Ekspresja TLR2 w limfocytach białaczki limfocytowej przewlekłej B komórkowej

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 11,, Nr, str HALINA ANTOSZ 1 JOANNA SAJEWICZ 1, BARBARA MARZEC-KOTARSKA 1, JANUSZ KOCKI 1, ANNA DMOSZYŃSKA, JACEK BASZAK 3, MAŁGORZATA JARGIEŁŁO-BASZAK 3 Ekspresja w limfocytach białaczki limfocytowej przewlekłej B komórkowej expression in chronic lymphocytic leukemia B cells 1 Samodzielna Pracownia Genetyki Klinicznej UM w Lublinie Kierownik: Dr hab. n. med. Janusz Kocki, prof. UM w Lublinie Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji szpiku UM w Lublinie Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Anna Dmoszyńska 3 Katedra i Klinika Kardiologii UM w Lublinie Kierownik: Prof. dr hab. Andrzej Wysokiński STRESZCZENIE Sygnalizacja za pośrednictwem TLR receptorów odgrywa waŝną rolę w biologii limfocytów B, indukuje dojrzewanie, proliferację i produkcję przeciwciał po rozpoznaniu patogenu, jest wymagana jako trzeci sygnał (po BCR i pomocniczych limfocytach T) do aktywacji i dalszego dojrzewania ludzkich naiwnych limfocytów B. Celem pracy było zbadanie, czy białaczkowe i prawidłowe limfocyty B róŝnią się ekspresją powierzchniowego i czy pod wpływem ligandów, zmienia się poziom ekspresji jego genu. Badania przeprowadzano na poziomie mrna, metodą RT- PCR w czasie rzeczywistym, w limfocytach B-PBL CD19 + /CD5 + i czystych, izolowanych, prawidłowych subpopulacjach B (CD19 + ) i T (CD5 + ), przed i po indukcji SAC (Staphyloccocus aureus szczep Cowan I) i LPS (Escherichia coli). Porównanie ekspresji w prawidłowych limfocytach B CD19 + i białaczkowych limfocytach B CD19 + /CD5 + wykazało blisko,5-krotnie niŝszą ekspresję mrna genu w komórkach białaczkowych oraz,65 razy wyŝszą ekspresję w prawidłowych limfocytach T, w porównaniu z ekspresją w prawidłowych limfocytach B. Analiza efektywności indukcji poprzez SAC i LPS była porównywalna i nie ujawniła znaczących róŝnic we wzroście aktywności genu. W przypadku stymulacji LPS-em limfocytów B prawidłowych stwierdzono 1,65-krotny wzrost ekspresji, natomiast w białaczkowych 1,5. Stymulacja SAC wykazała podobną skuteczność. Limfocyty B prawidłowe odpowiedziały wzrostem ekspresji na poziomie 1,3, natomiast białaczkowe 1,39. Porównawcza analiza ekspresji mrna w prawidłowych limfocytach T wykazała niemalŝe identyczne wzrosty tj. 1,35 i 1,35 po indukcji odpowiednio LPS i SAC. SŁOWA KLUCZOWE: B-PBL, SUMMARY TLR mediated signaling plays essential role in biology of B lymphocytes. It is involved in maturation, proliferation and antibody production after pathogen recognition. It is considered as the third signal (after BCR and T helper lymphocytes) required for activation and subsequent maturation of human naive B lymphocyte. The aim of our study was to elucidate the differences in surface expression between normal and B-CLL B lymphocytes, before and after ligand recognition. expression was assessed on mrna level (by means of Real-Time PCR method) in CD19 + /CD5 + B-CLL lymphocytes and isolated subpopulation of normal B (CD19+) and T (CD5 + ) lymphocytes, before and after SAC (Staphyloccocus aureus Cowan I) and LPS (Escherichia coli) induction. The assessment of expression in CD19 normal B lymphocytes and CD19/CD5 B-CLL lymphocytes showed nearly,5 fold decrease and,65 fold increase of mrna level respectively in B-CLL cells and normal T lymphocytes comparing to normal B lymphocytes. The efficacy of SAC and LPS mediated induction of was comparable and did not reveal significant differences in the increase of gene activity. We noticed respectively 1,65 and 1,5 fold increase in expression in normal B lymphocytes and B-CLL cells after LPS stimulation. The effectiveness of SAC stimulation was at the same level either in B normal lymphocytes and B-CLL cells (respectively 1,3

