AUTOREFERAT NAUKOWYCH... 2

Transkrypt

1 AUTOREFERAT SPIS TREŚCI 1. IMIĘ I NAZWISKO: BARTOSZ KEMPISTY WYKAZ POSIADANYCH DYPLOMÓW I STOPNI NAUKOWYCH ORAZ TYTUŁ ROZPRAWY DOKTORSKIEJ PRZEBIEG PRACY ZAWODOWEJ ORAZ INFORMACJE O DOTYCHCZASOWYM ZATRUDNIENIU W JEDNOSTKACH NAUKOWYCH OSIĄGNIĘCIE NAUKOWE I JEGO OMÓWIENIE OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH OSIĄGNIĘĆ NAUKOWO-BADAWCZYCH DZIAŁALNOŚĆ DYDAKTYCZNA INNE OSIĄGNIĘCIA DANE OSOBOWE I INFORMACJE UMOŻLIWIAJĄCE BEZPOŚREDNI KONTAKT Z WNIOSKODAWCĄ

2 1. IMIĘ I NAZWISKO: BARTOSZ KEMPISTY 2. WYKAZ POSIADANYCH DYPLOMÓW I STOPNI NAUKOWYCH ORAZ TYTUŁ ROZPRAWY DOKTORSKIEJ Tytuł zawodowy magistra biologii, dyplom ukończenia Akademii Rolniczej im Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu na Wydziale Hodowli i Biologii Zwierząt, 2005 Stopień naukowy doktora nauk biologicznych na podstawie rozprawy doktorskiej pt.: Badanie wybranych, molekularnych mechanizmów niepłodności u mężczyzn - Wydział Lekarski I, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu, 18 czerwca Promotor prof. dr hab. Paweł P. Jagodziński 3. PRZEBIEG PRACY ZAWODOWEJ ORAZ INFORMACJE O DOTYCHCZASOWYM ZATRUDNIENIU W JEDNOSTKACH NAUKOWYCH zatrudniony na etacie inżynieryjno-technicznym w Katedrze i Zakładzie Biochemii i Biologii Molekularnej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu zatrudniony na stanowisku asystenta do określonych zadań w Katedrze i Zakładzie Biochemii i Biologii Molekularnej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu zatrudniony na stanowisku asystenta w Katedrze i Zakładzie Histologii i Embriologii Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu zatrudniony na stanowisku asystenta w Katedrze i Zakładzie Anatomii Prawidłowej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu obecnie - zatrudniony na stanowisku adiunkta w Katedrze i Zakładzie Histologii i Embriologii Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu (1/4 etatu) obecnie - zatrudniony na stanowisku adiunkta w Katedrze i Zakładzie Anatomii Prawidłowej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu (3/4 etatu). 4. OSIĄGNIĘCIE NAUKOWE I JEGO OMÓWIENIE Tytuł osiągnięcia naukowego: Ekspresja wybranych genów i dystrybucja kodowanych przez nie białek w komórkach wieńca promienistego oraz komórkach ziarnistych jajnika świni w układzie hodowli pierwotnej, na podstawie cyklu 5 prac: 2

3 Publikacje składające się na osiągnięcie naukowe o którym mowa w artykule 16 ust. 2 ustawy oraz liczba cytowani na dzień opracowane na podstawie Web of Science. 1. Bartosz Kempisty, Agnieszka Ziółkowska, Hanna Piotrowska, Piotr Zawierucha, Paweł Antosik, Dorota Bukowska, Sylwia Ciesiółka, Jędrzej M. Jaśkowski, Klaus P. Brüssow, Michał Nowicki, Maciej Zabel. Real- time proliferation of porcine cumulus cells is related to the protein levels and cellular distribution of Cdk4 and Cx43. Theriogenology 2013: Vol. 80, nr 4, s , IF= 1.845, punkty MNiSW: 35 Indywidualny wkład własny polegał na: ustaleniu koncepcji badań i koordynacji prowadzonych eksperymentów, izolacji komórek z kompleksów COCs, oznaczeniu indeksu proliferacji komórek w hodowli pierwotnej w czasie rzeczywistym, przeprowadzeniu reakcji immunofluorencencyjnej, analizie statystycznej uzyskanych wyników, opracowaniu ryciny 1, 2, 3 i 4 oraz przygotowaniu redakcyjnym całości artykułu. Udział procentowy - 70% 2. Bartosz Kempisty, Agnieszka Ziółkowska, Hanna Piotrowska, Sylwia Ciesiółka, Paweł Antosik, Dorota Bukowska, Piotr Zawierucha, Magdalena Woźna, Jędrzej M. Jaśkowski, Klaus P. Brüssow, Michał Nowicki, Maciej Zabel. Short-term cultivation of porcine cumulus cells influences the cyclin-dependent kinase 4 (Cdk4) and connexin 43 (Cx43) protein expression- a real-time cell proliferation approach. J. Reprod. Dev. 2013: Vol. 59, nr 4, s , IF= 1.635, punkty MNiSW: 25 Indywidualny wkład własny polegał na: ustaleniu koncepcji badań i koordynacji prowadzonych eksperymentów, izolacji komórek z kompleksów COCs, oznaczeniu indeksu proliferacji komórek w hodowli pierwotnej w czasie rzeczywistym, przeprowadzeniu reakcji immunofluorencencyjnej, oraz przygotowaniu redakcyjnym całości artykułu. Udział procentowy - 60% 3. Bartosz Kempisty, Agnieszka Ziółkowska, Sylwia Ciesiółka, Hanna Piotrowska, Paweł Antosik, Dorota Bukowska, Klaus P. Brüssow, Michał Nowicki, Maciej Zabel. Expression and cellular distribution of estrogen and progesterone receptors and the 3

4 real - time proliferation of porcine cumulus cells. Zygote: page 1 of 10, 2014, doi: /S IF= 1.323, punkty MNiSW: 15 Indywidualny wkład własny polegał na: ustaleniu koncepcji badań i koordynacji prowadzonych eksperymentów, izolacji komórek z kompleksów COCs, oznaczeniu indeksu proliferacji komórek ziarnistych w hodowli pierwotnej w czasie rzeczywistym, przeprowadzeniu reakcji immunofluorescencyjnej, opracowaniu ryciny 1, 2 i 3 oraz przygotowaniu redakcyjnym całości artykułu. Udział procentowy - 70% 4. Bartosz Kempisty, Agnieszka Ziółkowska, Sylwia Ciesiółka, Hanna Piotrowska, Paweł Antosik, Dorota Bukowska, Michał Nowicki, Klaus-Peter Brüssow, Maciej Zabel. Association between the expression of LHR, FSHR and CYP19 genes, cellular distribution of encoded proteins and proliferation of porcine granulosa cells in realtime. J. Biol. Regul. Homeost. Agents 2014 : Vol. 28, nr 3, s IF= 2.406, punkty MNiSW: 20 Indywidualny wkład własny polegał na: ustaleniu koncepcji badań i koordynacji prowadzonych eksperymentów, izolacji komórek ziarnistych z pęcherzyków jajnikowych jajników świni pobranych poubojowo, oznaczeniu indeksu proliferacji komórek ziarnistych w hodowli pierwotnej w czasie rzeczywistym, przeprowadzeniu reakcji immunofluorencencyjnej, analizie statystycznej wyników oraz przygotowaniu redakcyjnym całości artykułu. Udział procentowy - 70% 5. Bartosz Kempisty, Agnieszka Ziółkowska, Sylwia Ciesiółka, Hanna Piotrowska, Paweł Antosik, Dorota Bukowska, Michał Nowicki, Klaus P. Brüssow, Maciej Zabel. Study on connexins gene and protein expression and cellular distribution in relations to realtime proliferation of porcine granulosa cells. J. Biol. Regul. Homeost. Agents 2014: Vol. 28, nr 4, s IF= 2.406, punkty MNiSW: 20 Indywidualny wkład własny polegał na: ustaleniu koncepcji badań i koordynacji prowadzonych eksperymentów, izolacji komórek ziarnistych z pęcherzyków jajnikowych jajników świni pobranych poubojowo, oznaczeniu indeksu proliferacji komórek ziarnistych w hodowli pierwotnej w czasie rzeczywistym, przeprowadzeniu reakcji immunofluorencencyjnej, opracowaniu ryciny 1-6 i 7 oraz przygotowaniu redakcyjnym całości artykułu. 4

