Adhezja bakterii na modyfikowanych powierzchniach protetycznego stopu Ni-Cr-Mo. Badania wstępne*

Transkrypt

1 PROTET. STOMATOL., 2007, LVII, 1, Adhezja bakterii na modyfikowanych powierzchniach protetycznego stopu Ni-Cr-Mo. Badania wstępne* Bacteria adhesion to modified surfaces of prosthodontic Ni-Cr-Mo alloy. A preliminary study Leszek Klimek, Witold Jakubowski, Katarzyna Banaszek 1 Z Instytutu Inżynierii Materiałowej Politechniki Łódzkiej Dyrektor: prof. dr hab. inż. P. Kula 2 Z Zakładu Endodoncji Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik: prof. dr hab. n. med. H. Pawlicka HASŁA INDEKSOWE: stopy protetyczne, adhezja bakterii, SEM, węglik tytanu, węglikoazotek tytanu KEY WORDS: prosthodontic alloy, adhesion of bacteria, SEM, titanium nitride, titanium nitrocarbide Streszczenie Cel pracy: określenie stopnia adhezji bakterii do modyfikowanych powierzchniach stomatologicznego stopu protetycznego Ni-Cr-Mo. Materiał i metoda: badania wykonano na stopie HE- ARENIUM, którego powierzchnię pokryto następującymi warstwami azotek tytanu TiN oraz węglikoazotek tytanu Ti(CN). Ten ostatni w dwóch wariantach składu bogatszy w węgiel (4% wag. C) i uboższy w węgiel (15% wag. C). Próbki zostały umieszczone na 24 godziny w hodowli bakteryjnej, a następnie poddane obserwacjom w elektronowym mikroskopie skaningowym gdzie określano liczbę bakterii obecnych na powierzchniach badanych próbek. Wyniki: otrzymane wyniki wykazały, że najmniej bakterii kolonizowało powierzchnie pokryte azotkiem tytanu, a najwięcej próbkę kontrolną stop bez pokrycia. Warstwy węglikoazotków tytanu wykazywały pośredni stopień kolonizacji bakteriami. Wnioski: z przeprowadzonych badań wynika, że istnieje możliwość modyfikacji powierzchni stopów protetycznych umożliwiająca zmniejszenie do nich adhezji bakterii. Warstwy azotków i węglikoazotków tytanu zdecydowanie zmniejszają adhezję bakterii na stopie Ni-Cr-Mo. Przy czym dało się zauważyć, że im warstwa bogatsza w węgiel, tym obserwuje się więcej bakterii na powierzchni. Summary Aim of the study: The study aimed at defining the degree of bacteria adhesion to modified surface of the prosthodontic Ni-Cr-Mo alloy is presented. Material and methods: The study was conducted on the hearenium alloy, the surface of which was covered with two following layers, titanium nitride TiN and titanium nitrocarbide Ti (CN). The latter was applied in two different composition variants richer in carbon (15% of weight) and poorer in carbon (4% of weight). The samples were placed in bacterial medium for 24 hours, then observed under a scanning electron microscope, and the number of bacteria present on their surfaces was determined. Results: The obtained results showed that the smallest number of bacteria colonised surfaces covered with titanium nitride and the greatest number of bacteria were observed on control samples not covered with any layer. Conclusions: Titanium nitrocarbides showed the medium degree of colonisation by bacteria. Moreover, it was observed that the more carbon in the layer the more bacteria on the surface were present. *Niniejsza praca była finansowana przez Uniwersytet Medyczny w Łodzi w ramach prac własnych nr

2 Stopy protetyczne adhezja bakterii Wstęp Jama ustna może być traktowana jako specyficzny przykład ekosystemu. W takim ujęciu biocenozę stanowiłyby zasiedlające ją drobnoustroje, które podlegają wpływom abiotycznych czynników otoczenia. Najliczniejszym przedstawicielem flory jamy ustnej są bakterie, jednak można znaleźć także przedstawicieli grzybów i pierwotniaków. Jednocześnie wielokrotnie potwierdzano obecność wirusów. W prawidłowych warunkach fizjologicznych zdrowego organizmu jama ustna posiada stały skład drobnoustrojów określany mianem mikroflory fizjologicznej. Pozostaje ona w stałej równowadze z organizmem gospodarza. Drobnoustroje te mogą doprowadzać do stanów patologicznych jedynie w wyjątkowych okolicznościach: np. w wyniku biernego zakażenia przez bakterie lub nadmiernego wzrostu w miejscu zazwyczaj dla nich niedostępnym, a korzystnym dla ich rozwoju. W efekcie prowadzi to do powstania oportunistycznych miejsc zapalnych, a mikroorganizmy takie nazywamy patogenami oportunistycznymi (1). W praktyce nie występuje stan jałowej jamy ustnej. Już w pierwszych godzinach życia można wykryć drobnoustroje, pochodzące z dróg rodnych matki, jej skóry, które podczas porodu, dostały się do jamy ustnej noworodka (2). Równocześnie przez całe życie dochodzi do biernego zakażania przez bakterie znajdujące się w spożywanych pokarmach, wodzie, powietrzu (1). Bakterie kolonizują wszystkie elementy anatomiczne wchodzące w skład jamy ustnej wargi, policzki, język, dziąsła, zęby i kieszonki dziąsłowe. Błona śluzowa wyścielająca jamę ustną jest pokryta nabłonkiem wielowarstwowym płaskim, który ulega złuszczaniu, co prowadzi do redukcji ilości bakterii na powierzchni jamy ustnej. Również na skutek fizjologicznych ruchów języka, warg i policzków podczas mówienia, żucia, uśmiechu, duża ilość bakterii zostaje starta z niektórych aktywnych mechanicznie powierzchni. Obecność śliny i płynu kieszonki dziąsłowej z jednej strony jest czynnikiem ograniczającym wzrost kolonii bakteryjnych, a z drugiej strony poprzez obecność lepkich peptydów i glikoprotein są czynnikiem ułatwiającym adhezję bakterii do powierzchni i są źródłem substancji pokarmowych (1, 3, 4). Bakterie osiedlają się szczególnie łatwo na twardych strukturach znajdujących się w jamie ustnej, gdyż ich powierzchnia nie ulega złuszczeniu, zwłaszcza na zębach a także na uzupełnieniach protetycznych i obturatorach. Nagromadzenie bakterii otoczonych polimerami pochodzenia bakteryjnego i ze śliny nazywane jest płytką bakteryjną. Płytka może odkładać się na zębach tworząc płytkę nazębną (dental plaque), dziąsłach (gigival plaque) i uzupełnieniach protetycznych (denture plaque) (4). Skład i wielkość płytki jest bardzo zróżnicowana i jest zależna od lokalizacji w jamie ustnej pacjenta, składu jego śliny, diety, działania naturalnych mechanizmów oczyszczających, zabiegów higienicznych i wieku płytki (4). Adhezja bakterii do twardej powierzchni zęba jest procesem złożonym i przebiega w kilku fazach. Początkowo na czystej powierzchni szkliwa osadza się warstwa glikoprotein i innych białek pochodzących ze śliny tworząc tzw. osłonkę nabytą. Do niej, dzięki siłom van der Waalsa i słabym oddziaływaniom elektrostatycznym, dochodzi do przylegania pierwszych bakterii, głównie z rodzaju Streptococcus. Wczesna płytka (po 1-2 dniach) charakteryzuje się przewagą Gram-odatnich ziarniaków i pałeczek, nazywana jest płytką 1 fazy. W II fazie dochodzi do wtórnej kolonizacji powierzchni już zasiedlonej przez bakterie i pojawiają się dodatkowo bakterie Gram-ujemne, co prowadzi do wzrostu patogenności tak powstałego bifilmu. Dojrzała płytka nazębna) faza III może mieć około 0,5 mm grubości (4). W tej fazie wielokrotnie obserwowano obecność ruchliwych krętków z rodzaju Treponema, które szczególnie obficie występują w poddziąsłowej płytce nazębnej. Wydzielają one zewnątrzkomórkowe enzymy podobne do trypsyny doprowadzając do degradacji kolagenu (1). Po 7 dniach w 1 g płytki może być mln bakterii. Bakterie rozwijają się w postępie geometrycznym, co prowadzi do bardzo szybkiego wzrostu biomasy płytki nazębnej. W literaturze dostępne są doniesienia o podwojeniu liczby bakterii zasiedlających jamę ustną nawet w ciągu 15 minut (4). Stąd biorąc pod uwagę cechy chorobotwórcze płytki bakteryjnej i jej wpływ na stan zdrowia jamy ustnej celowe jest zbadanie stopnia odkładania się bakterii na stopach metali stosowanych na uzupeł- PROTETYKA STOMATOLOGICZNA, 2007, LVII, 1 61

