PRACE POGLĄDOWE. Symulacje komputerowe terapii fagowej* Computer simulations of phage therapy ANTONI ZWIEFKA, BEATA WEBER DĄBROWSKA, ANDRZEJ GÓRSKI

Transkrypt

1 PRACE POGLĄDOWE Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 1, ISSN X ANTONI ZWIEFKA, BEATA WEBER DĄBROWSKA, ANDRZEJ GÓRSKI Symulacje komputerowe terapii fagowej* Computer simulations of phage therapy Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, Centrum Doskonałości: IMMUNE Streszczenie Terapia fagowa jest jedną z form terapii antybakteryjnej, stosowaną wówczas, gdy zawodzą antybiotyki. W terapii bakteriofagowej są wykorzystywane fagi, które w wyniku procesu namnażania się we wrażliwej komórce bakte ryjnej powodują jej całkowite zniszczenie i uwolnienie nowo powstałych cząstek fagowych zdolnych do niszcze nia następnych komórek bakteryjnych. Samoreplikujące się fagi potraktowano jak konwencjonalne leki i wprowa dzono nowe metody określające ich antybakteryjną aktywność. Zastosowanie symulacji komputerowych opartych na równaniach matematycznych pozwala przewidzieć przebieg terapii fagowej. Do rozwoju takiego modelu tera pii fagowej przyczynia się znajomość kinetycznych zależności gęstości bakterii i bakteriofagów, a także oddziały wań bakteriofagi bakterie. Od tego typu badań może również zależeć kliniczna skuteczność terapii bakteriofago wej. Analiza odpowiednio dobranego modelu powinna umożliwić określenie skutecznej dawki i czasu podania fa ga (Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 1, ). Słowa kluczowe: bakteriofag, terapia fagowa, farmakokinetyka, model kinetyczny, samoreplikacja. Abstract Phage therapy is one of the forms of antibacterial therapy. It is often applied in cases when antibiotics fail. Pha ges used in bacteriophage therapy as a result of the multiplication process in sensitive bacterial cell cause its destruction and liberation of newly created phage particles capable of destruction of next bacterial cells. Self replicating phages may be compared to conventional drugs and they demand new methods of defining their antibacterial activity. The use of computer simulations, based on mathematical equations, permits to foresee the course of phages therapy. Development of such a model of phage therapy is supported by the knowledge of kinetic dependence of bacteria and bacteriophage density as well as the interactions bacteriophages bacte ria. That kind of studies may also have an effect on the clinical efficiency of bacteriophage therapy. Analysis of the chosen model should make it possible to define the dose and time of phage application (Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 1, ). Key words: bacteriophage, phage therapy, pharmacokinetics, kinetic model, self replication. Jedną z najskuteczniejszych metod opisywa nia i analizy złożonych systemów biologicznych są symulacje komputerowe. Oparte na modelu matematycznym doskonale nadają się do badań związanych ze zwalczaniem zakażeń bakteryj nych. Do pełnego poznania zjawisk związanych z terapią antybakteryjną celowe jest zastosowa nie nowych metod pozwalających opisać je w sposób matematyczny. Do badań tych włączy ły się ośrodki badawcze zajmujące się do tej po ry różnymi formami zwalczania lekoopornych