5 Udział procentowy - 70% Sumaryczny Impact Factor według Journal Citation Reports= 9, Omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Podobieństwo filogenetyczne świni (łac. Sus scrofa domestica) do człowieka sprawia, że wybrane rasy tego gatunku są często wykorzystywane jako model doświadczalny w badaniach biomedycznych. Świnie szybko się rozmnażają i stosunkowo łatwo poddają się modyfikacjom genetycznym. DNA świni jest w 94% zgodne z DNA człowieka. Ponadto zaletami trzody chlewnej są wielkość organów i wydolność fizjologiczna, zbliżona do człowieka. Liczne zalety tego gatunku sprawiają, że znajduje on zastosowanie w transplantologii, głównie w kardiochirurgii, gdzie świnia często stanowi model doświadczalny w operacjach na otwartym sercu [Wong Y.C., 2015; Lelovas P.P., 2014; Maslov M.Y., 2014; Elgharably H., 2014]. W badaniach nad biologią rozrodu również istnieją procesy, których przebieg i regulacja jest zbliżona u świni i człowieka. Należą do nich między innymi: (1) pętle sprzężeń zwrotnych sekrecji wybranych hormonów (2) morfologia pęcherzyków jajnikowych, oraz (3) typy komórek, które budują pęcherzyki jajnikowe [Nichols-Burns S.M., 2014; Lunney J.K., 2007]. Prowadzone przeze mnie w ostatnich latach badania polegały na identyfikacji czynników wpływających na kompetencję rozwojową świńskich komórek jajowych w różnych układach hodowli in vitro. Zbadano wpływ hormonów progesteronu (P4) i 17-beta-estradiolu (E2) i/lub czynników tj. wielkości pęcherzyków jajnikowych, na osiąganie przez komórki jajowe zdolności do dojrzewania (IVM, ang. in vitro maturation) i zapłodnienia (IVF, ang. in vitro fertilization). Badania te polegały na opracowaniu takich warunków hodowli in vitro, które w największym stopniu naśladowałyby przebieg analizowanych procesów w warunkach in vivo [Kempisty B., 2012; Kempisty B., 2011; Antosik P., 2009]. Progesteron i 17-beta-estradiol odgrywają kluczową rolę podczas owulacji oraz dojrzewania kompleksów COCs (ang. cumulus-oocyte complexes) poprzedzających zapłodnienie [Salehnia M., 2013; O'Shea L.C., 2013; Kempisty B., 2012; Kitahara G., 2011; Shirazi A., 2007]. Z uwagi na wpływ somatycznych komórek wieńca promienistego na właściwy przebieg procesu dojrzewania oocytów [Ritter L.J., 2015; Basini G., 2015; 5

6 Coticchio G., 2015] większego znaczenia nabierają również badania nad rolą hormonów P4 i E2 w różnicowaniu się tych komórek podczas follikulogenezy. Dlatego też, hipoteza badawcza przedstawianego cyklu prac zakłada m. in. związek pomiędzy proliferacją komórek wieńca promienistego a profilem ekspresji i dystrybucji receptorów progesteronu, zarówno formy jądrowej (PGR), jak i błonowej (PGRMC1) oraz receptorów związanych z receptorami estrogenowymi (ERRγ, ERRβ/γ) w układzie hodowli pierwotnej. Z uwagi na różnicowanie się pierwotnych komórek ziarnistych m. in. do komórek wieńca promienistego (CCs, ang. cumulus cells), moja uwaga skupiła się na obu populacjach tych komórek. Komórki wieńca promienistego otaczają bezpośrednio oocyt i tym samym odgrywają kluczową rolę w procesie dojrzewania komórki jajowej [Appeltant R., 2014; Appeltant R., 2015; Santiquet N., 2014]. Pęcherzykowe komórki ziarniste budują ścianę pęcherzyków jajnikowych i z uwagi na obecność receptorów dla wybranych hormonów, stanowią integralną część pętli sprzężeń zwrotnych w hormonalnej regulacji czynności jajników u świń. Poniżej omówiono procesy follikulogenezy i oogenezy, których zarówno przebieg, jak i regulacja jest ściśle związana ze wzrostem, proliferacją i różnicowaniem się komórek wieńca promienistego oraz komórek ziarnistych. Pierwotne pęcherzyki jajnikowe charakteryzują się obecnością niezróżnicowanych komórek jajowych, otoczonych pojedynczą warstwą komórek określanych jako komórki preziarniste (ang. pre-granulosa cells), [Greenwald G.S., 1989; Silva R.C., 2011; Ding W., 2010; Knapczyk-Stwora K., 2013]. Komórki te zaczynają proliferować i uczestniczą w przemianie pęcherzyków pierwotnych do pierwszorzędowych. Przyjmuje się, że ścianę pęcherzyków pierwotnych buduje pojedyncza warstwa właściwych komórek ziarnistych (GC). Pęcherzykowe komórki ziarniste podlegają szybkim procesom proliferacji i różnicowania, czego wynikiem jest utworzenie pęcherzyków drugorzędowych z rozwijającą się wewnątrz komórką jajową. Po tym stadium komórki ziarniste w pęcherzykach jajnikowych różnicują się na dwie populacje komórek: (1) ścienne komórki ziarniste (mgc, ang. mural granulosa cells) współtworzące ścianę pęcherzyka, oraz (2) komórki wieńca promienistego (CC, ang. cumulus cells), które bezpośrednio otaczają komórkę jajową. W tym stadium pęcherzyki jajnikowe otoczone są dwoma i/lub trzema warstwami komórek ziarnistych. Stadium pęcherzyka Graafa charakteryzuje się obecnością wielu warstw komórek ziarnistych oraz obecnością uformowanej jamy pęcherzykowej. Po owulacji komórki pęcherzykowe szybko różnicują się 6

