Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach Politechnika Gdańska Polskie Towarzystwo Nauk o Rozdzielaniu CAMERA SEPARATORIA.

Transkrypt

1 Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach Politechnika Gdańska Polskie Towarzystwo Nauk o Rozdzielaniu CAMERA SEPARATORIA Volume 9 (1) 2017 pamięci prof. Edwarda Soczewińskiego

2 Siedlce University of Natural Sciences and Humanities Gdansk University of Technology Polish Separation Science Society Volume 9, Number 1 / June 2017 Siedlce 2017

3 Honorary Editor: Edward Soczewiński Editors-in-Chief: Bronisław K. Głód (Siedlce) Marian A. Kamiński (Gdańsk) Editors: Grzegorz Boczkaj (Gdańsk) Tadeusz Dzido (Lublin) Bronisław K. Głód (Siedlce) Marian Kamiński (Gdańsk) Paweł Piszcz (Siedlce) Piotr M. Słomkiewicz (Kielce) Piotr Stepnowski (Gdańsk) Monika E. Waksmundzka-Hajnos (Lublin) Mieczysław Sajewicz (Katowice) Andrzej Stołyhwo Language Editor: John Podgórski Technical Editors: Paweł Piszcz Reviewers: Monika Asztemborska Grzegorz Boczkaj Bronisław K. Głód Marian Kamiński Paweł Piszcz Mieczysław Sajewicz Piotr M. Słomkiewicz Monika E. Waksmundzka-Hajnos Editorial office s address: Department of Analytical Chemistry, Institute of Chemistry Siedlce University of Natural Sciences and Humanities ul. 3 Maja 54, Siedlce tel. :+48 (25) camera.separatoria@gmail.com Department of Chemical and Process Engineering, Chemical Faculty Gdansk University of Technology Gabriela Narutowicza 11/12 Str., Gdańsk, phone: +48 (58) marian.kaminski@pg.gda.pl

4 SPIS TREŚCI (CONTENTS) Prace oryginalne / Original papers Agata MICIAK, Malwina MOMOTKO, Maksymilian PLATA-GRYL, Grzegorz BOCZKAJ Badania właściwości asfaltenowej fazy stacjonarnej do rozdzielania mieszanin związków optycznie czynnych techniką chromatografii gazowej Paweł PISZCZ, Paulina BOGUSZEWSKA, Bronisław K. GŁÓD Właściwości antyoksydacyjne wybranych preparatów roślinnych Maksymilian PLATA-GRYL, Grzegorz BOCZKAJ Badania właściwości sorpcyjnych faz stacjonarnych na bazie frakcji asfaltenowych do rozdzielania mieszanin z zastosowaniem chromatografii gazowej Paweł PISZCZ, Iwona MARCINIAK, Bronisław K. GŁÓD Właściwości antyoksydacyjne herbat Instrukcje dla Autorów..46 Instructions for Authors and Editorial Policy Od Redakcji... 52

5 CAMERA SEPARATORIA Volume 9, Number 1 / June 2017, pp Agata MICIAK, Malwina MOMOTKO, Maksymilian PLATA-GRYL, Grzegorz BOCZKAJ* Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej ul. Gabriela Narutowicza 11/ Gdańsk, Poland *Autor do korespondencji, grzegorz.boczkaj@gmail.com Badania właściwości asfaltenowej fazy stacjonarnej do rozdzielania mieszanin związków optycznie czynnych techniką chromatografii gazowej Streszczenie: W pracy przedstawiono wyniki badań nad możliwością zastosowania asfaltenów jako chiralnej fazy stacjonarnej do chromatografii gazowej. Wyniki uzyskane dla fazy asfaltenowej porównano z wynikami uzyskanymi poprzez zastosowanie komercyjnie dostępnej chiralnej fazy stacjonarnej. Badania wykaz ały, że frakcja asfaltenowa posiada właściwości umożliwiające uzyskanie rozdzielenia mieszanin związków optycznie czynnych. Słowa kluczowe: asfalteny, chiralne rozdzielanie, chiralne fazy stacjonarne (CSP), chromatografia gazowa (GC) The research on properties of asphaltene stationary phase to separate mixtures of optically active compounds with the use of gas chromatography technique Abstract: The paper presents a results of research on the possibility of application of asphaltenes as a chiral stationary phase for gas chromatography. The results obtained for asphaltene stationary phase were compared with results obtained using a commercially available chiral stationary phase. The research showed that asphaltene fraction has properties allowing to separate mixtures of optically active compounds. Keywords: asphaltenes, chiral separation, chiral stationary phases (CSP), gas chromatography (GC) 1. Wstęp (Introduction) Chromatografia gazowa (GC) od lat jest stosowana do rozdzielania mieszanin związków optycznie czynnych. Wysoka sprawność kolumn kapilarnych oraz duża dostępność komercyjnych faz stacjonarnych pozwoliła na opracowanie szeregu aplikacji [1, 2, 3]. Asfalteny to grupa substancji wchodzących w skład surowej ropy naftowej, stanowiących policykliczne węglowodory aromatyczne wraz z przyłączonymi, w sposób peryferyjny, łańcuchami alifatycznymi. Ze względu na występowanie w składzie cząsteczek o zróżnicowanej strukturze i złożonej budowie, w tym cząsteczek zawierających asymetryczne atomy węgla, uzasadnione jest oczekiwanie specyficznych oddziaływań, które mogą stanowić o zdolności asfaltenów do rozdzielania mieszanin związków optycznie czynnych. W 2016 roku wykazano przydatność asfaltenów jako faz stacjonarnych do GC [4]. W pracy opisano badania wykonane w celu sprawdzenia zdolności asfaltenowych faz stacjonarnych do rozdzielania mieszanin związków optycznie czynnych.

6 6 2. Część eksperymentalna (Experimental) 2.1. Materiały (Materials) W pracy korzystano z następujących odczynników: substancje wzorcowe (Sigma-Aldrich, USA): -(R)-(-)-2-butanol, -(S)-(+)-2-butanol, -(R)-2-aminoheksan, -(S)-2-aminoheksan, -(R)-(+)-α-metylobenzyloamina, -(S)-(-)-α-metylobenzyloamina, -(R)-(-)-2-aminoheptan, -(S)-(+)-2-aminoheptan, -(R)-(+)-1,1,1-trifluoroheptan-2-ol, -(S)-(-)-1,1,1-trifluoroheptan-2-ol, disiarczek węgla - CS 2 (czystość do GC, Chempur), 1-metylo-2-pirolidon - NMP (czystość do analizy, Chempur), fazy stacjonarne: -asfalteny wyizolowane z asfaltu drogowego 20/30 (Lotos Asflat sp. z o. o.) (sposób przygotowania fazy stacjonarnej i kolumny chromatograficznej pakowanej opisano w wcześniejszej pracy [4]), -Astec CHIRALDEX B-DA (Sigma-Aldrich, USA), gazy techniczne: -azot czystość 5,0 N (Linde Gas, Polska), -powietrze z generatora tzw. zerowego powietrza (Perkin Elmer) czystość 5,0 N, -wodór czystość 5,5 N z generatora wodoru (Perkin Elmer) Aparatura (Instruments) Podczas wykonywania badań korzystano z następującej aparatury: Chromatograf gazowy Clarus 500 z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID) oraz automatycznym podajnikiem próbek (Perkin Elmer, USA), oprogramowanie: TotalChrom 6.3 (Perkin Elmer, USA), Chromatograf gazowy Clarus 580 z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID) oraz automatycznym podajnikiem próbek (Perkin Elmer, USA), oprogramowanie: TotalChrom 6.3 (Perkin Elmer, USA), Generator wodoru PGX-H2 500 (Perkin Elmer, USA), Generator tzw. zerowego powietrza (ang. Zero Air Generator) N-GC3000 (Perkin Elmer, USA) Metody postępowania (Methods) Przygotowanie roztworów (Preparation of the solutions) Roztwory wzorcowe do analizy chromatograficznej sporządzono poprzez rozpuszczenie analizowanego związku chemicznego w roztworze disiarczku węgla bądź w roztworze 1-metylo-2-pirolidonu (NMP). Skład poszczególnych mieszanin przedstawiono w tabeli 1. Ze względu na przeprowadzenie analizy chromatograficznej z wykorzystaniem dwóch chromatografów gazowych z kolumną pakowaną oraz kapilarną, sporządzono dwa zestawy roztworów wzorcowych. Pobrano po 1 ml każdej sporządzonej próbki, a następnie umieszczono w fiolkach posiadających membranę, przystosowanych do automatycznych podajników próbek stosowanych chromatografów gazowych. Do każdego zestawu próbek przygotowano dodatkowe fiolki zawierające po 1 ml czystych rozpuszczalników - disiarczku węgla oraz NMP.

7 7 Tabela 1. Dane dotyczące mieszanin wzorcowych sporządzonych w celu analizy chromatograficznej. Table 1. Data concerning standard mixtures dispensed for chromatographic analysis. Numer roztworu Analizowany związek chemiczny (analit) Objętość analitu [ml] Rozpuszczalnik Objętość rozpuszczalnika [ml] 1 (R)-(-)-2-butanol 0,02 NMP 10 2 (S)-(+)-2-butanol 0,02 NMP 10 3 (R)-2-aminoheksan 0,02 CS (S)-2-aminoheksan 0,02 CS (R)-(+)-αmetylobenzyloamina 0,02 CS (S)-(-)-αmetylobenzyloamina 0,02 CS (R)-(-)-2-aminoheptan 0,02 CS (S)-(+)-2-aminoheptan 0,02 CS (R)-(+)-1,1,1- trifluoroheptan-2-ol 0,02 CS (S)-(-)-1,1,1- trifluoroheptan-2-ol 0,02 CS 2 10 Warunki analizy (Chromatographic conditions) W tabelach przedstawiono warunki pracy aparatów GC, odpowiednio wyposażonych w kolumnę chromatograficzną z fazą stacjonarną komercyjnie dostępną (Tabela 2) oraz z fazą stacjonarną w postaci frakcji asfaltenowej (Tabela 3). Tabela 2. Warunki chromatograficzne panujące podczas analizy faz a stacjonarna Astec CHIRALDEX B- DA. Table 2. Chromatographic conditions during analysis stationary phase Astec CHIRALDEX B-DA. Warunki chromatograficzne Program temperaturowy 40 C (3min) - 15 C/min C Przepływ gazu nośnego - azot (30min) 2 ml/min w trybie constant flow Przepływ wodoru przez detektor 40 ml/min FID Przepływ powietrza przez 450 ml/min detektor Temperatura FID detektora FID 220 C Temperatura dozownika 200 C Objętość dozowania 0,5 µl w trybie Split 10:1 Tabela 3. Warunki chromatograficzne panujące podczas analizy faza stacjonarna: Asfalteny wyizolowane z asfaltu 20/30. Table 3. Chromatographic conditions during analysis stationary phase: Asphaltenes isolated from asphalt 20/30. Opracowanie wyników (Data evaluation) Warunki chromatograficzne Program temperaturowy 40 C (5min) - 10 C/min C Program ciśnieniowy 180 kpa (5 min) - 5,7 kpa/min Przepływ gazu nośnego - azot około 20 ml/min Przepływ wodoru przez detektor 40 ml/min Przepływ powietrza przez 450 ml/min Temperatura detektora FID 300 C Temperatura dozownika 350 C Objętość dozowania 0,5 µl w trybie Splitless Chromatogramy rejestrowano za pomocą programu TotalChrom 6.3. Na ich podstawie odczytano wartości czasu retencji (t R ) dla poszczególnych składników mieszanin wzorcowych.

8 8 3. Wyniki i dyskusja (Results and discussion) W przypadku związków optycznie czynnych, głównym celem analizy jest sprawdzenie stopnia rozdzielenia danej mieszaniny substancji na poszczególne enancjomery R oraz S. W tym celu dokonano porównania chromatogramów zawierających piki świadczące o obecności poszczególnych enancjomerów w mieszaninie. Aby stwierdzić, że dochodzi do rozdzielenia danej mieszaniny na poszczególne składniki konieczne jest, aby różniły się one wartością czasu retencji. Dokonanie takiego porównania może opierać się na wstępnej, wizualnej ocenie graficznego nałożenia chromatogramów, zawierających piki poszczególnych enancjomerów, a następnie potwierdzeniu stopnia ich nałożenia poprzez porównanie wartości czasu retencji odczytanych dla maksimów tych pików. W ten sposób dokonano opracowania rezultatów otrzymanych w wyniku przeprowadzenia analizy określonych związków optycznie czynnych. W tabeli 4 umieszczono wyniki analizy przeprowadzonej z wykorzystaniem chromatografu gazowego z kapilarną kolumnę chromatograficzną, z fazą stacjonarną CHIRAL DEX B-DA. Natomiast w tabeli 5 umieszczono wyniki analizy wykorzystującej fazę stacjonarną na bazie asfaltenów, wypełniającą k olumnę pakowaną. Tabela 4. Wartości parametrów wynikające z opracowania wyników dla analizy chromatograficznej z wykorzystaniem kolumny kapilarnej, faza stacjonarna: Astec CHIRALDEX B-DA. Table 4. The values of parameters from the results of chromatographic analysis with the use of capillary column stationary phase: Astec CHIRALDEX B-DA. Nr próbki Nazw a analizowanego związku Czas retencji (t R) [min] Rozstęp w artości czasu retencji dla każdego zw iązku (t R) [min] Zredukow any czas retencji (t' R) [min] retencji (k) [ - ] 1 (R)-(-)-2-butanol 3,52 0,25 2,02 1,34 2 (S)-(+)-2-butanol 3,65 0,01 2,15 1,43 3 (R)-2-aminoheksan 9,92 0,01 8,42 5,61 4 (S)-2-aminoheksan 9,91 0,01 8,41 5,60 5 (R)-(+)-α-metylobenzyloamina 13,36 0,01 11,86 7,90 6 (S)-(-)-α-metylobenzyloamina 13,35 0,00 11,85 7,90 7 (R)-(-)-2-aminoheptan 11,14 0,00 9,64 6,43 8 (S)-(+)-2-aminoheptan 11,13 0,00 9,63 6,42 9 (R)-(+)-1,1,1-trifluoroheptan-2-ol 9,31 0,01 7,81 5,20 10 (S)-(-)-1,1,1-trifluoroheptan-2-ol 9,30 0,00 7,80 5,20 Współczynnik selektyw ności (α) [ - ] Różnica w artości czasu retencji dla pary enancjomerów ( t R) [min] 1,065 0,13 1,001 0,01 1,000 0,01 1,001 0,01 1,001 0,01 Tabela 5. Wartości parametrów wynikające z opracowania wyników dla analizy chromatograficznej z wykorzystaniem kolumny pakowanej, faza stacjonarna: Asfalteny wyizolowane z asfaltu 20/30. Table 5. The values of parameters from the results of chromatographic analysis with the use of packed column stationary phase: Asphaltenes isolated from asphalt 20/30. Nr próbki Nazw a analizowanego związku Czas retencji (t R) [min] Rozstęp w artości czasu retencji dla każdego zw iązku (t R) [min] Zredukow any czas retencji (t' R) [min] retencji (k) [ - ] 1 (R)-(-)-2-butanol 17,41 0,00 16,69 23,18 2 (S)-(+)-2-butanol 17,51 0,00 16,79 23,32 3 (R)-2-aminoheksan 30,65 0,09 29,93 41,56 4 (S)-2-aminoheksan 30,60 0,06 29,88 41,50 5 (R)-(+)-α-metylobenzyloamina 33,84 0,01 33,12 45,99 6 (S)-(-)-α-metylobenzyloamina 33,18 0,09 32,46 45,08 7 (R)-(-)-2-aminoheptan 27,85 0,01 27,13 37,67 8 (S)-(+)-2-aminoheptan 27,78 0,00 27,06 37,58 9 (R)-(+)-1,1,1-trifluoroheptan-2-ol 26,51 0,01 25,79 35,81 10 (S)-(-)-1,1,1-trifluoroheptan-2-ol 26,55 0,01 25,83 35,87 Współczynnik selektyw ności (α) [ - ] Różnica w artości czasu retencji dla pary enancjomerów ( t R) [min] 1,006 0,10 1,002 0,05 1,020 0,66 1,002 0,07 1,002 0,04

9 9 Rys. 1. Chromatogram powstały w wyniku nałożenia chromatogramów uzyskanych dla próbek 1,1,1-trifluoroheptan-2-olu. Fig. 1. Chromatogram formed as a result of applying chromatograms obtained for samples of 1,1,1-trifluoroheptane-2-ol. Rys. 2. Powiększenie dla maksimów piku widoczne na chromatogramie uzyskanym z nałożenia chromatogramów dla próbek 1,1,1-trifluoroheptan-2-olu przy zastosowaniu asfaltenowej fazy stacjonarnej. Fig. 2. Enlargement for peak maximums visible on chromatogram obtained from application of chromatograms for samples of 1,1,1-trifluoroheptane-2-ol with the use of asphaltenes stationary phase. Zastosowana kolumna pakowana charakteryzuje się jednak zbyt niską sprawnością, aby uzyskane rozdzielenie można było uznać za zadowalające. W tabeli 5 zaznaczono, poprzez pogrubienie i podkreślenie wartości dla par związków chemicznych, dla których ten parametr pozwala przypuszczać, że w przypadku zastosowania kolumny kapilarnej (charakteryzującej się wyższą sprawnością w porównaniu do kolumny pakowanej), zawierającej tę samą fazę stacjonarną, powinno mieć miejsce wyraźne rozdzielenie par enancjomerów. Wygenerowane piki chromatograficzne powinny być wąskie, a ich rozmycie jak najbardziej ograniczone. Dla badanego zestawu substancji chemicznych uzyskano wartości znacznie przekraczające rozstęp wyników dla dwóch powtórzeń analizy tej samej substancji chemicznej, dla 4-ech z 5-ciu par enancjomerów. Warto zauważyć, że dla badanej fazy asfaltenowej, wyraźnie wskazuje na rozdzielenie maksimów piku, czego nie stwierdzono dla komercyjnej kolumny kapilarnej z optycznie czynną fazą stacjonarną przy jednakowej (bardzo dobrej w obu przypadkach), powtarzalności wyników analizy.

10 10 4. Wnioski końcowe (Conclusions) W niniejszej pracy przedstawiono wyniki badań mające na celu sprawdzenie przydatności asfaltenów jako chiralnej fazy stacjonarnej do rozdzielania związków optycznie czynnych, techniką chromatografii gazowej. Stopień przydatności danej fazy określono na podstawie parametrów uzyskanych z analizy chromatogramów mieszanin enancjomerów poszczególnych związków c hemicznych. Wyniki analiz, otrzymane z zastosowaniem nowej asfaltenowej fazy stacjonarnej, odniesiono do rezultatów uzyskanych z analiz przeprowadzonych z wykorzystaniem komercyjnej, chiralnej fazy stacjonarnej CHIRALDEX B -DA. Badania wykazały, że współczynniki selektywności dla poszczególnych par enancjomerów poddanych analizie z wykorzystaniem frakcji asfaltenowej, mieszczą się w zakresie 1,002-1,020 [ - ]. Wartości te spełniają warunek świadczący o zdolności rozdzielenia składników mieszanin racemiczny ch. Natomiast ze względu na fakt, że są one bardzo bliskie wartości jedności, efekt rozdzielenia nie jest w pełni zadowalający. Warto ukierunkować badania na osiągnięcie celu obejmującego zwiększenie wartości współczynnika selektywności, który stanowi o lepszym efekcie rozdzielenia. Odnosząc się do analizy przeprowadzonej z wykorzystaniem CHIRALDEX B-DA, wartości współczynników selektywności, w większości przypadków są niższe niż otrzymane z zastosowaniem fazy będącej frakcją asfaltenową. Wartość współczynnika α w przypadku 2-butanolu, dla komercyjnie dostępnej fazy stacjonarnej, wynosi 1,065 [ - ], co jednocześnie wskazuje możliwość rozdzielenia enancjomerów tej substancji. W pozostałych przypadkach, stosując fazę stacjonarną CHIRALDEX B-DA nie osiągnięto satysfakcjonujących różnic pomiędzy wartościami czasu retencji. Ich zakres mieścił się w przedziale 0,01 0,13 [min], z czego skrajnie wysoka wartość odnosi się do jedynej, w tym przypadku, rozdzielonej pary substancji, jaką jest mieszanina racemiczna 2-butanolu. Przeprowadzone badania w zakresie rozdzielania mieszanin związków optycznie czynnych z wykorzystaniem frakcji asfaltenowych, jako fazy stacjonarnej, wykazały, że istnieje możliwość jej zastosowania w technice chiralnej chromatografii gazowej. Jednak, aby osiągnąć zadowalające rozdzielenie, konieczne jest opracowanie warunków immobilizacji faz asfaltenowych w kolumnach kapilarnych. Podziękowania (Acknowledgements) Praca finansowana w ramach realizacji projektu badawczego finansowanego przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju (Program LIDER, edycja V, nr projektu: LIDER/036/573/L-5/13/NCBR/2014) pt. Badania nad otrzymywaniem i właściwościami sorbentów wytwarzanych z asfaltów. 5. Literatura (Literature) 1. Y. Xiaoa, Siu-Choon Ng, T.T. Yang Tan, Y. Wang, Recent development of cyclodextrin chiral stationary phases and their applications in chromatography, Journal of Chromatography A, 1269 (2012) G. Gubitz, M. G. Schmid, Chiral Separation by Chromatographic and Electromigration Techniques, Biopharmaceutics and Drug Disposition, 22 (2001) V. Schurig, Chiral separations using gas chromatography, TrAC - Trends in Analytical Chemistry, 21 (2002) G. Boczkaj, M. Momotko, D. Chruszczyk, A. Przyjazny, M. Kamiński, 2016, Novel stationary phases based on asphaltenes for gas chromatography, Journal of Separation Science, 39 (2016) 2527.

11 CAMERA SEPARATORIA Volume 9, Number 1 / June 2017, pp Paweł PISZCZ, Paulina BOGUSZEWSKA, Bronisław K. GŁÓD* Zakład Chemii Analitycznej i Nieorganicznej, Instytut Chemii, Wydział Nauk Ścisłych, Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach, ul. 3 Maja 54, Siedlce *Autor do korespondencji, bkg@onet.eu Właściwości antyoksydacyjne wybranych preparatów roślinnych Streszczenie: Wolne rodniki i antyoksydanty odgrywają istotną rolę w prawie każdej jednostce chorobowej, dlatego tak istotne jest ich oznaczanie. W literaturze opisanych jest wiele sposobów oznaczania antyoksydantów. Często jednak sumaryczna wielkość całkowity potencjał antyoksydacyjny (CPA) dostarcza więcej informacji o badanym układzie niż stężenia poszczególnych antyoksydantów. Celem pracy było oznaczenie całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (CPA) wodnych ekstraktów wybranych preparatów roślinnych. Materiał badawczy stanowiły próbki kudzu, guarany, żeńszenia oraz napoju herbacianego Ekoland. W celu zbadania CPA zastosowano metody spektrofotometryczne (z zastosowaniem rodników DPPH i peroksylowych oraz oznaczanie całkowitego stężenia polifenoli metodą FC), a także wysokosprawną chromatografię cieczową z detekcją elektrochemiczną (HPLC/ED). Wyniki CPA przedstawiono w przeliczeniu na ekwiwalent kwasu galusowego oraz wzajemnie ze sobą skorelowano. Słowa kluczowe: antyoksydanty, całkowity potencjał antyoksydacyjny, rośliny lecznicze, zioła Antioxidative properties of selected plants Abstract: Free radicals and antioxidants play an important role in almost every disease, so it is important to their determination. In the literature described many methods for determining antioxidants. Often however, the total antioxidant potential (TAP) provides more information about the system than the determination individual antioxidant concentrations. The aim of the study was to determine the total antioxidant potential of water extract of selected plants (panax ginseng, pueraria montana, guarana and Ekoland tea). In order to investigate the TAP we used spectrophotometric and chromatographic methods. The results were correlated with the TAPs values related to the DPPH and peroxyl radicals as well as to the total polyphenols content in the sample. Keywords: antioxidants; total antioxidant potential, medicinal plants, herbs 1. Wstęp (Introduction) Antyoksydanty (znane też pod nazwą przeciwutleniaczy) są to związki, które posiadają zdolność powstrzymywania lub opóźniania procesów utleniania. Z chemicznego punktu widzenia antyoksydanty są reduktorami, które przez samoutlenienie redukują inny związek. Antyoksydanty posiadają charakterystyczną zdolność do zmiatania/neutralizacji wolnych rodników. Podobnie jak wolne rodniki antyoksydanty można podzielić na egzogenne i endogenne. Antyoksydanty endogenne są wytwarzane przez organizm. W ystępują one w każdej komórce, a na ich poziom nie mamy dużego wpływu ze względu na to, że zależy on w głównej mierze od wieku i uwarunkowania genetycznego. Do tej grupy należy m. in. glutation, kwas moczowy, melatonina, koenzym Q10. Antyoksydanty egzogenne są dostarczane do organizmu głównie z pożywieniem, ale również w postaci suplementów diety i witamin. Zatem na ich ilość mamy duży wpływ. Są to m.in. karotenoidy, witaminy A, C, E oraz polifenole (głównie flawonoidy i kwasy fenolowe) [1]. Antyoksydanty na różne sposoby eliminują wolne rodniki z naszego organizmu. Przede wszystkim poprzez reakcję redukcji prowadzącą do powstania ich stabilnych i niereaktywnych form. Ponadto mogą zapobiegać powstawaniu wolnych rodników na skutek hamowania enzymów odpowiedzialnych za ic h tworzenie (np. lipooksygenazy i oksydazy ksantynowej). Często kompleksują metale dające początek reakcjom wolnorodnikowym [1, 2].

12 12 Głównym źródłem antyoksydantów w pożywieniu są owoce i warzywa. Owoce, które powinniśmy wprowadzać do codziennej diety to te o ciemnym, czerwonym i fioletowym zabarwieniu. Zawierają one dużo antocyjanów np. czarne porzeczki, aronia, czerwone winogrona, granaty, borówki amerykańskie, wiśnie. Korzystne są również cytrusy obfite w flawonoidy. Z kolei warzywa, których powinno być dużo w naszym jadłospisie to buraki, czerwona kapusta, szpinak, papryka, brokuły, rośliny strączkowe, pomidory. Wskazane jest stosowanie również świeżych ziół i przypraw np. bazylia, oregano, goździki. Duża ilość antyoksydantów znajduje się w czerwonej i zielonej herbacie oraz czerwonym winie, w którym zawarta jest spora ilość resweratrolu należącego do flawonoidów. Odpowiednia dieta, aktywność fizyczna, rezygnacja z używek oraz niewielka ilość stresu powinny zapewnić nam zapas antyoksydantów [3, 11, 12]. Zbadanie właściwości antyoksydacyjnych czystych związków nie jest zbyt wymagające. Problem pojawia się, gdy badanym obiektem jest próbka rzeczywista. Główną przeszkodą jest jej skład, który bardzo często nie jest znany. Dlatego ciężko jest oznaczać moc antyoksydacyjną indywidualnych antyoksydantów. Kolejnym problemem jest zjawisko synergizmu. Polega ono na wzajemnym oddziaływaniu na siebie antyoksydantów. Stąd też pomiar może być zaburzony, ponieważ obecność tych oddziaływań doprowadza do osłabienia lub wzmocnienia efektu antyoksydacyjnego. Dlatego dobrym rozwiązaniem jest określanie zdolności antyoksydacyjnej wszystkich związków obecnych w próbce. Zastosowanie sumarycznej informacji o tych właściwościach jest w wielu przypadkach uzasadnione. W prezentowanych wynikach dla każdej z próbek badany był jej całkowity potencjał antyoksydacyjny (CPA) [4]. Celem pracy było zbadanie właściwości antyoksydacyjnych ekstraktów znanych preparatów roślinnych (kudzu, guarana, żeń-szeń) oraz napoju herbacianego Ekoland. W tym celu wykorzystano wysokosprawną chromatografię cieczową z detekcją elektrochemiczną oraz spektrofotometryczne metody oznaczania właściwości antyoksydacyjnych (DPPH, AAPH, FC) [10]. Kudzu znany jest jako ołownik łatkowaty lub pueraria lobata. Należy do rodziny bobowatych. Jest rośliną jadalną. Występuje naturalnie w południowo - wschodniej Azji, Japonii i wyspach Oceanii. Roślina składa się z pnącza o drewnianej, owłosionej w górnej części łodydze, dużych trójlistkowych liści, dużego bulwiastego korzenia, kwiatów koloru purpurowego wyrastających z kątów liści oraz owocu będącego owłosionym strąkiem zawierającym nasiona. Nieocenioną częścią rośliny jest korzeń i strąk. W medycynie chińskiej jest to jedno z 50 stosowanych ziół. Jego korzeń służy do leczenia migreny, grypy, nadciśnienia, biegunek, niewydolności naczyń wieńcowych. Wyciąg z kudzu zwiększa w mózgu stężenie dwóch bardzo ważnych hormonów dopaminy i serotoniny, co ma bardzo duże znaczenie u osób cierpiących na zaburzenia nerwicowe i depresje. Posiada również właściwości antyoksydacyjne ze względu na dużą zawartość izoflawonów, których obecność w błonie komórkowej stanowi solidną zaporę przeciw wolnym rodnikom. Izoflawony dzięki swej budowie chemicznej (obecność podwójnych wiązań) przechwytują reaktywne formy tlenu, tym samym zapobiegając utlenianiu struktur komórkowych. Większość izoflawonów, obecnych w kudzu, stanowią pueraryny, które zmniejszają potrzebę spożywania alkoholu, pomagają w stabilizacji emocji oraz wspomagają neutralizację toksyn, dlatego też kudzu znalazł zastosowanie w terapii osób uzależnionych od alkoholu [5]. Guarana (inaczej nazywana paullinia cupana lub cierniopląt) należy do rodziny mydleńcowatych. Występuje naturalnie w Brazylii w dorzeczu Amazonki i Pary. Roślinę tworzy pnącze wspinające się lub płożące, kwiatostany groniaste o białych, drobnych i pachnących płatkach, parzystopierzaste liście oraz czerwony, gruszkowaty owoc, w którym znajdują się czarne nasiona. Najcenniejszą częścią rośliny są nasiona, które zawierają kofeinę, flawonoidy tj. katechiny, epikatechiny oraz procyjanidyny. Guarana zawiera cztery razy więcej kofeiny niż ziarna kawowca, przy czym warto wspomnieć, iż jest to kofeina niezawierająca zanieczyszczeń doprowadzających do zakwaszenia organizmu oraz przyswajająca się wolniej niż ta zawarta w kawie, stąd jej działanie utrzymuje się nieco dłużej. Działa zatem pobudzająco, znosi zmęczenie, ułatwia myślenie. Pobudza ośrodkowy układ nerwowy oraz ośrodki wegetatywne. Zwiększa również wydolność fizyczną i psychiczną poprzez wydzielanie hormonów i neuroprzekaźników. Ponadto guarana stosowana jest często przy produkcji energetyków, piwa, leków i preparatów do odchudzania. Jest pomocna przy takich dolegliwościach jak migreny, niskie ciśnienie czy zatrucia alkoholowe. Guarana charakteryzuje się również właściwościami antyoksydacyjnymi. Często nazywana jest naturalnym źródłem energii [6]. Żeń-szeń inaczej nazywany jest panaxginsengiem lub wszechlekiem. Należy do rodziny araliowatych. Rośnie dziko w górskich lasach Półwyspu Koreańskiego, północno-wschodnich Chin, na Wyspach Japońskich i w północno-wschodniej Syberii na luźnych, dobrze uwodnionych glebach. Wiek rośliny różnicuję ją pod względem budowy, na którą składa się korzeń w kolorze białym lub beżowym stanowiący palowe kłącze oraz drobne kwiaty seledynowe lub białoróżowe ułożone w baldy. W pierwszym roku życia pojawia się jeden trójpalczasty liść zaś w kolejnych latach pięciopalczasty, a po 10 roku życia rozeta liści oraz czerwony owoc będący pestkowcem zawierający dwa zrośnięte nasiona i łodygę. Nieocenioną częścią rośliny jest korzeń, który w tradycyjnej medycynie Dalekiego Wschodu wykorzystywany jest od kilku tysięcy lat. Przede wszystkim wykazuje on działanie wzmacniające podczas wycieńczenia fizycznego i psychicznego organizmu oraz zwiększa odporność na stres poprzez zwiększanie zdolności hemoglobiny do przyłączania tlenu. Żeń-szeń obniża poziom cholesterolu we krwi oraz działa przeciwzakrzepowo na płytki krwi. Zaobserwowano również korzystne jego działanie w leczeniu cukrzycy. Okazuje się, że obniża on poziom cukru we krwi oraz może mieć bardzo duże znaczenie przy regulacji produkcji insuliny.

13 13 Przyjmowanie żeń-szenia wzmaga utlenianie alkoholu w wątrobie i pomaga odbudować jej komórki, co znajduje zastosowanie w stanach po spożyciu alkoholu. Ponadto poprawia pamięć, przemianę materii, ułatwia gojenie ran, łagodzi uszkodzenia komórek spowodowanych przez promieniowanie, reguluje ciśnienie tętnicze krwi, korzystnie działa na potencję. Istnieją również doniesienia o jego znaczącej roli w zwalczaniu nowotworów. Posiada również właściwości antyoksydacyjne i odmładzające stąd często stosowany jest jako dodatek do różnego rodzaju kosmetyków. Prozdrowotne własności żeń -szeń zawdzięcza zawartości takich związków jak: węglowodany, flawonoidy, fenolokwasy, peptydoglikany, związki acetylenowe oraz najważniejsze saponozydy, nazwane ginzenozydami. Korzeń żeń-szenia ze względu na tak liczne spektrum działania, szczególnie lecznicze, jest nieustannym obiektem badań naukowców [7]. 2. Część eksperymentalna (Experimental) W badaniach CPA użyto następujących odczynników chemicznych: AAPH [dichlorowodorek 2,2 - diazobis-(2-amidynopropan)], bufor fosforanowy w postaci tabletki (PBS) o ph 7,4, DCFH DA (dioctan 2,7 - dichlorodihydrofluoresceiny), DPPH (2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl), metanol (99,9% HPLC grade) Sigma - Aldrich, Steinheim, Niemcy; diwodoroortofosforan sodu, wodoroortofosforan sodu, węglan sodu POCh, Gliwice, Polska; kwas galusowy, odczynnik Folina-Ciocalteu a, woda trójkrotnie destylowana (otrzymana w laboratorium z wykorzystaniem aparatu kwarcowego wody, Heraeus Quarzglas, Destamat, Niemcy). Korzystano również z następującej aparatury: wysokosprawny chromatograf cieczowy (HPLC) firmy Knauer (Berlin, Niemcy) (składający się z: interfejsu Smartline Manager 5000 z wbudowanym degazerem, dwutłokowej pompy Smartline 1000 o przepływie fazy ruchomej w granicach 0, ml/min, kolumny analitycznej Eurospher 5 C18, 4 x 150 mm, autosamplera Smartline 3800, detektora amperometrycznego EC3000 (układ trójelektrodowy: elektroda pracująca - węgiel szklisty, elektroda pomocnicza - Pt, elektroda odniesienia - Ag/AgCl), komputera z oprogramowaniem do rejestracji i obróbki danych ClarityChrom). Pomiary spektrofotometryczne wykonano na spektrofotometrze mikropłytkowym Epoch (BioTek Instruments, Inc. USA) sterowanym za pomocą programu Gen5 (ws zystkie pomiary zostały wykonane z wykorzystaniem płytek 96-dołkowych). Korzystano także z wirówki laboratoryjnej Centrfuge MPW (MPW Med. Instruments, Polska), wagi analitycznej (RADWAG, WAA 100/C/1, Radom, Polska) o dokładności 10-4 g, wagi analitycznej (Sartorius, Werke GmbH, Göttingen, Niemcy) o dokładności 10-6 g oraz łaźni ultradźwiękowej (Sonorex RK 250H, Bandelin, Niemcy). Materiał badawczy stanowiły trzy próbki ekstraktów roślinnych (kudzu, guarana, żeń-szeń) oraz napój herbaciany Ekoland. Ekstrakty zostały zakupione w sklepie internetowym Magiczny Ogród. Mają postać drobno utartego proszku i znajdują się w szczelnie zamkniętych opakowaniach. Rozpuszczalny w wodzie napój herbaciany ma postać niewielkich granulek. W pomiarach spektrofotometrycznych przygotowane roztwory ekstraktów miały stężenie 1 mg/ml. Przygotowanie ich polegało na odważeniu po 10 mg próbek, przeniesieniu ilościowo do kolb miarowych o pojemności 10 ml i uzupełnieniu wodą destylowaną do kreski. Do pomiarów chromatograficznych stężenia ekstraktów były czterokrotnie zwiększone i przygotowane poprzez odważenie 20 mg próbek i rozpuszczenie w 5 ml wody destylowanej (4 mg/ml). Oznaczanie CPA metodą DPPH (Determination of TAP using DPPH assay) Pomiary prowadzone były przy długości fali równej 517 nm. Na 96 - dołkową płytkę odmierzono po 30 μl próbki i 270 μl DPPH o stężeniu 0,2 mm. Przy takich proporcjach próbki i rodnika można porównać ze sobą wszystkie badane preparaty oraz dla każdego zarejestrować zmianę absorbancj i. Próbę kontrolną stanowiła mieszanina metanolu z rodnikiem DPPH w identycznych proporcjach. Czas analizy wynosił 20 min natomiast czas, w którym wyznaczono wartość CPA - 10 min. Następnie wykonano krzywą kalibracyjną dla kwasu galusowego (C GA = A/0,2391; gdzie: A - absorbancja, a C GA - stężenie kwasu galusowego; r 2 = 0,9998). Krzywa została sporządzona z czterech różnych stężeń po trzy powtórzenia dla każdego z nich (0,00 5,00 [mg/l] GA). Wszystkie otrzymane wyniki zostały przeliczone na ekwiwalent kwas galusowy GAE [mg GA/g próbki]. Oznaczanie całkowitego stężenia polifenoli (Determination of total polyphenols concentration) W celu wykonania pomiaru absorbancji na 96 - dołkową płytkę odmierzono po 25 μl badanej próbki, 25 μl odczynnika FC, 100 μl 20% węglanu sodu oraz 100 μl wody destylowanej. Całość odstawiono na pół godziny w ciemne miejsce. Po tym czasie zmierzono absorbancje. W próbie kontrolnej próbka została zastąpiona wodą. Pomiar był prowadzony przy długości fali równej 765 nm. Wartości CPA zostały podane w ekwiwalentach kwasu galusowego. W tym celu sporządzono krzywą kalibracyjną dla stężeń kwasu galusowego od 0 do 25 µg/ml (równanie prostej: A = 0,1007 C GA, r 2 = 0,999).

