Analiza wpływu polimorfizmu wybranych genów w odniesieniu do cech reprodukcyjnych loch raz polska biała zwisłoucha i wielka biała polska

Transkrypt

1 dr hab. inż. Arkadiusz Terman Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt Wydział Biotechnologii i Hodowli Zwierząt Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie RECENZJA pracy doktorskiej Pana mgr inż. Artura Mazurowskiego pt. Analiza wpływu polimorfizmu wybranych genów w odniesieniu do cech reprodukcyjnych loch raz polska biała zwisłoucha i wielka biała polska wykonanej na Wydziale Hodowli i Biologii Zwierząt, Uniwersytetu Technologiczno Przyrodniczego im. Jana i Jędrzeja Śniadeckich w Bydgoszczy, pod kierunkiem naukowym promotora prof. dr hab. inż. Sławomira Mroczkowskiego oraz promotora pomocniczego dr inż. Bogny Kowaliszyn. Prowadzenie badań naukowych związanych z doskonaleniem cech reprodukcyjnych zwierząt gospodarskich jest interesujące zarówno od strony hodowlanej, jak i naukowej, ponieważ odgrywają one istotną rolę w opłacalności produkcji zwierzęcej. Fakt ten w szczególnej mierze dotyczy gatunków zwierząt wydających na świat liczne potomstwo do których zalicza się m.in. trzodę chlewną. Wykorzystanie potencjału produkcyjnego zwierząt wpływa zaś na rentowność hodowli, ponieważ uzyskanie miotów o dużej liczebności pozwala na zmniejszenie kosztów związanych z odchowem jednego prosięcia. Wykorzystanie nowoczesnych technik laboratoryjnych pozwala zaś na prowadzenie oceny wartości genetycznej zwierząt hodowlanych na poziomie populacji, komórki oraz DNA. W obecnym czasie zainteresowania genetyków koncentrują się przede wszystkim na mapowaniu genów cech ilościowych QTL, jak również na molekularnej identyfikacji tych genów i ich zmutowanych form, które wpływają w sposób istotny na poziom niektórych cech ilościowych np. tempo wzrostu, wydajność rzeźną, czy cechy reprodukcyjne. W związku z powyższym celowe wydaje się prowadzenie badań naukowych mających na celu poszukiwanie markerów genetycznych powiązanych z użytkowością rozrodczą. 1

2 Ocena formalna rozprawy doktorskiej. Przedstawiona mi do oceny praca doktorska zawiera wszystkie elementy, które z formalnego punktu widzenia powinny zostać uwzględnione. Dysertacja dotyczy wytypowania, wykonania analiz molekularnych, a następnie oszacowania zależności pomiędzy określonymi wariantami polimorficznymi badanych genów, a wybranymi cechami użytkowości rozrodczej. Przyjęty układ ocenianej pracy jest przejrzysty i typowy dla tego typu opracowań naukowych. Dysertacja obejmuje 98 stron tekstu, ze spisem literatury włącznie, w której znajdują się również 33 tabele, 6 wykresów oraz 20 rycin. Praca została podzielona na następujące rozdziały: Wstęp i cel pracy 2 strony, Przegląd literatury 12 stron, Materiał i metody 9 stron, Wyniki i dyskusja 50 stron, Podsumowanie i wnioski - 1 strona, Bibliografia 16 stron oraz Streszczenie w języku polskim i angielskim 2 strony. Zaprezentowany spis literatury, na który składa się 208 pozycji głównie anglojęzycznych, w sposób klarowny dokumentuje istotność podejmowanego problemu badawczego. W odniesieniu do części redakcyjnej pracy zauważyłem nieliczne błędy literowe oraz kilka nieścisłości dotyczących cytowania innych autorów (generalnie są to same nazwiska i rok opublikowania, ale czasami w tekście zdarzają się również inicjały imion), jednakże pomimo tych uwag rozprawa prezentuje spójną całość dotyczącą podanego w tytule tematu badawczego. Ocena merytoryczna rozprawy doktorskiej. W ocenianej rozprawie doktorskiej Doktorant postawił sobie jeden główny cel, który polegał na detekcji polimorfizmów wybranych 9-ciu fragmentów genów w badanym stadzie loch rasy pbz i wbp, a następnie wykazaniu czy istnieją zależności pomiędzy tymi polimorfizmami a wybranymi cechami użytkowości rozrodczej. Wszystkie analizy wykonano w oparciu o klasyczna technikę molekularną (PCR-RFLP), którą Autor dobrze opanował. W swoich badaniach Doktorant skupił się na ocenie związku 9 wcześniej znanych i opisanych przez innych naukowców polimorfizmów w odniesieniu do cech użytkowości rozrodczej loch. Należy stwierdzić, że Autor wykonał bardzo dużą liczbę analiz, co wymagało wielkiego nakładu pracy, szkoda jednak, że wszystkie (poza genem ZAR1) zostały zidentyfikowane przynajmniej kilkanaście lat temu i brak jest bardziej aktualnych, niedawno opisanych polimorfizmów istotnych z punktu widzenia cech rozrodczych. 2