7 w komórki luteinowe (LC, ang. luteal cells). W tym stadium identyfikowane są dwie populacje komórek luteinowych: duże komórki luteinowe, powstałe w wyniku różnicowania się komórek ziarnistych, oraz małe komórki luteinowe, pochodzące z komórek tekalnych (TC, ang. theca cells) [Hashimoto S., 2007; Areekijseree M., 2006; Yokoo M., 2004]. Hormony gonadotropowe odgrywają kluczową rolę w rozwoju pęcherzyków jajnikowych oraz atrezji. Wiadomym jest, że hormon follikulotropowy (FSH, ang. follicle stimulating hormone) pełni ważną funkcję podczas regulacji procesów związanych z proliferacją i różnicowaniem się komórek ziarnistych [Verbraak E.J., 2011; Rusovici R., 2005; Yamashita Y., 2014]. Przyjmuje się, że tysiące małych pęcherzyków, określanych mianem pęcherzyków pre-antralnych rozwijają się w jajnikach ssaków w życiu płodowym [Erickson B.H., 1966; Tanaka Y., 2001]. W hodowli in vitro u myszy [Eppig J.J., 1996], bydła [Miyano T., 2003] oraz człowieka [Abir R., 1997] badano możliwości wykorzystania komórek jajowych pochodzących z pierwotnych pęcherzyków (ang. primordial follicles) dla uzyskania oocytów w pełni dojrzałych. Wyniki badań wskazują jednoznacznie na możliwość wykorzystania pre-antralnych pęcherzyków jako źródła komórek jajowych zdolnych do dojrzewania i zapłodnienia pozaustrojowego. Ponadto wykazano, że wzrost i rozwój pęcherzyków jajnikowych pierwotnych, pierwszorzędowych i drugorzędowych jest regulowany przez sekrecję hormonów tj. FSH, LH, P4, E2 czy androstendion [Duda M., 2013; Pan Z., 2012; Matsuda F., 2012]. Dlatego też jednym z celów badań była analiza związku pomiędzy proliferacją komórek ziarnistych a ekspresją genów i dystrybucją kodowanych przez nie białek receptorów LH (LHR) oraz FSH (FSHR) w modelu hodowli pierwotnej. Ponadto, z uwagi na udział aromatazy cytochromu P450 (CYP19) w konwersji androgenów do estrogenów w jajniku, jednym z celów badań była analiza ekspresji tego genu podczas proliferacji komórek ziarnistych w czasie rzeczywistym. W organizmach ssaków proces oogenezy polega na wzroście małych komórek jajowych aż do momentu osiągnięcia pełnej dojrzałości cytoplazmatycznej i jądrowej oraz uzyskania zdolności do zapłodnienia. Uznaje się, że proces dojrzewania komórki jajowej jest kluczowym etapem określającym potencjał rozwojowy zarodków [Georgiou A.S., 2011; García-Mengual E., 2008]. Proces osiągania przez komórki jajowe dojrzałości składa się z następujących etapów: (1) GV (stadium pęcherzyka zarodkowego), (ang. germinal vesicle), (2) GVBD (stadium zaniku pęcherzyka zarodkowego), (ang. germinal vesicle breakdown), (3) MI (ang. metaphase I) oraz (4) MII (ang. metaphase II). W fazie wzrostu pęcherzyków jajnikowych 7

8 do średnicy 2 mm, komórka jajowa zwiększa swoją średnicę ze 110 µm do 120 µm. W tym stadium komórki jajowe osiągają kompetencję rozwojową, zakończoną skutecznym zapłodnieniem i prawidłowym rozwojem zarodka [Ueno S., 2005; Gil M.A., 2013; Schoevers E.J., 2007; Rodriguez K.F., 2004]. Zarówno procesom rozwoju pęcherzyków jajnikowych (follikulogeneza), jak i procesom wzrostu komórek jajowych (oogeneza) towarzyszy proliferacja i różnicowanie się otaczających komórek somatycznych, tj.: komórek wieńca promienistego oraz komórek ziarnistych. Procesy wzajemnych interakcji pomiędzy tymi dwoma typami komórek regulowane są między innymi przez istnienie specyficznych połączeń typu neksus (GJC, ang. gap junction connections), uformowanych przez koneksyny (ang. connexins), (Cx) [Santiquet N.W., 2012; Sasseville' M., 2009; Mori T., 2000; Ozawa M., 2010]. Wzajemna komunikacja polegająca na wymianie substancji drobnocząsteczkowych ( cross-talk ) pomiędzy: (1) oocytem a komórkami ziarnistymi, (2) samymi komórkami ziarnistymi, oraz (3) komórkami ziarnistymi a tekalnymi, jest niezwykle istotna dla wzrostu i rozwoju pęcherzyków jajnikowych oraz dojrzewania komórek jajowych [Galas J.F., 2012; Brankin V., 2003; Shores E.M., 2000; Gregoraszczuk E., 1996]. Połączenia typu GJC stanowią międzykomórkowe błonowe mikrokanały, zbudowane przez koneksyny. Badania ostatnich lat wykazały, że koneksyny 43 i 37 (Cx43 i Cx37) odgrywają kluczową rolę w regulacji prawidłowego przebiegu follikulogenezy [Gershon E., 2008]. Defekty w genach kodujących te białka prowadzą do zaburzeń w rozwoju i różnicowaniu się komórek jajowych oraz komórek ziarnistych. Wykazano, że brak białka Cx43 zaburza follikulogenezę poprzez zatrzymanie wzrostu pęcherzyków jajnikowych na początkowych stadiach ich rozwoju [Li T.Y., 2007; Veitch G.I., 2004; Ackert C.L., 2001; Carabatsos M.J., 2000]. Zaburzony rozwój komórek ziarnistych skutkuje niemożliwością dokończenia dojrzewania mejotycznego przez komórki jajowe. Ponadto defekt w genach kodujących białka Cx37 oraz Cx43 prowadzi do zaburzenia późniejszych stadiów follikulogenezy uniemożliwiając formowanie się pęcherzyków Graafa, co skutkuje przedwczesną luteinizacją komórek ziarnistych [Tong D., 2006]. Podłoże molekularne tych mechanizmów, jak i charakterystyka białek uczestniczących w ścieżkach sygnalizacyjnych związanych z przekazywaniem substancji drobnocząsteczkowych są nadal u świń słabo poznane. Dlatego też jednym z celów rozprawy habilitacyjnej było zbadanie w układzie hodowli pierwotnej zależności pomiędzy zdolnością 8

9 proliferacji komórek ziarnistych a ekspresją i dystrybucją wybranych koneksyn (Cx30, Cx31, Cx36, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45) budujących połączenia typu GJC. Cel naukowy cyklu prac Głównym celem badań była analiza zależności pomiędzy procesem proliferacji komórek wieńca promienistego oraz komórek ziarnistych w układzie hodowli pierwotnej a ekspresją genów i dystrybucją kodowanych przez nie białek, kluczowych dla regulacji właściwego przebiegu follikulogenezy i oogenezy. Cel ten został zrealizowany za pomocą następujących celów szczegółowych: 1. badanie indeksu proliferacyjnego komórek wieńca promienistego oraz komórek ziarnistych z określeniem fazy adhezji komórek (faza lag) i fazy logarytmicznego wzrostu (faza log), 2. analiza ekspresji mrna PGR, PGRMC1, LHR, FSHR, CYP19, Cdk4 oraz koneksyn Cx30, Cx31, Cx36, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45 z wykorzystaniem techniki RT-qPCR (ang. real time quantative PCR), 3. analiza ekspresji i dystrybucji białek kodowanych przez powyższe geny przy zastosowaniu metod immunofluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej. Omówienie wyników pierwszej pracy 1. Bartosz Kempisty, Agnieszka Ziółkowska, Hanna Piotrowska, Piotr Zawierucha, Paweł Antosik, Dorota Bukowska, Sylwia Ciesiółka, Jędrzej M. Jaśkowski, Klaus P. Brüssow, Michał Nowicki, Maciej Zabel: Real-time proliferation of porcine cumulus cells is related to the protein levels and cellular distribution of Cdk4 and Cx43. Theriogenology 2013: Vol. 80, nr 4, s Dojrzewanie kompleksów oocyt-komórki wieńca promienistego (COCs, ang. cumulusoocyte complexes) stanowi złożony proces obejmujący zmiany biochemiczne (aktywacja ważnych białek) oraz morfologiczne (ekspansja komórek wieńca promienistego) w komórce jajowej i otaczających ją komórkach somatycznych. Proces dojrzewania kompleksów COCs kończy się osiągnięciem przez komórkę jajową stadium MII. Czynnikiem wpływającym w znacznym stopniu na właściwy przebieg procesu dojrzewania świńskich komórek jajowych 9

