Ewa Grucka-Mamczar, Ewa Birkner, Jolanta Zalejska-Fiolka, Tatianna Jamróz-Szłapa

Transkrypt

1 BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. XL, 2007, 4, str Ewa Grucka-Mamczar, Ewa Birkner, Jolanta Zalejska-Fiolka, Tatianna Jamróz-Szłapa WPŁYW FLUORKU SODU I KOFEINY NA AKTYWNOŚĆ WYBRANYCH ENZYMÓW WA TROBOWYCH SZCZURA Zakład Biochemii Ogólnej Katedry Biochemii w Zabrzu Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach Kierownik: dr hab. n. med. E. Birkner Celem pracy było zbadanie aktywności enzymów oceniaja cych stan wa troby: cholinesterazy (CHE), fosfatazay alkalicznej (FA) i γ-glutamylotranspeptydazy (γ-gt). Doświadczenie prowadzono na 18 szczurach (samcach) rasy Spraque-Dawley. Wykazano wzrost aktywności FA i γ-gt (pod wpływem NaF) charakterystyczny dla ostrej fazy wewna trzwa trobowej. Kofeina niwelowała działanie NaF na wa troby szczurów. Hasła kluczowe: enzymy wątrobowe, NaF, kofeina, szczury. Key words: liver enzymes, NaF, caffeine, rats. Badania doświadczalne przeprowadzone in vivo na szczurach wykazały, że fluorek (w postaci NaF) jest szybko absorbowany z żołądka i światła jelit. Szybkość absorbowania jest związana z ph żołądka. Fluorek jest rozprowadzany z osocza do wszystkich tkanek i narządów. Szybkość dostarczania fluorku jest generalnie wyznaczana przez przepływ krwi do tkanek. W konsekwencji stan równowagi stężeń fluorku między osoczem a takimi tkankami jak serce, płuca, wątroba jest osiągany znacznie szybciej niż odnośnie mięśni szkieletowych, skóry i tkanki tłuszczowej (1). Szczególnie wrażliwymi tkankami na oddziaływanie fluorku są wątroba i nerki (2, 3). Z kolei kofeina jest związkiem silnie pobudzającym układ nerwowy. Usuwa objawy zmęczenia i senności. Poprawia również koncentrację i sprawność myślenia (4, 5). Kofeina szybko się wchłania z przewodu pokarmowego. W wątrobie ulega całkowitej biotransformacji przy udziale cytochromu P 450 1A (6, 7, 8). Po przewlekłym narażeniu na duże dawki, kofeina prowadzi do zaburzeń gospodarki wapniowo-fosforanowej. W ostatnich latach zaobserwowano, że kofeina może zmniejszać toksyczność fluorku przez tworzenie związków kompleksowych. Hamuje to wchłanianie fluorku i ogranicza objawy zatrucia (9). Celem pracy było zbadanie wpływu skojarzonego podawania szczurom fluorku sodu i kofeiny na aktywność enzymów oceniających stan wątroby takich jak: cholinesteraza (CHE), fosfataza alkaliczna (FA) i γ-glutamylotranspeptydaza (γ-gt) oznaczane w tym narządzie.