bakterii. Na podstawie wcześniejszych doświad czeń proponują one na przykład nowe metody interpretacji zachodzących zjawisk, w tym sy mulacji komputerowej terapii fagowej [1] opar tych na modelu zaproponowanym przez Pay ne a [2 4]. Bazując na terapii konwencjonalny mi lekami (np. antybiotykami) przyjmuje on, że zasadniczymi czynnikami różniącymi fagi od an tybiotyków są: samopowielanie się, swoistość działania oraz brak istotnych działań ubocznych podczas fagoterapii. * Praca subsydiowana z grantu KBN nr 4 P05B

2 106 A. ZWIEFKA, B. WEBER DĄBROWSKA, A. GÓRSKI Zakażenia bakteryjne wywołane przez leko oporne formy bakterii stwarzają w praktyce me dycznej coraz większe problemy terapeutyczne. Wiążą się one ze stałym pojawianiem się szczepów bakteryjnych opornych na wszystkie antybiotyki, w tym na wankomycynę antybiotyk tak zwanej ostatniej szansy [5]. Pojawienie się gronkowców opornych na wszelkie dostępne antybiotyki [6] jest jednym z najpoważniejszych wyzwań medycyny naszych czasów. Wobec bezspornego zagrożenia ze strony lekoopornych bakterii, także w obecnej sytu acji realnego niebezpieczeństwa, jakie niesie ze so bą bioterroryzm [7, 8], a jednocześnie na podstawie pozytywnych wyników fagoterapii uzyskanych przez nasz Instytut (wyniki prezentowane są na stronie Instytutu ges/phages.html) oraz przez Instytut Mikrobiologii i Wirusologii w Gruzji [9], w różnych ośrodkach [1, 10, 16] są podejmowane ponowne próby wykorzy stania bakteriofagów w leczeniu zakażeń bakteryj nych u ludzi i zwierząt. W terapii bakteriofagowej są wykorzystywane fagi, które w wyniku procesu namnażania się we wrażliwej komórce bakteryjnej powodują jej całkowite zniszczenie (lizę) i uwolnie nie nowo powstałych cząstek fagowych zdolnych do niszczenia następnych komórek bakteryjnych. Proces namnażania fagów zachodzi zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo. Uzyskane do tychczas wyniki wykazały, że fagoterapia jest wy soce efektywna w leczeniu zakażeń wywołanych przez różne gatunki lekoopornych bakterii [11, 12]. Końcowy wynik terapii fagowej jest jednak uzależniony od wielu czynników, m.in. od szczepu bakteryjnego wywołującego zakażenie, jego wraż liwości na swoiste bakteriofagi, siły litycznej faga, koncentracji faga i bakterii, dostępności faga do miejsca zakażenia, rodzaju zakażenia, czasu poda wania fagów, a także od prowadzonej jednocze śnie antybiotykoterapii [11]. Według Ackermanna [14] bakteriofagi po winny być testowane podobnie jak antybiotyki i należy pełniej poznać ich farmakokinetykę, far makodynamikę, biologiczną dostępność, właści wości antybakteryjne i tolerancję przez orga nizm ludzki. Kinetyczna teoria terapii fagowej Podstawowy matematyczny model kinetyki terapii bakteriofagowej został zaprojektowany przez Payne a [2 4]. Zawiera podstawowe para metry dotyczące terapii i opisuje reprezentatywne cechy oddziaływań fagi bakterie. Jako model do komputerowej symulacji fagoterapii zostały użyte następujące równania kinetyczne [4]: niezakażone dx/dt = ax bvx Hx car, bakterie zakażone dy/dt = ay +bvx ky Hy cay, bakterie wolny dv/dt = kly bvx mv hv, bakteriofag antybiotyki da/dt = dax day na. (jeśli stosowane) Przedstawiają one zmiany gęstości (stężeń) nie zakażonych fagiem bakterii (dx/dt = x(t)), bakterii zakażonych przez faga (dy/dt = y(t)), gęstość wol nych fagów na zewnątrz komórek (dv/dt = v(t)) w czasie. Zależności te są też funkcjami odpowiedzi gospodarza na obecność bakterii i fagów H(t), h(t), oraz początkowej gęstości bakterii XQ. Model ten uwzględnia również takie parame try, jak: szybkość replikacji a, współczynnik wniknięcia faga do wnętrza komórki b, szybkość lizy zakażonych komórek k i liczbę fagów uwol nionych podczas lizy L. Poza tym określa wpływ czasu (T inoc ) i dawki (V inoc ) oraz utratę wolnego fa ga (m). W przypadku użycia w terapii również an tybiotyku, uwzględnia zmianę jego stężenia w czasie da/dt = A(t), współczynniki efektyw ności (c, d) oraz metabolizm antybiotyku (n) [4]. Na podstawie wyników badań eksperymental nych (in vitro) stwierdzono, że po wprowadzeniu bakteriofaga do hodowli bakteryjnej (T F ) jej gę stość gwałtownie maleje. Głównymi elementami opisywanego modelu są: próg gęstości namnażania faga (Xp) i krytyczny punkt czasu (Tp) (ryc. 1) [2]. Są one oparte na stwierdzeniu, że wzrost populacji faga jest krytycznie zależny od gęstości (stężenia) bakterii. Xp jest progiem gęstości bakterii, w którym następuje wzrost liczby fagów i poniżej którego maleje. Ten punkt jest też nazywany progiem gę stości namnażania i określa gęstość, przy której ist nieje prawdopodobieństwo spotkania wolnego bakteriofaga i podatnej na zakażenie komórki bak teryjnej. Czas Tp, w którym gęstość bakterii osiąga Xp jest nazywany często początkiem czasu namna żania faga. Przed tym punktem czasowym gęstość bakterii jest zbyt mała, aby podtrzymać populację fagów i następuje spadek ich liczby. Zgodnie z założeniami tego modelu liczba fa gów wzrasta, gdy tylko gęstość komórek bakteryj nych jest wystarczająco wysoka, dlatego też pro ces ich namnażania nie jest określany tylko przez rodzaj faga i bakterii, ale też przez zmianę faktycz nej gęstości bakterii w czasie. Przewidywane dla takiego prostego modelu wartości krytyczne pro gów gęstości i krytyczne punkty czasu są funkcją niezależnie ocenianych parametrów biologicz nych. Ustalenie matematycznego modelu terapii fagowej zasadza się na analizie podstawowej wła ściwości, jaką jest jej skuteczność. Obecny model

3 Symulacje komputerowe terapii fagowej 107 Ryc. 1. Znaczenie mierzenia czasu w terapii fagowej oparte na symulacjach kinetyki uogólnionego systemu fag/bakteria według Payne'a Fig. 1. Importance of timing in phage therapy based on simulations of the kinetics of a global phage/bacte ria system according to Payne jest oparty na wcześniejszych modelach biokon troli [15, 16] i opisuje skuteczność jako funkcję wielkości dawki faga i czasu. Pozwala rozważać znaczenie różnych czynników związanych z repli kacją fagów podczas terapii. Inną ważną cechą, która odróżnia terapię bakteriofagową od innych form biokontroli jest fakt, że fagi same namnażają się podczas trwania terapii [2]. Zanim dojdzie do replikacji aktywnego faga, dochodzi do wzrostu gęstości bakterii. Fakt ten stał się podstawą mode lu kinetycznego zasugerowanego przez Pay ne a [2], który zakłada, że wzrost populacji faga jest krytycznie zależny od gęstości (stężenia) bak terii. Aby terapia bakteriofagowa była skuteczna, wymagane jest więc