14 Absorbancja [AU] 14 Oznaczanie CPA metodą AAPH (Determination of TAP using AAPH assay) W celu przeprowadzenia pomiaru na 96 - dołkową płytkę odmierzono po 30 μl próbki, 70 μl buforu, 100 μl DCFH oraz 100 μl AAPH. W próbie kontrolnej próbkę zastąpiono wodą. Pomiar był prowadzony przez cztery godziny, a dane rejestrowane co minutę. W tej metodzie właściwości antyoksydacyjne można wyznaczyć jako: czas przegięcia krzywej, pole powierzchni pod nad krzywą kinetyczną wyliczone w stosunku do próby kontrolnej oraz czas indukcji. Wykorzystano wszystkie trzy metody i dla każdej z nich sporządzono krzywą wzorcową kwasu galusowego w zakresie stężeń 0-10 µg/ml, czas przegięcia krzywej: równanie prostej A = 3,793 C GA, R 2 =0,998, pole powierzchni pod nad krzywą: równanie prostej: A = 372,7 C GA, R 2 =0,996, czas indukcji: równanie prostej: A = 3,808 C GA, R 2 =0,988. CPA przeliczono na ekwiwalent kwasu galusowego. CPA mierzone za pomocą HPLC z detekcją elektrochemiczną (ED) (TAP measured by HPLC with electrochemical detection) Wszystkie próbki chromatografowane były w odwróconym układzie faz: niepolarna faza stacjonarna (C18) i polarna faza ruchoma (bufor fosforanowy o ph 5,8). Na kolumnę wstrzykiwano próbki za pomocą autosamplera o objętości 20 μl i stężeniu 4 mg/ml. Pomiary wykonane były w temperaturze 20 C, na detektorze elektrochemicznym w układzie trójelektrodowym, elektroda pracująca węglowa w zakresie potencjałów 0,2 1,2 V. Czas analizy ustalono na 60 minut. Miarą CPA było pole po wierzchni pod wszystkimi pikami na chromatogramie [8]. 3. Wyniki i ich dyskusja (Results and discussion) Podczas spektrofotometrycznego oznaczenia CPA DPPH zarejestrowano krzywe przedstawione na rysunku 1. Okazało się, że najsilniejsze właściwości antyoksydacyjne posiadał ekstrakt z kudzu, a najsłabsze ekoland. Oznacza to, że 1 g ekstraktu z kudzu odpowiada 43 mg kwasu galusowego, a 1 g ekstraktu ekolandu odpowiada tylko 2 mg GA. CPA DPPH dla wszystkich próbek przedstawiono na rysunku Czas [min] kontrolna guarana żeń-szeń ekoland kudzu Rys. 1. Zmiany absorbancji w metodzie DPPH. Fig. 1. Change of absorbance in DPPH method.

15 CPA DPPH /TAP [GAE] Absorbancja [AU] 15 Wykonano również pomiary przy różnych stężeniach objętościowych próbek ekstraktu kudzu tj. 30, 50 oraz 70 μl (co odpowiada: 0,1; 0,167; 0,233 mg/ml ekstraktu). Okazało się, że optymalne wyniki dostarcza pomiar przy objętości próbki równej 30 μl. Przy większych stężeniach próbka kudzu reaguje zbyt szybko. Po upływie około dwóch minut ekstrakt z kudzu praktycznie w 100% przereagował z rodnikami DPPH (rys. 2) Rys. 2. Zmiany absorbancji w metodzie DPPH. Fig. 2. Change of absorbance in DPPH method. Czas [min] kudzu 30 kudzu 50 kudzu KUDZU GUARANA ŻEŃ-SZEŃ EKOLAND Rys. 3. CPA DPPH badanych próbek. Fig. 3. TAP DPPH of tested samples. Oznaczono także w badanych próbkach całkowite stężenie polifenoli. Okazało się, że najsilniejszymi właściwościami antyoksydacyjnymi (największe stężenie polifenoli) charakteryzuje się ekstrakt z kudzu, zaś najsłabszymi ekoland, analogicznie jak w metodzie DPPH. W przeliczeniu na kwas galusowy wartości CPA są wyższe niż w przypadku DPPH, z wyjątkiem ekolandu, dla którego wartość CPA się nie zmienia. Pozostałe ekstrakty zawierają w swoim składzie duże stężenie związków fenolowyc h (najwięcej ekstrakt z kudzu), co przedstawiono na rysunku 4.

16 Absorbancja [AU] CPA FC /TAP [GAE] KUDZU GUARANA ŻEŃ- SZEŃ EKOLAND Rys. 4. CPA FCR badanych próbek. Fig. 4. TAP FCR of tested samples. Wynikiem monitorowania spektrofotometrycznego reakcji ekstraktów badanych próbek z rodnikami peroksylowymi (rozpad AAPH) są krzywe przedstawione na rysunku 5. Okazało się, że najsilniejsze właściwości antyoksydacyjne wykazuje ekstrakt z kudzu, a najsłabsze ekoland. Ekstrakty z guarany i żeńszenia z rodnikami peroksylowymi reagują podobnie. W poprzednio opisanych metodach (CPA DPPH i CPA FC ) guarana wykazywała większe wartości CPA niż żeń-szeń Czas [min] guarana żeń-szeń ekoland kudzu kontrolna Rys. 5. Zmiany absorbancji w metodzie AAPH. Fig. 5. Change of absorbance in AAPH method. Pomiar absorbancji próbki kontrolnej, guarany, żeń-szenia oraz ekolandu prowadzono przez 150 minut. Po tym czasie wszystkie krzywe uległy wypłaszczeniu, czyli reakcja z rodnikami zakończyła się. Stąd w kolejnych minutach pomiaru krzywe nie ulegają zmianie (rys. 5). W tych samych warunkach pomiarowych znacznie później wypłaszcza się krzywa obrazująca reakcję kudzu z rodnikami. Ekstrakt z kudzu charakteryzuje się silnymi właściwościami antyoksydacyjnymi, gdyż reakcja rodników peroksylowych z

17 CPA AAPH /TAP [GAE] 17 sensorem (DCFH) znacznie się opóźnia, co spowodowane jest obecnością wielu różnych antyoksydantów. Na rysunku 5 możemy zaobserwować, że krzywa zmian absorbancji dla ekstraktu z kudzu różni się kształtem od pozostałych. Krzywe zmian absorbancji guarany, żeń-szenia i ekolandu są równolegle przesunięte względem krzywej kontrolnej, zaś krzywa absorbancji kudzu jest bardziej wypłaszczona co wskazuje na złożony charakter reakcji składników ekstraktu kudzu z rodnikami peroksylowymi. Na rysunku 6 zestawiono wyniki CPA AAPH w przeliczeniu na GAE, wykonane trzema metodami opisanymi w części eksperymentalnej. Z przedstawionego wykresu wynika, że ekstrakt z kudzu znacznie odbiega wartościami CPA AAPH od pozostałych próbek, co wskazuje na to, że charakteryzuję się bardzo d użą zawartością antyoksydantów. Guaranę i żeń-szenia charakteryzują porównywalne właściwości antyoksydacyjne. Ekoland zawiera niewiele bądź nieduże stężenie przeciwutleniaczy. Otrzymane wartości CPA AAPH guarany i żeń-szenia są liczbowo porównywalne z wartościami CPA otrzymanymi w metodzie z wykorzystaniem odczynnika FC. Kudzu wykazuje znacznie większe wartości CPA AAPH niż CPA FC i CPA DPPH. Wartości CPA AAPH ekolandu są znacznie większe niż te uzyskane w poprzednich metodach. Ponadto w wartościach CPA AAPH wyznaczonych trzema metodami dla ekstraktów z guarany, żeń-szenia i ekolandu widać pewną prawidłowość. Dla każdej z tych próbek wartości CPA AAPH liczone z czasu indukcji są największe, zaś z czasu przesunięcia krzywej najmniejsze. Dla kudzu, gdzie krzywa nie jest przesunięta równolegle, jak w przypadku pozostałych próbek, takiej prawidłowości nie ma. Największa wartość CPA AAPH ekstraktu z kudzu została wyliczona z pola powierzchni pod krzywą, a najmniejsza z czasu przesunięcia krzywej kinetycznej czas przesunięcia powierzchnia pod nad krzywą czas indukcji KUDZU ŻEŃ-SZEŃ GUARANA EKOLAND Rys. 6. CPA AAPH badanych próbek. Fig. 6. TAP AAPH of tested samples. Wartości CPA ekstaktów wyznaczone trzema metodami spektrofotometrycznymi zestawiono na rys. 7. Wynika z niego dobra korelacja pomiędzy zastosowanymi metodami pomiarowymi. W każdej z zastosowanych metod ekstrakt z kudzu charakteryzuje się największymi właściwościami antyoksydacyjnymi. Otrzymane wartości CPA FC oraz CPA AAPH są wyższe od wartości CPA DPPH. Powodem jest najprawdopodobniej większa reaktywność odczynnika Folina-Ciocalteu a. Reaguje on nie tylko z silnymi przeciwutleniaczami, ale również z tymi słabszymi. (odczynnik FC nie jest specyficzny i wchodzi w reakcje również z innymi związkami oprócz polifenoli ). DPPH jest bardzo słabym rodnikiem. Prawdopodobnie fenole zawarte w próbkach charakteryzują się słabymi właściwościami antyoksydacyjnymi i nie wszystkie reagują z rodnikami DPPH.

18 CPA /TAP [GAE] AAPH 0 FC kudzu guarana żeń-szeń ekoland DPPH Rys. 7. Korelacje CPA DPPH, CPA FCR i CPA AAPH badanych próbek. Fig. 7. Correlation TAP DPPH, TAP FCR and TAP AAPH of tested samples. CPA wyznaczono także metodą HPLC z detekcją elektrochemiczną [8]. Chromatogramy próbki ekstraktu żeń-szenia wykonane przy różnych wartościach potencjałów elektrody pracującej zostały przedstawione na rysunku 8. Wynika z niego, że niektóre piki (np. czas retencji około 13 i 15 min.) pojawiają się dopiero przy wyższych wartościach potencjałów. Są to piki pochodzące od słabych antyoksydantów, np. w ok. 18 min. pomiaru pojawia się pik dopiero przy potencjale E = 0,8 V. Natomiast piki, które pojawiają się na chromatogramie już przy niskich wartościach potencjałów elektrody pracującej pochodzą od silnych reduktorów, zatem są to silne antyoksydanty, np. pik pochodzący od związku dającego sygnał w ok. 7 minucie pomiaru już przy potencjale E = 0,2 V. Analogiczna sytuacja ma miejsce dla ekstraktu kudzu (rys. 9). W 46 minucie pomiaru pojawia się pik przy potencjale E = 0,6 V. Przy niższej wartości potencjału nie jest on widoczny. Jest to pik pochodzący od związku charakteryzującego się słabymi właściwościami antyoksydacyjnymi. Natomiast piki o czasach retencji ok. 3, 10 i 21 min. są widoczne na chromatogramie, gdy analizę prowadzi się w całym zakresie potencjałów tj. 0,2 0,8 V. Są to związki charakteryzujące się silnymi właściwościami antyoksydacyjnymi.

19 19 Rys. 8. HPLC/ED chromatogramy ekstraktu z żeń-szenia o stężeniu 4 mg/ml. Warunki chromatograficzne: kolumna - Eurospher C18, 5 μm, 150 x 4 mm (Knauer); temperatura 20 C; faza ruchoma - bufor fosforanowy (ph 5,8); - szybkość przepływu: 1 ml/min, detekcja elektrochemiczna (E = 0,4-1,0 V vs Ag/AgCl). Fig. 8. HPLC/ED chromatograms of panax ginseng extract (4 mg/ml). Experimental conditions: column Eurospher C18, 5 μm, 150 x 4 mm (Knauer); temperature 20 C; mobile phase phosphate buffer (ph 5,8); flow rate 1 ml/min, electrochemical detection (E = 0.4 1,0 V vs Ag/AgCl). Rys. 9. HPLC/ED chromatogramy ekstraktu z kudzu o stężeniu 4 mg/ml. Warunki chromatograficzne jak na rys. 8. Fig. 9. HPLC/ED chromatograms of pueraria montana extract (4 mg/ml). Experimental conditions the same as on fig. 8. żeń-szenia oraz pola powierzchni wybranych pików, pochodzących od związków charakteryzujących się dużymi właściwościami antyoksydacyjnymi wchodzących w skład ekstraktu żeń - szenia przedstawiono na rysunku 10. W zakresie potencjałów 0,2 0,6 V największy (praktycznie 100% dla potencjałów 0,2 V i 0,4 V) udział w CPA ma związek eluowany w czasie retencji ok. 6,5 min. Zaś dla potencjałów 0,8 V i 1,0 V jest to związek o czasie retencji ok. 1,5 min. Ponadto kształt hydrodynamicznej CPA HPLC/ED

20 Sygnał [μa s] 20 krzywej przedstawiającej CPA żeń-szenia (widoczne dwie fale, czerwona linia), wskazuje na złożoność reakcji utleniania składników ekstraktu zachodzących na węglowej elektrodzie pracującej. Hydrodynamiczne woltamogramy badanych ekstraktów roślinnych zostały przedstawione na rysunku 11. Okazało się, że najsilniejszymi właściwościami antyoksydacyjnymi charakteryzuje się ekstrakt z kudzu (piki pojawiają się już przy niskich wartościach potencjałów), a najsłabszymi ekoland. Ponadto kształt krzywej kudzu (podobnie jak w przypadku żeń-szenia, rys. 10) wskazuje na złożoność reakcji utleniania zachodzącej na elektrodzie. Na chromatogramie analizowanej próbki ekolandu, w zastosowanych warunkach chromatograficznych obserwujemy pojedyncze, o małej intensywności piki dopiero przy potencjale > 0,8 V. Wskazuje to na jej słabe właściwości antyoksydacyjne ,5 5,4 6,5 12,7 17,4 CPA CPA [μa s] E [V] 0 Rys. 10. Hydrodynamiczne woltamogramy ekstraktu żeń-szenia o stężeniu 4 mg/ml. Warunki chromatograficzne jak na rys. 8. Fig. 10. Hydrodynamic voltammograms of panax ginseng extract (4 mg/ml). Experimental conditions the same as on fig. 8. Rys. 11. Hydrodynamiczne woltamogramy badanych ekstraktów o stężeniu 4 mg/ml. Warunki chromatograficzne jak na rys. 8. Fig. 11. Hydrodynamic voltammograms of tested extracts (4 mg/ml). Experimental conditions the same as on fig. 8.

21 21 Okazało się, że ekstrakt z guarany (podobnie jak z ekolandu) daje niewielkie sygnały przy wyższej wartości potencjału (rys. 12), a przy niższej nie pojawiają się na chromatogramie żadne piki. Pomiary spektrofotometryczne wykazały, że guarana charakteryzuje się dużymi właściwościami antyoksydacyjnymi. Jak wspomniano wcześniej, guarana zawiera w składzie bardzo dużą ilość kofeiny, która z kolei nie uleg a reakcji utleniania na elektrodzie detektora ED, stąd też brak sygnału charakterystycznego dla kofeiny. W celu sprawdzenia, czy zakupiony ekstrakt z guarany zawiera znaczną ilość kofeiny wykonano pomiar wykorzystując wysokosprawną chromatografię cieczową z detektorem DAD (rys. 13). Okazało się, że ekstrakt z guarany w swoim składzie zawiera bardzo duże stężenie kofeiny (rys. 13). Na chromatogramie ekstraktu pojawił się niewielki pik o czasie retencji ok. 5 min. Zadane warunki chromatograficzne nie wykazały obecności innych związków. Z danych literaturowych [9] wynika, że ekstrakt z guarany zawiera saponiny, witaminy A, E, jednak w przeprowadzonych analizach chromatograficznych nie zostało to potwierdzone. Będzie to przedmiotem dalszych prac, gdyż w celu zbadania obecności np. witaminy E należałoby w inny sposób przygotować próbkę do analizy (np. przeprowadzić proces zmydlania). Rys. 12. HPLC/ED chromatogramy ekstraktu z guarany o stężeniu 4 mg/ml. Warunki chromatograficzne jak na rys. 8. Fig. 12. HPLC/ED chromatograms of guarana extract (4 mg/ml). Experimental conditions the same as on fig. 8. Rys. 13. HPLC/DAD chromatogramy ekstraktu guarany o stężeniu 4 mg/ml (niebieska linia) i wzorca kofeiny o stężeniu 0,4 mg/ml (czerwona linia). Warunki chromatograficzne: kolumna chromatograficzna 5 µm C18, 4 x 100 mm (Eurospher, Knauer), faza ruchoma metanol:woda, (30:70 v/v), detektor DAD, 274 nm, szybkość przepływu fazy ruchomej 1,0 ml/min, objętość nastrzyku 20 µl. Fig. 13. HPLC/DAD chromatograms of guarana extract 4 mg/ml (blue line) and a 0.4 mg/ml caffeine standard (red line). Experimental conditions: column Eurospher C18, 5 μm, 100 x 4 mm (Knauer); mobile phase methanol:water (30:70 v/v); flow rate 1 ml/min, DAD detection, 274 nm, injection volume - 20 μl.

22 22 4. Wnioski (Conclusions) Zaprezentowane w pracy metody pomiaru całkowitego potencjału antyoksydacyjnego można zastosować do badania właściwości antyoksydacyjnych różnych ziół. Zbadane ekstrakty różnią się właściwościami antyoksydacyjnymi. Najsilniejszymi właściwościami antyoksydacyjnymi, potwierdzonymi wszystkimi technikami zastosowanymi w pracy, charakteryzują się ekstrakty z kudzu oraz żeń-szenia. Napój herbaciany Ekoland, mimo że zawiera w swym składzie witaminy A, C i E wykazał w badaniach niewielkie właściwości antyoksydacyjne. Ekstrakt z guarany zawiera duże stężenie kofeiny. Wartości CPA wodnych naparów roślin leczniczych otrzymane metodami spektrofotometrycznymi wykazują dobre korelacje. 5. Literatura (Literature) 1. G. Bartosz, Druga twarz tlenu-wolne rodniki w przyrodzie, Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa H. Puzanowska - Tarasiewicz, L. Kuźmicka, M. Tarasiewicz, Antyoksydanty a reaktywne formy tlenu, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 43 (2010) P. Piszcz, B.K. Głód, Właściwości antyoksydacyjne ziół zbadane rożnymi metodami, Camera Separatoria, 8 (2016) B.K. Głód, P. Piszcz, J. Czajka, P.K. Zarzycki, Evaluation of total antioxidant potential of selected biogenic polyamines, non-alcoholic drinks and alcoholic beverages using improved RP-HPLC assay involving fluorescence detection, Food Chemistry, 131 (2012) B. Waszkiewicz-Robak, Kudzu Root życie wolne od używek, "Medycyna i zdrowie", 1, Z. Podbielkowski, Słownik roślin użytkowych, Wydawnictwo PWRiL, Warszawa B. Karłowicz-Bodalska, Żeń-szeń wszechlek Dal ekiego Wschodu, Postępy Fitoterapii 4 (2004) P.M. Wantusiak, P. Piszcz, B.K. Głód, A fast and simple method for the measurement of total antioxidant potential and a fingerprint of antioxidants, Journal of Chromatographic Science, 50 (2012) R. Mattei, R.F. Dias, E.B. Esp ınola, E.A. Carlini, S.B.M. Barros, Guarana (Paulliniacupana): toxic behavioral effects in laboratory animals and antioxidant activity in vitro, Journal of Ethnopharmacology 60 (1998) R. Apak, S. Gorinstein, V. Böhm, K.M. Schaich, M. Özyürek, K. Güçlü, Methods of measurement and evaluation of natural antioxidant capacity/activity (IUPAC Technical Report), Pure and Applied Chemistry, 85 (2013) R.L. Prior, X. Wu, K. Schaich, Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53 (2005) J. Valls, S. Millána, M.P. Martía, E. Borrŕsa, L. Arolab, Advanced separation methods of food anthocyanins, isoflavones and flavanols, Journal of Chromatography A, 1216 (2009)

23 CAMERA SEPARATORIA Volume 9, Number 1 / June 2017, pp Maksymilian PLATA-GRYL, Grzegorz BOCZKAJ* Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, ul. Gabriela Narutowicza 11/ Gdańsk, Poland *Autor do korespondencji, grzegorz.boczkaj@gmail.com Badania właściwości sorpcyjnych faz stacjonarnych na bazie frakcji asfaltenowych do rozdzielania mieszanin z zastosowaniem chromatografii gazowej Streszczenie: W pracy przedstawiono wyniki badań nad możliwością wykorzystania faz stacjonarnych na bazie frakcji asfaltenowych do rozdzielania mieszanin związków chemicznych z wykorzystaniem chromatografii gazowej oraz porównano selektywność faz przygotowanych z frakcji asfaltenowych wyizolowanych z różnych surowców. Na podstawie uzyskanych wyników obliczono wartości liniowych indeksów retencji oraz stałych Rohrschneidera-McReynoldsa, za pomocą których charakter badanych faz określono jako średniopolarny. Przeprowadzone badania wykazały, że przygotowane fazy stacjonarne pozwalają na rozdzielenie związków w ramach grup związków tj. węglowodory aromatyczne, ketony, alkohole, sulfidy. Ponadto zaobserwowano różnice w selektywności faz stacjonarnych w zależności od surowca z jakiego były wyizolowane. Słowa kluczowe: asfalteny, chromatografia gazowa, stałe McReynoldsa, fazy stacjonarne Sorption properties of asphaltene stationary phases for gas chromatography separations Abstract: The purpose of this paper was to evaluate the usefulness of asphaltene stationary phases for gas chromatography separations and to compare selectivity of asphaltene stationary phases isolated from different raw materials. On the basis of information obtained from test mixture chrom atograms, chromatographic parameters were calculated to characterize prepared columns. The values of linear retention indices and Rohrschneider-McReynolds constants allowed to determine types of interactions between test solutes and stationary phases and for comparison with commercial stationary phases. The use of novel stationary phases enables the separation of substances among classes of compounds e.g. aromatic hydrocarbons, ketones, alcohols, sulfides. Calculated values of Rohrschneider -McReynolds constants characterize asphaltene stationary phases as phases of medium polarity and revealed differences in selectivity between phases obtained from different bitumens. Key words: asphaltenes, gas chromatography, McReynolds constants, stationary phases 1. Wstęp (Introduction) Asfalteny definiowane są na podstawie rozpuszczalności. Jest to frakcja występująca w bituminach, ropie naftowej i pozostałościach po destylacji ropy naftowej, nierozpuszczalna w n -alkanach, a rozpuszczalna w toluenie. Są to wielkocząsteczkowe węglowodory, stanowiące najbardziej aromatyczną i polarną frakcję ropy naftowej, składające się głównie ze skondensowanych pierścieni aromatycznych, mogące zawierać w swojej strukturze heteroatomy siarki, tlenu, azotu, wanadu, niklu, żelaza [1-5]. Przeprowadzone badania wskazują, że rozkład masy molekularnej, związków zaliczanych do asfaltenów, mieści się w zakresie od 250 g/mol do 2000 g/mol, ze średnią masą na poziomie 750 g/mol [2]. Suche, wyizolowane asfalteny, mają czarno-brązową barwę. Nie posiadają wyraźnie określonej temperatury topnienia. Podgrzane stopniowo miękną, przechodząc w formę ciekłą. Zakres temperatury mięknienia, różni się w zależności od pochodzenia surowca, z którego zostały wyizolowane. W temperaturze około 350 C, zaczynają ulegać rozkładowi [6]. Ze względu, na złożony skład frakcji asfaltenowej, dotychczas nie udało się jednoznacznie określić jej składu chemicznego. Asfalteny są mieszaniną wielu związków różniących się masą, polarnością i zawartością grup funkcyjnych [2, 4, 7].

24 24 Centralną strukturę, cząsteczki asfaltenów, stanowi rdzeń zbudowany z pojedynczej cząsteczki policyklicznych węglowodorów aromatycznych (tzw. struktura wyspowa), z przyłączonymi podstawnikami są to głównie łańcuchy alifatyczne i rozgałęzione, do C 30. Cząsteczki asfaltenów, zawierają niewielkie ilości heteroatomów, spośród których dominującym jest siarka. Występuje ona w grupach o charakterze niepolarnym, z tego względu ma niewielki wpływ na oddziaływania międzycząsteczkowe. Azot, z kolei, występuje w grupach polarnych (np. pirydynowych), i może wpływać na oddziaływania międzycząsteczkowe [2, 4, 8]. Jedną z cech wspólnych, asfaltenów izolowanych z różnych źródeł, jest stosunek at omów H/C (charakteryzujący aromatyczność), który jest na stosunkowo stałym poziomie, około 1,15 [5, 9]. W przemyśle naftowym, asfalteny są substancjami, które negatywnie wpływają na proces wydobycia, transportu i przerobu ropy naftowej. Można je postrzegać, jako cholesterol ropy naftowej - wykazują tendencję do wytrącania się (flokulacji) z fazy ciekłej. Powodują zatykanie i korozję rurociągów, a w skrajnych przypadkach, wytrącając się w złożu ropy naftowej, mogą doprowadzić do zatkania całego odwiertu [10, 11]. Dotychczas asfalteny znalazły zastosowanie przede wszystkim przy produkcji mas bitumicznych i asfaltów przemysłowych [12]. Obecnie pojawiły się pomysły, aby zastosować asfalteny w technikach rozdzielania, jako sorbenty, zarówno w zastosowaniach analitycznych (fazy stacjonarne do GC), jak i procesowych (filtry do oczyszczania strumieni procesowych) [13, 14]. Celem badań tej pracy, było określenie i porównanie właściwości sorpcyjnych faz stacjonarnych na bazie frakcji asfaltenowych wyizolowanych z dwóch różnych materiałów naftowych asfaltu drogowego 20/30 i asfaltu naturalnego. W celu scharakteryzowania faz stacjonarnych, przeprowadzono analizy mieszanin testowych, zawierających typowe związki rozdzielane za pomocą chromatografii gazowej. W badaniach wykorzystano kolumny pakowane z fazą stacjonarną w postaci frakcji asfaltenowej naniesionej na stały nośnik (Chromosorb W AW-DCMS), które stanowią wygodne narzędzie do wstępnego określenia właściwości badanych faz stacjonarnych, ze względu na łatwość przy gotowania i niski koszt (w przeciwieństwie do kolumn kapilarnych). Obliczenie stałych Rohrschneidera-McReynoldsa, pozwoliło na określenie rodzaju oddziaływań i polarności badanych faz, oraz porównanie ich z innymi fazami stacjonarnymi stosowanymi w chromatografii gazowej. 2. Część eksperymentalna (Experimental) 2.1. Materiały i próbki (Materials and samples) Do wyizolowania frakcji asfaltenowych wykorzystano asfalt drogowy 20/30 (LOTOS Asfalt, Polska), asfalt naturalny ZECO UINTAITE 11-A (USA), n-heptan EMPLURA (Merck, Niemcy). Do przygotowania faz stacjonarnych, oprócz wyizolowanych frakcji asfaltenowych, wykorzystano (jako nośnik) Chromosorb W AW - DCMS 80/100 mesh (Johns-Manville, USA), dichlorometan cz.d.a. (POCH, Polska). Do sporządzenia mieszanin testowych wykorzystano szereg związków wzorcowych (Sigma -Aldrich, USA) oraz mieszaninę wzorcową n-alkanów (od C 5 do C 17 ) (Analytical Controls, Holandia). Rozpuszczalnik próbek stanowił disiarczek węgla cz.d.a. (Merck, Niemcy) oraz metanol cz.d.a. (POCH, Polska). W trakcie analiz chromatograficznych z detekcją płomieniowo jonizacyjną korzystano z następujących gazów: azot i powietrze (5N, Linde Gas, Polska) oraz wodór (5,5N z generatora wodoru) Aparatura (Apparatus) Do przeprowadzenia analiz chromatograficznych wykorzystano chromatograf gazowy Clarus 500 z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID) oraz automatycznym podajnikiem próbek (Perkin Elmer, USA) i oprogramowaniem TotalChrom 6.3 (Perkin Elmer, USA) oraz kolumny pakowane ze stali nierdzewnej (1/8, L = 3 m). W tabeli 1 zestawiono fazy stacjonarne wykorzystane w trakcie badań. Tabela 1. Zestawienie przebadanych faz stacjonarnych Table 1. Compilation of packed column studied. Nazwa Zawartość procentowa Faza stacjonarna kolumny fazy na nośniku [%] Asf7 Asf13 Frakcja asfaltenowa wyizolowana z asfaltu drogowego 20/30 Frakcja asfaltenowa wyizolowane z asfaltu naturalnego ZECO UINTAITE 11-A Grubość filmu fazy stacjonarnej [μm] 10,03 0, ,04 0,0864

25 Procedura prowadzenia badań (Procedures) Izolacja frakcji asfaltenowych (Isolation of asphaltenes) Frakcje asfaltenowe, użyte do badań, wyizolowano na drodze precypitacji, z wykorzystaniem n-heptanu według normy ASTM D4124 [15]. Próbki asfaltów drogowego 20/30 i naturalnego ZECO UINTAITE 11-A rozpuszczono w rozpuszczalniku w proporcjach 1g asfaltu: 100 ml n-heptanu. Roztwory doprowadzono do wrzenia i ogrzewano przez 1 godzinę co jakiś czas mieszając ręcznie zawartość, po czym odstawiono na noc. Następnego dnia roztwory przefiltrowano przez spiek szklany z membraną teflonową (0,45 μm, hydrofobowa). Osad przemyto gorącym n-heptanem do momentu, aż przesącz był bezbarwny (w praktyce jasno-słomkowy). Sączek wraz z przemytym osadem przeniesiono do zlewk i, dodano 80 ml świeżego n-heptanu i podgrzewano, okazjonalnie mieszając, przez 30 min. Roztwór przefiltrowano przez nowy, starowany sączek (PTFE, 0,45 μm, hydrofobowy). Otrzymany osad ponownie przemyto gorącym rozpuszczalnikiem do momentu aż przesącz był bezbarwny. Osad wraz z filtrem wysuszono w 104 C przez 1 h. Otrzymane frakcje asfaltenowe oznaczono jako Asf7 (z asfaltu drogowego 20/30) i Asf13 (z asfaltu naturalnego ZECO UINTAITE 11-A) Nanoszenie fazy stacjonarnej na nośnik i napełnianie kolumn (Coating of asphaltenes onto solid support and GC columns packing) Przed naniesieniem fazy stacjonarnej wykonano aktywację nośnika. Chromosorb W AW DMCS, w ilości niezbędnej do napełnienia kolumny (obliczonej na podstawie objętości kolumny oraz gęstości nasypowej nośnika), został umieszczony w kolbie okrągłodennej. Kolbę umieszczono w suszarce próżniowej, na co najmniej 4 h, w temperaturze 235 C. Po zakończonej aktywacji kolbę z nośnikiem wyjęto z suszarki i odstawiono, do ochłodzenia. W celu naniesienia fazy stacjonarnej na nośnik, odpowiednia ilość frakcji asfaltenowej (obliczona na podstawie masy nośnika i oczekiwanej zawartości procentowej fazy stacjonarnej), została umieszczona w kolbie stożkowej. Za pomocą cylindra miarowego odmierzono określoną iloś ć dichlorometanu (300 ml na 1 g frakcji asfaltenowej) i przelano do kolby zawierającej odważoną frakcję asfaltenową. Zawartość kolby mieszano ręcznie do momentu całkowitego rozpuszczenia frakcji asfaltenowej (zaniku widocznych cząstek stałych w kolbie). Frakcję asfaltenową rozpuszczoną w dichlorometanie przelano do kolby okrągłodennej z nośnikiem. Zawartość kolby wymieszano delikatnymi, kolistymi ruchami i umieszczono w wyparce obrotowej w celu odparowania rozpuszczalnika. Obroty kolby ustawiono na około 1 50 obrotów na minutę. Początkową odparowanie dichlorometanu prowadzono w temperaturze otoczenia, po około 40 minutach temperaturę podwyższono do 40 C i kontynuowano odparowywanie przez 15 minut. Immobilizację prowadzono w warunkach podciśnienia (0,8 atm). Po całkowitym odparowaniu rozpuszczalnika kolbę z fazą stacjonarną odłączono od wyparki obrotowej i umieszczono w suszarce próżniowej. Suszenie fazy stacjonarnej prowadzono w temperaturze 100 C, przez noc. Przed napełnieniem kolumny fazą stacjonarną, pustą zwiniętą kolumnę rozprostowano tak aby uniknąć tworzenia się zagięć, w których mogłoby dochodzić do zatrzymywania się fazy stacjonarnej. Jeden koniec rozprostowanej kolumny zatkano watą silanizowaną i poprzez odpowiednią przejściówkę podłączono do źródła próżni. Do drugiego końca kolumny podłączono lejek szklany, poprzez który do kolumny wsypywana była faza stacjonarna. Po włączeniu próżni, do lejka, porcjami wsypywano fazę stacjonarną. W celu lepszego upakowania kolumny wprawiano ją w drgania, poprzez ostukiwanie jej na całej długości. Wsypywania fazy stacjonarnej zaprzestawano w momencie uznania, że faza nie osuwa się dalej wzdłuż kolumny. Po napełnieniu kolumny fazą stacjonarną odłączono od niej lejek i źródło próżni. Koniec kolumny, do którego podłączony był lejek, zatkano watą silanizowaną. Na kolumnie zaznaczono kierunek wsypywania fazy stacjonarnej i zwinięto ją w zwój, z wykorzystaniem okrągłego przedmiotu o pożądanej średnicy (ok. 20 cm). Po napełnieniu kolumnę poddano kondycjonowaniu. Jeden koniec kolumny, napełnionej fazą stacjonarną, podłączono do dozownika chromatografu, tak aby przepływ gazu był zgodny z kierunkiem napełniania kolumny. Następnie, przepuszczano przez nią gaz obojętny (azot) o natężeniu przepływu 20 ml/min. Kondycjonowanie prowadzono, w chromatografie, poprzez dwukrotne ogrzewanie programem temperaturowym (40 C 2 C/min 300 C). Kolejnym krokiem, było podłączenie drugiego końca kolumny do detektora płomieniowo-jonizacyjnego (FID, ang.: flame ionization detector). Kolumnę ogrzewano w temperaturze 300 C, do osiągnięcia stabilnego przebiegu sygnału z detektora.