2 390 E. Grucka-Mamczar i inni Nr 4 CZE ŚĆ DOŚWIADCZALNA Doświadczenie prowadzono na 18 szczurach (samcach) rasy Spraque-Dawley. Zwierzęta podzielono na 3 grupy po 6 zwierząt każda. Zwierzęta miały zachowany naturalny cykl dzienno-nocny i swobodny dostęp do standardowej paszy. Pierwsza grupa szczurów otrzymywała do picia wodę destylowaną i stanowiła grupę kontrolną. Druga grupa zwierząt otrzymywała fluorek sodu w dawce 4,9 mg F /kg m.c./dobę. Trzecia grupa szczurów otrzymywała taką samą dawkę F oraz kofeinę w dawce 3 mg kofeiny/kg m.c./dobę. Doświadczenie trwało 50 dni. Po tym czasie szczury usypiano thiopentalem w dawce 30 mg/szczura. Do badań pobrano wątrobę i sporządzono w/v homogentaty (1 g tkanki + 9 cm 3 oziębionego 0,9% NaCl). Homogenat odwirowano i w supernatancie oznaczono aktywności następujących enzymów: 1. cholinesterazy (CHE) (EC ) zestawem Biochemtest (POCH Gliwice, Polska, nr kat ). 2. fosfatazę alkaliczną (FA) (EC ) zestawem Biochemtest (POCH Gliwice, Polska, nr kat ). 3. γ-glutamylotranspeptydazy (γ-gt) (EC ) zestawem firmy Alpha Diagnostic Niemcy nr kat G ). Wyniki przedstawiono w jednostkach IU w przeliczeniu na białko, którego stężenie oznaczono metodą Lowry ego (10). A n a l i z a s t a t y s t y c z n a. Bazę danych utworzono w programie MS Excel W celu analizy statystycznej wykorzystano program Statistica PL. Jako wskaźniki statystyki opisowej użyto średniej (x) i odchylenia standardowego (SD). W celu porównania różnic między grupami zastosowano test U Manna-Whitney a. Za znamienne statystycznie przyjęto zmiany przy poziomie istotności p < WYNIKI Wyniki przedstawiono w tab. I do III. Z tab. I widać, że aktywności CHE w homogenatach wątroby szczurów grupy kontrolnej, otrzymującej NaF i otrzymującej NaF z kofeiną nie uległa statystycznie znamiennym zmianom. Tabela I Aktywność cholinesterazy w homogenatach wa troby szczurów Table I Activity of cholinesterase activity Aktywność CHE (IU/g białka) Kontrola 0,018 ± 0,003 NaF 0,019 ± 0,003 0,631 NaF + kofeina 0,017 ± 0,005 0,749 Aktywność FA u szczurów otrzymujących NaF w porównaniu z grupą kontrolną wzrosła znamiennie statystycznie, natomiast dodatek kofeiny spowodował spadek FA do jej wartości z grupy kontrolnej (tab. II). Jak widać z tab. III aktywność γ-gt w grupie szczurów otrzymujących NaF wzrosła (wynik nieznamienny statystycznie), a dodatek kofeiny spowodował obniżenie znamienne statystycznie aktywności badanego enzymu. W 1994 r. Chen i Whitford (11) stwierdzili, że kofeina zwiększa stężenie jonu fluorkowego w osoczu szczurów. Autorzy odkryli, że po 2 godz. od podania F w roztworze kofeiny, stężenie jonu fluorkowego w osoczu było wyższe niż podawanego w wodzie. Fakt ten skłonił nas do przeprowadzenia niniejszego doświadczenia, w którym podawaliśmy szczurom takie same dawki F i kofeiny jak Chen i Whitford, spodziewając się, że wyższe stężenie jonu fluorkowego w osoczu mogłoby spowodować większą jego kumulację w wątrobie i w konsekwencji uszkodzenie tego narządu. Kontrola stężenia jonów fluor-

3 Nr 4 Wpływ fluorku sodu i kofeiny na aktywność enzymów wątrobowych szczura 391 Tabela II Aktywność fosfatazy alkalicznej w homogenatach wa troby szczurów Table II Activity of alkaline phosphatase in rat liver homogenates Aktywność FA (IU/g białka) Kontrola 1,30 ± 0,22 NaF 1,67 ± 0,29 0,025 NaF + kofeina 1,40 ± 0,17 0,522 btabela III Aktywność γ-glutamylotranspeptydazy w homogenatach wa troby szczurów T a b l e III Activity of γ-gluthamylotranspeptydase in rat liver homogenates Aktywność γ-gt (IU/g białka) Kontrola 1,94 ± 0,98 NaF 3,92 ± 2,39 0,109 NaF + kofeina 0,74 ± 0,47 0,037 kowych w naszym doświadczeniu przeprowadzona w surowicy krwi badanych zwierząt nie wykazała jednak zależności odkrytej przez Chen a i Whitford a, ponieważ stężenie jonów fluorkowych w obecności kofeiny w surowicy było nieznamienne (2). Obserwując natomiast zmiany FA i γ-gt oznaczane w homogenatach wątroby szczurów można poczynić ciekawe obserwacje, dotyczące zmian, które miały miejsce w tym narządzie. Jak wiadomo FA obecna w surowicy jest również pochodzenia wątrobowego (ok. 20%) (12). Jest to enzym kontrolujący hydrolizę fosforanów organicznych. Jego optimum ph wynosi 10, a jego aktywatorami są Mg(II), Co(II) i Mn(II). Inhibitorami są natomiast aniony fosforanowe, boranowe, szczawianowe i cyjanki (13). Wzrost jej aktywności charakterystyczny jest m.in. dla cholestazy wewnątrzwątrobowej, co wynika z upośledzonego wydalania FA przez drogi żółciowe. Z kolei γ-gt jest enzymem związanym z przemianą aminokwasów. Katalizuje ona hydrolizę peptydów do aminokwasów lub drobnocząsteczkowych peptydów. γ-gt wydalana jest z ustroju głównie z żółcią. Enzym ten związany jest z błonami komórkowymi, występuje głównie w wątrobie, nerkach i trzustce. Wzrost aktywności tego enzymu jest najczęściej wskaźnikiem cholestazy wewnątrzwątrobowej, spowodowanej upośledzonym wydalaniem enzymu z żółcią. Wydaje się, że w naszym doświadczeniu (w którym oba enzymy FA i γ-gt zwiększały swoją aktywność w wątrobie pod wpływem NaF) doszło do wytworzenia cholestazy wewnątrzwątrobowej. Cholestazę wewnątrzwątrobową podzielić można na ostrą, przewlekłą i nawracającą się. Do ostrej cholestazy wewnątrzwątrobowej, dochodzi po podaniu niektórych leków, pod wpływem oddziaływania trucizn, czy też po zakażeniu wirusem (14). Można przypuszczać, że NaF w zastosowanej dawce zadziałał jako trucizna i wywołał ostrą cholestazę wewnątrzwątrobową (wzrost aktywności FA o 28%, a γ-gt o 102%). O zmienionej czynności wątroby pod wpływem fluorku sodu donoszą Qujeg i współpr. (15). Autorzy podawali szczurom 10, 20 i 30 mg NaF/kg m.c. dziennie przez 90 dni i stwierdzili statystycznie znamienny wzrost transferazy w surowicy krwi. Obserwując jednocześnie wyniki aktywności FA i γ-gt po dodaniu do NaF kofeiny można stwierdzić, że powyższy stan (ostra cholestaza wewnątrzwątrobowa) jest znoszona przez ten związek. Jak wiadomo, kofeina działa hamująco na fosfodiesterazę rozkładającą cykliczny AMP (camp). Powoduje to nagromadzenie camp w komórce, co aktywuje procesy metaboliczne (4). Warto podkreślić, że w naszym doświadczeniu zastosowaliśmy dawkę optymalną kofeiny dla człowieka (3 6 mg kofeiny/kg m.c./dzień) (16). Wydaje się jednak, że dodatek kofeiny wpływa nie tylko korzystnie na organizm szczura, ponieważ w poprzedniej naszej pracy (17) doszliśmy do wniosku, że zarówno pod wpływem F jak i F z kofeiną dochodzi u szczurów do ogólnych zaburzeń funkcji wątroby. Przejawia się to wyższymi średnimi wartościami aktywności AspAT i AlAT (F bez kofeiny) oraz

4 392 E. Grucka-Mamczar i inni Nr 4 zahamowaniem syntezy cholesterolu i triacylogliceroli (F if z kofeiną). Ciekawe wyniki uzyskaliśmy w badaniu aktywności CHE w surowicy krwi szczura (17). O ile NaF nie spowodował większych zmian aktywności CHE to dodatek kofeiny spowodował statystycznie znamienny spadek jej aktywności w surowicy. Pamiętać należy, że na ogół spadek aktywności CHE w surowicy wiąże się m.in. z uszkodzeniem hepatocytów, czego nie należy w tym przypadku wykluczyć. Chen i Whitford (18) badali wpływ różnych dawek kofeiny (3, 25 i 100 mg/kg m.c./dobę) przez okres 6 tyg. na równowagę metaboliczną i stężenie F, wapnia i fosforu w tkankach szczurów. Autorzy wykazali, że kofeina nie wpływa na wchłanianie, wydzielanie z moczem i równowagę fluorkową oraz jego stężenie w osoczu, szkliwie i kościach. Reasumując wyniki naszego eksperymentu należy podkreślić, że aczkolwiek kofeina działa prewencyjnie wobec przypuszczalnie ostrej cholestazy wewnątrzwątrobowej, to biorąc pod uwagę jej aktywność metaboliczną należałoby z pewnością ograniczyć spożycie kofeiny. WNIOSKI 1. NaF w zastosowanej dawce powoduje przypuszczalnie ostrą cholestazę wewnątrzwątrobową. 