RECENZJA rozprawy doktorskiej mgr Karoliny Wasik Analiza funkcjonalna «sierocego» białka regulatorowego Rv3143 u Mycobacterium

Transkrypt

1 Łódź, dnia r. Prof. dr hab. Katarzyna Lisowska Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii RECENZJA rozprawy doktorskiej mgr Karoliny Wasik Analiza funkcjonalna «sierocego» białka regulatorowego Rv3143 u Mycobacterium Przedstawiona mi do oceny praca doktorska wykonana została pod kierunkiem dr hab. inż. Aliny Kunickiej-Styczyńskiej, prof. PŁ, z Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej i prof. dr hab. Jarosława Dziadka z Pracowni Genetyki i Fizjologii Mycobacterium Instytutu Biologii Medycznej PAN w Łodzi. Promotorem pomocniczym jest dr Renata Płocińska z Pracowni Genetyki i Fizjologii Mycobacterium Instytutu Biologii Medycznej PAN w Łodzi. Tematyka badań podjętych w pracy dotyczyła określenia roli potencjalnych białek regulatorowych o nieznanej do tej pory funkcji u Mycobacterium, z wykorzystaniem modelu prątków patogennych i saprofitycznych. Mgr Karolina Wasik podjęła się realizacji bardzo ważnego tematu, ponieważ M. tuberculosis są czynnikiem etiologicznym gruźlicy, która pozostaje jedną z najgroźniejszych chorób zakaźnych, umieszczanych obok AIDS i malarii na czele chorób infekcyjnych zagrażających zdrowiu człowieka. Szacuje się, że obecnie około 1/3 ludności na świecie jest zainfekowana M. tuberculosis, a do rozwoju gruźlicy dochodzi u 5-10% osób z tej populacji, u pozostałych zaś infekcja przybiera postać bezobjawową. Wg danych WHO z powodu gruźlicy umiera ok. 1,6 mln osób rocznie. Zagrożenie gruźlicą rośnie głównie z powodu narastającej częstości izolowania leko- i wielolekoopornych szczepów M. tuberculosis, braku nowych leków przeciwgruźliczych, koinfekcji prątków M. tuberculosis Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii UŁ tel. (48) ; fax (48) ul. Banacha 12/16, PL Łódź, katarzyna.lisowska@biol.uni.lodz.pl

2 2 i wirusa HIV oraz niewystarczającej efektywności protekcyjnej stosowanej u ludzi szczepionki BCG. W związku z tym poszukiwanie nowych, skutecznych związków przeciwprątkowych oraz alternatywnych, docelowych tarcz dla nowych tuberkulostatyków jest niezwykle istotne. Jednym z kierunków aktualnych badań jest poznanie mechanizmów funkcjonowania systemów transdukcji sygnału, które umożliwiają komórkom drobnoustrojów szybką adpatację do efektywnego zasiedlania organizmów gospodarza. świetnie wpisuje się w ten nurt badań. Praca doktorska mgr Karoliny Wasik U M. tuberculosis zidentyfikowano bowiem 11 dwuskładnikowych systemów transdukcji sygnału oraz siedem białek tzw. sierocych o potencjalnej funkcji regulatorowej, dla których nieznane są białka spełniające rolę przekazywania sygnału z zewnątrz komórek. Wyjaśnienie roli tych białek w fizjologii i patogenezie Mycobacterium jest niezwykle istotne. Doktorantka podjęła się charakterystyki jednego z białek sierocych M. tuberculosis, białka Rv3143 oraz jego odpowiednika u M. smegmatis., MSMEG_2064. Wykorzystanie w badaniach modelowego odpowiednika M. tuberculosis - saprofitycznego, szybkorosnącego szczepu M. smegmatis uważam za celowe i w pełni uzasadnione, biorąc pod uwagę wysoką patogenność prątków gruźlicy i ich powolny wzrost oraz wysoki stopień podobieństwa białka MSMEG_2064 i Rv3143. Podjęta przez Doktorantkę tematyka wymagała zastosowania bogatego warsztatu metodycznego, w tym technik mikrobiologicznych, biochemicznych, inzynierii genetycznej, czy immunologicznych, z czym mgr Karolina Wasik świetnie sobie poradziła. Rozprawa doktorska mgr Karoliny Wasik obejmuje 143 strony, z podziałem tekstu na rozdziały, o układzie typowym dla prac doświadczalnych. Praca ilustrowana jest 57 rycinami i 10 tabelami, zawiera cytaty z 126 pozycji literaturowych. Pracę doktorską mgr Karoliny Wasik otwiera Streszczenie w języku angielskim. Wstęp pracy zawiera dobrze dobrany, aktualny materiał literaturowy, na podstawie ktorego Autorka przedstawiła dotychczasowy stan wiedzy z zakresu prowadzonych badań i wykazała celowość ich prowadzenia. Doktorantka scharakteryzowała bakterie z rodzaju Mycobacterium, w tym M. tuberculosis będące czynnikiem etiologicznym gruźlicy, opisała także epidemiologię i leczenie tej niezwykle groźnej choroby. Dokonała także wprowadzenia w zagadnienia dotyczące systemów przekazywania sygnału u drobnoustrojów, w tym dwukomponentowych systemów transdukcji sygnału u Mycobacterium, włączając opis dotychczasowych badań w zakresie charakterystyki białka Rv3143. Z obowiązku recenzenta chciałam zauważyć pewne niefortunne sformułowania w tej części pracy, jak np. gorączka o niskiej temperaturze.

3 3 Cel pracy został przez Doktorantkę sformułowany w postaci jednego celu głównego, zakładającego poznanie roli sierocego białka regulatorowego Rv3143 w komórkach M. tuberculosis oraz jego homologa MSMEG_2064 u M. smegmatis. Został on rozłożony na cele cząstkowe, będące jednocześnie etapami pracy. Jeden z celów analiza spektrometrii mas i identyfikacja potencjalnych partnerów dla białka Rv3143 powinien być raczej sformułowany jako identyfikacja potencjalnych partnerów dla białka Rv3143 z wykorzystaniem techniki tandemowej spektrometrii mas. Następne dwa rozdziały Materiały oraz Metody są przedstawione w sposób bardzo czytelny i wyczerpująco opisane. Na podkreślenie zasługuje liczba szczepów i wektorów stosowanych w pracy, co świadczy o dużym nakładzie pracy, którą wykonała Doktorantka. Zasadniczy rozdział pracy Wyniki zawiera dane eksperymentalne przedstawione graficznie lub tabelarycznie, które zostały wyczerpująco omówione. W pierwszej części tego rozdziału Doktorantka przedstawiła wyniki badań dotyczące identyfikacji białek zdolnych do tworzenia kompleksów z białkiem Rv3143, z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas oraz narzędzi bioinformatycznych. Dane te dostarczyły cennych informacji na podstawie, których wytypowano białka Nuo, a w szczególności NuoD (białko należące do kompleksu dehydrogenazy NADH typu I, zaangażowanej w proces fosforylacji oksydacyjnej) jako potencjalne białka partnerskie dla białka Rv3143. Oddziaływania pomiędzy tymi białkami potwierdzono, wykorzysując metodę koimmunoprecypitacji. Kluczowym elementem pracy była wieloetapowa i skomplikowana konstrukcja ukierunkowanych mutantów M. tuberculosis i M. smegmatis, pozbawionych funkcjonalnych kopii genów rv3143 i msmeg_2064, w celu określenia znaczenia białek Rv3143 i MSMEG_2064 w fizjologii komórek Mycobacterium. Mgr Karolina Wasik wykazała, że białka te nie są niezbędne dla przeżycia prątków w warunkach in vitro. Następnie Doktorantka dokonała szerokiej analizy porównawczej obu mutantów i szczepów wyjściowych, analizując tempo wzrostu i przeżywalność komórek w różnych warunkach hodowli, a także, w przypadku mutanta M. smegmatis, zdolność do ruchu, tworzenia biofilmu czy tworzenia agregatów komórkowych. Badania obejmowały także określenie wrażliwości badanych szczepów na wybrane antybiotyki oraz związki zaburzające proces fosforylacji oksydacyjnej i potencjał membranowy, które Doktorantka trafnie dobrała, opierając się na wcześniejszych wynikach sugerujących oddziaływanie białka Rv3143 z białkami wchodzącymi w skład kompleksu I łańcucha oddechowego. Na podstawie przeprowadzonej charakterystyki fenotypowej, Doktorantka wykazała istotne różnice: brak funkcjonalnego białka MSMEG_2064 powodował zwolnienie tempa wzrostu M. smegmatis w obecności reaktywnych form azotu. Natomiast brak funkcjonalnego białka Rv3143 powodował wzrost oporności szczepu M. tuberculosis na walinomycynę, antybiotyk obniżający potencjał elektrochemiczny

4 4 komórek. Wykazano także wyższą aktywność metaboliczną obydwu mutantów, powiązaną ze wzmożoną aktywnością łańcucha oddechowego, w porównaniu do szczepów referencyjnych. Dlatego też w dalszej części Doktorantka ukierunkowała badania właściwości fizjologicznych mutanta msmeg_2064 na procesy oddychania komórkowego. W tej części pracy Doktorantka podjęła udaną próbę konstrukcji mutantów M. smegmatis Mc i msmeg-2064 z wyciszoną ekspresją genu ndh, kodującego dehydrogenazę NADH typu II, z wykorzystaniem systemu CRISPR-Cas. Badania przeżywalności otrzymanych szczepów w różnych warunkach dostępu do tlenu potwierdziły znaczenie białka MSMEG_2064 dla prawidłowego funcjonowania kompleksu dehydrogenazy NADH typu I. Rozdział Dyskusja podsumowuje uzyskane wyniki w świetle dotychczasowych publikacji z tego zakresu. Rozdział ten jest dobrze napisany i świadczy o dojrzałości naukowej i doskonałej orientacji Autorki w zakresie probelamtyki badawczej będącej obiektem Jej zainteresowań. Rozdział Wnioski - Uzyskane przez Doktorantkę wyniki stały sie podstawą do opracowania wniosku głównego, na podstawie obserwacji sformułowanych w sześciu punktach, będących podsumowaniem najważniejszych wyników. Pracę zamyka Streszczenie i Literatura, zawierająca spis 126 pozycji bibliograficznych obejmujujących dobrze dobrane publikacje naukowe, w większości z ostatnich kilku lat. Mgr Karolina Wasik uzyskała w swoich badaniach wiele bardzo interesujących wyników, w podsumowaniu zwrócę uwagę tylko na najważniejsze osiągnięcia Doktorantki: - Wykazanie, że badane geny rv3143 i msmeg-2064 nie są niezbędne dla przeżycia komórki, co było możliwe dzięki konstrukcji odpowiednich mutantów Mycobacterium, - Zidentyfikowanie oddziaływań pomiędzy białkiem Rv3143 a białkiem NuoD, będącym składnikiem kompleksu dehydrogenazy NADH typu I, - Wykazanie funkcji białka Rv3143 i MSMEG-2064 w procesie oddychania komórkowego. W tym miejscu chciałabym prosić Doktorantkę o uzasadnienie wyboru właśnie białka Rv3143 do analiz. Proszę też o wyjaśnienia na jakiej podstawie Doktorantka stwiedziła, że brak białka MSMEG-2064 nie wpływa ani na ilość, ani na jakość glikolipidów obecnych w ścianie komórkowej. Czy Doktorantka próbowała dokonać analizy glikolipidów ściany komórkowej otrzymanych mutantów i szczepów wyjściowych Mycobacterium, biorąc pod uwagę, że lipidom Mycobacterium jest jednym z ważnych czynników oporności tych drobnoustrojów? Ponadto proszę o komentarz do stwierdzenia, że test Microplate Alamar Blue pozwala na analizę jedynie

5 5 aktywności bakteriobójczej. Z obowiązku recenzenta chciałabym także zwrócic uwagę na małą czytelność rycin i tabel. W podsumowaniu recenzji stwierdzam, że opiniowaną rozprawę doktorską mgr Karoliny Wasik oceniam bardzo wysoko. Pod względem celowości podjęcia tematu, a także wykorzystanych metod analitycznych i uzyskanych wyników praca w pełni spełnia wymogi stawiane rozprawom na stopień naukowy doktora, przewidziane w Ustawie z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (z późn. zmianami). Wszystkie uwagi i komentarze mają charakter dyskusyjny i nie umniejszają wartości merytorycznej pracy. Bogata, co do różnorodności przeprowadzonych analiz część eksperymentalna badań została prawidłowo zaplanowana i metodycznie odpowiednio wykonana przy wykorzystaniu świetnego doświadczenia Promotorów tej rozprawy. Przedstawiona rozprawa zawiera istotne elementy nowości naukowej, a uzyskane wyniki poszerzą wiedzę z zakresu fizjologii i genetyki Mycobacterium. Wnoszę zatem do Wysokiej Rady Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej o dopuszczenie mgr Karoliny Wasik do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Pragnę także dodać, że biorąc pod uwagę wysoką jakość naukową pracy, nowatorskie koncepcje badawcze, bardzo dobry i bogaty warsztat badawczy i uzyskane wyniki zwracam się do wysokiej Rady Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej z wnioskiem o wyróżnienie pracy doktorskiej stosowną nagrodą. Prof. dr hab. Katarzyna Lisowska