26 Badanie właściwości sorpcyjnych faz stacjonarnych (Investigation of GC retention characteristics of asphaltene-based stationary phases) W celu zbadania właściwości sorpcyjnych faz stacjonarnych, na bazie frakcji asfaltenowych, przeprowadzono analizę chromatograficzną mieszanin testowych, które zawierały typowe związki rozdzielane z wykorzystaniem chromatografii gazowej. Mieszaniny zostały przygotowane, poprzez pobranie 10 μl substancji wzorcowych do fiolek o pojemności 12 ml i dodanie do każdej z nich 10 ml disiarczku węgla. Roztwory mieszanin testowych umieszczono w fiolkach, z membraną, o pojemności 2 ml. Fiolki umieszczono w automatycznym podajniku próbek chromatografu. Dla każdej mieszaniny wykonano dwie analizy w założonych warunkach chromatograficznych, przedstawionych w tabeli 2. Tabela 2. Warunki chromatograficzne. Table 2. Chromatographic conditions. Warunki chromatograficzne Program temperaturowy 40 C (5 min) 10 C/min 250 C (25 min) Program ciśnieniowy 180 kpa (5 min) 5,7 kpa/min 300 kpa (25 min) Przepływ gazu nośnego (azotu) 20 ml/min Przepływ wodoru przez detektor FID 40 ml/min Przepływ powietrza przez detektor FID 450 ml/min Temperatura detektora FID 300 C Temperatura dozownika 300 C Objętość dozowania 0,5 μl w trybie splitless 3. Wyniki i ich dyskusja (Results and discussion) 3.1. Porównanie wyników rozdzielania mieszanin testowych (Compilation of GC separations results of test mixtures) W tabeli 3 przedstawiono wartości współczynników retencji i współczynników selektywności dla rozdzielanych związków. Związki zostały podzielone na grupy, a w ramach grup posegregowane względem rosnącej wartości współczynnika retencji na fazie Asf7. Tabela 3. Wyniki analizy mieszanin testowych na fazie Asf7 i Asf13 Warunki chromatograficzne podane w tabeli 2. Table 3. Results of chromatographic separations of test mixtures for Asf7 and Asf13 stationary phases. Chromatographic conditions as in table 2. Grupa Związek t.w. [ C] k [-] α C7 [-] Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 Węglowodory benzen 80,1 13,01 11,16 1,04 0,84 toluen 110,8 15,56 13,58 1,24 1,02 aromatyczne etylobenzen 136,2 17,48 15,45 1,39 1,16 propylobenzen 159,2 19,29 17,01 1,54 1,28 butylobenzen 183,3 20,97 18,58 1,67 1,40 Ketony diizopropyloketon 125,2 13,14 14,63 1,05 1,10 metyloizopropyloketon 94,2 15,07 15,00 1,20 1,13 2-pentanon 102,2 16,00 16,63 1,27 1,25 cyklopentanon 130,5 16,95 17,69 1,35 1,33 2-heksanon 127,6 17,83 18,45 1,42 1,39 cykloheksanon 155,4 19,00 19,98 1,51 1,50 3-heptanon 146,0 19,20 19,23 1,53 1,45 3-metylocykloheksanon 169,3 20,34 20,80 1,62 1,57 acetofenon 202,1 22,47 24,15 1,79 1,82 Tiofeny tiofen 84,1 12,79 11,18 1,02 0,84 2-metylotiofen 112,5 15,39 13,90 1,23 1,05 3-metylotiofen 115,4 15,51 13,91 1,23 1,05 2-etylotiofen 136,0 17,37 15,68 1,38 1,18

27 27 Sulfidy i disulfidy sulfid dietylu 92,1 14,46 12,45 1,15 0,94 disulfid dimetylu 109,7 14,91 15,44 1,19 1,16 sulfid dipropylu 142,8 18,30 18,33 1,46 1,38 disulfid dietylu 154,0 18,54 16,55 1,48 1,25 sulfid dibutylu 168,0 21,62 21,65 1,72 1,63 disulfid dipropylu 196,0 21,70 19,43 1,73 1,46 disulfid ditertbutylu 201,0 22,14 19,11 1,76 1,44 Tiole 1-pentanotiol 126,6 12,92 11,59 1,03 0,87 1-heksanotiol 152,7 13,33 17,01 1,06 1,28 tiofenol 169,1 17,54 15,39 1,40 1,16 1-dekanotiol 240,0 19,61 23,39 1,56 1,76 Pirydyny pirydyna 115,2 17,63 16,24 1,40 1,22 3-metylopirydyna 144,1 20,47 22,41 1,63 1,69 4-metylopirydyna 145,3 20,63 23,23 1,64 1,75 2,4-dimetylopirydyna 158,4 20,79 18,74 1,66 1,41 2,4,6-trimetylopirydyna 170,0 21,19 18,94 1,69 1,43 1-butanol 117,6 13,14 12,66 1,05 0,95 2-butanol 99,4 14,29 15,03 1,14 1,13 alkohol tertamylow y 102,4 14,69 12,81 1,17 0,97 2-merkaptoetanol 150,0 15,34 14,55 1,22 1,10 2-pentanol 119,1 16,18 14,81 1,29 1,12 alkohol amylow y 137,6 17,64 16,90 1,40 1,27 cykloheksanol 160,9 18,68 19,80 1,49 1,49 1-heksanol 156,9 19,20 17,79 1,53 1,34 1-heptanol 178,0 21,01 19,88 1,67 1,50 alkohol benzylowy 205,3 22,09 21,44 1,76 1,61 Inne nitropropan 131,2 15,91 17,15 1,27 1,29 nitrobenzen 210,7 22,05 21,11 1,76 1,59 p-tolueno aldehyd 202,0 22,93 24,51 1,83 1,85 Badania wykazały, że fazy stacjonarne Asf7 wykazują selektywność wystarczającą do uzyskania rozdzielenia mieszanin związków w ramach badanych grup. Na fazie Asf7 analizowane związki, w większości grup, są eluowane zgodnie z rosnącą temperaturą wrzenia. Największe odstępstwa od tej reguły zaobserwowano dla ketonów i alkoholi. W przypadku fazy Asf13 jedynie węglowodory aromatyczne oraz tiofeny ulegają elucji zgodnie z rosnącą temperaturą wrzenia. W stosunku do fazy Asf7 zaobserwowano zmianę w kolejności elucji związków z grupy ketonów (2 związki), sulfidów (4 związki), tioli (2 związki), alkoholi (6 związków). Największą selektywność, faza stacjonarna na bazie asfaltenów wyizolowanych z asfaltu naturalnego, wykazywała względem związków z grup węglowodorów aromatycznych i tioli. Dla wybranych grup związków obliczono także rozdzielczość (R), liczbę półek teoretycznych (N), oraz współczynnik asymetrii (A S ). Wartości tych parametrów zostały przedstawione w tabelach 4-6, pod którymi zamieszczono chromatogramy mieszanin związków z wybranych grup. Powstały one poprzez nałożenie na siebie chromatogramów odpowiednich mieszanin testowych, gdyż wyjściowe mieszaniny testowe były dobrane w ten sposób, by uzyskać pełne rozdzielenie związków w celu łatwej identyfikacji pików. Tabela 4. Zestawienie parametrów retencji dla badanych kolumn i mieszaniny węglowodorów aromatycznych. Table 4. Retention parameters on tested columns for aromatic hydrocarbons. k [-] α C7 [-] N [-] R [-] A S [-] Związek t.w. [ C] Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 benzen 80,1 13,01 11,16 1,04 0, ,35 1,51 toluen 110,8 15,56 13,58 1,24 1, ,58 1,47 1,85 2,18 etylobenzen 136,2 17,48 15,45 1,39 1, ,17 1,54 1,87 2,30 propylobenzen 159,2 19,29 17,01 1,54 1, ,97 1,38 2,03 2,54 butylobenzen 183,3 20,97 18,58 1,67 1, ,86 1,48 2,01 2,93

28 28 Rys. 1. Chromatogramy mieszaniny węglowodorów aromatycznych, otrzymane z wykorzystaniem kolumn z fazą stacjonarną Asf7 i Asf13. Piki: 1 benzen, 2 toluen, 3 etylobenzen, 4 propylobenzen, 5 butylobenzen. Warunki chromatograficzne podano w tabeli 2. Fig. 1. Chromatograms of aromatic hydrocarbons for Asf7 and Asf13 stationary phases. Peaks: 1 benzene, 2 toluene, 3 ethylbenzene, 4 propylbenzene, 5 butylbenzene. Chromatographic conditions as in table 2. Na fazie Asf7 uzyskano nieznacznie lepsze rozdzielnie związków z grupy węglowodorów aromatycznych, wynikające głównie z wyższej sprawności, w stosunku do fazy Asf13. Na fazie Asf13 uzyskano niższe wartości czasu retencji. Na obu fazach analizowane związki były eluowane zgodnie z rosnącą temperaturą wrzenia. Sprawność kolumn wzrastała wraz z czasem trwania analizy i była około dwukrotnie wyższa dla kolumny z fazą stacjonarną Asf7. Piki związków rozdzielanych na fazie Asf13 charakteryzowały się większym współczynnikiem asymetrii. Tabela 5. Zestawienie parametrów retencji dla badanych kolumn i mieszaniny sulfidów i disulfidów. Table 5. Chromatographic parameters compilation for sulphides and disulphides compounds on tested columns. Związek (1)sulfid dietylu (2) disulfid dimetylu (3) sulfid dipropylu (4) disulfid dietylu (5) sulfid dibutylu (6) disulfid dipropylu (7) disulfid ditertbutylu t.w. [ C] k [-] α C7 [-] N [-] R [-] A S [-] Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 92,1 14,46 12,45 1,15 0, ,82 2,08 109,7 14,91 15,44 1,19 1, ,51 2,11 1,73 1,87 142,8 18,30 18,33 1,46 1, ,77 1,42 2,13 1,92 154,0 18,54 16,55 1,48 1, ,25 0,95 1,90 2,61 168,0 21,62 21,65 1,72 1, ,45 2,00 2,30 1,60 196,0 21,70 19,43 1,73 1, ,09 0,22 2,10 3,03 201,0 22,14 19,11 1,76 1, ,32 0,46 1,24 1,60

29 29 Rys. 2. Chromatogramy mieszaniny sulfidów i disulfidów, otrzymany z wykorzystaniem kolumn z fazą stacjonarną Asf7 i Asf13. Pik: 1 sulfid dietylu, 2 disulfid dimetylu, 3 sulfid dipropylu, 4 disulfid dietylu, 5 sulfid dibutylu, 6 disulfid dipropylu, 7 disulfid ditertbutylu. Warunki chromatograficzne podano w tabeli 2. Fig. 2. Chromatograms of sulphide and disulphide mixtures separated on Asf7 and Asf13 stationary phases. Peaks: 1 diethyl sulphide, 2 dimethyl sulphide, 3 dipropyl sulphide, 4 diethyl disulphide, 5 dibutyl sulphide, 6 dipropyl disulphide, 7 ditertbutyl disulphide. Chromatographic conditions as in table 2. W przypadku sulfidów i disulfidów, na fazie Asf7 zaobserwowano nakładanie się pików sulfidu dietylu (1) i disulfidu dimetylu (2), sulfidu dipropylu (3) i disulfidu dietylu (4) oraz sulfidu dibutylu (5), disulfidu dipropylu (6) i disulfidu ditertbutylu (7). Związki te były eluowane w kolejności rosnącej temperatury wrzenia. Analiza pojedynczych składników prowadzi do otrzymania różnic w wartościach czasu retencji, lecz niewystarczająca sprawność kolumn uniemożliwia uzyskanie zadowalającego rozdzielenia w mieszaninie. Na fazie Asf13 uzyskano lepsze rozdzielenie związków, w krótszym czasie, z jednoczesną inwersją retencji pomiędzy disulfidem dietylu (4) i sulfidem dipropylu (3) oraz disulfidem ditertbutylu (7), disulfidem dipropylu (6) i sulfidem dibutylu (5). Podobnie jak w przypadku węglowodorów aromatycznych, faza Asf13 charakteryzuje się gorszą sprawnością i nieznacznie większą asymetrią pików. Tabela 6. Zestawienie parametrów retencji dla badanych kolumn i mieszaniny tiofenów. Table 6. Chromatographic parameters compilation for thiophenes on tested columns. k [-] α C7 [-] N [-] R [-] A S [-] Związek t.w. [ C] Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 tiofen 84,1 12,79 11,18 1,02 0, ,57 1,69 2-metylotiofen 112,5 15,39 13,90 1,23 1, ,05 2,02 1,82 2,20 3-metylotiofen 115,4 15,51 13,91 1,23 1, ,14 0,01 1,89 2,32 2-etylotiofen 136,0 17,37 15,68 1,38 1, ,28 1,59 1,89 2,54

30 30 Rys. 3. Chromatogramy mieszaniny tiofenów, otrzymany z wykorzystaniem kolumn z fazą stacjonarną Asf7 i Asf13. Chromatogramy powstały poprzez nałożenie chromatogramów odpowiednich mieszanin testowych. Pik: 1 tiofen, 2 2-metylotiofen, 3 3-metylotiofen, 4-2-etylotiofen. Warunki chromatograficzne podano w tabeli 2. Fig. 3. Chromatograms of thiophenes mixtures separated on Asf7 and Asf13 stationary phases. Peaks: 1 thiophene, 2 2-methylthiophene, 3 3-methylthiophene, 4 2-ethylthiophene. Chromatographic conditions as in table 2. Dla związków z grupy tiofenów nie zaobserwowano znaczących różnic pomiędzy oboma badanymi fazami. Na obu dochodziło do koelucji pików 2-metylotiofenu i 3-metylotiofenu. Faza Asf13 charakteryzowała się gorszą sprawnością oraz większą asymetrią pików. Dodatkową rzeczą odróżniającą obie fazy, widoczną na chromatogramach, jest kształt piku rozpuszczalnika (disiarczku węgla). Na fazie Asf13 jest on węższy i ma bardziej regularny kształt. Dla obu faz zaobserwowano wzrost sprawności, wraz ze wzrostem wartości czasu retencji Porównanie wartości liniowych indeksów retencji (Comparison of linear retention indices) W tabeli 7, zamieszczonej na końcu artykułu, przedstawiono liniowe indeksy retencji dla związków w mieszaninach testowych, dla badanych faz na bazie asfaltenów oraz dwóch komercyjnie dostępnych faz: niepolarnej DB-1 (100% PDMS) i polarnej DB-Wax (PEG). LRI dla faz DB-1 i DB-Wax odczytano z bazy danych Narodowego Instytutu Standaryzacji i Technologii Stanów Zjednoczonych (NIST, ang. National Institute of Standards and Technology). W przypadku braku danych dla niektórych związków i danych faz stacjonarnych podano indeksy retencji na fazach o podobnej charakterystyce. W przypadku kilku związków nie udało się znaleźć informacji na temat indeksów LRI, w zamian podano wartość indeksu retencji Kovátsa. Na podstawie liniowych indeksów retencji można stwierdzić, że wszystkie analizowane związki ulegają mniejszej retencji na obu fazach asfaltenowych, niż na polarnej fazie na bazie PEG. W kolumnie z fazą stacjonarną Asf7 badane związki ulegają większej retencji, niż na niepolarnej fazie stacjonarnej DB -1, poza tiolami które są eluowane szybciej. W przypadku fazy Asf13 mniejszej retencji, niż na fazie niepolarnej, ulegają wszystkie związki z grup węglowodorów aromatycznych, tiofenów i tioli Porównanie wartości stałych Rohrschneidera-McReynoldsa (Comparison of Rohrschneider-McReynolds constants) W tabeli 8, przedstawiono wartości stałych Rohrschneidera-McReynolds a dla badanych faz stacjonarnych oraz faz komercyjnie dostępnych, które zostały uszeregowane w kolejności rosnących wartości stałych. W tabeli uwzględniono, także wyniki z wcześniejszych badań nad fazami stacjonarnymi na bazie asfaltenów, które zostały opublikowane w artykule [13] fazy Asf1, Asf2, i Asf3. Stałe Rohrschneidera-McReynolds a (X, Y, Z, U, S ) obliczono na podstawie różnicy (ΔI) pomiędzy indeksami LRI, dla odpowiednich związków testowych, na fazach Asf7 i Asf13 a fazą odniesienia (skwalanem). Do wyznaczenia stałych wykorzystuje się pięć substancji (benzen, n-butanol, 2-pentanon, nitropropan i pirydynę), które uznaje się za wzorce dla różnych typów oddziaływań między fazą stacjonarną, a badanymi związkami [16-18].