uwzględnienie różnych czyn ników niespotykanych w przypadku użycia kon wencjonalnych leków. Poza tym teoria kinetyczna sugeruje możliwość takiego wyboru czasu poda wania faga, który może okazać się krytyczny dla sukcesu leczenia. Na przykład, sugeruje się możli wość niepowodzenia przy zbyt wczesnym podaniu antybiotyku. Inny niekorzystny przebieg fagotera pii może być spowodowany jednoczesnym uży ciem faga i antybiotyku [18, 19]. Wpływ antybiotyków na terapię fagową Wzrost antybiotykooporności bakterii uzasa dnia celowość przeprowadzenia badań nad jed noczesnym użyciem fagów i antybiotyków. Uni kalność fagoterapii polega między innymi na wzroście stężenia leku w czasie jego stosowa nia. Jak wynika z badań przeprowadzonych przez Ślopka et al. [18] oraz Sakandelidze [19], stosowanie połączeń faga i antybiotyku w fago terapii sugeruje, że wypadkowy efekt takiej tera pii jest słabszy niż w przypadku użycia samego bakteriofaga. Z danych doświadczalnych wyni ka, że antybiotyk może zmniejszać skuteczność terapii fagowej. Należy także dodać, że jedno czesne dodanie antybiotyków i fagów powoduje wydłużenie czasu namnażania faga. Zgodnie z teorią kinetyczną Payne a [4] należałoby się więc spodziewać, że w przypadku użycia faga po czasie Tp użycie antybiotyku powinno raczej zwiększać skuteczność terapii fagowej. Wyniki te wskazują na złożoność interakcji faga, anty biotyku i bakterii. Pasywny i aktywny charakter terapii fagowej W wyniku przeprowadzonych symulacji kom puterowych model zaproponowany przez Pay ne a [2] sprawdzono w warunkach in vivo oraz in vitro. W przypadku stosowania małych dawek fa ga efekt samoreplikacji porównano z ponownym dodaniem leku konwencjonalnego i uznano, że te rapia ma wówczas charakter aktywny. W przypad ku zastosowania dużych dawek początkowych we dług kinetycznej terminologii Payne a terapia ma charakter pasywny. Na podstawie modelu zapro ponowanego przez Payne a analizowano skutecz ność terapii jako funkcję wielkości dawki dodane go faga i wyboru czasu podania. Użycie tego ma tematycznego modelu pozwala na porównanie skuteczności terapii dla konwencjonalnego leku i bakteriofaga. Analizując zależność skuteczności terapii od wielkości dawki i czasu podania fagów (ryc. 2) [4], stwierdzono różne wyniki w zależno ści od wyżej wymienionych parametrów. Następ stwem takiego modelu jest to, że przy odpowie dnio zbliżonym stosunku ilościowym bakterii do fagów przebieg terapii ma charakter aktywny. Zo stało to dobrze zilustrowane w przeprowadzonych przez Soothilla [17] eksperymentach fagoterapii zwierząt. Według autorów tego modelu, w proce sie namnażania faga, początek terapii jest opóźnia ny z uwagi na jej pasywny charakter. Jak wynika w przeprowadzonych symulacji tego modelu terapii, w tym czasie zmniejsza się liczba bakterii. Świadczy o tym zgodność powierzchni skuteczności w zakre sie dużych dawek dla konwencjonalnego leku i dla faga (ryc. 2) [4]. Dla pozostałych dawek faga stwier dzono przebieg powierzchni charakteryzujący się brakiem jej ciągłości. Przyjmowanie zerowych war tości skuteczności terapii dla mniejszych i początko wych dawek sugeruje (w tym modelu), że terapia za wiedzie, jeśli dokona się takiego wyboru dawko wania i wyboru czasu podania faga.