3 L. Klimek i inni nienia protetyczne. Ma to duże znaczenie dla osób mających braki zębowe, a szczególnie dla pacjentów dodatkowo cierpiących na choroby przyzębia i błony śluzowej (5, 6). Stosowanymi często w protetyce materiałami są stopy, których podstawowymi składnikami są chrom i nikiel lub chrom i kobalt. Wykazują one jednak stosunkowo niską odporność korozyjną w porównaniu ze stopami metali szlachetnych (7, 8). Ich stosowanie podyktowane jest jednak względami ekonomicznymi. W celu poprawienia odporności korozyjnej pokrywane są warstwami azotków lub węglikoazotków tytanu. Wydaje się, więc celowe sprawdzenie w jakim stopniu te pokrycia wpływają na adhezję bakterii do powierzchni metalowych elementów protetycznych (9, 10, 11, 12, 13). Cel pracy Celem pracy było określenie stopnia adhezji bakterii do modyfikowanych powierzchniach stomatologicznego stopu protetycznego Ni-Cr-Mo. Materiał i metoda Materiał do badań stanowiły próbki w kształcie walca o średnicy 8 mm i wysokości 5 mm wykonane ze stopu HEARENIUM o składzie zamieszczonym w tabeli I. Osiem próbek wykonanych z tego stopu podzielono na 4 grupy po 2 próbki w każdej. Jedna grupa pozostała bez pokrycia i stanowiła grupę kontrolną, natomiast z pozostałych jedna została pokryta warstwą azotku tytanu TiN, natomiast dwie pozostałe warstewkami węglikoazotku tytanu TiCN, przy czym poszczególne grupy różniły się zawartością węgla i azotu w warstwie. Pierwsza warstwa oznaczona Ti(CN) 1 zawierała 4% wag. węgla, natomiast druga oznaczona Ti(CN) 2 zawierała 15% wag. węgla. Próbki po umyciu i wyjałowieniu alkoholem etylowym umieszczone zostały w100 ml hodowli bakteryjnej o składzie: Pepton G 0,5%, ekstrakt drożdżowy 0,5%, NaCl 1,0%, ph = 7,0, którą zaszczepiono bakteriami E. coli szczepu K12 (około 2x10 3 komórek). Po 24 godzinach hodowli w temperaturze 37 C próbki wyjęto z pożywki i przemyto sterylną wodą destylowaną w celu usunięcia niezaadherowanych bakterii. Tak przygotowane próbki utrwalano w 2,5% aldehydzie glutarowym w 0,1 M buforze fosforanowym o ph 7,4 przez 1 godzinę w temperaturze 4 C. Następnie próbki płukano w buforze fosforanowym o ph 7,4 dwa razy po 10 minut. Badane powierzchnie odwadniano w szeregu alkoholi o wzrastającym stężeniu, suszono na powietrzu a następnie napylono nm warstwą złota w napylarce JEOL JEE-4X. Otrzymane w ten sposób preparaty poddano obserwacjom w elektronowym mikroskopie skaningowym HITACHI S-3000N przy napięciu przyspieszającym 5 kv. W każdej z badanych grup wybrano losowo 30 obszarów przy powiększeniu 1000x i liczono ilość obecnych na nich bakterii. Z tak otrzymanych wyników policzono średnie arytmetyczne, odchylenia standardowe i poddano je analizie statystycznej stosując Parametryczny test istotności oparty na dużych próbach (14). Wyniki badań Wyniki obliczeń liczby bakterii zaobserwowanych w obszarze przyjętym do analizy zamieszczono w tabeli II, natomiast przykładowe obrazy uzyskane w wyniku obserwacji w elektronowym mikroskopie skaningowym przedstawiono na ryc. 1a-d. Na ryc. 2 zamieszczono graficzne przedstawienie ilościowych obliczeń zaadherowanych bakterii na poszczególnych podłożach. T a b e l a I. Skład chemiczny stopu użytego do badań Zawartość pierwiastków [%] wag. Ni Cr Mo Fe Mn Ta Si Nb reszta 24,36 9,81 1,07 0,85 0,19 0,43 0,21 62 PROTETYKA STOMATOLOGICZNA, 2007, LVII, 1

4 Stopy protetyczne adhezja bakterii T a b e l a I I. Liczba zaadherowanych bakterii na poszczególnych próbkach Rodzaj podłoża kontrola TiN Ti(CN) 1 Ti(CN) 2 Średnia liczba bakterii Odchylenie standardowe 13,7 5,1 6,9 7,6 Ryc. 1. Skaningowe obrazy powierzchni badanych próbek; a próbka kontrolna, b próbka pokryta TiN, c próbka pokryta TiCN-1, d próbka pokryta TiCN-2. Omówienie wyników badań Na podstawie wykonanych obliczeń ilości bakterii zaadherownych na poszczególnych próbkach można stwierdzić, że przy założeniu poziomu istotności wynoszącym 0,95 otrzymano istotne statystycznie różnice pomiędzy badanymi próbkami (ryc. 2). Najwięcej bakterii zaadherowało na próbce kontrolnej wykonanej ze stopu Ni Cr Mo nie poddanej żadnym procesom modyfikującym jej powierzchnię. Na powierzchniach próbkach z naniesionymi warstwami azotku lub węglikoazotków tytanu zaobserwowano zdecydowanie mniej bakterii (TiN 9, TiCN uboższy w węgiel 20, PROTETYKA STOMATOLOGICZNA, 2007, LVII, 1 63