31 31 Uzyskane wyniki ( (ΔI)) wskazują, że badane fazy stacjonarne mają charakter średniopolarny, przy czym faza Asf13 (605) jest mniej polarna niż faza Asf7 (690). W obu fazach najmniejszy wkład w wypadkowa selektywność tych faz okazują się mieć oddziaływania π-π (X ). Faza Asf13 jest pod tym względem zbliżona do skwalanu i fazy OV-1 (100% PDMS). Na fazie Asf7 największe znaczenie, mają oddziaływania protonoakceptorowe oraz oddziały wania dipolowe (Z, U, S ). Zarówno pod względem ogólnej polarności, jak i siły poszczególnych oddziaływań faza Asf7 jest zbliżona do fazy OV-7 (20% fenylometylo-pdms). W przypadku fazy Asf13 największą wartość przyjmuje stała U, charakteryzowana poprzez oddziaływanie fazy z nitropropanem i opisująca oddziaływania dipolowe. Podobną stałą U ma faza OV -17 (50% fenylometylo-pdms). Najniższą wartość, dla fazy Asf13, przyjmuje stała S, która jest miarą silnych oddziaływań protonoakceptorowych, i jest znacznie niższa niż dla fazy Asf7. Mimo, że obie fazy mają charakter średniopolarny, to wartości poszczególnych stałych Rohrschneidera-McReynolds a różnią się między sobą, w większym stopniu na fazie Asf13, niż fazie Asf7 (stałe Z, U, S mają prawie identyczne wartości). Efektem tych różnic jest odmienna selektywność fazy, na bazie asfaltenów wyizolowanych z asfaltu naturalnego, która objawia się zmianą kolejności elucji niektórych związków, w stosunku do fazy Asf7 (np. sulfidów i disulfidów). Tabela 8. Porównanie wartości stałych Rohrschneidera-McReynoldsa, dla faz stacjonarnych na bazie asfaltenów i faz komercyjnie dostępnych [19]. Table 8. Compilation of Rohrschneider-McReynolds constants for asphaltene and commercially available stationary phases. Faza Temp X Y Z U S Suma Min/Max ΔI (ΔI) Skwalan 20/ OV-1 100/ OV-7 0/ Asf13 25/ Asf7 25/ Asf1 25/ Asf3 25/ OV-11 0/ Asf2 25/ OV-202 0/ Carbowax 20M 60/ Podsumowanie (Summary) Przeprowadzone badania wykazały, że zastosowane fazy stacjonarne na bazie asfaltenów, wyizolowanych zarówno z asfaltu naturalnego (Asf13), jak i asfaltu drogowego (Asf7), mogą być wykorzystane do rozdzielania mieszanin związków, z wykorzystaniem chromatografii gazowej. W większości przypadków uzyskano rozdzielenie mieszanin testowych. Mechanizm rozdzielenia ma, prawdopodobnie, charakter adsorpcyjno-podziałowy. W niższych temperaturach zachodzi adsorpcja, a w miarę wzrostu temperatury i topnienia asfaltenów może pojawiać się mechanizm podziałowy, czego rezultatem byłyby różnice w sprawności kolumn zależne od czasu retencji analizowanych substancji wzorcowych. Sprawność rosła wraz ze wzrostem wartości czasu retencji, co może być spowodowane zmianą mechanizmu rozdzielenia z adsorpcyjnego na adso rpcyjno-podziałowy. W przypadku kolumny Asf7, dla wielu pików uzyskano zadowalającą, jak na kolumnę pakowaną, sprawność rzędu N/m. Dla kolumny z fazą Asf13 liczba półek teoretycznych była około dwukrotnie mniejsza, w porównaniu do fazy Asf7. Efektem niskich sprawności były szerokie piki. Dodatkowo, dla większości związków, zaobserwowano znaczące ogonowanie pików chromatograficznych, które może być efektem silnego oddziaływania rozdzielanych związków z fazą stacjonarną oraz częściowo jest charakterystyczne dla chromatografii adsorpcyjnej. Korzystne z punktu widzenia jakości rozdzielenia byłoby przygotowanie kolumn kapilarnych, co pozwoliłoby na uzyskanie węższych, bardziej symetrycznych pików i lepsze ich rozdzielenie, a co za tym idzie lepszą interpretację wyników. Przygotowane kolumny chromatograficzne charakteryzowały się podobną polarnością wyrażoną za pomocą sumy stałych Rohrschneidera-McReynolds a. Jednocześnie zauważalne są różnice w wartościach poszczególnych stałych pomiędzy badanymi fazami stacjonarnymi. Wpływ na to mają prawdopodobnie

32 32 różnice właściwości asfaltenów pomiędzy surowcami z jakich wyizolowano asfalteny. Wynikiem tego są różnice w selektywności względem rozdzielanych związków, widoczne m.in. w przypadku takich grup związków jak sulfidy i pirydyny. Porównanie stałych Rohrschneidera -McReynolds a dla badanych faz oraz tych komercyjnie dostępnych pozwoliło stwierdzić, że fazy asfaltenowe są zbliżone, swoimi właściwościami, do faz polidimetylosiloksanowych z kilkudziesięcioprocentowy m udziałem grup fenylowych (20-50%). Jednocześnie wszystkie fazy asfaltenowe (z tej i wcześniejszych prac) wykazały zbliżone właściwości. Fazy asfaltenowe wykazują korzystne cechy z punktu widzenia chromatografii gazowej, a także szeroko pojętych technik rozdzielania (w skali analitycznej i procesowej). Szczególnie interesująca jest selektywność tych faz względem niektórych związków, która zachęca do dalszych badań. Powinny one uwzględniać porównanie faz asfaltenowych wyizolowanych z różnych surowców oraz przygotowanie kolumn kapilarnych, które mają szereg zalet nad pakowanymi. Dodatkową zaletą faz asfaltenowych jest niski koszt ich przygotowania, wynikający z niskiej ceny i wysokiej dostępności surowca oraz mało skomplikowanej metody izolacji asfaltenów. Podziękowania (Acknowledgements) Prace były współfinansowane przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju w ramach projektu badawczego (Program LIDER, edycja V, nr projektu: LIDER/036/573/L-5/13/NCBR/2014) pt. Badania nad otrzymywaniem i właściwościami sorbentów wytwarzanych z asfaltów.

33 33 Tabela 7. Liniowe indeksy retencji dla związków z mieszanin testowych dla badanych faz i wybranych faz odniesienia. Dane literaturowe pochodzą ze źródeł [20]. Table 7. Linear retention indices of compounds on tested columns and two commercially available stationary phases nonpolar DB1 and polar DB-Wax. Linear retention indices for DB1 and DB-Wax were extracted from [20]. Grupa Związek t.w. [ C] DB-1 DB-Wax LRI [-] ΔLRI [-] ΔLRI [-] LRI [-] LRI [-] Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 Asf7 Asf13 Węglowodory benzen 80, aromatyczne toluen 110, etylobenzen 136, propylobenzen 159, butylobenzen 183, Ketony diizopropyloketon 125, metyloizopropyloketon 94, pentanon 102, cyklopentanon 130, heksanon 127, cykloheksanon 155, heptanon 146, metylocykloheksanon 169, acetofenon 202, Tiofeny tiofen 84, metylotiofen 112, metylotiofen 115, etylotiofen 136, Sulfidy i disulfidy sulfid dietylu 92, disulfid dimetylu 109, sulfid dipropylu 142, disulfid dietylu 154, sulfid dibutylu 168, disulfid dipropylu 196, disulfid ditertbutylu 201, b.d. b.d. b.d Tiole 1-pentanotiol 126, ,K heksanotiol 152, tiofenol 169, ,K dekanotiol 240, ,K Pirydyny pirydyna 115, metylopirydyna 144, metylopirydyna 145, ,4-dimetylopirydyna 158, ,4,6-trimetylopirydyna 170,

34 34 Alkohole 1-butanol 117, butanol 99, alkohol tertamylowy 102, merkaptoetanol 150, pentanol 119, alkohol amylowy 137, cykloheksanol 160, heksanol 156, heptanol 178, alkohol benzylowy 205, Inne nitropropan 131, nitrobenzen 210, p-tolueno aldehyd 202, OV-101, 2 HP-Wax, 3 BP-1, 4 SPB-1, 5 AT-Wax, 6 CP Sil 5 CB, 7 HP-Innowax, 8 skwalan, 9 Carbowax 20M, 10 PEG-20M, 11 CP-Wax 58CB, 12 OV-1, 13 HP-1, K indeks retencji Kovátsa

35 35 5. Literatura (Literature) [1] D. Chruszczyk, G. Boczkaj, Techniki i metody wyodrębniania, rozdzielania i oznaczania frakcji asfaltenowej w rafineryjnych strumieniach procesowych, 7 (2015) 5. [2] O.C. Mullins, The Asphaltenes, Annual Review of Analytical Chemistry (2011) 393. [3] H. Groenzin, O.C. Mullins, Molecular size and structure of asphaltenes from various sources, Energy Fuels 14 (2000) 677. [4] P. Redelius, Asphaltenes in bitumen, what they are and what they are not, Road Materials and Pavement Design 10 (2009) 25. [5] J.G. Speight, Petroleum asphaltenes - Part 1: Asphaltenes, resins and the structure of petroleum, Oil & Gas Science and Technology 59 (2004) 467. [6] M.R. Gray, G. Assenheimer, L. Boddez, W.C. McCaffrey, Melting and fluid behavior of asphaltene films at C, Energy Fuels 18 (2004) [7] B. Schuler, G. Meyer, D. Peña, O.C. Mullins, L. Gross, Unraveling the molecular structures of asphaltenes by atomic force microscopy, Journal of the American Chemical Society 137 (2015) [8] T.F. Yen, Structure of petroleum asphaltene and its significance, Energy Sources 1 (1974) 447. [9] N. Nciri, S. Song, N. Kim, N. Cho, Chemical characterization of gilsonite bitumen, Journal of Petroleum and Environmental Biotechnology 5 (2014) 1. [10] C.H. Arnaud, Digging into asphaltenes: mass spectrometry uncovers chemical details of petroleum s most recalcitrant fraction, Chemical & Engineering News 87 (2009) 12. [11] S.L. Kokal, S.G. Sayegh, Asphaltenes: the cholesterol of petroleum, SPE Middle East Oil Show, [12] F.S. Rostler, H.W. Sternberg, Compounding rubber with petroleum products - correlation of chemical characteristics with compounding properties and analysis of petroleum products used as compounding ingredients in rubber, Industrial and Engineering Chemistry 41 (1949) 598. [13] G. Boczkaj, M. Momotko, D. Chruszczyk, A. Przyjazny, M. Kamiński, Novel stationary phases based on asphaltenes for gas chromatography, Journal of Separation Science 39 (2016) [14] G. Boczkaj, M. Kamiński, M. Momotko, D. Chruszczyk, Sorbent, kolumna sorpcyjna lub chromatograficzna: sposób wykonania tych kolumn oraz sposób ich wykorzystania, patent PL P , [15] ASTM D , Standard test methods for separation of asphalt into four fractions. [16] L. Rohrschneider, Chromatographic characterization of liquid phases and solutes for column selection and identification, Journal of Chromatographic Science 11 (1973) 160. [17] M.H. Abraham, C.F. Poole, S.K. Poole, Classification of stationary phases and other materials by gas chromatography, Journal of Chromatography A 842 (1999) 79. [18] O.W. McReynolds, Characterization of some liquid phases, Journal of C hromatographic Science 8 (1970) 685. [19] T.J. Bruno, P.D.N. Svoronos, Handbook of basic tables for chemical analysis, CRC Press, Boca Raton, [20] NIST Chemistry Web Book, data dostępu:

36 CAMERA SEPARATORIA Volume 9, Number 1 / June 2017, pp Paweł PISZCZ, Iwona MARCINIAK, Bronisław K. GŁÓD* Zakład Chemii Analitycznej i Nieorganicznej, Instytut Chemii, Wydział Nauk Ścisłych, Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach, ul. 3 Maja 54, Siedlce *Autor do korespondencji, bkg@onet.eu Właściwości antyoksydacyjne herbat Streszczenie: Napar herbaciany składa się kilkuset związków, głównie z alkoholi, kwasów, polifenoli, a także kofeiny. Składniki herbat posiadają wiele właściwości prozdrowotnych m.in. zapobiegają zakrzepom, wspomagają aktywność soków trawiennych oraz hamują przechodzenie cholesterolu do krwioobiegu. Celem pracy było wyznaczenie całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (CPA) wodnych naparów różnych rodzajów herbat: b iałej (Fujien White), zielonej (Matcha i chińska liściasta), czarnej (Ceylon i Dourjeeling Himalaya), czerwonej (Pu erh), Oolong, żółtej oraz aromatyzowanych odmian herbat białej i czerwonej. W badaniach zastosowano metody spektrofotometryczne wykorzystują ce rodniki DPPH, ABTS + oraz wyznaczono całkowite stężenie polifenoli stosując odczynnik Folina -Ciocalteu. Przeprowadzono również wstępne pomiary CPA techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detek cją elektrochemiczną (HPLC/ED). Z przeprowadzonych badań wynika, że herbata biała posiada najwyższą wartość CPA, około sześć razy większą w porównaniu z CPA herbaty czerwonej, która charakteryzuje się najsłabszymi właściwościami antyoksydacyjnymi. CPA dla różnych odmian herbaty czarnej i zielonej różni si ę od siebie, odmianami dominującymi są Ceylon i chińska liściasta. Zastosowane w pracy metody pomiaru wartości CPA herbat wykazują dobrą korelację. Słowa kluczowe: całkowity potencjał antyoksydacyjny, antyoksydanty, wolne rodniki, herbata Antioxidant properties of teas Abstract: Tea infusion consists of several hundred compounds, mainly from alcohols, acids, polyphenols and caffeine. Ingredients of teas have many health-promoting properties, prevent thrombosis, support the activity of digestive juices and inhibit the passage of cholesterol into the bloodstream. The aim of the work was to determine the total antioxidant potential (TAP) of water infusions of various types of teas: white (Fujian White), green (Matcha and Chinese leafy), black (Ceylon and Darjeeling Himalayan), red (Pu-erh), Oolong, yellow and flavored varieties of white and red teas. In order to investigate the TAP we used spectrophotometric (DPPH, ABTS +, total concentration of polyphenols - Folina-Ciocalteu reagent) and chromatographic methods (HPLC/ED). The study showed that white tea has the highest TAP value, about six times higher than TAP of red tea, which is characterized by the weakest antioxidant properties. TAP for different varieties of black and green tea are different from each other, the dominant varieties are Ceylon and Chinese leafy. The methods of measuring TAP values various types of teas used in the work show good correlation. Key words: total antioxidant potential, antioxidants, free radicals, tea 1. Wstęp (Introduction) Herbata (Thea Sinensis) to wiecznie zielona roślina pochodząca z rośliny kamelii. Wyróżnia się jej trzy podstawowe gatunki herbatę z Chin, Kambodży i Assamu. Gatunkiem pochodzącym z Chin jest Camellia sinensis. Roślina ta osiąga maksymalną wysokość w granicach 3 4,5 metrów. Jest odporna na bardzo niskie temperatury, wytwarza liście o długości 5 centymetrów przez okres 100 lat. Najlepiej rośnie w Chinach, Tybecie i Japonii. Kolejną odmianą jest Camellia assamica subspecies lasiocalyx. Drzewo to osiąga maksymalną wysokość 4,5 metra. Pochodzi z Kambodży i jest używana do produkcji różnych mieszanek herbat. Trzecim gatunkiem herbaty wyróżnianym przez botaników jest Camellia assamica. Drzewo osiągające nawet metrów wysokości, produkuje liście o długości centymetrów przez około 40 lat. Obecnie Camellia assamica uprawiana jest w Japonii, Indiach, Birmie, Cejlonie i Jawie. Najkorzystniejsze warunki klimatyczne dla krzewów herbacianych występują w strefie klimatów tropikalnych i subtropikalnych. Szybki wzrost rośliny obserwujemy na żyznej, lekko kwaśniej glebie. Optymalna temperatura dla rozwoju krzewu mieści się w granicach C [1].

37 37 Wyróżniamy sześć podstawowych rodzajów herbat biała, zielona, czarna, czerwona, Oolong oraz żółta. Poszczególne odmiany różnią się od siebie sposobem obróbki, co przekłada się na ich smak oraz właściwości. Liście krzewów herbaty składają się z wielu substancji chemicznych, które wpływają na charakterystyczny zapach, kolor i smak poszczególnych naparów. Liście składają się w 75 80% z wody, której ilość zostaje zmniejszona do 60 70% w wyniku więdnięcia. W przypadku Oolonga oraz herbaty czarnej polifenolowe flawony w procesie utleniania pod wpływem tlenu zawartego w powietrzu tworzą unikatowy zapach i kolor naparu. Suszenie liści redukuje zawartość wody do 3% i dezaktywuje enzym odpowiedzialny za utlenianie [2]. Herbata jest produktem całkowicie naturalnym, nie zawiera środków suszących, sztucznych barwników czy aromatów. Napój herbaciany spożywany bez dodatku cukru i mleka posiada praktycznie zerową ilość kalorii oraz odgrywa ważna rolę w utrzymaniu odpowiedniego poziomu nawodnienia organizmu. Skład chemiczny świeżo zebranych liści od herbaty sypkiej jest różny. Niektóre z nich ulegają procesowi utlenienia, inne tworzą zupełnie nowe związki. Napar herbaciany składa się kilkuset związków, w tym z alkoholi, kwasów, polifenoli, a także kofeiny. Składniki herbat wykazują pozytywne działanie w zapobieganiu schorzeniom serca. Wynika to z obecności w ich składzie kofeiny, która stymuluje oraz wspomaga aktywność soków trawiennych. Polifenole zawarte w herbacie zmniejszają szybkość przyswajania kofeiny, a więc jej działanie pojawia się później i trwa dłużej. Poza tym polifenole hamują także przechodzenie cholesterolu do krwioobiegu oraz zapobiegają tworzeniu się zakrzepów. Herbata jest bogata we fluor oraz witaminy A, B, C i P. Napój herbaciany posiada właściwości antymutagenne, zmiata wolne rodniki, zapobiega powstawaniu zmarszczek, rozświetla i nawilża cerę, a także wspomaga koncentrację [2]. Właściwości antyoksydacyjne oraz stężenie polifenoli dla różnych rodzajów herbat zostały prześledzone w wielu badaniach. Wykorzystując metodę absorpcji rodników ponadtlenkowych (ORAC) stwierdzono, że herbaty zielona i czarna wykazują wyższą aktywność przeciwutleniającą względem rodników peroksylowych niż warzywa (czosnek, szpinak, kapusta, brukselka) [ 3]. Całkowity potencjał antyoksydacyjny zielonej herbaty oznaczony dzięki zdolności redukowania jonów żelaza (FRAP) jest wyższy niż dla herbat czarnej i czerwonej [4]. Wartość CPA zielonej herbaty jest zazwyczaj wyższa, niż w przypadku herbaty czarnej i Oolong. Dowiedziono jednak, że flawonoidy zawarte w czarnej herbacie są równie skutecznymi przeciwutleniaczami, co katechiny wchodzące w skład herbaty zielonej [ 5, 6]. Za pomocą metody Folina- Ciocalteu określono całkowite stężenie fenoli oraz cześć katechin w nich zawartych dla herbat czarnej i zielonej. Najwięcej polifenoli znajduje się w czarnej herbacie z Cejlonu (około 135 mg/g suchej masy), natomiast najwyższy procent katechin posiada czarna herbata Dourjeeling (około 35%). Zawartość polifenoli w zielonej herbacie mieści się w zakresie od 60 do 106 mg/g suchej masy, a procent katechin wynosi od 50 do 98%. Najwyższe wartości zaobserwowano w japońskiej zielonej herbacie Bandia [7]. Celem pracy było określenie całkowitego potencjału antyoksydacyjnego wodnych naparów różnych gatunkowo herbat. CPA zbadano za pomocą metod spektrofotometrycznych z zastosowaniem rodników DPPH, ABTS + oraz oznaczono całkowite stężenia polifenoli metodą Folina-Ciocalteu. W pracy wykonano także wstępne pomiary CPA stosując wysokosprawną chromatografię cieczową z detekcją elektrochemiczną (HPLC/ED). 2. Część eksperymentalna (Experimental) W badaniach korzystano z następujących odczynników chemicznych: woda trójkrotnie destylowana (otrzymana w laboratorium z wykorzystaniem aparatu kwarcowego wody, Heraeus Quarzglas, Destamat, Niemcy), metanol (99,9% czysty do HPLC), (Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy), DPPH (2,2-difenylo-1- picrylohydrazyl), (Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy), ABTS (2,2 -azynobis(3-etylobenzotiazolino-6- sulfonian) diamonowy), (Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy), odczynnik Folina-Ciocalteu a (FC), kwas galusowy, diwodoroortofosforan sodu (Chempur, Piekary Śląskie, Polska), wodoroortofosforan disodu, węglan sodu (Chempur, Piekary Śląskie, Polska), bufor fosforanowy w tabletkach o ph 7,4, PBS (phosphate buffered saline), (Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy). W pomiarach CPA korzystano z aparatury: wysokosprawny chromatograf cieczowy (HPLC) firmy Knauer (Berlin, Niemcy) (składający się z: interfejsu Smartline Manager 5000 z wbudowanym degazerem, dwutłokowej pompy Smartline 1000 o przepływie fazy ruchomej w granicach 0, ml/min, kolumny analitycznej Eurospher 5 C18, 4 x 150 mm, autosamplera Smartline 3800, detektora amperometrycznego EC3000 (układ trójelektrodowy: elektroda pracująca - węgiel szklisty, elektroda pomocnicza - Pt, elektroda odniesienia - Ag/AgCl), komputera z oprogramowaniem do rejestracji i obróbki danych ClarityChrom). Pomiary spektrofotometryczne wykonano na spektrofotometrze mikropłytkowym Epoch (BioTek Instruments, Inc. USA) sterowanym za pomocą programu Gen5 (wszystkie pomiary zostały wykonane z wykorzystaniem płytek 96-dołkowych). Ponadto korzystano z wirówki laboratoryjnej Centrfuge MPW (MPW Med. Instruments, Polska), wagi analitycznej (RADWAG, WAA 100/C/1, Radom, Polska) o dokładności 10-4 g oraz wagi analitycznej (Sartorius, Werke GmbH, Göttingen, Niemcy) o dokładności 10-6 g, a także z łaźni ultradźwiękowej (Sonorex RK 250H, Bandelin, Niemcy).

38 38 Materiałem badawczym w pracy było dziesięć różnych rodzajów herbat: biała (odmiana: Fujien White), zielona (odmiany: Matcha i chińska liściasta), czarna (odmiany: Ceylon i Dourjeeling Himalaya), czerwona (odmiana: Pu erh), Oolong, żółta (odmiana: Fithess), biała aromatyzowana Biała Dama (odmiana: Fujien White, z dodatkami: ananasa, płatków słonecznika, yerba maty), czerwona aromatyzowana (odmiana: Pu erh, dodatki: czerwona i czarna porzeczka). Na wadze analitycznej odważono po 0,6 g poszczególnych herbat, a następnie z naważek przygotowano wodne napary. Każdą próbkę zalano 40 ml wody d estylowanej o temperaturze 95ºC i parzono pod przykryciem przez 3 minuty. Tak przygotowane napary herbaciane odwirowano oraz przesączono za pomocą filtru strzykawkowego o średnicy porów 0,45 µm. W pomiarach fotometrycznych (z wykorzystaniem DPPH oraz ABTS) i chromatograficznych uży to próbki dwukrotnie rozcieńczone wodą destylowaną o stężeniu 7,5 mg/ml. W przypadku pomiarów z odczynnikiem Folina - Ciocalteu stężenie próbek wynosiło 15 mg/ml. Oznaczanie CPA herbat metodą DPPH (Determination of TAP teas using DPPH assay) Spektrofotometryczna metoda pomiaru całkowitego potencjału antyoksydacyjnego względem rodników DPPH została wykonana przy 517 nm. Kinetyka reakcji trwała 10 minut, z częstotliwością odczytów co 30 sekund. Roztwór DPPH w wyniku reakcji zmienia swoją barwę z purpurowej na żółtą. Mierzy się spadek absorbancji w porównaniu z próbką kontrolną. CPA wyznaczono po 5 minutach od rozpoczęcia pomiaru. Wyniki CPA przeliczono na ekwiwalent kwasu galusowego, GAE (mg GA/ 1 g naparu). Do dołka płytki pomiarowej odmierzono: 5 µl naparu z herbaty o stężeniu 7,5 mg/ml, 45 µl wody destylowanej, 250 µl roztworu DPPH. Wykonano krzywą kalibracyjną dla kwasu galusowego: C GA = 0,188/A (gdzie: C GA stężenie kwasu galusowego, A absorbancja). Została ona opracowana na podstawie trójkrotnie powtórzonych pomiarów absorbancji dla sześciu różnych stężeń kwasu galusowego z zakresu stężeń GA 0 8,3 µg/ml. Oznaczanie całkowitego stężenia polifenoli (Determination of total polyphenols concentration) Podstawą metody FC jest odwracalna reakcja redukcji molibdenu (VI) do molibdenu (V) prowadzona w środowisku zasadowym. Powstały w wyniku reakcji związek o niebieskiej barwie posiada maksimum absorpcji przy określonej długości fali 765 nm. Intensywność absorpcji obserwowana przy 765 nm jest proporcjonalna do stężenia fenoli w próbce. Do dołka płytki pomiarowej odmierzono: 5 µl naparu z herbaty, 25 µl odczynnika FC, 100 µl 20% Na 2 CO 3, 120 µl wody destylowanej. Tak przygotowaną płytkę odstawiono w ciemne miejsce na 30 minut, a następnie zmierzono absorbancję próbek. Sporządzono krzywą kalibracyjną dla kwasu galusowego z zakresu stężeń 0 8,3 µg/ml (A = 0,092 C GA, R² = 0,9977). CPA został przedstawiony jako ekwiwalent kwasu galusowego. Wyniki CPA przeliczono na ekwiwalent kwasu galusowego [GAE = mg GA/g naparu]. Oznaczanie CPA metodą ABTS (Determination of TAP using ABTS assay) Metoda wykorzystująca kationorodnik ABTS.+ (2,2 -azynobis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonian) diamonowy) polega na wytworzeniu rodników w reakcji ABTS z utleniaczem (K 2 S 2 O 8 ). Powstały kationorodnik charakteryzuje się zielononiebieskim zabarwieniem. Pomiary wykonano dla dwóch wartości długości fali 414 i 734 nm. Obie długości fali charakteryzują się najwyższą różnicą pomiędzy wartością absorbancji formy utlenionej i zredukowanej. Do dołka płytki pomiarowej odmierzono: 2 µl naparu z herbaty, 298 µl roztworu ABTS rozcieńczonego w stosunku 1:14 z wodą destylowaną. Odczekano jedną minutę i po jej upływie uruchomiono pomiar abs orbancji. CPA herbat wyrażono jako % inkubacji próbki (. CPA mierzone za pomocą metody HPLC z detekcją elektrochemiczną (ED) (TAP measured by HPLC method with electrochemical detection) Pomiary chromatograficzne z detekcją elektrochemiczną (zakres potencjałów E = 0, 6 1,0 V) przeprowadzono w układzie faz odwróconych (RP -C18) na kolumnie Eurospher C18 (Knauer), jako fazę ruchomą zastosowano bufor fosforanowy (ph=5,8 z 5% dodatkiem metanolu). Pomiary prowadzono w temperaturze 20 C. Szybkość przepływu fazy ruchomej wynosiła 1 ml/min, a objętość nastrzykiwanej na kolumnę próbki 20 μl. Miarą CPA [8, 9] było sumaryczne pole powierzchni wszystkich pików eluowanych do 60 minuty trwania analizy.

39 Absorbancja [AU] Wyniki i ich dyskusja (Results and discussion) Zmianę absorbancji w trakcie reakcji rodników DPPH z podstawowymi odmianami naparów z herbat przedstawiono na rysunku 1. Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, że biała herbata posiada największe właściwości antyoksydacyjne, co odpowiada 87 GAE. Czerwona herbata charakteryzuje się najniższą mocą antyoksydacyjną 1 g naparu jest równoważny 14 mg GA (rys. 4). Wartości CPA DPPH dla różnych odmian herbaty zielonej i czarnej różnią się od siebie. Różnica wartość GAE dla dwóch rodzajów herbaty zielonej wynosi 44 mg, na korzyść odmiany chińskiej liściastej. W przypadku rożnych rodzajów herbaty czarnej wynosi ona 48 mg, a dominującą odmianą jest Ceylon (rys. 3). Wzbogacenie herbaty Pu-erh czerwoną i czarną porzeczką (rys. 2) zwiększa jej właściwości antyoksydacyjne. Owoce te są bogate we flawonoidy, witaminę C oraz kwasy fenolowe. Główne antyoksydanty porzeczki to antocy jany, które stanowią ponad 90% polifenoli znajdujących się w tych owocach [10, 11]. Urozmaicenie odmiany Fujien White płatkami słonecznika i kawałkami ananasa obniża jej moc antyoksydacyjną. Prawdopodobnie jest to skutek zastąpienia w części próbki czystej herbaty dodatkami, a więc zmniejszenie stężenia herbaty oraz ostatecznie zmniejszenie stężenia związków o właściwościach antyoksydacyjnych w niej występujących Czas [min] próba kontrolna czerwona żółta Oolong czarna Ceylon zielona chińska biała Rys. 1. Zmiany absorbancji w metodzie DPPH. Fig. 1. Change of absorbance in DPPH assay.

40 Absorbancja [AU] Absorbancja [AU] Czas [min] czerwona czerwona z porzeczką próba kontrolna biała biała dama Rys. 2. Zmiany absorbancji w metodzie DPPH. Fig. 2. Change of absorbance in DPPH assay Czas [min] zielona chińska czarna Ceylon próba kontrolna zielona Matcha czarna Dourjeeling Himalaya Rys. 3. Zmiany absorbancji w metodzie DPPH. Fig. 3. Change of absorbance in DPPH assay.

41 biała zielona czarna Ceylon Oolong żółta czerwona % CPA biała zielona chińska czarna Ceylon biała dama Oolong zielona Matcha żółta czerwona z porzeczką czarna Dourjeeling Himalaya czerwona CPA DPPH [GAE] Rys. 4. CPA DPPH badanych herbat wyznaczony metodą DPPH. Fig. 4. TAP DPPH of tested teas determined using DPPH assay. Wartości CPA ABTS [%] w odniesieniu do ABTS + poszczególnych rodzajów herbat są podobne w pomiarach prowadzonych przy obu długościach fali 414 i 730 nm (rys. 5). Największymi właściwościami antyoksydacyjnymi w odniesieniu do ABTS + charakteryzuje się biała i zielona herbata, a najniższymi żółta i czerwona nm 730 nm Rys. 5. CPA ABTS badanych herbat wyznaczony metodą ABTS. Fig. 5. TAP ABTS of tested teas determined using ABTS assay. Z wyników CPA FC przedstawionych na rysunku 6 możemy wywnioskować, że herbata biała posiada w swoim składzie najwyższe stężenie związków fenolowych. Całkowity potencjał antyoksydacyjny herbaty zielonej (odmiana chińska) oraz czarnej (odmiana Ceylon) oscyluje wokół podobnej wartości. Porównywalne

42 CPA DPPH [GAE] biała zielona chińska czarna Ceylon czarna Dourjeeling Himalaya zielona Matcha biała dama Oolong żółta czerwona z porzeczką czerwona CPA FC [GAE] 42 wartości CPA FC posiadają również herbata żółta, Oolong i biała aromatyzowana ( biała dama ). Herbata czerwona oraz jej odmiana aromatyzowana zawierają w swoim składzie najniższe stężenie polifenoli Rys. 6. CPA FC badanych próbek wyznaczony metodą Folina-Ciocialteu. Fig. 6. TAP FC of the samples determined using Folina-Ciocialteu assay. Wartości CPA dla ekstraktów z herbat: białej, zielonej (odmiany chińska liściasta i Matcha), czarnej (odmiana Ceylon), Oolong, żółtej, czerwonej i czerwonej aromatyzowanej uzyskane za pomocą różnych metod fotometrycznych porównano oraz przedstawiono na rysunku 7. W obu metodach biała herbata posiada największe właściwości antyoksydacyjne, a herbata czerwona charakteryzuje się najniżs zymi wartościami CPA. Obydwie metody bardzo podobnie szeregują wartości CPA [GAE] badanych herbat y = 0,734x + 23,826 R² = 0, CPA FC [GAE] Rys. 7. Korelacje CPA DPPH i CPA FCR badanych próbek. Fig. 7. Correlation TAP DPPH and TAP FCR of tested samples.

43 43 Przeprowadzono także wstępne badania CPA HPLC/ED za pomocą metody HPLC z detekcją elektrochemiczną. Na podstawie otrzymanych chromatogramów ekstraktu z herbaty białej zarejestrowanych przy dwóch wartościach potencjału elektrody pracującej (rys. 8) zaobserwowano, że przy wyższym potencjale 0,8 V pojawia się większa ilość pików oraz są one wyższe. Sygnały, które pojawiają się jedynie w przypadku wyższego potencjału pochodzą od słabych antyoksydantów (np. czas retencji wynoszący około 3 i 9 minut). Analogicznie przedstawia się sytuacja na chromatogramie ekstraktu z herbaty czerwonej (rys. 9). W 4 minucie pomiaru przy potencjale 0,8 V na chromatogramie obserwujemy wysoki pik, który nie jest widoczny w pomiarze prowadzonym przy potencjale 0,6 V. Sygnał ten pochodzi od związku posiadającego słabe właściwości antyoksydacyjne. Rys. 8. HPLC/ED chromatogramy herbaty białej (zarejestrowane przy 0,6 V niebieski sygnał i 0,8 V czerwony sygnał). Warunki chromatograficzne: kolumna Eurospher C18, 5 μm, 150 x 4 mm (Knauer); temperatura 20 C; faza ruchoma bufor fosforanowy ph 5,8 / 5% MeOH; szybkość przepływu: 1 ml/min, dete kcja elektrochemiczna (vs Ag/AgCl). Fig. 8. HPLC/ED chromatograms of white tea (0.6 V blue signal and 0.8 V red signal). Experimental conditions: column Eurospher C18, 5 μm, 150 x 4 mm (Knauer); temperature 20 C; mobile phase phosphate buffer ph 5,8 / 5% MeOH; flow rate 1 ml/min, electrochemical detection (vs Ag/AgCl). Rys. 9. HPLC/ED chromatogramy herbaty czerwonej (zarejestrowane przy 0,6 V bordowy sygnał i 0,8 V czerwony sygnał). Warunki chromatograficzne jak na rys. 8. Fig. 9. HPLC/ED chromatograms of red tea (0.6 V maroon signal and 0.8 V red signal). Experimental conditions the same as on fig. 8.

44 44 Chromatogramy herbat białej i czerwonej uzyskanych na detektorze elektrochemicznym przy potencjale 0,8 V przedstawiono na rysunku 10. Porównując pola powierzchni wszystkich eluowanych pików i ich wysokości można stwierdzić, że CPA HPLC/ED herbaty białej jest około sześć razy większy niż herbaty czerwonej. Tak różne właściwości antyoksydacyjne tych herbat mogą wynikać m.in. z procesu ich obróbki. Herbata biała (podobnie jak zielona) należy do herbat niepoddanych procesowi fermentacji. Dzięki takiej obróbce liście herbaty białej zachowują cenne właściwości antyok sydacyjne. Herbata czerwona przechodzi proces fermentacji i dodatkowo leżakowania. Traci przez to część swoich cennych właściwości antyoksydacyjnych. Jej charakterystyczną cechą jest bardzo wyrazisty zapach i smak. Rys. 10. HPLC/ED chromatogramy herbat białej (zielony sygnał) i czerwonej (czerwony sygnał), zarejestrowane przy 0,8 V. Warunki chromatograficzne jak na rys. 8. Fig. 10. HPLC/ED chromatograms of white (green signal) and red teas (red signal) registered at 0.8 V. Experimental conditions the same as on fig Wnioski (Conclusions) Właściwości antyoksydacyjne różnych rodzajów herbat są zróżnicowane. CPA herbaty białej jest około sześć razy większy w porównaniu z CPA herbaty czerwonej, co zostało wykazane wszystkimi metodami stosowanymi w pracy. Wartości CPA naparów z herbat otrzymane za pomocą rodników DPPH oraz odczynnika Folina-Ciocalteu posiadają dobrą korelację. Przedstawione w pracy metody pomiaru CPA mogą być zastosowane do badania zdolności antyoksydacyjnych naparów z herbat. 5. Literatura (Literature) 1. R. Dewing, The Tea Companion, Quintet Publishing Limited, Brighton M. Capari, Herbata, Zakład Poligraficzno Wydawniczy POZKAL, Warszawa G. Cao., E. Sofic., R. L. Prior, Antioxidant Activity of Tea, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44 (1996)

45 45 4. J. F. F. Benzie, Y. T. Szeto, Total Antioxidant Capacity of Teas Analyzed by the FRAP Method, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47 (2) (1999) A. J. Stewart, W. Mullen, A. Crozier, On-line HPLC Analysis of the Antioxidant Activity of Phenolic Compounds in Green and Black Tea, Molecular Nutrition and Food Research, 49 (2005) L. K. Leung, Y. Su, R. Chen, Theaflavins in Black Tea and Catechins in Green Tea are Equally Effective Antioxidants, Journal of Nutrition, 131, (2001) Y. Hara, Antioxidant Activity of Tea Polyphenols, International Biotechnology Laboratory, 2, (1994) P. Piszcz, B.K. Głód, Właściwości antyoksydacyjne ziół zbadane rożnymi metodami, Camera Separatoria, 8 (2016) P.M. Wantusiak, P. Piszcz, B.K. Głód, A fast and simple method for the measurement of total antioxidant potential and a fingerprint of antioxidants, Journal of Chromatographic Science, 50 (2012) E. Ambożewicz, E. Skrzydlewska, Antyoksydacyjne właściwości czarnej porzeczki, F armaceutyczny Przegląd Naukowy, 10, (2009) E. Piątkowska, A. Kopeć, T. Leszczyńska, Antocyjany charakterystyka, występowanie i oddziaływanie na organizm człowieka, Żywność. Nauka. Technologa, Jakość, 4 (77) (2011)

46 46 INSTRUKCJE DLA AUTORÓW W wydawane są artykuły oryginalne (nie publikowane wcześniej) oraz przeglądowe poświęcone różnym działom nauki, techniki i technologii rozdzielania. Dodatkowo publikowane będą listy do redakcji, informacje na temat aparatury naukowej, recenzje książek, reklamy, materiały firmowe, sprawozdania redakcji jak również informacje o konferencjach. Artykuł do CamSep przygotowany w edytorze Microsoft Word 2003 lub nowszym (w formacie.doc lub.docx) zgodnie z przedstawionym poniżej opisem należy przesłać wraz z listem motywacyjnym na adres camera.separatoria@gmail.com. Nie ma ograniczenia co do długości artykułu. * * * Jan KOWALSKI, Anna KOWALSKA* (Arial 12 pkt., bold) 1 Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny, Wydział Nauk Ścisłych, Instytut Chemii, Zakład Chemii Analitycznej, ul. 3 Maja 54, Siedlce, * Autor do korespondencji, camera.separatoria@gmail.com 2 Uniwersytet (Afiliacja Arial 9 pkt., normal bez boldu) Tytuł artykułu w języku polskim 12 pkt. Arial bold Streszczenie: (Arial 9 pkt. normal bold). Treść streszczenia Arial 9 pkt. kursywa bez boldu. Streszczenie polskojęzyczne powinno zawierać około znaków (ze spacjami). Należy w nim krótko wskazać czego dotyczy artykuł, co jest w nim nowego oraz podsumowanie wniosków. Słowa kluczowe: 5-8 słów, bez skrótów i akronimów, Arial 9 pkt., bez boldu, kursywą Tytuł artykułu w języku angielskim 12 pkt. Arial bold kursywa Abstract: (Arial 9 pkt. normal bold). Streszczenie anglojęzyczne Arial 9 pkt. kursywa bez boldu, powinno być rozszerzone, o objętości około znaków (ze spacjami). Powinno zawierać: wskazanie czego dotyczy artykuł, co jest w nim nowego oraz podsumowanie wniosków. Key words: 5-8 słów, bez skrótów i akronimów, Arial 9 pkt., bez boldu, kursywą Podtytuły ponumerowane Arial 12 pkt., bold (Wstęp, Część eksperymentalna, Wyniki i dyskusja, Podsumowanie lub Wnioski, Literatura itp.) wersja polska - normal i (angielska - kursywą), Śródtytuły ponumerowane Arial 11 pkt., bold, wersja polska i angielska - kursywą Wcięcia akapitowe na 1,0 cm, tekst podstawowy wyjustowany Arial 10 pkt., odstępy między wierszami pojedyncze. Nie wymuszać w żaden sposób podziałów wierszy. Wszystkie marginesy 2 cm. Wzory i rysunki należy sformatować jako obiekty wyśrodkowane przenoszone z tekstem. Wzory napisane w edytorze równań należy traktować jako element zdania np.: V t F R R (1)

47 47 gdzie: V R objętość retencji, t R czas retencji [min.], F przepływ gazu nośnego [cm 3 /s]. Symbole użyte we wzorach powinny mieć rozmiar zgodny z rozmiarem czcionki tekstu rozdziału. Wzory należy numerować kolejno w całym tekście artykułu. Numery wzorów powinny być wyrównane do prawej. Oznaczenia stosowane na rysunkach i w tabelach muszą być czytelne i zgodne z oznaczeniami używanymi we wzorach i w tekście artykułu. Nazwy związków chemicznych stosować zgodnie z nomenklaturą IUPAC, jednostki z układu SI. W odpowiednie miejsca w tekście należy wstawić rysunki i tabele wraz z tytułami. Powinny one znajdować się w miejscach, w których po raz pierwszy są do nich odwołania w tekście artykułu. Rysunki i zdjęcia zamieszczone w artykule muszą być czytelne i kontrastowe oraz zapisane jako czarno -białe lub w skali odcieni szarości (w wersji elektronicznej mogą być w kolorze). Rysunki i tabele należy numerować kolejno w całym tekście artykułu (Rys. i Tab. nr arabskie). Tytuły rysunków i tabel należy podać w języku polskim i angielskim (kursywą) jak na przykładzie przedstawionym poniżej: Tabela 1. Całkowita emisja metali z obszaru Polski według rodzajów działalności. Arial 10 pkt. Table 1. Total emission of heavy metals in the area of Poland kinds of activities. Arial 10 pkt. Ogółem (Total) Elektrociepłow nie, elektrow nie, ciepłow nie (Heat and power plants, power stations) Cd Pb Cu Zn Ni tony 66,1 555,0 390,9 2345,1 295,8 1,9 19,9 12,8 59,2 72,2 Tabele w pionie nie mogą przekraczać szerokości 12 cm, a w poziomie 18 cm. Czcionka wewnątrz tabeli Arial 8 lub 9 pkt. Rysunek, wykres, czy inna forma materiału ilustracyjnego nie może przekraczać w pionie szerokości 12 cm, wysokości 18 cm; w poziomie szer. 18 cm, wysokości 9 10 cm (na stronie musi zmieścić się jeszcze podpis do rysunku). Materiał ilustracyjny powinien być zapisany z rozszerzeniem JPG i przesłany dodatkowo w oddzielnych plikach podpisanych, jako Rys.1., Rys. 2. itd. Rys. 1. Tytuł rysunku w języku polskim, Arial 9 pkt. Fig. 1. Tytuł rysunku w języku angielskim, Arial 9 pkt. Literatura (w tekście numerujemy w kolejności cytowania [1], [2, 3], [4-8] itd., - Arial 10 pkt.): 1. L.E. Green, J.C. Worman, Research of separation, Analytical Chemistry 37 (1965) Oprócz danych bibliograficznych należy zamieścić tytuł, w tym także publikacji, materiału z internetu, opisu patentowego itp. Tytuł w j. polskim, lub innym, niż język polskim jest pisany zwykłym drukiem w cudzysłowie, tytuł w języku angielskim kursywą. 2. T. Paryjczak, Chromatografia gazowa, tłumaczenie tytułu na j. angielski kursywą, PWN, Warszawa 1986.

48 48 (w przypadku, gdy tytuł pracy jest w innym języku, niż po angielsku, należy tytuł oryginalny napisać w języku oryginału, a następnie jego tłumaczenie na język angielski - kursywą) Wszystkie materiały: artykuł (w formacie.doc,.docx, lub.rtf), dodatkowo zdjęcia i rysunki (w formacie JPG), prosimy przesyłać w formie plików, w jednej wiadomości na adres camera.separatoria@gmail.com * * * Przesłany artykuł do CamSep podlega wstępnej ocenie przez Edytora, następnie przekazywany jest dwóm recenzentom do oceny. Recenzenci pozostają anonimowi. O przyjęciu artykułu do druku decyduje redakcja, w oparciu o przygotowaną recenzję. Jeśli w jej wyniku zachodzi konieczność poprawienia artykułu przez autora, to powinno to nastąpić w okresie nie dłuższym niż trzy tygodnie. Po tym terminie uważa się, że autor rezygnuje z publikacji lub gdy artykuł zostanie przesłany do redakcji podlegać on będzie ponownej ocenie. Po opublikowaniu autorzy bezpłatnie otrzymują elektroniczna wersję artykułu i właściwy nr CamSep jako egzemplarz autorski. Ogłoszenia/reklamy mogą być publikowane za odpowiednią, wcześniej ustaloną, opłatą. Przepisy etyczne Ważne jest, aby uzgodnić standardy etycznych zachowań dla wszystkich zaangażowanych w działania publikacji: autora, redaktora czasopisma, recenzenta, wydawcy i społeczeństwa czasopism. Redaktorzy i recenzent są zobowiązani do zapewnienia, że reklama, przedruk lub inny przychód komercyjny, nie ma wpływu na decyzje redakcyjne. Nie mogą oni ujawniać żadnych informacji na temat przedstawionego rękopisu do kogokolwiek innego niż autora artykułu. Niepublikowane materiały, ujawnione w przedstawionej pracy, nie mogą być używane przez redaktorów/recenzentów, jako część własnych badań bez pisemnej zgody autora. Powielanie lub adaptacja opublikowany wcześniej tabel, rycin, ilustracji lub obszernych cytatów z innych źródeł, akceptowana jest tylko za posiadaniem odpowiedniej pisemnej zgody autora.

49 49 Zapory ghostwriting i guest-autorship Zgodnie z wytycznymi MNiSzW ( [dostęp r.]). oraz dbając o rzetelność naukową publikacji Redakcja wdraża procedury wykluczające nieetyczne działania przy publikowaniu wyników badań. Warunkiem publikacji artykułu jest ich zachowanie przez Autorów. Przejawy braku rzetelności i działań nieetycznyc h będą dokumentowane przez redakcję. Po zakwalifikowaniu publikacji do druku Autor korespondujący zobowiązany jest do przesłania oświadczenia, że wszyscy współautorzy brali czynny udział w jej przygotowaniu i są współposiadaczami praw autorskich. Aby autorstwo było uzasadnione musi opierać się na istotnym wkładzie do (i) opracowania idei (koncepcji) pracy, (ii) wykonania eksperymentu, (iii) analizy i/lub interpretacji danych, (iv) opracowaniu artykułu i jego krytycznej oceny. Nie zalicza się do tego udziału działania polegającego jedynie na zbieraniu funduszy lub zbieraniu danych oraz nadzorowanie pracy. W oświadczeniu musi się także znajdować zapis o niepominięciu w składzie zespołu autorskiego nikogo, kto wniósł istotny wkład badawczy w powstanie pracy. Redakcja może dodatkowo zwrócić się Autorów o wskazanie tego z nich, który ma największy udział w publikacji i procentowego udziału pozostałych autorów, a także podania który z autorów jest twórcą koncepcji badawczej, metodyki badań, analizy wyników itd... miejscowość, data... imię i nazwisko (nr dow. os.).... afiliacja.... adres do korespondencji, , nr telefonu Oświadczam, że zostałem poinformowany o zasadach związanych z zaporą ghostwriting i guest-authorship. W związku z tym wraz z manuskryptem publikacji poniżej załączam informacje o podmiotach przyczyniających się do jej powstania (wkład merytoryczny, rzeczowy, finansowy etc.), z podaniem ich afiliacji oraz udziału, tj. informacji kto jest autorem koncepcji, wykonawstwa eksperymentu, obliczeń i/lub wyprowadzenia wzorów, protokołu itp. oraz dane o źródłach finansowania publikacji (financialdisclosure). Jako osoba zgłaszająca manuskrypt do druku ponoszę odpowiedzialność za podanie danych zgodnych z prawdą. Zgłoszenie artykułu jest jednoznaczne z przekazaniem Redakcji praw do opublikowania artykułu w wersji papierowej i elektronicznej.

50 50 Instructions for Authors and Editorial Policy is a scholarly and peer-reviewed journal (print and online) published 2 times per year which was founded in It is a continuation of the journal Postępy Chromatografii (Progress in Chromatography) devoted to the science, technique and technology of separation. It provides a medium for the publication of theoretical and experimental studies and reviews related to separation science: chromatography, electrophoresis, mass spectrometry, exctraction, electroseparation etc. publishes original (not published previously and are not currently under consideration by another journal except in the form of an abstract or as part of a published lecture, review, or thesis) and review papers from all branches of separation science, technique and technology. Additionally letters to the editor; expert opinions; information on instrumentation, book reviews and information about conferences as well as advertisements are also published. The journal welcomes contributions which promote the exchange of ideas and rational discourse between practicing educators and material researchers all over the world. The manuscript can be submitted to any editor, together with the cover letter, using e -mail. No limitation of the articles lengths are provided. The manuscript should be original, has not been published previously and should not be currently being considered by another journal. The manuscript can be submitted to any editor, together with the cover letter, using e -mail. No limitation of the articles lengths are provided. Manuscript should be prepared using MS-Word editor in the.doc/.docx format. It should be typed in single-spaced lines using Arial 10p. font with the overall page numbering (at the center of bottom margins). Tables (Arabic numeration, title in Polish and English, Arial 10p.), figures and figure captions (Arabic numeration, in Polish and English, Arial 9p.) and references can be placed directly to the text. The main heading appears in the following order: - list of Authors by first, middle names, surname (capital letters); the Corresponding Author s name should be accompanied by an asterisk (*); if Authors are from more than one affiliation, use superscript numbers to link the Authors names and their affiliations, - list of affiliations and complete mailing addresses of the authors (including zip code, city, street, and number; for universities, the faculty or department should be given), - the title (should not exceed 20 words) of the article in Polish as well as English, (in all capital letters, Arial 12p.), - if there is more than one affiliation, use asterisks to indicate the institute with which each author is affiliated, as it is presented below: Jan K. KOWALSKI, Karol ROBERT* Department of Separation Science, Ins titute of Chemistry ul. 1 Maja 3, Warszawa * camera.separatoria@gmail.com I Podlaskie Spotkanie Chromatograficzne 1 st Podlasie s Chromatographic Meeting Body text In the subsequent text, the following parts are is desirable: abstract (in Polish and English, Arial 9p.), keywords (about five, in Polish and English, Arial 9p.), introduction (review of literature and formulation the aim of the paper), experimental (reagents, apparatus, protocols, data analysis), results and discussion, conclusions, acknowledgments and literature. The SI units and nomenclature recommended by IUPAC should be used. References should be typed in the forms: 1. J.K. Kowalski, K. Robert, Research of separation, Analytical Chemistry 44 (2000) A. Adzik, in Fundamentals of Separation Science, K. Karol, ed., PTNoR, Reymontówka Polish standard PN EN ISO 17993, text 4. S. Separator, Proceedings of 2 nd Podlachia s Chromatographic Meeting, Kotuń-Chlewiska, Sep , in a list at the end of article and numbered in the order of appearance. Citation in the text should be denoted by number in square brackets. One of the Editor first evaluates the manuscript. Exceptionally it can be acc epted at this stage. Those rejected at this stage are passed on to 2 experts for review. Acceptance for publication is subject to positive recommendation from the referees. The referees remains anonymous throughout the process. Reviewers are not supposed to contact the authors or to otherwise make their identity known. The referees are asked to evaluate the manuscript according to the below rules within 3 weeks. Authors have three months to correct

51 51 the article after the reviewing process. After this time, the returned article is considered as newly received. The authors receive the electronic version of their paper and the proper volume of free of charge. Advertisements may be published according to the prescribed rates. * * * Ethical guidelines It is crucial to agree upon standards of expected ethical behavior for all involved in the act of publishing: author, editor, reviewer, publisher and society. Editors and reviewer are committed to ensuring that advertising, reprint or other commercial revenue has no impact or influence on editorial decisions. They must not disclose any information about a submitted manuscript to anyone other than the corresponding author. The unpublished materials disclosed in a submitted manuscript must not be used in an editor's/referee s own research without the express written consent of the author. The reproduction or adaptation of previously published tables, figures, illustrations, or extensive quotations from other sources must obtain appropriate written permission.

52 52 OD REDAKCJI Z przykrością i smutkiem zawiadamiamy, że 12 grudnia 2016 roku zmarł w wieku 88 lat nasz przyjaciel i kolega, honorowy członek Komitetu Naukowego, profesor Edward SOCZEWIŃSKI Chcielibyśmy, aby jeden z kolejnych numerów został poświęcony Jego pamięci. Serdecznie zapraszamy do przesyłania propozycji artykułów oryginalnych, przeglądowych, ale również i wspomnień. Redakcja

53 53 PL e-isnn