Stowarzyszenie Inżynierów i Techników Leśnictwa i Drzewnictwa

Transkrypt

1 Stowarzyszenie Inżynierów i Techników Leśnictwa i Drzewnictwa

2 postępy techniki w leśnictwie 122 Zastosowanie metod analiz DNA we współczesnym leśnictwie Stowarzyszenie Inżynierów i Techników Leśnictwa i Drzewnictwa

3 Dyrekcja Generalna Lasów Państwowych rekomenduje publikację do celów szkoleniowych kadry leśnej. Komitet Redakcyjny Postępów Techniki w Leśnictwie : Przewodniczący i redaktor naczelny Krzysztof Jodłowski Zastępca przewodniczącego Marek Berft Sekretarz Zbigniew Święcicki Redaktorzy Olgierd Łęski, Tadeusz Moskalik Jacek Stocki, Anna Tylman, Jerzy Zieliński Redaktor wiodący zeszytu Justyna Nowakowska Treść artykułów zamieszczanych w Postępach Techniki w Leśnictwie jest wyrazem poglądów prezentowanych przez Autorów opracowań. Komitet Redakcyjny zastrzega sobie prawo do dokonywania zmian wynikających z opracowania redakcyjnego artykułów. Copyright by Zarząd Główny SITLiD, Warszawa 2013 r. ISSN Wydawnictwo Świat, Warszawa Al. Niepodległości 156/6, tel./fax Okładka: Gacki brunatne w kolonii letniej znajdującej się w leśniczówce w okolicach Stężycy. Z przeprowadzonych badań genetycznych wynika, że przedstawiciele tego gatunku występujący na terenie naszego kraju charakteryzują się niezwykle wysokim zróżnicowaniem genetycznym, co więcej blisko 75% uzyskanych haplotypów było unikatowych, występujących tylko w jednej lokalizacji (fot. A. Tereba). Nakład 2000 egz., ark. wyd. 4,50, ark. druk. 3,50 + 0,25 (wkł. barwna) = 3,75.

4 Spis treści DZIAŁ A. ZASTOSOWANIE METOD ANALIZ DNA WE WSPÓŁCZESNYM LEŚNICTWIE Od Komitetu Redakcyjnego Justyna A. Nowakowska, Agata Konecka DNA jako narzędzie w badaniach struktury genetycznej drzew leśnych Andrzej Lewandowski Markery mitochondrialnego DNA pomocne w ustaleniu pochodzenia świerka pospolitego w Polsce Małgorzata Sułkowska, Jan Łukaszewicz Historia poglądów na temat zasięgu buka zwyczajnego w świetle badań molekularnych Tomasz Oszako Wykrywanie i identyfikacja za pomocą analiz DNA inwazyjnych patogenów w szkółkach i drzewostanach Robert Rutkowski, Ewa Suchecka, Dorota Zawadzka Migracyjność zależna od płci a genetyczna struktura populacji kuraków leśnych.. Anna Tereba Wpływ fragmentacji środowisk leśnych na strukturę genetyczną wybranych gatunków nietoperzy Zbigniew Borowski Zastosowanie biologii molekularnej w łowiectwie Podstawowe terminy genetyczne i objaśnienia używanych skrótów Literatura uzupełniająca DZIAŁ B. WYBRANE NOWOŚCI PIŚMIENNICTWA LEŚNEGO Zagospodarowanie lasu, łowisk i wód Ekologia i ochrona lasu Ekonomika, organizacja, zarządzanie

5 DZIAŁ A. ZASTOSOWANIE METOD ANALIZ DNA WE WSPÓŁCZESNYM LEŚNICTWIE Od Komitetu Redakcyjnego Współczesne leśnictwo wykorzystuje w duże mierze nowoczesne osiągnięcia techniki, a w ostatnim czasie również narzędzia molekularne do detekcji i identyfikacji organizmów na poziomie gatunkowym, populacyjnym i osobniczym. Analizy informacji genetycznej zapisanej w cząsteczkach kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) stały się ostatnio filarem badań systematycznych (identyfikujących organizm do rangi gatunku) oraz są wysoce pomocne w poznaniu struktury genetycznej (bogactwa) genów oraz historycznego pochodzenia roślin, grzybów i zwierząt. Niniejsze zeszyt Postępów Techniki w Leśnictwie wypełnia lukę w świecie wydawniczym, spowodowaną brakiem polskojęzycznych opracowań na temat zastosowań najnowszych osiągnięć biologii molekularnej w szeroko pojętym leśnictwie, od analiz struktury genetycznej drzew, po precyzyjną identyfikację molekularną patogenów i poznanie zróżnicowania genetycznego populacji zwierząt. Zawiera najnowszy przegląd technik i metod badawczych opartych na markerach genetycznych DNA, które znajdują praktyczne zastosowanie w leśnictwie. Dalszy postęp nauk biotechnologii ukierunkowanej na poznanie struktury genetycznej organizmów umożliwi głębsze poznanie struktury genetycznej gatunków tworzących ekosystemy leśne, oraz opracowania strategii zachowania leśnych zasobów genowych, gwarantujących adaptację osobników i populacji do zmiennych warunków środowiska. Komitet Redakcyjny Postępów Techniki w Leśnictwie Zarządu Głównego SITLiD

6 Justyna A. Nowakowska Agata Konecka Zakład Hodowli Lasu i Genetyki Drzew Leśnych, Instytut Badawczy Leśnictwa DNA jako narzędzie w badaniach struktury genetycznej drzew leśnych Analiza cząsteczek DNA jest szeroko wykorzystywanym narzędziem w badaniach struktury genetycznej drzew leśnych, począwszy od odczytu sekwencji genomów poszczególnych gatunków, poznania mechanizmów ekspresji genów odpowiedzialnych za ważne cechy hodowlane, po transformację komórek i tworzenie organizmów o nowych cechach GMO. Poznanie struktury genetycznej sadzonek hodowanych w szkółkach leśnych daje możliwość oszacowania wpływu sposobu produkcji na poziom puli genowej materiału rozmnożeniowego, a zbadanie struktury genetycznej na poziomie DNA w sztucznym i naturalnym odnowieniu, umożliwia ocenę poziomu zachowania puli genowej w odnowieniu. Nowoczesne techniki identyfikacji profili genetycznych DNA drzew dają mocny dowód w trakcie prowadzenia postępowań karnych w dochodzeniu o kradzież drewna. Na genom drzew leśnych składa się zbiór informacji genetycznej zawartej w cząsteczkach kwasu deoksyrybonukleinowego (ang. DNA) zlokalizowanych w jądrze komórkowym oraz organellach (mitochondria i chloroplasty). Odkrycie budowy kodu genetycznego w postaci podwójnej helisy DNA, dokonane przez Jamesa Watsona i Watsona Cricka w 1953 roku, zrewolucjonizowało pojęcie współczesnej genetyki u wszystkich organizmów żywych. Dzięki informacji zapisanej za pomocą kodu genetycznego opartego na kombinacji tylko czterech par zasad (A-adeniny, T-tyminy, C-cytozyny i G-guaniny), możliwe jest zapewnienie wszystkich funkcji życiowych drzewa, rozwinięcie cech strukturalnych (m.in. budowa pnia, korony, kształt i kolor blaszki liściowej) i funkcjonalnych (oddychanie, fotosynteza), od narodzin do naturalnej śmierci. Dodatkowo, precyzyjny układ kombinacji czterech par zasad nukleinowych A, T, C i G, stanowi unikalny zapis informacji genetycznej, charakterystycznej dla danego gatunku, a nawet osobnika (wkładka barwna, rys. 1). Drzewa wytwarzają określone cząsteczki i substancje, np. białka budulcowe w trakcie wzrostu stymulowanego naturalnymi hormonami wzrostu, lub związki eteryczne w trakcie żeru na liściach szkodników owadzich, oraz kalusowe podczas infekcji patogenów. Obecnie, prowadzonych jest wiele badań mających na celu zrozumienie mechanizmów, dzięki którym drzewa postrzegają i reagują na bodźce środowiskowe, uruchamiając procesy adaptacyjne i ewolucyjne. Na wzrost wegetatywny i rozwój drzewa, od stadium zarodka do wykształcenia poszczególnych tkanek i narządów (w tym rozwój korzeni i powstawanie drewna, wykształcanie kwiatów, owoców i nasion) składa się szereg procesów precyzyjnie regulowanych w czasie (fazy wzrostu i ontogenezy) i przestrzeni (lokalizacja tkankowa), na podstawie zapisu dziedzicznego w cząsteczkach DNA. Dynamicznie rozwijające się techniki biologii molekularnej, w tym sekwencjonowanie genomów i tworzenie baz danych sekwencji dla drzew umożliwi

7 8 Justyna A. Nowakowska, Agata Konecka w najbliższym czasie poznanie genomów topoli, sosny i świerka. Trwają prace nad poznaniem genetycznego podłoża cech gwarantujących adaptację i przetrwanie gatunków zagrożonych wyginięciem (jak cis pospolity), a nawet interakcji między mikroorganizmami współzależnymi z gatunkiem. Od kilkudziesięciu lat, badanie ekspresji genów przyniosło wiele informacji odnośnie funkcji i aktywności wielu genów, głównie u topoli. U Populus tremula x P. alba, P. tremuloides i P. euramericana poznano ekspresję genów odpowiedzialnych za tworzenie włókien drewna reakcyjnego, geny odpowiedzialne za procesy przejścia z fazy wzrostu do fazy spoczynku oraz geny biorące udział w procesie kwitnienia. Aktywność genów kodujących białka uczestniczące w syntezie ściany komórkowej potwierdzono w przypadku ekspozycji liści topoli na podwyższone stężenie (560 ppm) CO 2 i 1,5-krotne podwyższone ponad normę stężenie ozonu (O 3 ), jak również na atak wirusa plamistości mozaikowej topoli (PopMV). Jak dotąd, analizy ekspresji genów u gatunków iglastych, przeprowadzono jedynie w badaniach niektórych gatunków sosny i świerka. U sosny (Pinus taeda L.) przebadano geny kodujące białka strukturalne, które ulegały zmniejszonej ekspresji w komórkach ksylemu podczas tworzenia drewna wczesnego i późnego. Tworzenie się korzeni bocznych u Pinus contorta charakteryzuje się zmianą w profilu ekspresji ok. 220 genów, m.in. odpowiedzialnych za syntezę białek odpowiedzialnych za podziały komórkowe, transport auksyn, fotosyntezę i syntezę ściany komórkowej. U świerka (Picea abies L. Karst.) i sosny (Pinus taeda L.) badano mechanizmy regulacji rozwoju zarodków somatycznych podczas procesu embriogenezy za pomocą techniki mikromacierzy. Co ciekawe, u Pinus taeda wykryto 131 różnic w ekspresji genów w zależności od geograficznego położenia badanych drzewostanów, co może świadczyć o genetycznym podłożu procesów adaptacyjnych w obrębie gatunku. Identyfikacja genów adaptacyjnych u gatunków drzewiastych oraz charakterystyka poszczególnych populacji pod kątem ekspresji genów warunkujących adaptację do zmiennych warunków środowiska może być podstawą do zachowania różnorodności biologicznej podczas sztucznych odnowień stanowisk leśnych. Wykorzystanie analiz DNA do określenia skutków genetycznych działalności człowieka w populacjach drzew leśnych W naukach leśnych zauważa się istotny niedobór informacji i badań na temat zmian struktury genetycznej drzewostanów powodowanych aktywnością ludzką. Największe oddziaływanie na lasy mają leśnicy, których obowiązkiem jest dbanie o ekosystem leśny poprzez wprowadzanie zabiegów pielęgnacyjnych. Badacze zajmujący się ekologią roślin wykazali, że decydujące znaczenie w utrzymaniu równowagi każdej populacji, również drzew leśnych, odgrywa poziom różnorodności biologicznej i zmienności genetycznej. Kształtowana jest ona głównie przez zróżnicowanie genetyczne drzewostanów wpływające na stabilność i trwałość ekosystemów leśnych. Również polityka leśna państwa zaleca, aby cele produkcyjne były łączone z celami ekologicznymi, przede wszystkim dotyczącymi zachowania różnorodności biologicznej na poziomie ekosystemów, gatunków i puli genowej poszczególnych populacji. Na podstawie przeprowadzonych badań genetycznych populacji drzew leśnych można przypuszczać, że drzewostany o ubogiej puli genowej są mniej odporne na zmiany środowiskowe oraz bardziej narażone na działanie niepożądanych czynników. Działalność człowieka, mająca na celu poprawę jakości i stanu sanitarnego drzewostanów, najprawdopodobniej zubaża już zawężoną pulę genetyczną w przypadku populacji powstających w wyniku odnowienia sztucznego. Powstaje jednak pytanie w jakim stopniu zróżnicowanie genetyczne jest przy okazji wykonywania zabiegów pielęgnacyjnych modyfikowane? Czy podjętymi działaniami zubożamy pulę genetyczną populacji? Czy osobniki usuwane cechują się jednakowym genotypem? Pytania można mnożyć. Obecnie ponad 90% lasów powstaje na drodze odnowienia sztucznego. Pula genetyczna takich populacji jest zredukowana już na etapie zbioru nasion. Wysiewane na szkółkach partie

8 DNA jako narzędzie w badaniach struktury genetycznej drzew leśnych 9 nasion pochodzą z drzewostanów wytypowanych przez człowieka pod względem fenotypowym, ponadto nie ze wszystkich drzew lecz z obradzających w danym roku. W pierwszym etapie hodowli lasu badacze skupili się na selekcji nasion i sadzonek. Dodatkowo obserwacje wykazały, że z 1000 nasion sosny wyrasta około 250 siewek, a do wieku rębnego na uprawie pozostaje tylko 5 drzew. Kolejnym etapem na poziomie szkółek jest sortowanie pod względem wielkości materiału sadzeniowego. Tu również następuje ściśle określona selekcja eliminująca część genotypów. Powyżej przytoczone zostały tylko niektóre aspekty produkcji szkółkarskiej, które wymagają głębszej analizy pod kontem genetycznym. Aktualnie, w Instytucie Badawczym Leśnictwa prowadzone są badania nad wpływem sposobu produkcji szkółkarskiej na zróżnicowanie genetyczne materiału sadzeniowego. Na podstawie analiz laboratoryjnych DNA jądrowego oraz chloroplastowego przeprowadzonych przy użyciu wybranych markerów dla loci DNA mikrosatelitarnego (SSR), określona zostanie pula genowa sadzonek sosny zwyczajnej wyhodowanej metodą kontenerową i polową oraz pokolenia rodzicielskiego, z którego zostały zebrane nasiona do produkcji sadzonek. Dla pełniejszej charakterystyki zbadane zostanie również zróżnicowanie genetyczne naturalnego odnowienia występującego pod drzewami rodzicielskimi. Analiza poziomów bogactwa genetycznego poszczególnych grup pozwoli wyróżnić bardziej pożądany, pod względem utrzymania możliwie wysokiej różnorodności genotypowej, sposób produkcji materiału sadzeniowego, w zależności od warunków w jakich siewki wzrastają (wkładka barwna rys. 2). Nadal żywym zagadnieniem wśród leśników jest kwestia wyższości odnowienia naturalnego nad odnowieniem sztucznym stosowanym w lasach. W Instytucie Badawczym Leśnictwa zespół Zachary przeprowadził badania nad odnowieniami naturalnymi sosny zwyczajnej, świerka pospolitego i dębu szypułkowego. Do analiz wykorzystano jądrowe i organellowe DNA mikrosatelitarne (SSR). Wykazano, że we wszystkich przypadkach pokolenie potomne i rodzicielskie charakteryzuje się zbliżoną strukturą genetyczną. U sosny i dębu nastąpiło nieznaczne wzbogacenie puli genowej potomstwa o odpowiednio 0,7% i 4,4%. Odnowienie naturalne świerka posiadało nieco zubożoną (o 1%) pulę genetyczną w stosunku do pokolenia rodzicielskiego. Prawdopodobnie zmiana ta spowodowana została selekcją adaptacyjną do panujących warunków wzrostu. Badania potwierdziły dobrą jakość genetyczną odnowienia naturalnego, co może gwarantować wysoką trwałość lasów. Istnieje teza, że populacje pochodzenia sztucznego są lepsze pod względem cech jakościowych, jednak uboższa pula genetyczna prawdopodobnie czyni je mniej odpornymi na niepożądane czynniki zewnętrzne w porównaniu do bardziej zróżnicowanych populacji naturalnych. W konsekwencji, niski poziom zmienności genetycznej drzewostanu sprawia, że populacja taka jest mniej stabilna i bardziej narażona na zniszczenie pod wpływem czynników patogenicznych oraz szkodliwych zmian środowiska. Badacze zajmujący się dziedziną leśnictwa widzą więc potrzebę prowadzenia dalszych analiz z wykorzystaniem narzędzi genetyki molekularnej. W kolejnych fazach wzrostu drzewostanów to cięcia pielęgnacyjne, poprzez zabiegi czyszczeń oraz trzebieży, kształtują pulę genową, która tworzy kolejne pokolenia. W historii lasów Polski można wyróżnić konkretne tendencje w gospodarowaniu i kształtowaniu zasobów leśnych. Błędne gospodarowanie lasami doprowadziło swego czasu do praktykowania trzebieży jako źródła pozyskania cennych sortymentów wielkowymiarowych, cechujących się wysoką jakością. Trzebież sortymentowa prowadziła do pozostawiania drzew najgorszych pod względem fenotypowym, jakościowym, zdrowotnym i najprawdopodobniej genetycznym. Obecnie trzebieże prowadzone są racjonalnie a uwaga leśników skierowana jest na równomierne oraz planowe wykorzystywanie i pielęgnowanie zasobów leśnych. Dotychczasowe badania nie zgłębiały zagadnienia struktury genetycznej drzewostanów poddawanych zabiegom pielęgnacyjnym w różnych fazach wzrostu. Zarówno w Polsce, jak i za granicą, prowadzone badania nad kształtowaniem zróżnicowania genetycznego drzewostanów pod wpływem usuwania drzew najczęściej prowadzono na plantacjach nasiennych, ponieważ znany układ i rozmieszczenie drzew pozwalają na precyzyjne założenie doświadczenia i jasne

9 10 Justyna A. Nowakowska, Agata Konecka wyniki. Badania prowadzono jednak na poziomie markerów morfologicznych poprzez opis cech fenotypowych poszczególnych osobników lub markerów enzymatycznych. Wiele przeprowadzonych badań dotyczyło przepływu pyłku i systemów kojarzenia oraz poziomu wsobności populacji na plantacjach np. sosny zwyczajnej, gdzie wykazano, że u drzew iglastych dominuje zapłodnienie krzyżowe, które podlega zmienności zarówno pod wpływem czynników środowiskowych tj. pogoda w danym roku, jak i genetycznych tj. dopływ obcego pułku do populacji. Również działalność człowieka, poprzez np. trzebieże powoduje modyfikację systemu kojarzenia. Inne badania prowadzone na plantacji sosny kalifornijskiej (Pinus radiata D.) wykazały, że różne metody trzebieży odmiennie wpływają na zróżnicowanie genetyczne. Na podstawie pomiaru pierśnicy stwierdzono, że zastosowana trzebież losowa i selekcyjna oraz ich kombinacja, nieznacznie zniekształciły różnorodność genetyczną plantacji. Wszystkie zastosowane metody zmieniły strukturę genetyczną populacji. Wyniki badań prowadzonych na terenie Niemiec w drzewostanach świerka pospolitego wskazują na wpływ zabiegu trzebieży dolnej i górnej, nawet o małej intensywności, na zróżnicowanie genetyczne populacji. Przeprowadzone doświadczenia w drzewostanach bukowych, naśladujące naturalne procesy wypadu poszczególnych drzew również zmieniły strukturę puli genowej. Stwierdzono jednak, że selektywne usuwanie poszczególnych osobników naśladujące przyrodę mniej narusza zmienność genetyczną niż wyrąb drzew pożądanych pod względem surowcowym. Kolejne analizy wykazały, że powtarzanie trzebieży w 60-letnim drzewostanie bukowym nie miało negatywnego wpływu na zmienność puli genowej drzewostanu. Należy podkreślić, że powyższe badania ukierunkowane są na analizę zmian w strukturze genetycznej populacji drzew leśnych na podstawie markerów morfologicznych lub markerów enzymatycznych. W dobie dostępności bardziej precyzyjnych narzędzi badawczych istotne jest prowadzenie badań weryfikujących wpływ obowiązujących kierunków hodowli, gospodarowania i pielęgnacji lasów na strukturę ekosystemów leśnych w oparciu o markery DNA jądrowego oraz organellowego. Modyfikacja genetyczna drzew leśnych Modyfikacja informacji genetycznej drzew, polega na zmianie wybranych odcinków DNA i wykorzystaniu markerów molekularnych do stworzenia drzewa o nowych, korzystnych cechach hodowlanych. Pierwszym organizmem zmodyfikowanym genetycznie była w 1973 roku bakteria pałeczki okrężnicy Escherichia coli, występująca w sposób naturalny w jelicie grubym człowieka, do której wprowadzono gen odporności na antybiotyk. Osiągnięcie to zapoczątkowało erę laboratoryjnej inżynierii przy pomocy genomowych strategii selekcji prowadzonej na komórkach zwierzęcych (żaby, świni, krowy, owcy) i roślinnych (rzepaku, soi, kukurydzy, ryżu). Wyprodukowanie białka nici pajęczej w mleku kozim, insuliny ludzkiej w bakteriach, czy substancji krzepliwości krwi w komórkach ssaków to już rzeczywistość medycyny 21-go wieku. Od dwóch dziesięcioleci, biotechnologia odgrywa również coraz większą rolę w światowym leśnictwie. Głównym celem badań prowadzonych w tym kierunku jest utworzenie transgenicznych drzew odpornych na żery szkodników owadzich i patogenów grzybowych, oraz na szkodliwe czynniki abiotyczne (susza, zasolenie). Odporność na środki chwastobójcze (herbicydy) stosowane w uprawie sadzonek na szkółkach i plantacjach leśnych, jak również takie cechy, jak zmiana jakości włókien drewna są brane pod uwagę w tworzeniu drzew GMO. W jaki sposób powstają drzewa transgeniczne? Prześledźmy ten proces na podstawie poszczególnych etapów tworzenia transgenicznej topoli, odpornej na glifosfat herbicyd o szerokim zakresie skuteczności oraz na żer owadów z rzędu błonkówek, muchówek i chrząszczy. W pierwszym etapie transformacji, pozyskiwane są geny, które posłużą do modyfikacji genomu drzewa, np. gen białka EPSP z bakterii Salmonella typhimurium, odpowiadający za blokadę biosyntezy związków aromatycznych w roślinie, oraz gen białka cry wyizolowany z bakterii Bacillus thuringiensis (Bt) i odpowiedzialny za syntezę toksyny niszczącej nabłonek jelit u owadów

10 DNA jako narzędzie w badaniach struktury genetycznej drzew leśnych 11 (wkładka barwna rys. 3). Dalej, transformacja komórek topoli, może być przeprowadzona przy użyciu wektora bakterii glebowych Agrobacterium tumefaciens. W trakcie infekcji wywołanej przez A. tumefaciens, następuje przeniesienie fragmentu informacji genetycznej do genomu rośliny gospodarza, i w konsekwencji powstanie narośli tumorowych. Ale udoskonalona, gdyż syntetycznie pozbawiona wirulentych genów bakteria jest nadal dobrym nośnikiem informacji genetycznej i w laboratoryjnych warunkach in vitro (na szkle) możne posłużyć do infekcji blaszek liściowych topoli Populus trichoderma, po uprzednim wprowadzeniu do kolistego DNA (plazmidy) A. tumefaciens obu genów (białka EPSP i cry). W trakcie infekcji, bakterie przekazują fragmenty DNA wraz z genami EPSP i cry do jądra komórki roślinnej, gdzie następuje integracja z genomem topoli. W kolejnym etapie transformacji, następuje selekcja transgenicznych siewek topoli, które zintegrowały geny EPSP i cry w swoim genomie. Siewki, których cząsteczki DNA nie zostały zmienione, nie przeżyją na pożywkach wzbogaconych herbicydem. Na końcu procesu transformacji ma miejsce regeneracja odpornej topoli GMO w szklarni i jej uprawa w warunkach polowych. W ten sposób prowadzone są uprawy topoli w USA, gdzie na plantacjach stosowane są herbicydy o szerokim zakresie działania, charakteryzujące się małą toksycznością dla środowiska i człowieka. Nadal nierozwiązanym pozostaje aspekt niekontrolowanego zapylenia naturalnych drzew danego gatunku przez pyłek zawierający bakteryjne geny, oraz ciągła synteza białek odporności w trakcie długiego życia drzewa, co niesie ze sobą ryzyko uodpornienia się żerujących szkodników. Dwie trzecie upraw drzew GMO w Chinach to około 15 mieszańców topoli Populus sp. ze zintegrowanym genem odporności na owady oraz zmienioną strukturą włókien drewna. W Kanadzie, Argentynie, Brazylii to również chętnie uprawiany gatunek transgeniczny, włącznie z eksperymentami, aby blaszki liściowe topoli miały zwiększoną asymilację jonów amonowych (źródło azotu z gleby), co w konsekwencji zwiększy produkcję asymilatów i da korzystny przyrost biomasy. Zwiększenie aktywności innego genu ligazy kumarynowej C4L, biorącej udział w łańcuchu biosyntezy lignin, pozwoli na łatwiejszy przerób pulpy w przemyśle papierniczym bez użycia szkodliwych związków chloru, a modyfikacja genów kwitnienia nly czy lfy umożliwi kontrolę sterylności drzew na plantacjach. Jak dotąd, w świetle Dyrektywy UE 2001/18/WE, wprowadzenie do obrotu organizmu o zmienionym genotypie GMO jest możliwe dopiero po wieloletnich badaniach i udowodnieniu ich nieszkodliwości dla człowieka i środowiska. Procedury dopuszczenia GMO do upraw mogą trwają na ogół 10 lat i jak dotąd, zezwolono jedynie na uprawę transgenicznej kukurydzy poprzez wprowadzenie genu Bt (kukurydza odmiany MON810, odporna na omacnicę prosowiankę). Lista innych zmodyfikowanych genetycznie gatunków roślin uprawnych czekających na rejestrację UE jest długa, ale nie ma wśród nich gatunków drzewiastych. Spośród drzew kandydatów do modyfikacji, najłatwiejszym gatunkiem jest topola, ze względu na najprostszą budowę DNA oraz łatwość regeneracji w warunkach laboratoryjnych i polowych. Inne gatunki, takie jak świerk, sosna, brzoza posiadają bardziej rozbudowany genom i wymagają większego wkładu pracy w tworzeniu odmian transgenicznych. Mimo optymistycznych wizji upraw drzew GMO na plantacjach, o szybkim czasie rotacji, o cechach odporności na szkodniki i środki ochrony roślin, nadal istnieje wiele kontrowersji, dotyczących głównie kwestii niekontrolowanego uwolnienia bakteryjnych genów do środowiska oraz ryzyko szybkiej adaptacji szkodników do toksyn syntetyzowanych przez drzewo. DNA drewna jako dowód w postępowaniu karnym Genetyka sądowa jest jedną z dynamicznie rozwijających się dziedzin nauki, która precyzyjnie łączy badania podstawowe, oparte głównie na analizach DNA organizmów, z praktyką w procesach sądowych. Postęp technologiczny, jaki dokonał się w ostatnich dziesięcioleciach w badaniach struktury DNA organizmów żywych, umożliwia obecnie przeprowadzenie identy-

11 12 Justyna A. Nowakowska, Agata Konecka fikacji materiału dowodowego z precyzją, sięgającą nawet 99,99%. Analizy porównawcze wykonywane dla celów procesowych opierają się na zestawieniu profili wybranych fragmentów DNA (markerów), pochodzących co najmniej z dwóch różnych próbek materiału organicznego np. kawałków drewna. Charakterystyka kodu genetycznego materiału dowodowego, zabezpieczonego na miejscu przestępstwa i porównawczego, pobranego od domniemanego sprawcy ma na celu dostarczenie dowodów w sprawie karnej na podstawie potwierdzenia bądź wykluczenia podobieństwa badanych prób. Sposób pobrania materiału biologicznego do badań (zachowanie czystości i prawidłowy opis prób), oraz jego przechowywanie do czasu wykonania analiz biochemicznych (unikanie wilgoci i ciepła podczas) są kluczowymi elementami, gwarantującymi prawidłowe wykonanie analiz DNA w laboratorium. Tamże, przeprowadzana jest ekstrakcja i analiza cząsteczek DNA w celu uzyskania profilu genetycznego danej próbki (wkładka barwna rys. 4 i 5). Ogromną zaletą badań DNA w celach porównawczych jest szybkość i precyzja ich wykonania: od kilku do kilkunastu dni. Dodatkowo, informacja genetyczna nie zależy od danych takich, jak wiek i rozmiar drzewa, rodzaj pobranej tkanki, czy miąższość. W podsumowaniu można stwierdzić, że ingerencja człowieka w strukturę genetyczną drzew leśnych oraz poznanie naturalnych procesów regulacji zróżnicowania populacji drzew mogą przynieść liczne korzyści hodowlane, użytkowe i ekonomiczne, respektując działania leśników, które powinny gwarantować zachowanie możliwie pełnej zmienności genetycznej drzewostanów. Ponieważ techniki badań genetycznych istotnie mogą wzbogacić wiedzę o hodowli i gospodarowaniu lasami, dlatego warto wykorzystać nowe możliwości określania wpływu działalności człowieka na podstawie markerów molekularnych. Dzięki zdobyczy nauki, jakimi są techniki molekularne, leśnicy mają coraz większe możliwości wnikliwego poznania tajemniczych i dynamicznych praw rządzących ekosystemem leśnym.

12 Andrzej Lewandowski Instytut Dendrologii w Kórniku Markery mitochondrialnego DNA pomocne w ustaleniu pochodzenia świerka pospolitego w Polsce Artykuł prezentuje wykorzystanie dziedziczącego się wyłącznie w linii matecznej mitochondrialnego markera DNA mt15-d02 do określenia pochodzenia świerka pospolitego [Picea abies (L.) Karst.] w Polsce. Badania przeprowadzono na próbie 3067 drzew z 138 populacji, pochodzących z całego obszaru naszego kraju, z wyłączeniem Pomorza Zachodniego, gdzie świerk pospolity jest wyłącznie sztucznego pochodzenia. Struktura genetyczna współcześnie występujących populacji świerka pospolitego w Polsce jest wypadkową wielu procesów. Najważniejszym z nich było naturalne kształtowanie się zasięgu w czasie rozprzestrzeniania się gatunku po ostatnim zlodowaceniu. Pierwsze, śladowe ilości pyłku świerka notowane na terenie Polski pochodzą już z okresu późnoglacjalnego, tj. sprzed ok. 13 tys. lat. Z wyników badań palinologicznych wiadomo, że migracja świerka nastąpiła z dwóch odmiennych kierunków, jednak w różnym czasie. Najpierw świerk wkroczył z kierunku południowego karpackiego. Dopiero później, bo pod koniec okresu borealnego, tj. ok. 8 tys. lat temu z kierunku północno-wschodniego Na naturalny proces kształtowania się zasięgu świerka nałożyły się działania człowieka, z początku związane z wylesieniami pod rozwijające się osadnictwo, pozyskiwaniem drewna na cele gospodarcze, aż po zastępowanie naturalnych drzewostanów sztucznymi nasadzeniami. Koniec dziewiętnastego i początek dwudziestego wieku był w leśnictwie okresem, w którym preferowano uprawę świerka, jako gatunku stosunkowo łatwego w hodowli, zapewniającego duży i szybki zysk. Rys. Kierunki naturalnej migracji świerka pospolitego po ostatnim zlodowaceniu. Kropkami zaznaczono badane populacje 1 Nadleśnictwo Gołdap 2 Puszcza Białowieska 3 Nadleśnictwo Skrilno 4 Nadleśnictwo Kartuzy Szlaki naturalnej migracji Zasięg północny Zasięg południowy

13 14 Andrzej Lewandowski Na szeroką skalę, w miejsce wyciętych lasów, często liściastych, wprowadzano szybkorosnące monokultury świerkowe. Przy czym używany materiał siewny był zazwyczaj nieznanego pochodzenia. Należy pamiętać, że nasze najstarsze dzisiaj drzewostany pochodzą z okresu zaborów i kształtowane były, w zależności od zaboru, przez różne praktyki leśne. W wyniku tego obecne drzewostany świerkowe i te z udziałem świerka są silnie przekształcone, i dalekie od tego, jakie byłyby bez ingerencji człowieka. Opisane wyżej fakty miały niewątpliwie istotny wpływ na ukształtowanie puli genowej świerka. O ile na temat istnienia na terenie naszego kraju dwóch odrębnych, pod względem pochodzenia, pul genowych świerka od dawna panowała zgodna opinia, to kontrowersje dotyczyły charakteru i pochodzenia tzw. strefy bezświerkowej, która rozdziela te dwa zasięgi na Niżu Polskim. Dyskusje na ten temat rozpoczęły się na początku dwudziestego wieku. Z początku Raciborski wyróżnił na terytorium Polski tylko jeden obszar występowania świerka, ograniczony liniami zasięgowymi od południowego wschodu i północnego zachodu. Następnie Szafer wydzielił obszar dysjunkcji w zasięgu, jako rejon oddzielający w sposób naturalny dwie odrębne pule genowe świerka, południową i północno-wschodnią. Wiązał on tę nieciągłość z niedokończoną, holoceńską migracją świerka z dwóch różnych ostoi glacjalnych. W związku z tym, sporadycznie występujący tu świerk należy, jego zdaniem, uznać wyłącznie jako sztucznego pochodzenia. Zupełnie odmiennego zdania był Jedliński, który w latach dwudziestych ubiegłego wieku zakwestionował istnienie pasa bezświerkowego. Jako pierwszy zasugerował, że do braku świerka na omawianym terenie w dużej mierze przyczynił się człowiek. Ostatecznie też poddał w wątpliwość celowość wyodrębniania tego pasa, zwłaszcza w sytuacji odnotowania tu wielu wyspowych, jego zdaniem, naturalnego pochodzenia stanowisk świerka. W drugiej połowie dwudziestego wieku coraz częściej pojawiły się opracowania potwierdzające przypuszczenia Jedlińskiego. Najbardziej prawdopodobna wydawała się więc teza o ciągłym, w sensie historycznym zasięgu świerka i wtórnym pochodzeniu nieciągłości. Natomiast nie podlegał wątpliwości fakt uformowania zasięgu przez dwa odmienne regiony refugialne. Otwartą pozostawała kwestia wyznaczenia strefy kontaktu północnego i południowego szlaku migracyjnego. Nic także nie wiadomo było na temat skali wymieszania różnych pochodzeń świerka na skutek działalności człowieka. Brak odpowiednich narzędzi badawczych nie pozwalał na rozwikłanie tych wątpliwości. Sytuacja uległa radykalnej zmianie wraz z rozwojem technik biologii molekularnej i znalezieniem dziedziczących się wyłącznie w linii matecznej markerów mitochondrialnego DNA. U roślin DNA występuje w jądrze komórkowym, mitochondriach i chloroplastach. Jednak sposób jego dziedziczenia jest odmienny. Jądrowe DNA dziedziczy się po obu rodzicach. DNA chloroplastowe, u roślin nagozalążkowych, a więc i u świerka, dziedziczy się wyłącznie w linii ojcowskiej, a mitochondrialne tylko w linii matecznej. Jednym z wykorzystywanych w badaniach świerka markerem mitochondrialnego DNA jest marker o oznaczeniu mt15-d02. Marker ten doskonale nadaje się do analizy pochodzenia świerka w naszym kraju, ponieważ posiada trzy fragmenty o różnej długości, charakterystyczne dla różnych rejonów pochodzenia. Fragment najdłuższy (o długości 1249 pz) jest charakterystyczny dla świerka pochodzenia karpackiego. Fragment krótszy (1107 pz) występuje u świerka pochodzenia alpejskiego, który został wprowadzony w naszym kraju sztucznie przez import nasion obcego pochodzenia. Natomiast fragment najkrótszy (ok. 800 pz) posiadają świerki pochodzenia borealnego, północno-wschodniego. Na przestrzeni ostatnich kilku lat, z zastosowaniem tego markera, w Pracowni Biologii Molekularnej Instytutu Dendrologii w Kórniku, przeanalizowano pod kątem pochodzenia łącznie 3067 drzew z 138 populacji. Badany materiał pokrywa cały obszar naszego kraju, z wyłączeniem Pomorza Zachodniego, gdzie świerk pospolity jest wyłącznie sztucznego pochodzenia. Z przeprowadzonych analiz wyłania się w miarę przejrzysty obraz rozprzestrzenienia świerka w Polsce. W południowej części zasięgu w większości występują świerki pochodzenia karpackiego. Tylko sporadycznie, w kilku populacjach, znaleziono domieszkę świerków pochodzenia alpejskiego. Teren Polski północno-wschodniej jest opanowany głównie przez świerki pochodzenia borealnego. Chociaż dokładne analizy przeprowadzone na terenie Nadleśnictwa Gołdap uznanego za

14 Markery mitochondrialnego DNA pomocne w ustaleniu pochodzenia świerka pospolitego w Polsce 15 mikroregion mateczny dla świerka rominckiego, ekotypu świerka północno-wschodniego, wykazały duży udział świerka pochodzenia, głównie alpejskiego, ale i karpackiego, które zostały tu wprowadzone sztucznie przez człowieka pod koniec dziewiętnastego i na początku dwudziestego wieku. Drzewa obcego pochodzenia znaleziono zarówno w gospodarczych, jak i wyłączonych drzewostanach nasiennych (WDN). Skala zanieczyszczenia materiałem obcego pochodzenia jest różna i wynosi od 0% aż do 85%. Tylko dwa na cztery zbadane WDN-y były czyste pod względem pochodzenia. Jeden z WDN-ów ma w swoim składzie zaledwie 15% drzew pochodzenia lokalnego i aż 69% drzew pochodzenia alpejskiego. Zamieszanie dotyczy także drzew matecznych. Osiem na 24 zbadane drzewa były drzewami obcego pochodzenia, głównie alpejskiego. Pod tym względem najlepiej prezentują się rezerwaty przyrody, ponieważ w żadnym z czterech zbadanych rezerwatów nie znaleziono ani jednego drzewa obcego pochodzenia. Natomiast w strefie bezświerkowej, w większości badanych populacji, współwystępują osobniki pochodzenia północno-wschodniego borealnego, jak i południowego karpackiego. Podobnie, osobniki obu pochodzeń współwystępują we wszystkich kilku zbadanych stanowiskach świerka z Puszczy Białowieskiej, w tym na terenie rezerwatu ścisłego. Przy czym w większości przypadków zaznacza się przewaga świerków pochodzenia południowego. Podobnie zresztą jest także po białoruskiej stronie puszczy. Jest to zaskakujące zważywszy na fakt, że do tej pory rejon Puszczy Białowieskiej w sposób niepodlegający żadnej dyskusji był włączany do zasięgu świerka północno- -wschodniego. Uzyskane wyniki w sposób jednoznaczny wskazują, że teren strefy bezświerkowej oraz Puszczy Białowieskiej jest miejscem, gdzie w sposób naturalny doszło do spotkania się i wymieszania dwóch odrębnych pul genowych świerka północno-wschodniej i południowej. Jak już wspomniano wcześniej, na terenie naszego kraju spotyka się także świerki pochodzenia alpejskiego. Okazuje się, że ich udział jest stosunkowo duży w licznych populacjach ze strefy bezświerkowej. Może to świadczyć o dawnych próbach sztucznego wprowadzania na te tereny upraw świerkowych. Z powodu braku lokalnej bazy nasiennej nasiona były prawdopodobnie sprowadzane z innych rejonów, w tym z zachodniej Europy. Natomiast świerka pochodzenia alpejskiego nie znaleziono na terenie Puszczy Białowieskiej, gdzie w zasadzie nie zakładano monokultur świerkowych, co potwierdza przypuszczenie, że świerk alpejski jest na terenie naszego kraju pochodzenia sztucznego i został tu zawleczony z obcym materiałem siewnym. Opisany marker genetyczny potencjalnie może zostać użyty do rekonstrukcji przebiegu naturalnych granic zasięgu świerka w Polsce, co z uwagi na niemożność określenia pochodzenia większości stanowisk było bardzo trudne do ustalenia. Do tej pory uważało się, że naturalnie świerk pochodzenia południowego występuje najdalej na północ po Wzniesienia Rawskie. Jednak ostatnie badania mitochondrialnego DNA wskazują, że granica ta może być przesunięta o ok. 100 km bardziej na północ. Na terenie Nadleśnictwa Skrwilno (RDLP Toruń), w okolicach Lipna i Sierpca znaleziono czyste drzewostany świerkowe pochodzenia karpackiego. Na naturalne pochodzenie świerka w tym rejonie wskazywał już Jedliński w swoim opracowaniu z 1928 roku. Badane w tym czasie przez niego pniaki ściętych świerków były w wieku ok. 110 lat, czyli drzewa pochodziły z początku dziewiętnastego wieku, a więc okresu, kiedy jeszcze do lasów nie wprowadzano na większą skalę materiału obcego pochodzenia. Zwłaszcza na tych terenach, które wtedy znajdowały się w zaborze rosyjskim, gdzie prowadzono z reguły ekstensywną gospodarkę leśną. Na możliwą, naturalną kolonizację tego terenu przez świerka po ostatnim zlodowaceniu wskazują również badania palinologiczne. Z praktycznego punktu widzenia, bardzo interesujące są badania mające na celu określenie pochodzenia świerka na Pojezierzu Kartuskim. Co do pochodzenia świerka pospolitego na tym terenie, przeważa pogląd, oparty głównie na wynikach badań palinologicznych, że został on tu posadzony sztucznie. Przeprowadzone badania, wykazały obecność wszystkich trzech, pod względem pochodzenia, fragmentów mitochondrialnego DNA. Zmieszanie drzew wszystkich trzech pochodzeń stwierdzono w 12 na 26 przebadanych drzewostanach. Najwięcej drzew, średnio 59%, było pochodzenia alpejskiego. Drzewa pochodzenia alpejskiego znaleziono we wszystkich drzewostanach, jednak z bardzo różną częstością występowania, od 6% aż do 90%. Znacznie mniej

15 16 Andrzej Lewandowski było drzew pochodzenia karpackiego, średnio 30%. Wśród wszystkich zbadanych drzew, najmniej było drzew pochodzenia północno-wschodniego, bo tylko 11%. Duży udział świerka alpejskiego na terenie Pojezierza Kartuskiego nie jest dużym zaskoczeniem. Teren ten znajduje się poza przyjmowanym, naturalnym zasięgiem świerka w Polsce. W związku z tym, należy założyć, że w większości został on tu wprowadzony sztucznie przez człowieka. W dziewiętnastym i na początku dwudziestego wieku na tych terenach gospodarowali leśnicy niemieccy, którzy prowadzili intensywną gospodarkę leśną. Jak już wspomniano wcześniej, jest to także okres, w którym preferowano uprawę świerka. Na dużą skalę działały już wtedy firmy nasienne, rozprowadzające materiał po całej Europie, nie zwracając zazwyczaj uwagi na jego pochodzenie. W owym czasie, nie prowadzono jeszcze badań proweniencyjnych i nie zdawano sobie sprawy jakim ryzykiem hodowlanym może być obarczony materiał obcego pochodzenia, niedopasowany do warunków klimatycznych miejsca uprawy. Większość działających firm było firmami niemieckimi bądź austriackimi. W związku z tym można sądzić, że w większości, w obrocie handlowym były nasiona świerka najłatwiejsze dla nich do pozyskania, a więc te, które były pochodzenia alpejskiego. Z podobną sytuacją mamy do czynienia na terenie Nadleśnictwa Gołdap, które chociaż znajduje się w granicach naturalnego zasięgu świerka północno-wschodniego, to posiada duży udział posadzonego sztucznie świerka pochodzenia alpejskiego. W kilku drzewostanach Nadleśnictwa Kartuzy, obok świerka pochodzenia alpejskiego, niewątpliwie obcego pochodzenia, występuje także świerk pochodzenia północno-wschodniego, niekiedy nawet do 88%. Wydaje się prawdopodobne, że w niektórych przypadkach może być on naturalnego pochodzenia. Nadleśnictwo Kartuzy znajduje się przecież w bezpośrednim sąsiedztwie uznawanej dzisiaj za naturalną zachodniej granicy świerka północno-wschodniego i jest wysoce prawdopodobne, że forpoczty naturalnej migracji świerka mogły przed setkami lat dotrzeć na teren Pojezierza Kartuskiego. Nie rozstrzygając ostatecznie kwestii o ewentualnej, częściowej rodzimości świerka w Nadleśnictwie Kartuzy, należy zaznaczyć, że jest on dzisiaj na tym terenie dobrze zadomowionym, odnawiającym się w sposób naturalny, ważnym z gospodarczego punktu widzenia gatunkiem. Wiele faktów świadczy też o tym, że Pojezierze Kartuskie znajduje się w granicach potencjalnego, naturalnego zasięgu świerka pospolitego. Jak się uważa sztuczne poszerzenie areału uprawy tego gatunku na omawianym obszarze należy potraktować jako przyspieszenie jego naturalnej ekspansji. Przeprowadzone do tej pory badania z wykorzystaniem mitochondrialnego markera DNA pozwalają na następujące podsumowania, dotyczące pochodzenia świerka w Polsce: na terenie Polski występują naturalnie dwie, odrębnego pochodzenia, pule genowe świerka pospolitego, północno-wschodnia (borealna) i południowa (karpacka), tak zwaną strefę bezświerkową, rozdzielającą dwa odrębne zasięgi świerka na Niżu Polskim, należy raczej uważać za rejon o rozrzedzonym występowaniu świerka. Obszar ten jest miejscem naturalnego spotkania i wymieszania się dwóch odrębnych pul genowych (borealnej i karpackiej), ale pochodzenie pasa jest sztuczne związane z działalnością człowieka. Niewątpliwie występują tu resztki naturalnych populacji świerkowych. Być może warto zainteresować się nimi z hodowlanego punktu widzenia. Już na początku dwudziestego wieku Jedliński wykazał dodatni wpływ świerka na kształtowanie drzewostanów sosnowych na tym terenie. Na obszarze strefy bezświerkowej występują także liczne populacje założone przez człowieka z materiału obcego pochodzenia, w dużej mierze reprezentującego populacje świerka alpejskiego, również obszar Puszczy Białowieskiej jest miejscem naturalnego wymieszania się dwóch odrębnych pul genowych świerka pospolitego, dlatego południową granicę północno-wschodniego zasięgu świerka należy przesunąć na północ, poza rejon Puszczy Białowieskiej, północna granica południowego zasięgu świerka przebiega przez Nadleśnictwo Skrwilno, a więc ok. 100 km bardziej na północ, niż do tej pory sądzono, na terenie naszego kraju, na dużą skalę, w sposób niekontrolowany, wprowadzono świerka obcego pochodzenia. Świerk nielokalnego pochodzenia może występować nawet w mikroregionach matecznych, które zostały utworzone z myślą o ochronie lokalnych ekotypów oraz wśród drzew matecznych.

16 Małgorzata Sułkowska Jan Łukaszewicz Zakład Hodowli i Genetyki Drzew Leśnych, Instytut Badawczy Leśnictwa Historia poglądów na temat zasięgu buka zwyczajnego w świetle badań molekularnych Obecny zasięg występowania buka zwyczajnego na terenie Polski ukształtowany został w wyniku zlodowaceń oraz działalności człowieka. W pierwszym etapie historię wędrówki buka na ziemie polskie poznano dzięki badaniom paleobotanicznym, a w szczególności analizom pyłkowym i makroszczątków wydobywanych z pokładów torfowych. Badania genetyczne potwierdziły dotychczasową wiedzę i dostarczyły dużo nowych informacji pokazujących drogi migracji gatunku, znaczące interakcję genotypu ze środowiskiem widoczną w różnym wzroście tej samej populacji w odmiennych warunkach siedliskowych. Wykazano też niewielkie zróżnicowanie między populacjami i dużą zmienność wewnątrzpopulacyjną. Wyniki tych badań mają istotne znaczenie dla gospodarki leśnej i ochrony przyrody w ekosystemach leśnych z udziałem tego gatunku. Krótka historia poglądów na temat zasięgu buka zwyczajnego w świetle badań przyrodniczych i paleobotanicznych Buk zwyczajny należy do podstawowych gatunków lasotwórczych w Polsce. Występuje na 5,5% powierzchni leśnej kraju i ma udział 6,8% ogólnej miąższości drewna. Rozmieszczeniem buka nauka zajęła się pod koniec XIX wieku, a rozwój metod analiz pyłkowych w pierwszej połowie XX wieku doprowadził do powstania map zawartości pyłku buka w skali przestrzennej i czasowej obejmującej wędrówkę gatunku na ziemie polskie po ostatnim zlodowaceniu. W roku 1912, prof. M. Raciborski wykreślił granicę występowania buka na ziemiach polskich (rys. 1). Nazwał ją kresem północno-wschodnim. Było to pierwsze, powszechnie przyjęte opracowanie naukowe przedstawiające w aspekcie historycznym i przyrodniczym granice rozmieszczenia buka. Według Raciborskiego buk występował naturalnie na terenie całej obecnej Polski z wyjątkiem skrawka północno-wschodniego obejmującego w przybliżeniu teren obecnej RDLP Białystok. Tak wytyczony zasięg zamieszczony był w Encyklopedii Polskiej i długie lata był podstawą do rozważań naukowych na temat występowania tego gatunku. Rozmieszczeniem buka na terenie Polski zajmowało się wielu naukowców i w opublikowanych pracach na podstawie analiz dokumentów historycznych i badań paleobotanicznych przedstawili oni autorskie koncepcje występowania tego gatunku w czasach historycznych i obecnie. Znane są prace polskich badaczy m.in.: Szafera, Ralskiej-Jasiewiczowej i Środonia. Część autorów kreśląc obszary naturalnego występowania buka w czasach współczesnych nie brała pod uwagę wpływu człowieka na powstanie obszaru bezbukowego w środkowej i środkowo-wschodniej Polsce, a szczególnie na Mazowszu. W wyniku działalności rolniczej, a szczególnie gospodarki wypaleniskowej trwającej ponad dwa tysiące lat, obszar występowania tego gatunku został

17 18 Małgorzata Sułkowska, Jan Łukaszewicz Rys. 1. Zasięg buka (nazwany kresem północnowschodnim) i innych gatunków na ziemiach polskich wg Raciborskiego (1912) zredukowany, na wielu stanowiskach buk został niemal wyrugowany. Świadczą o tym prace naukowe potwierdzające występowanie rodzimego buka na tym obszarze od wieków. Niedziałkowski w pracy z 1931 roku opisuje obecność drzewostanów z udziałem tego gatunku na terenie Nadleśnictwa Skierniewice i stawia tezę, że stosowanie rębni zupełnej i regulacja serwitutów znacznie ograniczyły obszar jego występowania. Buk przywędrował wraz z jodłą do Polski w okresie atlantyckim lat temu, a jego rola lasotwórcza jest szczególnie znacząca w okresie subatlantyckim, który zaczął się 4500 lat temu i trwa do dzisiaj. Jest gatunkiem, któremu odpowiada łagodny klimat morski. Klimat kontynentalny z ekstremalnymi mrozami i późnymi przymrozkami nie sprzyja zasiedlaniu takich obszarów przez buka. W warunkach klimatu przejściowego Polski, wraz ze wzrostem wpływu klimatu kontynentalnego drzewa narażone są na duże szkody mrozowe i przymrozkowe. Przykładem może być zima na przełomie lat 1928 i 1929, kiedy buki zamarły na znacznym obszarze Polski. Analizy zawartości pyłku buka w pokładach torfu w Europie, wskazują na wędrówkę buka po okresie lodowcowym na teren Polski, z dwóch kierunków: z jednej strony z Półwyspu Bałkańskiego, a z drugiej strony z Półwyspu Apenińskiego i Iberyjskiego. Na terenie kraju buk wkraczał

18 Historia poglądów na temat zasięgu buka zwyczajnego w świetle badań molekularnych 19 obniżeniami w pasmach górskich przez Bramę Morawską i Przełęcz Dukielską w Karpatach oraz przez Bramę Lubawską w Sudetach. Po przekroczeniu pasma gór buk przemieszczał się na zachód, północ i powoli w kierunku wschodnim. Praktycznie cały obszar kraju był terenem ekspansji buka i tylko warunki siedliskowe i ostry klimat kontynentalny na północnym wschodzie decydowały o jego obecności i stopniu udziału w składzie gatunkowym drzewostanów. Działalność człowieka i ograniczenia klimatu kontynentalnego związane z przymrozkami i mrozami na terenie Mazowsza, Kurpi i północnowschodniej Polski oraz układ stosunków glebowych w dawnych pradolinach rzek Wisły i Warty, doprowadziły do powstania dwóch obszarów: występowania buka górsko-wyżynnego i pomorskiego. Wyznaczony przez Szafera i powszechnie przyjęty obszar bezbukowy ani obecnie, ani w ostatnich wiekach nie był pozbawiony naturalnych stanowisk tego gatunku. Wielu autorów uważa, że rodzaj Fagus w Europie Środkowej i Zachodniej zaznaczył swój udział dwukrotnie w historii rozwoju zbiorowisk leśnych tych obszarów. Pierwszy raz stwierdzono jego obecność w neogenie trzeciorzędu na podstawie analiz kopalnych ziaren pyłków, szczątków liści, owoców i drewna. W Polsce, Środoń w latach 60. XX wieku, badał obecność pyłku buka w 61 stanowiskach osadów neogeńskich. Szczególnie duże ilości wykrył w Kotlinie Nowotarsko-Orawskiej, na Dolnym Śląsku i na Pojezierzu Dobrzyńskim. Ochłodzenie klimatu ograniczyło występowanie buka w zbiorowiskach leśnych Europy na przełomie trzecio- i czwartorzędu, aż do czasów holocenu. Podczas okresów zlodowacenia ostoje buka w Europie znajdowały się w górskich regionach południowej części kontynentu. Według oceny Szafera w latach 30-tych ubiegłego stulecia po ustąpieniu zlodowacenia, buk powtórnie pojawił się na terenie obecnej Polski z kierunku południowo-wschodniego (prawdopodobnie z ostoi w południowej części Wschodnich Karpat lub/i Besarabii). Jego zdaniem Fagussylvatica L. początkowo posuwał się wzdłuż łuku Karpat, a następnie przez Bramę Morawską w kierunku Sudetów. W ten sposób zasiedlił polską część Karpat i Sudetów, a następnie tereny nizinne na północy i dotarł do linii Bałtyku. Powszechnie znane są opracowania pod kierunkiem prof. Ralskiej-Jasiewiczowej, która analizowała zawartość pyłku buka na terenie Polski w okresie ostatnich ok lat, tj. od momentu ustąpienia lodowców do czasów obecnych. Najnowsze opracowania przedstawiające izolinie jednakowych zawartości pyłku buka, np. ponad 1500 lat temu (rys. 2), pozwalają stwierdzić, że buk był w różnym udziale w składzie gatunkowym drzewostanów na terenie praktycznie całej Rys. 2. Mapa izopolowa obecności pyłku buka 1500 lat BP (czyli przed rokiem 1950) na terenie Polski (Ralska-Jasiewiczowa 2004)

19 20 Małgorzata Sułkowska, Jan Łukaszewicz Polski. Ralska-Jasiewiczowa uważa, że buk przybył do Polski nie z jednego a kilku refugiów, w których zachował się na południu Europy podczas okresu zlodowacenia. Około 5000 BP buk zaczął rozprzestrzeniać się z południa i południowego zachodu w obrębie Karpat i prawdopodobnie przez Beskid Niski i Bramę Morawską lub wzdłuż sąsiednich pasm. Tak więc buk pochodzący z tego refugium mógł zasiedlić także Sudety. Jej zdaniem buk w Sudety mógł przybyć też ze wschodu do 5000 BP. Istnieją jej zdaniem też dowody na migrację buka z północnego zachodu, wzdłuż pojezierzy i stamtąd ekspansję na wschód i południe. Okres sprzed około 1000 lat zaznaczył się maksymalnie dużym zasięgiem buka (większym, niż obecny) i wyraźnie dużym udziałem w Górach Świętokrzyskich w stosunku do otaczających je regionów. Zmienność genetyczna buka w badaniach molekularnych na terenie Polski Gömöryi współautorzy na podstawie badań zmienności białek izoenzymatycznych, jako pierwsi pod koniec ubiegłego wieku zauważyli, że buk na teren Europy przywędrował z jednego refugium lub kilku refugiów, nie zróżnicowanych genetycznie, za wyjątkiem obszaru południowych Włoch i Bałkanów. Wskazują oni, że główne refugium buka w Europie podczas okresu zlodowacenia znajdowało się w południowej części Gór Dynarskich (Słowenia) oraz południowej Francji i południowej części Karpat. Ostatnie interdyscyplinarne badania dotyczące szlaków migracji gatunku prowadzone przez Magrii zespół, łączące wyniki badań paleontologicznych pyłku i fragmentów roślin oraz analiz molekularnych na podstawie analiz markerów białek enzymatycznych i DNA jądrowego oraz chloroplastowego, potwierdzają ich wyniki (rys. 3). Wskazują na ograniczenie występowania buka do obszarów środkowej i południowej części Włoch, południowo-wschodniej Francji, Słowenii i możliwe, że także południowej części Moraw, które stanowiły centra migracji na teren Europy Centralnej i Północnej oraz Półwyspu Bałkańskiego i północnej części Iberyjskiego refugia basenu śródziemnomorskiego Europy. Aktualna struktura genetyczna populacji buka została ukształtowana pod wpływem wielu, często przeciwstawnie działających czynników, związanych między innymi z przepływem genów między populacjami. Lokalne środowi- Rys. 3. Rozmieszczenie geograficzne chloroplastowych markerów DNA: (a) (PCR-RFLP), (b) mikrosatelitarnych (dane dla obszaru Włoch na podstawie Vettori i inni., 2004) W: Magri i inni 2006

20 Historia poglądów na temat zasięgu buka zwyczajnego w świetle badań molekularnych 21 sko wzrostu selekcjonuje populacje buka poprzez eliminację osobników nieprzystosowanych do panujących w nim warunków wzrostu, co wpływa na zmianę struktury genetycznej danej populacji. Decydujące znaczenie na obecny stan zasobów genowych buka miały zmiany klimatyczne w czwartorzędzie, które ograniczyły występowanie buka do niewielkich refugiów w okresie zlodowacenia. Istnienie takich refugiów Fagussylvatica L. w Europie potwierdzono na podstawie analiz izoenzymatycznych oraz zróżnicowania chloroplastowego DNA, które jest dziedziczone u buka w linii matecznej. W Polsce mamy stosunkowo bogatą wiedzę na temat zmienności i zróżnicowania tego gatunku. Między innymi badania IBL objęły 25 populacji buka w ramach naturalnego zasięgu występowania gatunku przeprowadzone wspólnie z Uniwersytetem Technicznym z Zvolen (Słowacja), a także w ramach projektu oceny kondycji gatunku na granicy zasięgu szacowano zmienność genetyczną 18 populacji. Badania innych 30 populacji buka przeprowadzono na powierzchni proweniencyjnej w Bystrzycy Kłodzkiej. Analizy prowadzono dla pokolenia matecznego oraz potomnego z wykorzystaniem markerów izoenzymatycznych, także markerów molekularnych DNA (RAPD i mikrosatelitarnych). Badania te uszczegółowiono dla 6 pochodzeń z tej powierzchni poprzez zastosowanie 3 markerów chloroplastowych oraz wybranych markerów jądrowych. Badania 9 pochodzeń buka, reprezentujące zwarty zasięg gatunku, dotyczące struktury genetycznej pokolenia matecznego i potomnego, w oparciu o charakterystykę glebową siedlisk, potwierdziły potrzebę wyróżnienia ekotypów glebowych. Wszystkie cytowane powyżej badania potwierdzają mozaikowy, ekotypowy charakter zmienności genetycznej buka w Polsce. Istnieje potrzeba przeprowadzenia oceny zróżnicowania gatunku poza granicami jego gromadnego występowania, szczególnie na terenach Polski, gdzie odnawia się naturalnie. Prowadzone dotychczas badania zróżnicowania genetycznego buka w Polsce na podstawie analiz molekularnych oraz białek enzymatycznych wykazały: nieznaczne zubożenie genetyczne populacji buka z północnej Polski w stosunku do południowych, obraz zróżnicowania populacji buka w Polsce, który nie umożliwia wydzielenia regionów geograficznych o podobnym poziomie zmienności genetycznej, mozaikowy charakter zmienności genetycznej gatunku, który wskazuje na jego siedliskowy i lokalny charakter zróżnicowania.