2. Kofeina znosi powyższe działanie NaF. E. G r u c k a-m a m c z a r, E. B i r k n e r, J. Z a l e j s k a-f i o l k a, T. J a m r ó z-szłapa THE INFLUENCE OF SODIUM FLUORIDE AND CAFFEINE ON THE ACTIVITY CHOSEN LIVER ENZYMES IN RATS Summary The aim of the study was to investigate the effect of sodium fluoride (NaF) on the activity of liver enzymes, such as: cholinesterase (CHE), alkaline phosphatase (FA) and γ-glutamyltranspeptidase (γ-gt). Eighteen Spraque-Dawley male rats were used in the experiment. The results indicate an increase of FA and γ-gt (during NaF supplementation), which is characteristic of acute intrahepatic phase. Caffeine neutralized the effect that NaF had on rat livers. PIŚMIENNICTWO 1. Enviromental Health Criteria 227 Fluorides. World Health Organization geneva Birkner E., Grucka-Mamczar E., Zalejska-Fiolka J., Chlubek D., Kasperczyk S., Stawiarska-Pięta B., Błaszczyk U.: Influence of sodium fluoride and caf eine on the concentration offluoride ions, glucose and urea of blood serum and activity of protein metabolism enzymes in rat liver. Biol. Trace Elem. Res., 2006; 113: Birkner E., Grucka-Mamczar E., Żwirska-Korczala K., Zalejska-Fiolka J., Stawiarska-Pięta B., Kasperczyk S., Kasperczyk A.: Influence of sodium fluoride and caffeine on the kidney function and free-radical process in that organ in adult rats. Biol. Trace Elem. Res., 2006; 109: Danysz A., Kleinrok Z.: Podstawy farmakologii dla lekarzy, farmaceutów i studentów medycyny. (red.) Danysz A., Klienrok Z.; Wrocław, Wyd. Volumed 1996; Kolanowski W.: Kawa charakterystyka i znaczenie zdrowotne. Żywność i żywienie a zdrowie., 1998; 3: Seńczuk W.: Toksykologia. Wyd. Lek. PZWL, Warszawa, 1994; i Janus K.: Kofeina jako substancja modelowa służąca do oceny metabolicznej wydolności wątroby. Problemy Terapii Monitorowanej, 1993; 4(1): Daniel W.A., Syrek M., Ryłko Z., Wójcik J.: Effects of antidepressant drugs on the activity of cytochrome P-450 measured by caffeine oxidation in rat liver microsomes. Pol. J. Pharmacol., 2001; 53: Cirksena W., Mitchell G., Samaras G., Wax C.: Fluoride metabolism. Vien: Verlag Wilheln Mandrich., 1980; Lowry O.M., Rosenbrough N.J., Forr A.R., Randal R.L.: Protein measurement with Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951; 193:

5 Nr 4 Wpływ fluorku sodu i kofeiny na aktywność enzymów wątrobowych szczura Chen X., Whitford G.M.: Lack of significant effect of coffee and caffeine on fluoride metabolism in rats. J. Dent. Res., 1994; 73: Kokot F., Kokot S.: Badania laboratoryjne. Wyd. Lek. PZWL, Warszawa 2002; Jakubowski Z., Kabata J., Kalinowski L., Szczepańska-Konkel M., Anglieski S.: Badania laboratoryjne w codziennej praktyce. Wyd. V., Gdańsk 1998; Wyd. Med. MAK med., Brzozowski R. (red.): Choroby wątroby i dróg żółciowych. Wyd. Lek. PZWL, Warszawa 1998; Qujeg D., Laghale B., Ghalipour A., Solimani N., Hassenzadeh S.: Effect of sodium fluoride on total serum protein levels and transaminase activity. Biomed. Pharmacother., 2002; 56: Magkos F., Kavouras S.A.: Caffeine and ephedrine. Physiological metaboilc and performance enhancing effects. Sports. Med., 2004; 34: Grucka- Mamczar E., Birkner E., Zalejska-Fiolka J., Kasperczyk S., Kasperczyk A., Stawiarska-Pięta B., Birkner B., Polaniak R.: Wpływ NaF i kofeiny na aktywność wybranych enzymów i parametrów biochemicznych surowicy szczurów. Ann. Acad. Med. Siles., 2006; 60: Chen X., Whitford G.M.: Effect of caffeine on fluoride, calcium, and phosphorus metabolism and calcited tissues in the rat. Arch. Oral Biol., 1999; 44: Adres: Zabrze, ul. Jordana 19.