5 L. Klimek i inni Piśmiennictwo Ryc. 2. Liczba zaadherowanych bakterii na powierzchniach badanych próbek; a próbka kontrolna, b próbka pokryta TiN, c próbka pokryta TiCN-1, d próbka pokryta TiCN-2. TiCN bogatszy w węgiel 33). Widać z tego, że warstwy azotków i węglikoazotków tytanu zdecydowanie zmniejszają ilość zaadherowanych na ich powierzchniach bakterii. Daje się zauważyć, że im warstwa uboższa w węgiel tym mniej obserwuje się niej bakterii. Najmniej dla czystego TiN najwięcej dla TiCN o zawartości 15% wag. węgla. Trudno powiedzieć czy jest to związane ze składem chemicznym warstw czy z ich budową. Wyraźnie widać bowiem, że wraz ze zwiększeniem zawartości węgla w badanych warstwach rośnie ich rozwinięcie powierzchni, a ten parametr sprzyja adhezji elementów do powierzchni. Z uwagi na to, że warstwy tego typu otrzymuje się różnymi metodami wydaje się konieczne zbadanie takich warstw otrzymanych innymi metodami. Wnioski 1. Istnieje możliwość modyfikacji powierzchni stopów protetycznych umożliwiająca zmniejszenie do nich adhezji bakterii. 2. Warstwy azotków i węglikoazotków tytanu zdecydowanie zmniejszają adhezję bakterii na stopie Ni Cr Mo. 3. Im mniejsza zawartość węgla w warstwie tym mniejsza do niej adhezja bakterii. 1. Marsh P., Marsh M.: Mikrobiologia Jamy ustnej, PWN, Warszawa Kurnatowska A.: Składniki ontocenozy jamy ustnej. Czas. Stomat., 2002 LV, 7, Czuryszkiewicz J.: Płyn kieszonkowy (Gingiral Crevieular Fluid) jako rezerwuar ważnych diagnostycznie wskaźników aktywności chorób przyzębia na podstawie piśmiennictwa. Czas. Stomat., 2001, LIV, 5, Jańczuk Z.: Biblioteka Stomatologa 6. Choroby przyzębia, zapobieganie, diagnostyka i leczenie. PZWL, Warszawa Chrustowicz Ł., Brzezińska-Błaszczyk E.: Rola mechanizmów komórkowych w rozwoju chorób przyzębia. Czas. Stomat., 1999, LII, 9, Górska R. i wsp.: Wpływ flory bakteryjnej kieszonek przyzębnych na poziom cytokoin u pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia. Czas. Stomat., 2002, LV, 8, Geis-Gerstorfer J., Greener E.: Zum Einflus des Mo-Gehaltes und des ph-werters auf das Korrosionsverhalten von Ni-20Cr-Mo-Dentallegir ungen Dtsch. Zahnärztl. Z., Peterson C., Hillberry B., Heck D.: Component wear of total knee prostheses using Ti-6Al-4V, titanium nitride coated Ti-6Al-4V, and cobalt-chromium-molybdenum femoral components. J. Biomed. Mater. Res., Klimek L.: Badania odporności korozyjnej stopu stomatologicznego Hearenium NA pokrytego warstwami azotku i węglikoazotków tytanu, Magazyn Stomatologiczny, 1, 157, rok XV styczeń 2005, Klimek L.: Budowa i odporność korozyjna warstw azotku i węglikoazotku tytanu na stomatologicznym stopie WIRONIT, Inżynieria Biomateriałów Engineering of Biomaterials, 42-43, 2005, Rylska D., Sokołowski J., Klimek L.: Corrosion resistance investigations of prosthetic dental alloys coated by TiN. Annals of Transplantation, 9, 1A, 2004, Sokołowski J.: Ocena przydatności ochronnych powłok azotku tytanu wytworzonych na metalowych elementach uzupełnień protetycznych. Rozprawa habilitacyjna Akademia Medyczna w Łodzi, Łódź Wisbey A., Gregson P., Tuke M.: Application of PVD TiN coating to Co-Cr-Mo based surgical implants Biomaterials 1987, 8, 6, Platt C.: Problemy rachunku prawdopodobieństwa i statystyki matematycznej, PWN, Warszawa Zaakceptowano do druku: 20.VII.2006 r. Adres autorów: Łódź, ul. Stefanowskiego 1. Zarząd Główny PTS PROTETYKA STOMATOLOGICZNA, 2007, LVII, 1