. Lab. Clin. Med. 28: Data on file at BD Diagnostics. 14. Simmons, J.S A culture medium for differentiating organisms of typhoid-colon-aerogenes groups and for isolation of certain fungi. J. Infect. Dis. 39: Moeller, V Simplified tests for amino acid decarboxylases and for arginine dihydrolase system. Acta Pathol. Microbiol. Scand. 36: Murray, P.R., E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken Manual of clinical microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 5

6 Ró ne Gram-ujemne laseczki Diagram nr 1 (Ruchome dziêki witkom) REDUKCJA NITRATÓW Ochrobactrum anthropi GLUKOZA (1% W OFBM)OFBM) Bordetella bronchiseptica MOCZNIK CDC Grupa IVc-2 OFBM = Pod³o e podstawowe fermentacyjno - utleniaj¹ce Alcaligenes xylosoxidans subsp. xylosoxidans KSYLOZA (1% W OFBM) REDUKCJA NITRATÓW Alcaligenes xylosoxidans subsp. denitrificans Alcaligenes faecalis PRODUKCJA GAZÓW Z AZOTANU Alcaligenes piechaudii Ró ne Gram-ujemne laseczki Diagram nr 2 (Ruchome dziêki witkom zlokalizowanym na biegunach) ARGININA WZROST W TEMP. 42 C MANNOZA (1% W OFBM) Burkholderia picketti Pseudomonas mendocina Pseudomonas fluorescens ELATYNA Ró ne Gram-ujemne laseczki Diagram nr 3 (Nieruchome) Pseudomonas putida Moraxella lacunata Methylobacterium subsp. ELATYNA GLUKOZA (1% W OFBM) Pseudomonas pseudoalcaligenes Oligella urethralis MOCZNIK DEAMINAZA FENYLOALANINY Moraxella osloensis Comamonas acidovorans MANNITOL (1% W OFBM) Piœmiennictwo: 1. Gilardi, G.L., Identification of Glucose-Nonfermenting Gram-Negative Rods, 1/90 2. Manual of Clinical Microbiology, 5th Edition, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1991 FRUKTOZA (1% W OFBM) WZROST NA POD O U MACCONKEY'A Pseudomonas Methylobacterium pseudoalcaligenes subsp. KATALAZA LICZBA WITEK Pseudomonas alcaligenes Methylobacterium subsp. 1 >1 Comamonas testosteroni OFBM = Pod³o e podstawowe fermentacyjno-utleniaj¹ce Eikenella corrodens WZROST NA POD O U MACCONKEY A 6