10 jest prawidłowa komunikacja pomiędzy komórkami wieńca promienistego a oocytem. Dwukierunkowa komunikacja pomiędzy tymi dwoma typami komórek przybiera więc formę dialogu polegającego na wzajemnej wymianie substancji drobnocząsteczkowych. Proces ten zachodzi za pośrednictwem połączeń typu GJC tworzonych przez białka z rodziny koneksyn tj. Cx31, Cx37, Cx43 i Cx45. Uzyskanie przez komórkę jajową stadium MII jest regulowane również na drodze molekularnych mechanizmów, które obejmują głównie aktywację białek kontrolujących zmiany jądrowe podczas podziału mejotycznego. Przykładem tego typu białek jest rodzina kinaz zależnych od cyklin Cdk (ang. cyclin dependent kinase), regulujących kompetencję mejotyczną oocytów. Wcześniejsze badania wykonane przeze mnie w modelu in vitro wskazują, że Cdk4 może regulować proces dojrzewania świńskich komórek jajowych. Ponadto wykazano, że ekspresja genu Cdk4 związana jest z jakością pęcherzyków jajnikowych, z których pozyskiwane były kompleksy COCs [Antosik P., 2011; Kempisty B., 2013]. Wiele podejmowanych badań w tematyce prawidłowego dojrzewania kompleksów COCs dotyczy zagadnienia komunikacji pomiędzy oocytem a komórkami somatycznymi. Jak dotąd nie ma jednak dostępnych w piśmiennictwie danych na temat proliferacji w czasie rzeczywistym oraz różnicowania się komórek wieńca promienistego w odniesieniu do ekspresji białek regulujących proces dojrzewania. Dlatego też celem powyższej pracy było: (1) określenie poziomu mrna i białka Cx43, Cdk4, markerów dojrzewania komórek jajowych w komórkach wieńca promienistego, oraz (2) analiza dystrybucji wymienionych białek podczas proliferacji komórek wieńca promienistego w hodowli pierwotnej w czasie rzeczywistym trwającej 168 godz. W hodowli pierwotnej utrzymywano wyizolowane komórki wieńca promienistego. Komórki te pozyskiwano w wyniku ich odseparowania od całych kompleksów COCs i inkubowano następnie w roztworze kolagenazy. Hodowano również całe kompleksy oocyt-komórki wieńca promienistego (COCs). Obie populacje komórek hodowano w medium TCM-199 (ang. Tissue Culture Medium 199) w analizatorze proliferacji komórek w czasie rzeczywistym (RTCA, ang. real-time cellular analyzer). Zmiany w dystrybucji białek Cx43 oraz Cdk4 obserwowano w mikroskopie konfokalnym po 44 godz. hodowli in vitro. W wyniku przeprowadzonych analiz wykazano wzrost znormalizowanego indeksu proliferacji komórek po 25 godz. utrzymywania ich w hodowli in vitro. Wzrost ten utrzymywał się przez cały późniejszy okres prowadzenia hodowli pierwotnej. Zaobserwowano również 10

11 podwyższony poziom ekspresji białek Cx43 oraz Cdk4 po 44 godz. hodowli, w porównaniu do ekspresji tych białek przed założeniem hodowli in vitro (0 godz.). Wzrost ekspresji tych białek korelował ze wzrostem indeksu proliferacyjnego komórek wieńca promienistego. Przed założeniem hodowli pierwotnej białka Cx43 i Cdk4 były zlokalizowane w jądrze komórek wieńca promienistego, natomiast po 44 godz. zlokalizowano je w cytoplazmie komórek. Wyniki moich badań wskazują, że w oocytach otoczonych przez komórki wieńca promienistego dystrybucja białka Cdk4 jest zależna od czasu prowadzenia hodowli in vitro. Ze względu na fakt, że kompleksy COCs osiągają dojrzałość u świń po 44 godz. hodowli in vitro, wnioskuje się, że dystrybucja białka Cdk4 może być markerem ich wzrostu i dojrzewania. Badania prowadzone w ramach powyższej pracy polegały na izolacji niedojrzałych kompleksów COCs. Wykazano, że kompleksy COCs izolowane z preantralnych pęcherzyków jajnikowych nie mogą osiągnąć stadium GVBD, co związane jest z zahamowaniem mejozy i zwiększeniem stężenia cyklicznego camp, aktywnie transportowanego przez połączenia typu GJC [DiLuigi A., 2008]. Powszechnie wiadomo, że hormony gonadotropowe są kluczowe dla właściwego przebiegu procesu dojrzewania kompleksów COCs [Xiao X., 2014; Appeltant R., 2015]. FSH prowadzi bowiem do wznowienia podziału mejotycznego w warunkach in vitro poprzez regulację stężenia camp [Songsasen N., 2002]. Wykazano, że dodanie hormonów gonadotropowych do medium hodowlanego wydaje się konieczne do uzyskania stadium GVBD. Sugeruje się więc, że translokacja białka Cdk4 w 44 godz. może być związana z osiąganiem przez kompleksy COCs stadium GVBD [Chen L., 2012; Fujii W., 2011]. Badania Nagyovej i wsp. (2000) polegały m. in. na określeniu roli komórek wieńca promienistego w dojrzewaniu komórek jajowych świńskich oraz identyfikacji czynników regulujących proces ekspansji tych komórek. Doświadczenia zostały wykonane w modelu odseparowanych oocytów od populacji komórek somatycznych (ang. oocytectomized complexes, OOXs), [Nagyova E., 2000]. Badano oocyty w różnym stadium konfiguracji jądrowej: GV, późna diakineza, MI oraz MII po inkubacji z butyrolaktonem, inhibitorem białka Cdk4. Wykazano, że zahamowanie rozwoju oocytów w stadium GV i późnej diakinezie, po inkubacji komórek z butyrolaktonem, skutkowało zwiększeniem (>90%) ekspansji komórek wieńca promienistego w kompleksach OOX (ang. oocytectomized comlex) oraz brakiem możliwości osiągnięcia stadium GVBD. Wyniki Nagyovej i wsp. (2000) sugerują, że ekspansja komórek wieńca promienistego może być związana z jądrową lokalizacją białka Cdk4 ponieważ zablokowanie ekspresji tego genu przez butyrolakton 11

12 nie hamowało procesu ekspansji. W przeciwieństwie do przedstawionych powyżej wniosków, wyniki Lonergana i wsp. (2003) wykazały, że inkubacja bydlęcych kompleksów COCs w obecności butyrolaktonu i roskowityny, inhibitorów białka Cdk4, skutkowała zaburzeniem ekspansji komórek wieńca promienistego podczas dojrzewania COCs in vitro [Lonergan P., 2003]. Dlatego też można sugerować, że translokacja obydwu białek Cx43 i Cdk4 z jądra komórek wieńca promienistego do cytoplazmy stanowi mechanizm gatunkowo specyficzny, który jest związany z ekspansją i dojrzewaniem tych komórek in vitro. Ponieważ po 44 godz. hodowli kompleksów COCs u świń następuje ekspansja komórek wieńca promienistego, sugeruje się, że procesowi temu może towarzyszyć wykazana przeze mnie translokacja białka Cdk4 z jądra do cytoplazmy komórek. Dane dostępne w piśmiennictwie wskazują, że ekspresja białek MIS i SNAT3 jest markerem wzrostu ekspansji komórek wieńca promienistego otaczających oocyt w kompleksach COCs [Diaz F.J., 2007]. W ramach przedstawianej pracy włączonej do cyklu habilitacyjnego wykonano analizę ekspresji markerów białek MIS i SNAT3 po 44 godz. hodowli (faza log). Niski poziom tych białek sugeruje, że ich ekspresja nie jest specyficzna dla procesu ekspansji komórek wieńca promienistego odseparowanych od kompleksów COCs. Wyniki badań ostatnich lat wykazały, że proces dojrzewania in vitro (IVM, ang. in vitro maturation) kompleksów COCs u bydła, świń i myszy jest związany ze zmianą profilu ekspresji wielu genów [Leal C.L., 2012; Tesfaye D., 2009]. Nadal dostępnych jest niewiele danych odnoszących się do zmian morfologicznych, jakim podlegają kompleksy COCs podczas IVM [Cota A.M., 2012; Rienzi L., 2010]. Wskazuje się jednak, że zmiany te głównie polegają na indukcji procesu ekspansji somatycznych komórek wieńca promienistego otaczających oocyt [Ploutarchou P., 2015; Ritter L.J., 2015; Appeltant R., 2015]. Pomimo, że proces ekspansji komórek wieńca promienistego jest uznawany za jeden z najważniejszych wskaźników określających stopień dojrzałości kompleksów COCs, podłoże molekularne tego procesu pozostaje wciąż niewyjaśnione. Wnioski 1. Wzrost proliferacji komórek wieńca promienistego w układzie hodowli pierwotnej może być związany ze wzrostem ekspresji białek Cx43 i Cdk4. 12