4 108 A. ZWIEFKA, B. WEBER DĄBROWSKA, A. GÓRSKI Ryc. 2. Powierzchnie skuteczności pokazane jako funkcja czasu i wielkości dawki, dla: (A) typowego leku kon wencjonalnego, (B) bakteriofaga jako samoreplikującego się leku według Payne'a [4] Fig. 2. Efficacy surfaces displayed as a function of the time and size of dose, for: (A) a typical conventional style drug, (B) bacteriophage as a self replicating drug according to Payne [4] Koloidalny model terapii fagowej Inny model terapii fagowej [20] przewiduje, że spotkanie fagów z komórkami bakterii, jako ich gospodarzami, jest całkowicie przypadkowe. Wzajemne oddziaływanie fagów i bakterii jest tu opisywane przez ruchy Browna oraz łączenie się (koagulację) bezwładnych koloidalnych cząstek. Model ten został zaproponowany przez Kasman et al. [21]. Przeprowadzone symulacje kompute rowe tego modelu przyczyniły się do alternatyw nego wytłumaczenia zjawiska replikacji fagów. Zostało ono zinterpretowane poprzez próg gęsto ści replikacji na podstawie matematycznego mo delu Schlesingera [22]. Podstawowym elemen tem tego modelu jest MOI (multiplicity of infec tion) definiowany jako średnia liczba zakażania każdej komórki, obliczana jako stosunek liczby cząstek wirusa i komórek bakterii. Istotą tego modelu jest założenie, że wszystkie cząstki wiru sa znajdą i zakażą komórkę. Również w tym przy padku ważnym wymogiem efektywnej terapii jest, aby komórki bakterii były obecne w gęsto ściach równych lub znacznie większych niż faga. Wnioski Terapeutyczne zastosowanie bakteriofagów, uważanych za samoreplikujące się leki wynika z ich zdolności do namnażania się [13]. Wskazu je to na teoretyczną możliwość stosowania bardzo małych ilości fagów. Symulacja odpowiednio do branego modelu terapii fagowej powinna umożli wić przewidywanie dawki i czasu podania faga. Ostatnio ukazała się kolejna praca sugerująca, że symulacja komputerowa wzrostu liczby fagów może ułatwić ocenę stopnia ich namnażania [24]. Wymogi te może spełnić w przyszłości dalszy rozwój modelu kinetycznego. Przyczyni się do te go znajomość zachodzących kinetycznych zja wisk zależności gęstości bakterii i bakteriofagów, a także oddziaływań bakteriofagi bakterie. Jednym z głównych czynników wpływających na przebieg terapii fagowej jest fakt opóźnienia wzrostu liczby fagów w hodowli od czasu, gdy bakteriofag jest mieszany z podatnymi nań bakte riami. W kulturze bakteryjnej (in vitro) liczba fa gów wzrasta dopiero po okresie minut. Czas ten jest określany jako czas potrzebny, aby osiągnąć próg replikacji lub próg namnażania fagów [23]. Matematyczny model takiego opóź nienia w replikacji fagów nie był jeszcze szeroko badany lub dyskutowany. Dlatego też należy w najbliższym czasie podjąć takie badania. Wiadomo, że z punktu widzenia kinetyki naj wolniejszy etap określa dynamikę całego procesu. To, co jest dlań decydujące, powinno więc być analizowane również na poziomie molekularnym. Należy założyć, że kliniczna skuteczność tera pii bakteriofagowej może zależeć również od tego typu badań. Wyniki badań nad fagami otrzymywa ne z zastosowaniem metod biologii molekularnej i genetyki mogą być również interpretowane w kontekście kinetyki fagów. Uzupełniony w ten sposób matematyczny model terapii fagowej po zwoli dokładniej przeanalizować procesy zacho dzące podczas jej prowadzenia. Innym rozszerzeniem tego modelu powinno być zastosowanie symulacji komputerowej opartej na me todach dynamiki molekularnej. Umożliwi to zapropo nowanie modelu potrafiącego przewidzieć i analizo wać oddziaływania fagów i bakterii zarówno na po ziomie molekularnym, jak i makromolekularnym.