2 H. ANTOSZ i wsp. and 1,39 fold increase). mrna expression in normal T lymphocytes after LPS and SAC induction increased similarly (respectively 1,35 and 1,35 fold). KEY WORDS: B-CLL, WSTĘP Przewlekła białaczka limfocytowa B komórkowa (B-PBL) jest jednym z częściej występujących nowotworów hematologicznych. Dotyczy najczęściej ludzi po 5 roku Ŝycia i charakteryzuje się niezwykle róŝnorodnym przebiegiem klinicznym. B-PBL obecnie postrzegana jest jako choroba akumulacyjna wywodząca się ze stymulowanych, antygenowo dojrzałych limfocytów B, które nie są eliminowane przez apoptozę, lecz uzupełniane przez proliferację komórek prekursorowych. Przypuszcza się, Ŝe proliferacja miałaby być indukowana przez sygnały przeŝycia docierające ze środowiska zewnętrznego i przekazywane za pośrednictwem róŝnych receptorów (np. receptora komórki B, receptory chemokinowe i cytokinowe) i ich ligandów [1]. Antygeny indukujące nie są znane, ale nie wyklucza się, Ŝe klonalną ekspansję mogą prowokować latentne wirusy, bakterie, pewne antygeny środowiskowe lub autoantygeny [ 5]. W defensywie przeciwko patogenom istotną rolę pełni sygnalizacja za pośrednictwem receptorów Toll-podobnych (TLR). Ekspresję tych receptorów wykazują komórki systemu wrodzonej, nieswoistej odporności. Rozpoznają one wzorce molekularne charakterystyczne dla określonego rodzaju patogenu (PAMP Pahtogen-Associated Molecular Patterns) i następnie inicjują aktywację odporności swoistej poprzez limfocyty B i T [6 7]. Sygnalizacja za pośrednictwem TLR odgrywa waŝną rolę w biologii limfocytów B, indukuje dojrzewanie, proliferację i produkcję przeciwciał po rozpoznaniu patogenu [8]. Reprecht CR i Lanzavecchia A [9] wykazali, Ŝe stymulacja za pośrednictwem TLR jest wymagana jako trzeci sygnał (po BCR i pomocniczych limfocytach T), do aktywacji ludzkich naiwnych limfocytów B. Komórki naiwne wykazują niski poziom ekspresji TLR, ale ich ekspresja jest indukowana poprzez receptor B-komórkowy, stąd w limfocytach B pamięci poziom ekspresji kilku receptorów TLR jest stale wysoki. Obecnie znanych jest 1 ludzkich TLR [1]. Występują głównie w obrębie błony komórkowej (TLR1,, TLR, TLR5, TLR6, TLR1) oraz w błonie pęcherzyków cytoplazmatycznych (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9) [11]. Sygnalizacja poprzez TLR jest inicjowana przez domeny Toll/IL-1 (TIR), które mogą oddziaływać z cytoplazmatycznymi białkami adaptorowymi MyD88, TIRAP/MAL i TRIF. Sygnalizacyjna droga aktywacji za pośrednictwem TIR skutkuje albo aktywacją czynnika transkrypcyjnego NFκB i w konsekwencji produkcją cytokin prozapalnych, chemokin, cząsteczek defensywnych i białek inaktywujących mikroby lub aktywacją białkowych kinaz, aktywowanych miogenem tj. p38 i JNK [1 13]. W większości ligandy PAMP receptorów Toll-podobnych zostały zidentyfikowane. Dla receptora ligandami są m.in. bakteryjne lipoproteidy (pochodzące z Treponema, Mycoplasma, Borella), peptydoglikan, lipoarabinomannam (Mycobacterium), kwas lipotejchojowy (bakterie Gram-dodatnie), poryny (Neisseria sp.). Heterodimer utworzony z i TLR6 rozpoznaje lipopeptydy mykoplazm (zawierające dwie reszty kwasów tłuszczowych) i składniki ściany komórkowej grzybów zymosan. wspólnie z TLR1 wiąŝe lipopeptydy bakteryjne (zawierające trzy reszty kwasów tłuszczowych) [1 15]. Biorąc pod uwagę fakt, Ŝe większość limfocytów B-PBL, charakteryzuje ten sam immunofenotyp jak ich prawidłowe odpowiedniki, badanie ekspresji receptorów Toll-podobnych i funkcjonalne konsekwencje ich stymulacji, jest bardzo interesujące. Istnieją doniesienia, Ŝe stymulacja limfocytów B-PBL poprzez TLR skutkuje kompleksowymi zmianami, waŝnymi dla biologii limfocytów B-PBL, tj. efektem przeciwnowotworowym jaki i efektem promującym rozwój tego nowotworu [16].

3 Ekspresja w limfocytach B-PBL 1 Celem pracy było zbadanie czy białaczkowe i prawidłowe limfocyty B róŝnią się ekspresją powierzchniowego i czy pod wpływem ligandów zmienia się poziom ekspresji jego genu. Badania przeprowadzano na poziomie mrna, metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym, w limfocytach B-PBL CD19 + /CD5 + i czystych, izolowanych, prawidłowych subpopulacjach B (CD19 + ) i T (CD5 + ), przed i po indukcji SAC (Staphyloccocus aureus szczep Cowan I) i LPS (lipopolisacharyd Escherichia coli). MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiły limfocyty krwi obwodowej chorych na przewlekłą białaczkę B limfocytową (B-PBL). Diagnozę przeprowadzono w Klinice Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. W okresie poprzedzającym badanie Ŝaden z chorych nie był leczony. Grupa badawcza obejmowała 8 kobiet i 1 męŝczyzn w wieku od lat (mediana: 68). Stopień zaawansowania choroby był róŝny u poszczególnych chorych i obejmował stadia,1,, wg charakterystyki Rai a [17]. Grupę kontrolną (15 osób) stanowili pacjenci Kliniki Kardiologii UM w Lublinie, wiekowo odpowiedni, hospitalizowani z powodu nadciśnienia tętniczego. Izolacja limfocytów krwi obwodowej Krew pobierano na 3,8% cytrynian sodu a następnie izolowano limfocyty przez wirowanie w gradiencie gęstości limphoprepu, zmodyfikowaną metodą Böyum a [18]. Manualna technika selekcji pozytywnej i ocena immunofenotypu limfocytów Limfocyty grupy kontrolnej rozdzielano na subpopulacje CD19 + i CD5 + w separatorze magnetycznym (MiniMACS Separator, Miltenyi Biotec) w celu uzyskania subpopulacji o czystości około 95%. Pomiaru liczby komórek, czystości preparatu oraz ekspresji powierzchniowego receptora, dokonywano przy pomocy cytometrii przepływowej (FACS Calibur, Becton Dickinson). Izolacja RNA Izolacji RNA dokonywano zmodyfikowaną metodą Chomczyńskiego [19]. Synteza cdna Syntezę cdna przeprowadzano przy uŝyciu zestawu odczynników High-Capacity cdna Reverse Transcription Kit (AppliedBiosystems), zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta. Badanie ekspresji genu metodą PCR w czasie rzeczywistym Uzyskane po odwrotnej transkrypcji próby cdna amplifikowano w czasie rzeczywistym przy uŝyciu techniki półilościowej analizy ekspresji w czasie rzeczywistym-real Time PCR. Procedurę PCR wykonano w aparacie 73 Real-Time System firmy Applied Biosystems, z wykorzystaniem oprogramowania SDS. Mieszanina reakcyjna zawierała: 1,5 µl mieszaniny sondy i starterów specyficznych dla badanych genów (Applied Biosystems), 1,5 µl buforu TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1,5 µl H O oraz 1 µl cdna. Reakcję prowadzono na płytce optycznej w objętości 5 µl. Zastosowano następujące zestawy sond typu TaqMan znakowanych FAM-NFQ i starterów dla genu oraz GAPDH jako genu referencyjnego (Applied Biosystems). Warunki reakcji: denaturacja wstępna 95 C 1 minut, cykli: 95 C 15s, 6 C 6s. Ilość kopii cząsteczek badanych genów kwasu nukleinowego była monitorowa-

4 H. ANTOSZ i wsp. na w kaŝdym cyklu reakcji amplifikacji. Ilość cykli reakcji PCR, po których poziom fluorescencji przekroczył zdefiniowany próg (tc T ) była stosowana do obliczenia ilości badanych cząsteczek obecnych w mieszaninie na początku reakcji (analiza przy uŝyciu oprogramowania RQ Study ang. Relative Quantification; AppliedBiosystems). Dla kaŝdej próby wartość CT dla genu referencyjnego GAPDH była uŝyta do normalizacji ekspresji badanych genów. Poziomy ekspresji badanych genów ( C T ) wyznaczono według wzoru: C T genu = C T genu - C T GAPDH. Ekspresję względną (RQ) badanych genów oznaczono wg wzoru: RQ= -( CT genu - CT kalibratora) gdzie: C T kalibratora = C T genu kalibratora - C T GAPDH kalibratora. WYNIKI Ocena immunofenotypu limfocytów badanych chorych U chorych z rozpoznaniem przewlekłej białaczki limfocytowej wykonano badanie immunofenotypowe antygenów powierzchni komórki, charakterystycznych dla limfocytów B-PBL, metodą cytometrii przepływowej. Odsetek komórek CD5 + /CD19 + wynosił 8,67±1,%. Subpopulację tę przyjęto traktować jako białaczkową (Rycina 1). R Ryc. 1. Immunofenotyp powierzchni limfocytów B-PBL Fig. 1. Immunophenotype of B-CLL lymphocytes surface Grupę porównawczą stanowiła czysta subpopulacja limfocytów B zdrowych dawców. Za kryterium czystości przyjęto ekspresję antygenu CD19 na powierzchni limfocytów B. Kontrolę czystości przeprowadzono w cytometrze przepływowym. Odsetek subpopulacji B w kaŝdej z badanych, kontrolnych prób przekraczał 9% (Rycina ).

5 Ekspresja w limfocytach B-PBL 3 Ryc.. Ocena czystości prawidłowej subpopulacji limfocytów B (CD19 + ) Fig.. Purity evaluation of normal B lymphocytes subpopulation (CD19 + ) A) B) Ryc. 3. Ekspresja na powierzchni limfocytów B-PBL (A) i prawidłowych limfocytów B CD19 + (B) Fig. 3. expression on B-CLL cells (A) and normal B lymphocytes CD19 + (B) B-PBL B ±Odch.std ±1,96*Odch.std - B T ±Odch.std ±1,96*Odch.std A) B) Ryc.. Ekspresja w limfocytach B-PBL i prawidłowych limfocytach B (A), ekspresja w prawidłowych limfocytach B i T (B) Fig.. expression in B-CLL and normal B lymphocytes (A), expression in normal B and T lymphocytes (B)

6 H. ANTOSZ i wsp. Tabela 1. Porównanie ekspresji w prawidłowych i białaczkowych limfocytach B Table 1. Comparison of expression in normal and B-CLL lymphocytes B/B-PBL T/B,881 (p=,5659),65996 (p=,3351) Porównanie ekspresji w prawidłowych limfocytach B CD19 + i białaczkowych limfocytach B CD19 + /CD5 + wykazało blisko,5-krotnie niŝszą ekspresję mrna genu w komórkach białaczkowych oraz,65 razy wyŝszą ekspresję w prawidłowych limfocytach T, w porównaniu z ekspresją w prawidłowych limfocytach B (Rycina, Tabela 1). Analiza efektywności indukcji poprzez SAC i LPS była porównywalna i nie ujawniła znaczących róŝnic we wzroście aktywności genu. W przypadku stymulacji LPS-em limfocytów B prawidłowych stwierdzono 1,65-krotny wzrost ekspresji, natomiast w białaczkowych 1,5. Stymulacja SAC wykazała podobną skuteczność. Limfocyty B prawidłowe odpowiedziały wzrostem ekspresji na poziomie 1,3, natomiast białaczkowe 1,39. Porównawcza analiza ekspresji mrna w prawidłowych limfocytach T wykazała niemalŝe identyczne wzrosty tj. 1,35 i 1,35 po indukcji odpowiednio LPS i SAC (Tabela, Rycina 5 6). Tabela. Porównanie ekspresji w prawidłowych i białaczkowych limfocytach B po indukcji LPS i SAC Table. Comparison of expression in normal and B-CLL lymphocytes after LPS and SAC induction B-PBL B T LPS 1,59958 (p=,983) 1,61111 (p=,1673) 1,35967 (p=,1787) SAC 1,39395 (p=,3853) 1, (p=,331758) 1, (p=,1166) Analiza porównawcza skuteczności indukcji LPS i SAC ekspresji udowodniła, Ŝe jeśli chodzi o ten parametr, limfocyty B-PBL wykazują równieŝ znaczną heterogenność. Limfocyty chorych nr 5, 8, 9 nie reagowały zwiększeniem ekspresji po stymulacji LPS i SAC, podczas gdy u chorego nr 13 zaobserwowano znaczny wzrost ekspresji zarówno po stymulacji LPS i SAC, natomiast u chorego nr 11 znaczny wzrost jedynie po stymulacji LPS (Rycina 7).

7 Ekspresja w limfocytach B-PBL 5,5 1,8 1,6, 1, 1,5 1, 1, 1,,8,5,6,,,, -,5-1, B-PBL B-PBL LPS ±Odch.std ±1,96*Odch.std -, -, B-PBL B-PBL SAC ±Odch.std ±1,96*Odch.std A) B) Ryc. 5. Wpływ indukcji LPS (A) i SAC (B) na ekspresję w limfocytach B-PBL Fig. 5. Influence of LPS (A) and SAC (B) induction on expression in B-CLL lymphocytes B B LPS ±Odch.std ±1,96*Odch.std -1 - B B SAC ±Odch.std ±1,96*Odch.std A) B) Ryc. 6. Wpływ indukcji LPS (A) i SAC (B) ekspresji w prawidłowych limfocytach B Fig. 6. Influence of LPS (A) and SAC (B) induction on expression in normal B lymphocytes

8 6 H. ANTOSZ i wsp T T LPS ±Odch.std ±1,96*Odch.std A) B) - T T SAC ±Odch.std ±1,96*Odch.std Ryc. 7. Wpływ indukcji LPS (A) i SAC (B) na ekspresję w prawidłowych limfocytach T Fig. 7. Influence of LPS (A) and SAC (B) induction on expression in normal T lymphocytes 3,5 3,5 1,5 1, B-PBL B-PBL+LPS B-PBL +SAC Ryc. 8. Wpływ indukcji LPS i SAC na ekspresję w grupie 1 chorych na B-PBL Fig. 8. Influence of LPS (A) and SAC (B) induction on expression in group of 1 B-CLL patients DYSKUSJA Klasyfikacja B-PBL, morfologia, jak równieŝ immunofenotyp jest juŝ w większym stopniu opisany w tej chorobie. Są nowe sugestie, Ŝe stymulacja antygenowa razem z interakcją z dodatkowymi komórkami i cytokinami jest czynnikiem promocyjnym, który stymuluje proliferację komórek CLL pozwalając im unikać apoptozy. Efekt moŝe być róŝny w odrębnych podgrupach CLL i tym samym prowadzi do róŝnic w przebiegu klinicznym wśród indywidualnych przypadków. Etiologia choroby jednak nadal

9 Ekspresja w limfocytach B-PBL 7 pozostaje nieznana. W obrazie klinicznym B-PBL na plan pierwszy wysuwają się zaburzenia odporności, prowadzące często do cięŝkich zakaŝeń bakteryjnych i wirusowych, które są przyczyną około 6% zgonów. Pod koniec lat dziewięćdziesiątych ubiegłego stulecia okazało się, Ŝe organizmy wirulentne mają stałe i konserwatywne ewolucyjnie wzorce antygenowe, które są często wspólne dla róŝnych patogenów [ 1]. Organizmy eukariotyczne wykrywają te cząsteczki, dzięki wytworzonym receptorom PRR (Pattern Recognition Receptors), wśród których duŝe znaczenie mają TLR. Receptory te umoŝliwiają rozpoznanie patogenu i są w stanie prowadzić do wzbudzenia odpowiedzi swoistej, indukując jednocześnie zmiany w ekspresji cząsteczek ko-stymulujących tj. CD, CD5, CD8, CD86 i MHC kl. I i II, niezbędnych w efektywnej odpowiedzi immunologicznej [ 3]. Niestety dotychczas nie ma kompleksowych badań ekspresji i funkcji w limfocytach B w B-PBL. Nie wiadomo dokładnie, jaki efekt na biologię limfocytu B wywiera angaŝowanie. Prowadzona przez nas analiza porównawcza pomiędzy prawidłowymi subpopulacjami limfocytów B i T a komórkami B-PBL wykazała obniŝoną ekspresję genu na poziomie mrna w limfocytach chorych na B-PBL. MoŜna zatem spekulować, Ŝe jedną z przyczyn niedoborów immunologicznych w B-PBL moŝe być zbyt niska ekspresja tego receptora by efektywnie uaktywnić niezbędne czynniki ko-stymulujące. Potwierdzeniem tej tezy byłyby doniesienia Chiron D. i wsp. [], Ŝe w B-PBL ligandy nie indukują zmian w ekspresji cząsteczek ko-stymulujących. Fakt ten musi pociągać za sobą zaburzenia kooperacji limfocytów B i T, niezbędnej w odpowiedzi humoralnej. Nasze badania wykazały, Ŝe ekspresja w prawidłowych limfocytach T jest,6 razy wyŝsza w porównaniu z limfocytami B prawidłowymi. Wprawdzie nie analizowaliśmy ekspresji w poszczególnych subpopulacjach limfocytów T, to jednak wysoka totalna ekspresja dowodzi istotnego znaczenia w odpowiedzi immunologicznej. Nie bez znaczenia jest więc fakt zaburzonego stosunku limfocytów B/T, odwrócenia proporcji subpopulacji CD + /CD8 + oraz zwiększonego odsetka komórek T regulatorowych (Treg) u chorych na PBL-B. Są doniesienia, Ŝe stymulacja receptorów pod wpływem PAMP grzyba Candida albicans wywołuje stan immunosupresji w wyniku nasilenia uwalniania IL-1 oraz zwiększenia przeŝywalności komórek Treg(CD + /CD5 + ) [5]. Inne badania wykazały, Ŝe patogeny wewnątrzkomórkowe i grzyby wykorzystują szlaki przekaźnictwa sygnału w celu zahamowania odpowiedzi typu Th1 i przesunięcia równowagi w kierunku odpowiedzi typu Th, co potwierdza w/w rolę w indukcji odpowiedzi typu humoralnego [6]. MoŜe dziwić zbliŝony wzrost ekspresji genu po stymulacji SAC i LPS zarówno w limfocytach B białaczkowych jak i prawidłowych limfocytach B i T. LPS E.coli jest głównie ligandem TLR, w związku z tym moŝna by oczekiwać, Ŝe będzie miał mniejszy wpływ na ekspresję. Są jednak doniesienia, Ŝe LPS wyizolowany z. Porphyromonas gingivalis działa niezaleŝnie od receptora TLR i stymuluje prowadząc do odpowiedzi immunologicznej [7]. Podobny wzrost ekspresji moŝna tłumaczyć porównywalną siłą stymulacyjną PAMP pochodzących ze Staphyloccocus aureus i Escherichia coli. PAMP róŝnych mikroorganizmów mogą, ale nie muszą wykazywać odmienne właściwości stymulacji TLR. Inne bardziej prawdopodobne wyjaśnienie sugeruje, Ŝe wpływ ligandów na ekspresję genów ich receptorów jest niewielki, a aktywacja dotyczy genów molekuł ko-stymulacyjnych i sekrecji odpowiednich cytokin i chemokin. Bez odpowiedzi, jak na razie pozostaje pytanie, dlaczego ekspresja genu na poziomie mrna jest blisko,5 razy niŝsza w limfocytach B-PBL. ObniŜona ekspresja w limfocytach białaczkowych moŝe tłumaczyć istnienie upośledzenia nadzoru immunologicznego w B-PBL, skutkujące przeciwdziałaniem w usuwaniu pewnych antygenów, co moŝe bezpośrednio nasilać stymulację i selekcję wybranych klonów komórkowych prowadząc do transformacji nowotworowej.

10 8 H. ANTOSZ i wsp. 1. Praca była finansowana z grantu KBN nr NN 639. Praca powstała z wykorzystaniem sprzętu zakupionego w ramach Projektu:,,WyposaŜenie innowacyjnych laboratoriów prowadzących badania nad nowymi lekami stosowanymi w terapii chorób cywilizacyjnych i nowotworowych w ramach Programu Operacyjnego Rozwój Polski Wschodniej 7 13, Osi priorytetowej I Nowoczesna Gospodarka, Działania I.3 Wspieranie Innowacji. PIŚMIENNICTWO 1. Chiorazzi N, Rai KR, Ferrarini M. Mechanisms of disease: Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 5; 35: Broker BM, Klajman A, Youinou P i wsp. Chronic lymphocytic leukemic (CLL) cells secrete multispecific autoantibodies. J Autoimmun 1988; 1: Sthoeger ZM, Wakai M, Tse DB i wsp. Production of autoantibodies by CD5-expressing B lymphocytic leukemia. J Exp Med 1989; 169: Borche L, Lim A, Binet JL, Dighiero G. Evidence that chronic lymphocytic leukemia B lymphocytes are frequently committed to production of natural autoantibodies. Blood 199; 76: Schwartz RS, Stollar BD, Heavy-chain directed B-cell maturation: continuous clonal selection beginning at the pre-b cell stage. Immunol Today 199; 15: Akira S. Mammalian toll-like receptors. Curr. Opin. Immunol. 3; 15: Akira S, Takeda K. Toll-like receptor signaling. Nat Rev Immunol ; : Hayashi EA, Akira S, Nobrega A. Role of TLR in B cell development: signalling through TLR promotes B cell maturation and is inhibited by. J Immunol 5; 17: Reprecht CR, Lanzavecchia A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur J Immunol 6; 36: Beutler B, Hebe K, Du X, Ulevitch RJ. How we detect microbes and respond to them: Toll-like receptors and their transducers. J Leukoc Biol 3; 7: Nishiya T, DeFranco AL. Ligand regulated chimeric receptor approach reveals distinctive subcellular localization and signalling properties of the Toll-like receptors. J Biol Chem ; 79: Iwaszki A, Medzhitov R. Toll-like receptor control of the adaptive immune response. Nat Immunol ; 5: Underhill DM, Ozinsky A. Toll like receptors: key madiators of microbe detection. Curr Opin Immunol ; 1: Kaisho T, Akira S. Toll-like receptor function and signalling. J Allergy Clin Immunol 6; 117: Kawai T, Akira S. Pathogen recognition with Toll-like receptors. Curr Opin Immunol 5; 17: Rožkowá D, Novotná L, Pytlík R i wsp. Toll- like receptors on B CLL cells: expression and function consequences of their stimulation. Int J Cancer 1; 16: Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP, Chanana AD, Levy RN, Pasternack BS. Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1975; 6: Böyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Supplement, 1968; 97: Chomczyński P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987; 16, Hopkins PA, Scriskandan S.Mammalian Toll-like receptors: to immunity and beyond. Clin Exp Immunol 5; 1: Martin M, Rehani K, Jope RS, Mchalek SM. Toll-like receptor mediated cytokine production is differentially regulated by glycogen synthase kinase 3. Nat Immunol 5; 6: Albigier B, Dahlberg S, Henriques-Normark B, Normark S. Role of the innate immune system in host defense against bacterial infections: fokus on the Toll-like receptors. J Intern Med 7; 61: Spaner DE, Shi Y, White D i wsp. Immunomodulatory effects of Toll-like receptor 7 activation on chronic lymphocytic leukemia cells. Leukemia 6; : Chiron D, Bekeredjian-Ding I, Pellat-DeceunynckC, Bataille R, Jego G. Toll-like receptors: lessons to learn from norma land malignant human B cells. Blood 8; 11: 5-13.

11 Ekspresja w limfocytach B-PBL 9 5. Netea MG, Sutmuller R, Hermann C i wsp. Toll-like receptor suppresses immunity against Candida albicans through induction of IL-1 and regulatory T cells. J Immunol ; 17: Netea MG, van der G raaf CA, van der Meer JW, Kullberg BJ. Toll-like receptors and the host defense against microbial pathogens: bringing specificity to the innate-immune system. J Leukoc Biol ; 75: Pulendran B, Kumar P, Cutler ChW, Mohamadzadeh M, Van Dyke T. Banchereau J. Lipopolysaccharides from Distinct Pathogens Induce Different Classes of Immune Responses In Vivo. J Immol 1; 167: Praca wpłynęła do Redakcji.6.11 r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres do korespondencji: Dr hab. n. med. Halina Antosz Samodzielna Pracownia Genetyki Klinicznej UM w Lublinie -95 Lublin ul. Radziwiłłowska 11