13 2. Podczas wzrostu proliferacji komórek wieńca promienistego translokacja białka Cx43 z jądra komórek wieńca promienistego do cytoplazmy może być związana z regulacją funkcji międzykomórkowych połączeń typu GJC pomiędzy komórkami wieńca promienistego a oocytem. Wzrost poziomu ekspresji białka Cdk4, regulatora cyklu podziału komórkowego, może sugerować jego istotną rolę podczas proliferacji komórek wieńca promienistego świń w układzie hodowli pierwotnej. 3. Translokacja białek Cx43 oraz Cdk4 z jądra komórkowego do cytoplazmy może być procesem gatunkowo specyficznym i może być związana z indukcją ekspansji komórek wieńca promienistego podczas hodowli in vitro. Omówienie wyników drugiej pracy 2. Bartosz Kempisty, Agnieszka Ziółkowska, Hanna Piotrowska, Sylwia Ciesiółka, Paweł Antosik, Dorota Bukowska, Piotr Zawierucha, Magdalena Woźna, Jędrzej M. Jaśkowski, Klaus P. Brüssow, Michał Nowicki, Maciej Zabel: Short-term cultivation of porcine cumulus cells influences the cyclin-dependent kinase 4 (Cdk4) and connexin 43 (Cx43) protein expression- a real-time cell proliferation approach. J. Reprod. Dev. 2013: Vol. 59, nr 4, s Zdolność świńskich komórek jajowych do osiągnięcia pełnej dojrzałości (stadium MII) polega na zmianach jądrowych oraz cytoplazmatycznych. Wykazano, że tylko w pełni dojrzałe komórki jajowe mogą zostać zapłodnione oraz gwarantują prawidłowy rozwój zarodka [Antosik P., 2010; Duranthon V., 2001; Kempisty B., 2011]. Na właściwy przebieg procesu dojrzewania komórek jajowych mają wpływ czynniki wewnętrzne oraz zewnętrzne polegające m.in na gromadzeniu znacznych ilości mrna oraz białek w cytoplazmie komórek, jak i transporcie substancji drobnocząsteczkowych pomiędzy oocytem a otaczającymi komórkami wieńca promienistego [Ju S., 2012; Luciano A.M., 2005; Moor R. i Dai Y., 2001]. Sugeruje się, że aktywność połączeń GJC pomiędzy tymi komórkami w znaczący sposób determinuje dojrzewanie oocytów oraz dokończenie mejozy [Anderson E. i Albertini D.F., 1976; Santiquet N.W., 2012; Thomas R.E., 2004]. Badania na modelu mysim z wyłączonym genem kodującym białko Cx37 (-/-Cx37) współtworzące połączenia GJC, skutkowało zaburzeniem dojrzewania oocytów prowadząc do bezpłodności samic [Simon A.M., 1997]. Wyniki badań wskazują na ekspresję koneksyn w komórkach wieńca promienistego oraz 13

14 sugerują jednoznacznie istotną rolę tych białek w dojrzewaniu kompleksów COCs [Antosik P., 2010; Nitta M., 2010]. Jednakże profil ekspresji genów i dystrybucji białek koneksyn w odniesieniu do proliferacji odseparowanych komórek wieńca promienistego nie został jak dotąd poznany. Dlatego też w ramach powyższej pracy badano poziom białka Cx43 oraz jego translokację. Celem pracy była również analiza ekspresji i dystrybucji białka Cdk4, które jak wykazały wcześniejsze badania, odgrywa równie istotną rolę w osiąganiu przez komórki jajowe stadium MII. Badania Malumbres M. (2011) wykonane na modelu mysim potwierdziły, że białka należące do rodziny Cdk odgrywają kluczową rolę w cyklu podziału komórkowego. Ponadto De Falco i wsp. (2004) wykazali, że tworzenie kompleksu pomiędzy białkiem Cdk4 a cykliną D reguluje proces proliferacji komórek. Dlatego też, jednym z celów pracy prezentowanej w cyklu habilitacyjnym była analiza ekspresji i dystrybucji białka Cdk4 w komórkach wieńca promienistego w odniesieniu do proliferacji tych komórek in vitro w czasie rzeczywistym. Podczas dojrzewania kompleksów COCs in vivo i/lub in vitro komórki wieńca promienistego przechodzą proces ekspansji związany z osiąganiem stadium MII oraz aktywnym transportem substancji drobnocząsteczkowych przy udziale połączeń typu GJC. Wyniki badań wskazują, że procesowi ekspansji komórek wieńca promienistego może towarzyszyć wzrost proliferacji tych komórek [Bruckova L., 2008; Voznesenskaia T.I.U., 2001; Wongsrikeao P., 2005]. Natomiast związek pomiędzy ekspresją i dystrybucją omawianych białek Cx43 i Cdk4 a proliferacją odseparowanych komórek wieńca promienistego w czasie rzeczywistym podczas hodowli pierwotnej nie był jak dotąd przedmiotem badań. W pierwszej omawianej pracy cyklu habilitacyjnego badano proliferację komórek wieńca promienistego utrzymywanych w długoterminowej hodowli pierwotnej (przez 164 godz.), (punkty czasowe: 0, 44, 88, i 132 godz.) w układzie hodowli: (1) odseparowanych komórek wieńca promienistego, oraz (2) hodowli całych kompleksów COCs. W powyższej publikacji analizowano natomiast ekspresję białek Cx43 oraz Cdk4 tylko w układzie krótkoterminowej (trwającej 44 godz.), (punkty czasowe: 0, 12, 44 godz.) hodowli in vitro odseparowanych komórek wieńca promienistego. W celu wykonania badań, z pobranych poubojowo pęcherzyków jajnikowych dojrzałych płciowo świń, izolowano kompleksy COCs, z których następnie pozyskiwano komórki wieńca promienistego. Odseparowane w ten sposób komórki hodowano w standardowej pożywce TCM-199 przez okres 44 godz., 14

15 w systemie RTCA (ang. real-time cellular analyser). Podczas trzech etapów hodowli (0-12, 12-24, godz.) analizowano znormalizowany indeks proliferacyjny. Ekspresję oraz dystrybucję białek Cx43 oraz Cdk4 badano z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej. Wykazano, że indeks proliferacyjny komórek wieńca promienistego w odseparowanej, krótkoterminowej hodowli pierwotnej nie różnił się istotnie pomiędzy badanymi etapami hodowli. Po 44 godzinach hodowli zaobserwowano natomiast znaczący wzrost ekspresji analizowanych białek, Cx43 i Cdk4, w odniesieniu do ekspresji tych białek przed hodowlą. Przed rozpoczęciem hodowli pierwotnej oba białka były zlokalizowane w jądrze komórkowym komórek wieńca promienistego, natomiast po 44 godz. białka te uległy translokacji do cytoplazmy. W przedstawionej pracy sugeruje się, że proces proliferacji komórek wieńca promienistego może być związany z ekspresją i lokalizacją białek Cx43 i Cdk4 regulujących odpowiednio, aktywność połączeń typu GJC oraz progresję cyklu komórkowego. Badania Regassa i wsp. (2011) polegały na analizie transkryptomu w odseparowanych oocytach oraz komórkach wieńca promienistego u bydła. Wykazano odmienny profil ekspresji genów w odseparowanych komórkach wieńca promienistego od komórek hodowanych razem z oocytami. Przedstawiono także profil ekspresji genów wspólnych zarówno dla oocytów oraz odseparowanych komórek wieńca promienistego. Wyniki badań przeprowadzonych w ramach pierwszej pracy wykazują ekspresję białek Cx43 i Cdk4 zarówno w całych kompleksach COCs, jak i w odseparowanych komórkach wieńca promienistego podczas długoterminowej hodowli in vitro. Wyniki prezentowanej pracy wskazują także na ekspresję tych białek w odizolowanych komórkach wieńca promienistego w hodowli krótkoterminowej. Dlatego też sugeruje się udział tych białek w proliferacji i ekspansji komórek wieńca promienistego odseparowanych od oocytów. Wnioski 1. Komórki wieńca promienistego mogą być utrzymywane w układzie hodowli pierwotnej bez obecności komórek jajowych współtworzących kompleksy COCs. 2. Translokacja białek Cx43 i Cdk4 z jądra komórkowego do cytoplazmy może być związana z procesami proliferacji i ekspansji komórek wieńca promienistego w układzie hodowli pierwotnej. 15

16 Omówienie wyników trzeciej pracy 3. Bartosz Kempisty, Agnieszka Ziółkowska, Sylwia Ciesiółka, Hanna Piotrowska, Paweł Antosik, Dorota Bukowska, Klaus P. Brüssow, Michał Nowicki, Maciej Zabel. Expression and cellular distribution of estrogen and progesterone receptors and the real-time proliferation of porcine cumulus cells. Zygote: page 1 of 10, 2014, doi: /s Rola jaką hormony steroidowe, progesteron (P4) i 17-beta-estradiol (E2) odgrywają u ssaków w regulacji funkcji rozrodczych została dobrze poznana. Powszechnie wiadomo, że hormony te są kluczowe w regulacji właściwego przebiegu oogenezy, follikulogenezy, embriogenezy oraz utrzymaniu ciąży. Wykazano, że P4 reguluje ważne etapy dojrzewania oocytów i wzrostu pęcherzyków jajnikowych [Fair T. i Lonergan P., 2012]. Oddziaływanie hormonów steroidowych na tkanki i komórki docelowe odbywa się za pośrednictwem specyficznych receptorów, które w przeważającej większości tworzą rodzinę receptorów jądrowych pełniących jednocześnie funkcje czynników transkrypcyjnych. Receptor progesteronu może jednak występować w komórkach w dwóch formach: klasycznej formie receptora jądrowego (ang. progesterone receptor, PGR) lub w formie receptora błonowego (ang. progesterone receptor membrane component, PGRMC1), [Elassar A., 2012; Saint-Dizier M., 2012; Slonina D., 2012]. Receptory estrogenowe (ERs) należą do rodziny czynników transkrypcyjnych, które łącząc się do odpowiednich sekwencji regulatorowych DNA aktywują transkrypcję genów docelowych [Kawashima I., 2008; Motola S., 2008]. Badania ostatnich lat wykazały, że receptory estrogenowe ulegają ekspresji w jajnikach swiń oraz uczestniczą w regulacji wzrostu pęcherzyków jajnikowych [Soboleva T.K., 2004; Knapczyk K., 2008]. Określono również ekspresję receptorów progesteronowych i estrogenowych zarówno w jajniku świni, jak i całych kompleksach COCs. Ponadto opisano funkcję jaką pełnią te receptory w regulacji owulacji i całego cyklu rozrodczego. Nadal jednak niewiele wiadomo o roli hormonów steroidowych oraz ekspresji i dystrybucji ich receptorów w komórkach wieńca promienistego w odniesieniu do proliferacji tych komórek w czasie rzeczywistym. Dlatego też celem pracy było określenie ekspresji receptorów progesteronowych: klasycznej formy jądrowej-pgr, komponenty błonowej-pgrmc1 oraz receptorów związanych z receptorami estrogenowymi ERRγ i ERRβ/γ, w odseparowanych komórkach wieńca 16

17 promienistego w odniesieniu do wartości indeksu proliferacyjnego w warunkach hodowli pierwotnej w czasie rzeczywistym. Podczas trwającej 96 godz. proliferacji komórek w czasie rzeczywistym poziom ekspresji genów PGR, PGRMC1, ERRγ i ERRβ/γ analizowano za pomocą techniki RT-qPCR. Ekspresję i dystrybucję kodowanych przez nie białek badano przy wykorzystaniu mikroskopii konfokalnej. W wyniku przeprowadzonych analiz wykazano wyższy poziom ekspresji białka PGR przed rozpoczęciem hodowli in vitro w porównaniu do jego ekspresji po 96 godz. hodowli (P<0,001). Nie wykazano natomiast istotnych statystycznie różnic w ekspresji białek PGRMC1, ERRγ i ERRβ/γ pomiędzy etapem rozpoczęcia hodowli (0 godz.) a 96 godz. hodowli komórek wieńca promienistego. Badania na poziomie transkryptu nie wykazały istotnych różnic w ekspresji mrna zarówno PGR, jak i PGRMC1, ERRγ i ERRβ/γ w trakcie wszystkich etapów hodowli (0-96 godz.). W wyniku wykonanych analiz za pomocą systemu RTCA w drugim etapie hodowli zaobserwowano znaczący wzrost proliferacji komórek (faza log), trwający do 96 godz. hodowli pierwotnej. Badania Shimady i wsp. (2004), polegały na analizie ekspresji dwóch izoform receptora progesteronu PRA (ang. progesterone receptor A) i PRB (ang. progesterone receptor B) w świńskich komórkach wieńca promienistego w odniesieniu do proliferacji tych komórek. Wykazano wzrost ekspresji białka PRB podczas pierwszych 8 godz. hodowli, podczas gdy ekspresja białka PRA była najwyższa w 20 godz. hodowli. Wyniki badań Shimady i wsp. (2004) sugerują, że łączenie się progesteronu P4 z odpowiednimi receptorami oraz aktywność połączeń typu GJC ma wpływ na zdolność proliferacyjną komórek wieńca promienistego. W przeciwieństwie do wyników Shimady i wsp. (2004) w przedstawianej przeze mnie pracy nie zaobserwowano związku pomiędzy ekspresją PGR a proliferacją komórek wieńca promienistego. Obniżenie ekspresji PGR może być wynikiem niskiego stężenia progesteronu w medium hodowlanym. Ponadto translokacja białka PGR z jądra komórkowego do cytoplazmy komórek wieńca promienistego po 96 godz. hodowli sugeruje utratę aktywności receptora jako czynnika transkrypcyjnego, co może być wynikiem niskiego stężenia agonisty. Badania Aparicio i wsp. (2011) polegały natomiast na analizie ekspresji błonowej formy receptora progesteronu (PGRMC1) w bydlęcych kompleksach COCs oraz w odseparowanych komórkach wieńca promienistego. Podobnie do wyników uzyskanych 17

18 przeze mnie wykazano ekspresję obydwu form receptora progesteronu PGR i PGRMC1 w analizowanych populacjach komórek, wykorzystując techniki immunofluorescencyjne oraz western-blotting. Przytoczone wyniki badań sugerują, że P4 jako agonista uczestniczy w aktywacji obydwu form, zarówno jądrowego, jak i błonowego receptora progesteronu [Aparicio I.M., 2011]. Wyniki badań Dode i Graves (2003) przedstawiają wpływ E2 na przebieg dojrzewania jądrowego i cytoplazmatycznego oocytów świń. Wykazano najwyższy wzrost ekspresji ER w oocytach w 24 godz. hodowli oraz w 36 godz. w komórkach wieńca promienistego. W przeciwieństwie do badań Dode i Graves (2003), wyniki prezentowanej pracy nie wykazują zależności pomiędzy ekspresją mrna receptorów progesteronowych oraz estrogenowych a zdolnością do proliferacji komórek wieńca promienistego w układzie hodowli pierwotnej. Wnioski 1. Wzrost indeksu proliferacyjnego komórek wieńca promienistego świń jest związany z czasem prowadzenia hodowli w warunkach in vitro. 2. Podwyższony indeks proliferacyjny nie jest związany z ekspresją PGR ponieważ poziom tego białka był niższy po 96 godz. hodowli in vitro w porównaniu do rozpoczęcia hodowli (0 godz.). Wyniki te oraz zaobserwowana translokacja białka PGR do cytoplazmy po 96 godz. sugerują niski poziom agonisty w medium hodowlanym, co może powodować utratę funkcji PGR jako czynnika transkrypcyjnego. Komentarz do omówionych trzech prac We wszystkich przedstawionych pracach omawiano związek ekspresji wybranych genów: Cx43, Cdk4, PGR, PGRMC1, ERRγ i ERRβ/γ i dystrybucji kodowanych przez nie białek (uznawanych za białka kluczowe dla procesów follikulogenezy i oogenezy u świń) z proliferacją komórek wieńca promienistego w czasie rzeczywistym. Przedmiotem badań były: (1) białko Cx43, współtworzące połączenia typu GJC, (2) białko regulatorowe cyklu komórkowego Cdk4, oraz (3) receptory dla hormonów steroidowych PGR, PGRMC1, oraz receptory związane z receptorami estrogenowymi ERRγ i ERRβ/γ. Celem eksperymentów we wszystkich omawianych pracach było zbadanie wpływu czasu prowadzenia hodowli 18

19 pierwotnej komórek wieńca promienistego (hodowla krótkoterminowa i długoterminowa) zarówno na ekspresję, jak i dystrybucję analizowanych białek. We wszystkich prowadzonych badaniach komórki wieńca promienistego utrzymywano w hodowli pierwotnej w systemie RTCA, określając tym samym indeks proliferacyjny i/lub znormalizowany indeks proliferacyjny komórek. W wyniku przeprowadzonych badań opracowano model proliferacji odseparowanych komórek wieńca promienistego oraz całych kompleksów COCs w warunkach in vitro hodowli pierwotnej. Sugeruje się, że podczas hodowli kompleksów COCs u świń, ekspresja badanych markerów oraz proliferacja komórek wieńca promienistego może być związana z ich ekspansją w modelu in vitro. Ponadto udowodniono, że indeks proliferacyjny komórek w opracowanych modelach hodowli pierwotnej wykazuje związek z ekspresją genów Cx43 i Cdk4, natomiast nie jest związany z poziomem ekspresji genów kodujących receptory dla hormonów steroidowych. Uzyskane wyniki sugerują więc, że proliferacja komórek wieńca promienistego w układzie in vitro może być niezależna od profilu ekspresji receptorów steroidowych. Omówienie wyników czwartej pracy 4. Bartosz Kempisty, Agnieszka Ziółkowska, Sylwia Ciesiółka, Hanna Piotrowska, Paweł Antosik, Dorota Bukowska, Michał Nowicki, Klaus-Peter Brüssow, Maciej Zabel: Association between the expression of LHR, FSHR and CYP19 genes, cellular distribution of encoded proteins and proliferation of porcine granulosa cells in realtime. J. Biol. Regul. Homeost. Agents 2014: Vol. 28, nr 3, s Rozwój pęcherzyków jajnikowych oraz owulacja są procesami regulowanymi przez sekrecję wielu hormonów. Poznanie wzajemnych zależności pomiędzy sekrecją hormonów umożliwia wprowadzanie programów kontroli cyklu rozrodczego oraz leczenie zaburzeń płodności u zwierząt gospodarskich [Angel M.A., 2014; Bó G.A., 2014]. W procesach tych kluczowe znaczenie odgrywają hormony gonadotropowe jak LH i FSH, które oddziaływują na komórki docelowe za pośrednictwem specyficznych receptorów błonowych związanych z aktywacją białek G [McFarland K.C., 1989; Sprengel R., 1990]. Komórki ziarniste budują ścianę pęcherzyka jajnikowego stanowiąc jego integralną część zarówno strukturalną, jak i funkcjonalną. Podczas wzrostu, rozwoju i formowania się pęcherzyków jajnikowych komórki ziarniste podlegają procesom proliferacji, różnicowania się oraz luteinizacji [Vireque 19

20 A.A., 2015; Sugino N., 2014; Fadhillah, 2014]. Ekspresja genów receptora LH (LHR), receptora FSH (FSHR) czy aromatazy cytochromu P450 (CYP19) zostały dobrze poznane w pęcherzykach jajnikowych różnych gatunków ssaków [Rawan A.F., 2015; Yung Y., 2014; Chakraborty P., 2015; Barć J., 2014; Nomura M., 2013]. Zeleznik i wsp. (1974) jako pierwsi zidentyfikowali obecność receptorów FSHR na skrawkach immunohistochemicznych jajnika u szczura. Ponadto badania Campa i wsp. (1991) wykazały ekspresję mrna receptora LHR w komórkach tekalnych niedojrzałych pęcherzyków jajnikowych oraz komórkach ziarnistych dojrzałych pęcherzyków antralnych szczura. Wykazano, że aromataza cytochromu P450 (CYP19) określana także jako syntetaza estrogenowa katalizuje proces konwersji androgenów do estrogenów oraz reguluje ekspresję LHR i FSHR podczas owulacji [Park S.B., 2013; Ptak A., 2006; Karpeta A., 2013]. CYP19 ulega ekspresji w jajniku i łożysku oraz stymuluje wzrost i różnicowanie się komórek pęcherzykowych [Nakamura E., 2012; Zhou P., 2013; Hsieh M., 2011]. Nadal jednak niewiele wiadomo na temat ich ekspresji na poziomie mrna oraz dystrybucji kodowanych przez nie białek w odniesieniu do procesu proliferacji i luteinizacji komórek ziarnistych in vitro u świń. Dlatego też celem badań była analiza proliferacji komórek ziarnistych świni w czasie rzeczywistym podczas hodowli pierwotnej, w odniesieniu do ekspresji genów i dystrybucji białek LHR, FSHR i CYP19. Komórki ziarniste pozyskiwane były z dużych (>5mm) pęcherzyków jajnikowych świni poprzez ich nakłuwanie. Zawiesinę komórek inkubowano następnie z roztworem kolagenazy i hodowano przez 168 godz. w systemie RTCA, analizując proliferację komórek w czasie rzeczywistym. Ekspresję mrna analizowano pozyskując komórki z hodowli (0-168 godz.) w odstępach 24 godzinnych. Badanie ekspresji i dystrybucji białek LHR, FSHR oraz CYP19 przeprowadzono w oparciu o reakcję immunofluorescencyjną i obserwację komórek w mikroskopie konfokalnym przed rozpoczęciem hodowli (0 godz.), a następnie tylko po 24 godz. (faza lag), 48 oraz 96 godz. (faza log) hodowli in vitro. Funkcja jaką pełnią komórki ziarniste w pęcherzykach jajnikowych jest regulowana przez ekspresję LHR, FSHR oraz CYP19 [Orisaka M., 2013; Jeppesen J.V, 2012; Yapura M.J., 2012].Wykonane przeze mnie badania wykazały znaczący wzrost ekspresji mrna LHR i CYP19 po 24 i 48 godz. hodowli w odniesieniu do pozostałych przedziałów czasowych (P<0,01 i P<0,001). Sugeruje się, że wzrost ekspresji receptora LHR jest związany z sekrecją hormonu luteinizującego. Dlatego 20

21 też, wnioskuje się, że wzrost poziomu mrna LHR w 48 godz. hodowli może wskazywać na różnicowanie się komórek ziarnistych do komórek luteinowych. Poziom ekspresji mrna FSHR był dziewięciokrotnie wyższy w momencie rozpoczęcia hodowli in vitro (P<0,001), w porównaniu do pozostałych przedziałów czasowych: 0, 24, 48 i 96 godzin. Ekspresja białek LHR, FSHR i CYP19 była najwyższa w 168 godz. hodowli w porównaniu do pozostałych przedziałów czasowych (P<0,001). Analiza dystrybucji wykazała cytoplazmatyczną lokalizację badanych białek w komórkach ziarnistych podczas wszystkich etapów hodowli. Wzrost proliferacji komórek ziarnistych obserwowano po 24 godz. hodowli ( godz.). Zależność pomiędzy zwiększoną proliferacją a wzrostem ekspresji badanych białek może sugerować, że hormony gonadotropowe i steroidowe regulują (podwyższają) proces proliferacji komórek ziarnistych świni w układzie hodowli pierwotnej. Wnioski 1. Ekspresja genów LHR, FSHR oraz CYP19 jest zależna od poszczególnych przedziałów czasowych hodowli pierwotnej komórek ziarnistych. 2. Różny poziom ekspresji mrna i białek może sugerować proces post-transkrypcyjnej modyfikacji genów LHR, FSHR i CYP19 w komórkach ziarnistych podczas hodowli pierwotnej. Omówienie wyników piątej pracy 5. Bartosz Kempisty, Agnieszka Ziółkowska, Sylwia Ciesiółka, Hanna Piotrowska, Paweł Antosik, Dorota Bukowska, Michał Nowicki, Klaus P. Brüssow, Maciej Zabel: Study on connexins gene and protein expression and cellular distribution in relations to realtime proliferation of porcine granulosa cells. J. Biol. Regul. Homeost. Agents 2014: Vol. 28, nr 4, s Podczas follikulogenezy polegającej na wzroście pęcherzyków jajnikowych następuje proces różnicowania się komórek ziarnistych. W rozwiniętym pęcherzyku antralnym występują dwie populacje tych komórek: ścienne, budujące ścianę pęcherzyków jajnikowych oraz zróżnicowane komórki wieńca promienistego otaczające oocyt. Wyniki wielu badań wykazały, że procesom proliferacji i różnicowania się komórek ziarnistych towarzyszy szereg zmian biochemicznych i morfologicznych [Sessions-Bresnahan D.R., 2014; Gaytan F., 2014; 21

22 Hatzirodos N., 2014]. Wykazano, że proces ekspansji komórek wieńca promienistego jest kluczowy dla prawidłowego dojrzewania komórki jajowej in vivo i in vitro [Dunning K.R., 2015; Appeltant R., 2015]. Ponadto udowodniono, że istotną rolę w tym procesie odgrywają połączenia typu GJC pomiędzy komórką jajową a otaczającymi ją komórkami somatycznymi [Dieci C., 2013; Lodde V., 2013]. Opisywane połączenia metaboliczne typu neksus są formowane przez białka z grupy koneksyn, wśród których za najważniejsze uważa się koneksynę 37, 43 oraz 45 (Cx37, Cx43, Cx45). Przyjmuje się, że wymiana substancji drobnocząsteczkowych pomiędzy komórkami jajowymi a komórkami wieńca promienistego oraz komórkami ziarnistymi jest kluczowa dla prawidłowego wzrostu i dojrzewania oocytów [Kempisty B., 2014; Santiquet N., 2013; Feng G., 2013]. Dlatego też zakłada się, że aktywność połączeń typu GJC może być jednym z markerów zdolności oocytów do dojrzewania. W piśmiennictwie niewiele jest danych na temat roli połączeń typu GJC w proliferacji i różnicowaniu komórek ziarnistych w warunkach in vitro u świń. Dlatego też celem powyższej pracy była analiza: (1) obecności połączeń typu GJC w pęcherzykowych komórkach ziarnistych (poprzez zbadanie ekspresji koneksyn budujących te kanały), (2) dystrybucji koneksyn w komórkach ziarnistych, oraz (3) związku pomiędzy ekspresją wybranych koneksyn, ich komórkową lokalizacją a proliferacją komórek w czasie rzeczywistym. Wykazano wyższy poziom ekspresji mrna Cx36, Cx37 i Cx43 w komórkach ziarnistych przed założeniem hodowli (0 godz.) w porównaniu do pozostałych przedziałów czasowych: 24, 48, 72, 96, 120, 144 i 168 godz. hodowli (P<0,001). Ekspresja mrna Cx40 była wyższa natomiast w 24 godz. hodowli w porównaniu do poziomu transkryptu tego genu w momencie założenia hodowli (0 godz. hodowli). Podobnie do ekspresji mrna, białka Cx31, Cx 37 oraz Cx45 wykazywały wyższy poziom przed hodowlą (0 godz.) w odniesieniu do 168 godz. hodowli. Ekspresja białek Cx30 i Cx43 nie wykazywała natomiast różnic pomiędzy analizowanymi przedziałami czasowymi hodowli. Wszystkie badane białka wykazywały lokalizację błonową oraz cytoplazmatyczną. Ostatnie badania sugerują, że procesowi formowania się połączeń typu GJC towarzyszy wysoka ekspresja koneksyn [Gershon E., 2008; Sela-Abramovich S.,2008]. Badania Meltona i wsp. (2001) oraz Itahany i wsp. (1996) polegały na analizie ekspresji koneksyn Cx26, Cx30.3, Cx32 oraz Cx43 w rozwijających się pęcherzykach niedojrzałych płciowo loszek. Wykazano znaczący wzrost ekspresji Cx43 w komórkach ziarnistych rozwijających się pęcherzyków. 22

23 Ponadto udowodniono, że aktywność połączeń typu GJC jest związana ze wzrostem pęcherzyków jajnikowych [Luciano A.M., 2012; Bagg M.A., 2009]. Wyniki moich badań prowadzonych w pierwotnej hodowli komórek ziarnistych wskazują jednak na brak związku pomiędzy wzrostem proliferacji komórek ziarnistych a ekspresją koneksyn, co sugeruje, że przedstawiony model in vitro nie odpowiada procesowi formowania się połączeń typu GJC w warunkach in vivo. Moje obserwacje znajdują częściowo potwierdzenie w badaniach Santiquet i wsp. (2013), który wykazał, że ekspresja, degradacja i lokalizacja koneksyn w oocytach są dynamicznymi procesami zmieniającymi się podczas pierwszych godzin dojrzewania komórek jajowych w warunkach in vitro. Wnioski 1. Wykazanie ekspresji mrna oraz białek koneksyn w komórkach ziarnistych izolowanych z pęcherzyków jajnikowych świń sugeruje istnienie połączeń typu GJC w tych komórkach. 2. Sugeruje się, że przedstawiony model pierwotnej hodowli komórek ziarnistych nie naśladuje procesu formowania się połączeń typu GJC w warunkach in vivo. Komentarz do omówionych dwóch prac Komórki ziarniste pełnią funkcję komórek współtworzących ścianę pęcherzyków jajnikowych u świń. Dlatego też uznaje się, że należą one do komórek odgrywających kluczową rolę podczas wzrostu pęcherzyków jajnikowych [Wigglesworth K., 2015; Paulini F., 2014]. Ponadto sugeruje się, że komórki ziarniste mogą odgrywać nie tylko funkcję strukturalną, ale też wpływać na właściwą komunikację międzykomórkową. Wyniki badań wskazują, że należą one do grupy komórek wrażliwych na działanie hormonów gonadotropowych [Liu X., 2014; Karakaya C., 2014; Torrealday S., 2013]. Z uwagi na obecność enzymu aromatazy cytochromu P450, w komórkach ziarnistych może zachodzić proces konwersji androgenów do estrogenów. Ponadto pęcherzykowe komórki ziarniste wykazują ekspresję białek z grupy koneksyn. Dlatego też zakładano, że komórki ziarniste mogą aktywnie uczestniczyć w międzykomórkowym przekazywaniu substancji drobnocząsteczkowych. W przeprowadzonych przeze mnie badaniach wykazano ekspresję genów kodujących białka, które budują połączenia metaboliczne, jednak poziom ich ekspresji był niezależny od intensywności proliferacji komórek. Brak zależności pomiędzy ekspresją 23