7 Tabela 1 Gatunki identyfikowane przez system BBL Crystal E/NF ID System Acinetobacter baumannii Acinetobacter lwoffii Aeromonas caviae Aeromonas hydrophila Aeromonas sobria Aeromonas veronii Agrobacterium tumefaciens Burkholderia cepacia Burkholderia pseudomallei Cedecea davisae Cedecea lapagei Cedecea neteri Chromobacterium violaceum Chryseomonas luteola Citrobacter amalonaticus Citrobacter freundii Citrobacter koseri Edwardsiella hoshinae Edwardsiella tarda Enterobacter aerogenes Enterobacter asburiae Enterobacter cloacae Enterobacter gergoviae Enterobacter sakazakii Enterobacter taylorae Escherichia coli Escherichia coli grupa serologiczna O111 Escherichia coli grupa serologiczna O157 Escherichia coli AD Escherichia fergusonii Escherichia hermanii Escherichia vulneris Ewingella americana Flavimonas oryzihabitans 1 Ró ne Gram-ujemne laseczki" to okreœlenie grupy gatunków oksydazododatnich wzglêdnie nieaktywnych i nierozró nialnych w systemie BBL Crystal Enteric/Nonfermenter ID System. Tabele 1 i 2 w tej ulotce zawieraj¹ informacje pozwalaj¹ce na bardziej szczegó³ow¹ identyfikacjê w sytuacji, gdy pierwsza identyfikacja wyka e Ró ne Gram-ujemne laseczki". Do grupy Ró ne Gram-ujemne laseczki" nale ¹ Alcaligenes faecalis Alcaligenes piechaudii Alcaligenes xylosoxidans subsp. denitrificans Alcaligenes xylosoxidans subsp. xylosoxidans Bordetella bronchiseptica Burkholderia pickettii CDC, grupa IV C-2 Comamonas acidovorans Comamonas testosteroni Eikenella corrodens 2 Mog¹ byæ tak e wymienione osobno w bazie danych Flavobacterium breve Flavobacterium gleum Flavobacterium indologenes Flavobacterium meningosepticum Flavobacterium odoratum Hafnia alvei Klebsiella ornithinolytica Klebsiella oxytoca Klebsiella ozaenae Klebsiella pneumoniae Klebsiella rhinoscleromatis Kluyvera ascorbata Kluyvera cryocrescens Leclercia adecarboxylata Moellerella wisconsensis Morganella morganii Pantoea agglomerans Pasteurella aerogenes Pasteurella haemolytica Pasteurella multocida Plesiomonas shigelloides Proteus mirabilis Proteus penneri Proteus vulgaris Providencia alcalifaciens Providencia rettgeri Providencia rustigianii Providencia stuartii Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas diminuta Pseudomonas fluorescens Pseudomonas gladioli Pseudomonas paucimobilis Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri Pseudomonas vesicularis Methylobacterium gatunki Moraxella lacunata Moraxella osloensis Ochrobactrum anthropi Oligella urethralis Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas fluorescens2 Pseudomonas mendocina Pseudomonas pseudoalcaligenes Pseudomonas putida2 Rahnella aquatilis Salmonella arizone Salmonella choleraesuis Salmonella paratyphi A Salmonella gatunki Salmonella typhi Serratia ficaria Serratia fonticola Serratia liquefaciens Serratia marcescens Serratia odorifera 1 Serratia odorifera 2 Serratia plymuthica Serratia rubidaea Shewanella putrefaciens Shigella dysenteriae Shigella gatunki (S. boydii, S. flexneri) Shigella sonnei Sphingobacterium multivorum Stenotrophomonas maltophilia Tatumella ptyseos Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio damsela Vibrio fluvialis Vibrio hollisae Vibrio metschnikovii Vibrio mimicus Vibrio parahaemolyticus Vibrio vulnificus Weeksella virosa/zoohelcum Yersinia enterocolitica skgrupa (Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii) Yersinia pseudotuberculosis Yokenella regensburgei Ró ne Gram-ujemne laseczki 1 7

8 Tabela 2 Tabela kontroli jakoœci dla systemu BBL Crystal E/NF ID System Klebsiella Escherichia Acinetobacter Proteus Enterobacter Pseudomonas Po³o enie Kod pneumoniae coli lwoffii vulgaris cloacae aeruginosa ATCC ATCC ATCC ATCC 8427 ATCC ATCC A ARA V 4B MNS V 4C SUC 4D MEL V V 4E RHA 4F SOR 4G MNT V 4H ADO 4I GAL 4J INO 2A PHO V V V V 2B BGL V 2C NPG 2D PRO V 2E BPH V V V 2F BXY 2G AAR () ( ) () 2H PHC V 2I GLR 2J NAG 1A GGL V 1B ESC V 1C PHE 1D URE V V V 1E GLY V V 1F CIT () 1G MLO 1H TTC () V 1I ARG V V V () 1J LYS V V = reakcja dodatnia - = reakcja ujemna V = reakcja zmienna () = zwykle dodatnia, lecz sporadycznie ujemna 8

9 Fig. A Fig. B Fig. C Fig. D Fig. E Fig. F Fig. G 9

10 10

11 Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland USA BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BBL, BD, BD Logo, BBL Crystal and Trypticase are trademarks of Becton, Dickinson and Company BD.