3 W związku z powyższym proszę o wyjaśnienie jakimi względami kierował się Doktorant wybierając określone polimorfizmy do badań? Szczególnie proszę o podanie powodu, dlaczego znalazł się gen RYR1, o którym wiadomo, że od wielu lat prowadzone są prace mające na celu wyeliminowanie z hodowli allela T, w związku z powyższym już przed wykonaniem analiz można było przewidzieć, że takich osobników nie będzie wcale, bądź będzie ich niewiele, co potwierdziły wyniki badań. Niezbędne są oczywiście badania dotyczące polimorfizmu genu RYR1, jednakże wykorzystuje je się raczej do sprawdzenia czy dane stado jest wolne od allela T, a nie pod kontem badań asocjacyjnych. W pierwszym rozdziale Wstęp Doktorant przybliża problematykę podejmowanego tematu oraz uzasadnia potrzebę prowadzenia badań z zakresu poszukiwania markerów genetycznych w odniesieniu do cech ilościowych. Jedyną uwagę może stanowić brak wyodrębnionej hipotezy badawczej, która w mojej opinii powinna poprzedzać sformułowane cele, co pozwoliłoby ocenić oryginalność planów badawczych Doktoranta i dałoby szerszy pogląd na zakres podjętej tematyki badawczej. Kolejny rozdział zatytułowany Przegląd literatury został podzielony na szereg podrozdziałów dotyczących każdego z badanych genów. Autor w sposób szczegółowy omawia poszczególne geny oraz kodowane przez nie białka odnosząc się przy tym do badań uzyskanych przez innych naukowców, co jest bardzo pomocne przy wprowadzeniu czytelnika w tematykę badawczą. Rozdział ten nie jest zbyt obszerny, ale zawarte w nim informacje są wystarczające i poruszają najważniejsze aspekty będące przedmiotem badań. Jedyną rzeczą, którą można by poprawić to ujednolicenie przedstawianych informacji. Opisy nie wszystkich genów są takie same np. przedstawiono dokładne informacje na temat badanego polimorfizmu genu RYR1 (jakiego typu to polimorfizm, w jakim miejscu występuje i jakie zmiany w łańcuchu polipeptydowym powoduje), a brak jest takich informacji przy opisie pozostałych, gdzie Doktorant skupił się jedynie na informacji, gdzie dany gen został zmapowany oraz z ilu eksonów i intronów się składa. Z opisu dotyczącego genu osteopontyny dowiadujemy się, że zidentyfikowano 353 formy polimorficzne tego genu, podając przy tym informacje o związkach z cechami rozrodczymi opisanymi przez innych badaczy, jednak brak jest informacji jakim polimorfizmem zajmował się Doktorant realizując swoją pracę doktorską, w związku z tym proszę o wyjaśnienie? 3

4 Rozdział Materiał i metody jest dobrze napisany, ponieważ zawiera wszystkie niezbędne informacje dotyczące: stad zwierząt poddanych badaniom, metodom molekularnym, które zostały użyte oraz zastosowanych metod statystycznych. Występuje tu jednak kilka nieścisłości bądź niedomówień o które chciałbym zapytać: 1. Autor informuje, że w trakcie izolacji DNA próby przechowywano w temperaturze 4 C w związku z tym czy izolacja przebiegała w chłodni? Jeżeli tak, to jaki był tego powód? 2. Przy opisie izolacji DNA pojawia się informacja, że nastąpiła modyfikacja tej procedury polegająca na wydłużaniu czasu wirowania oraz zmniejszenia ilości alkoholu jakie przeszkody napotkano wcześniej, które skłoniły do takich działań? 3. W tabeli 2 przydałaby się jeszcze jedna kolumna informująca jakiego typu jest to polimorfizm oraz w jakim miejscu genu występuje. 4. Tabela 3 zawiera informacje o profilu termiczno czasowym poszczególnych reakcji PCR, jednak brak jest danych dotyczących genu RYR1. 5. Dlaczego w przypadku genu properdyny (BF) temperatura trawienia jest inna niż w przypadku innych genów? Ponadto, dlaczego zarówno temperatura, jak i czas trawienia jest inny niż w publikacji Jiang i Gibson (1998), na którą powołuje się Doktorant? 6. W przypadku modelu statystycznego nasuwa się pytanie czy genotyp ma wpływ stały czy losowy? Należałoby się zastanowić nad uwzględnieniem dodatkowo efektu roku i sezonu oraz ojca i matki, ponadto brakuje informacji na temat spokrewnienia badanych zwierząt. Reasumując, należy stwierdzić, że rozdział materiał i metody pomimo kilku niejasności został poprawnie i logicznie zaplanowany i przedstawiony. Rozdział 4. Wyniki i dyskusja jest rozdziałem, który uchodzi za najistotniejszy i należy stwierdzić, że Doktorant dołożył wszelkich starań, aby tak właśnie było, bo jest to rozdział najobszerniejszy uwzględniający w sposób bardzo szczegółowy wszystkie uzyskane wyniki badań. Wzbogacony został ponadto o liczne tabele, ryciny i wykresy, co pozwala na dokładniejsze pokazanie wyników badań oraz jest to bardzo pomocne dla czytelnika w zrozumieniu ich interpretacji. Otrzymane przez Doktoranta wyniki badań zostały jasno i czytelnie porównane do podobnych uzyskanych przez innych naukowców i co najważniejsze wnoszą określone wartości poznawcze, co może być pomocne w ich wykorzystaniu w praktyce. 4

5 Jako recenzent chciałbym jednak poddać pod dyskusję kilka uwag, które się nasunęły podczas czytania tego rozdziału: 1. Podano, że otrzymano DNA o stężeniu od µg/ml czy to nie za duża rozpiętość? ponadto w podrozdziale znajduje się informacja, że rozcieńczano matrycę tak aby uzyskać stężenie około 100 µg/ml proszę o ustosunkowanie się do tych różnych informacji. 2. Czy uzyskane amplikony w wyniku reakcji PCR każdego z badanych genów nie powinny być tej samej długości? Na rycinie 4 pokazującej elektroforegram produktu genu EGF oraz na rycinie 5 dotyczącej genu SPP1 widoczne są różnice, co może sugerować, że są to zdjęcia pokazujące różne fragmenty restrykcyjne, a nie amplikony. 3. Na rycinie 15 brak jest informacji jakie genotypy zidentyfikowano na torach 7,8,10 i 11, porównując je z innymi można to odczytać, jednak Autor powinien tak jak w przypadku pozostałych przypisać im określony wariant genetyczny. 4. Należy spróbować wykonać lepszej jakości elektroforegram ryciny 17, ponieważ ciężko jest z całą pewnością stwierdzić, że na torze 4 znajduje się genotyp AA, co może mieć istotne znaczenie w interpretacji wyników. 5. Dlaczego na rycinie 19 nie przedstawiono genotypu AA? Autor tłumaczy ten fakt niską frekwencją, jednak w przypadku wizualnego przedstawiania genotypów frekwencja nie ma znaczenia, w związku z tym uważam, że jeśli uzyskano 1 osobnika o genotypie AA można by się tym faktem pochwalić, ponieważ występuje bardzo rzadko. 6. W tabeli 5 suma frekwencji alleli w rasie pbz nie daje 100%. Oceniając całość uzyskanych i przedstawionych wyników badań uważam, że wykazują one bardzo wysoką wartość praktyczną i mogą zostać wykorzystane w przyszłości. W kolejnym rozdziale Autor przedstawia w 7 punktach wnioski, które czasami wydają się być streszczeniem najważniejszych wyników badań i w mojej opinii niektóre z nich noszą znamiona stwierdzeń, co powinno się znaleźć w tytule tego rozdziału. Opisane stwierdzenia i wnioski pokazują jednak w pigułce to co osiągnął Doktorant podczas wykonywania swoich badań. Podsumowując wykonaną recenzję pracy doktorskiej Pana mgr inż. Artura Mazurowskiego chciałbym stwierdzić, że tematyka podjętych badań przez Doktoranta stanowi bardzo istotny element zarówno z punktu widzenia nauki jak i praktyki, a wykorzystane metody molekularne przyczyniły się do uzyskania wyników oraz ich odpowiedniego zinterpretowania. 5

6 Uważam, że wniesione przeze mnie uwagi natury dyskusyjnej nie umniejszają wartości pracy z punktu widzenia merytorycznego, a dają możliwość innego spojrzenia i będą pomocne Doktorantowi w trakcie przygotowywania pracy do druku w znaczących czasopismach. W podsumowaniu stwierdzam, że ze względu na aktualność przedstawionych badań, dużą wiedzę oraz znajomość wykorzystania technik molekularnych przez Doktoranta, jak również wykazanie aspektów poznawczych i praktycznych uzyskanych wyników badań, wyrażam opinię, że przedstawiona mi do oceny rozprawa doktorska Pana mgr inż. Artura Mazurowskiego pt. Analiza wpływu polimorfizmu wybranych genów w odniesieniu do cech reprodukcyjnych loch raz polska biała zwisłoucha i wielka biała polska spełnia wymogi stawiane rozprawom doktorskim, określone w ustawie z dnia 14 marca 2003 roku o stopniach i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki z późniejszymi zmianami. W związku z powyższym wnoszę do Wysokiej Rady Wydziału Hodowli i Biologii Zwierząt, Uniwersytetu Technologiczno Przyrodniczego im. Jana i Jędrzeja Śniadeckich w Bydgoszczy o przyjęcie rozprawy doktorskiej i dopuszczenie Pana mgr inż. Artura Mazurowskiego do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Szczecin, dnia 6 kwietnia 2018 roku 6