5 Symulacje komputerowe terapii fagowej 109 Piśmiennictwo [1] Pirisi A.: Phage therapy advantages over antibiotics? Lancet 2000, 356, [2] Payne R. J. H, Jansen V. A. A.: Phage therapy: The peculiar kinetics of self replicating pharmaceuticals. Clin. Pharmacol. Ther. 2000, 68, [3] Payne R. J. H., Jansen V. A. A.: Understanding bacteriophage therapy as a density dependent kinetic process. J. Ther. Biol. 2001, 208, [4] Payne R. J. H., Jansen V. A. A.: Pharmacokinetic principles of bacteriophage therapy. Clin. Pharmacokinetics. (in press). [5] Smith T. L., Pearson M. L., Wilcox K. R., Cruz C., Lancaster M. V., Robinson Dunn B., Tenover F. C., Ze rvos M. J., Band J. D., White E., Jarvis W. R.: Emergence of vancomycin resistance in Staphylococcus, N. Engl. J. Med. 1999, 340, [6] Hryniewicz W., Trzciński K.: Oporność na metycylinę Staphylococcus aureus. Mikrob. Ed. 1995, 2/3, [7] Annas G. J.: Bioterrorism, public health, and civil liberties, N. Engl. J. Med. 2002, 346, [8] Schuch R., Nelson D., Fischetti V. A.: A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis, Nature 2002, 418, [9] Sulakvelidze A., Alavidze Z., Morris J. G. Jr.: Bacteriophage therapy, Antimicrob. Agents Chemother. 2001, 45, [10] Smith H. W., Huggins M. B., Shaw K. M.: The control of experimental Escherichia coli diarrhoea in calves by means of bacteriophages, J. Gen. Microbiol. 1987, 133, [11] Ślopek S., Weber Dąbrowska B., Dąbrowski M., Kucharewicz Krukowska A.: Results of bacteriophage tre atment of suppurative bacterial infections in the years , Arch. Immunol. Ther. Exp. 1987, 35, [12] Weber Dąbrowska B., Mulczyk M., Górski A.: Bacteriophage therapy of bacterial infections: an update of our institute's experience, Arch. Immunol. Ther. Exp. 2000, 48, [13] Sharp R.: Bacteriophages: biology and history. J. Chem. Tech. Biotech. 2001, 76, [14] Ackermann H. W., DuBow M.: Viruses of Prokaryotes I: General Properties of Bacteriophages. Chap. 7. In: Practical Applications of Bacteriophages. CRC Press, Boca Raton, Floryda [15] Barrow P. A., Soothil J. S.: Bacteriophage therapy and prophylaxis: rediscovery and renewed assessment of po tential. Trends Microbiol.1997, 5, [16] Alisky J., Iczkowski K., Rapaport A., Troitsky N.: Bacteriophage show promise as antimicrobial agents. J. In fect. 1998, 36, [17] Soothill J. S.: Treatment of experimental infection of mice with bacteriophages. J. Med. Microbiol., 1992, 37, [18] Ślopek S., Durlakowa I., Weber Dąbrowska B., Kucharewicz Krukowska A., Dąbrowski M., Bisikiewicz R.: Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections I. General evaluation of the results. Arch. Immunol. Ther. Exp. 1983, 31, [19] Sakandelidze V. M.: The combined use of specific phages and antibiotics in different infectious allergoses. Vrach. Delo 1991, 3, (in Russian). [20] Stent G. S.: Molecular biology of bacterial viruses. p. W. H. Freeman and Company, San Francisco 1963, [21] Kasman L. M., Kasman A., Westwater C., Dolan J., Michael G., Schmidt I., James S., Norris I.: Overcoming the Phage Replication Threshold: a Mathematical Model with Implications for Phage Therapy. J. Virol. 2002,76, [22] Schlesinger M.: Adsorption of phages to homologous bacteria. II. Quantitative investigations of adsorption velocity and saturation. Estimation of the particle size of the bacteriophage, Z. Hyg. Immunitaetsforsch. 1932, 114, [23] Wiggins B. A., Alexander M.: Minimum bacterial density for bacteriophage replication: implications for signi ficance of bacteriophages in natural ecosystems, Appl. Environ. Microbiol. 1985, 49, [24] Abedon S. T., Herschler T. D., Stopar D.: Bacteriophage latent period evolution as a response to resource ava ilability. Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, Adres do korespondencji: Antoni Zwiefka Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN ul. Rudolfa Weigla Wrocław Praca wpłynęła do Redakcji: r. Po recenzji: r. Zaakceptowano do druku: r. Received: Revised: Accepted: