Przeciwciała monoklonalne w diagnostyce. Immunodiagnostyka

Transkrypt

1 Przeciwciała monoklonalne w diagnostyce Immunodiagnostyka

2 Problemy: Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne cechy charakterystyczne i różnice, w kontekście zastosowań w diagnostyce Metody otrzymywania, modyfikacje Testy techniki laboratoryjne Zastosowanie w diagnostyce

3 Immunodiagnostyka Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne mogą być stosowane w testach mających za zadanie: o identyfikację o oznaczenie ilościowe o lokalizację molekuł lub komórek (własnych lub obcych).

4 Zastosowanie w medycynie i medycynie weterynaryjnej w dziedzinach: mikrobiologia immunologia hematologia i transfuzjologia patofizjologia histopatologia medycyna sądowa

5 Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne Immunoglobuliny, białka wytwarzane przez w pełni zróżnicowana limfocyty B plazmocyty Zdolne do swoistego wiązania z antygenem

6 Otrzymywanie przeciwciał poli- i monoklonalnych

7 Otrzymywanie przeciwciał poliklonalnych Miano przeciwcia ł Wspólne miano Pierwszy kontakt z antygenem Drugi kontakt z antygenem Veterinary immunology. 9th edn. Edited by IR Tizard. Elsevier, St Louis, 2013

8 Przeciwciała poliklonalne c.d.

9 Przemysłowa produkcja przeciwciał monoklonalnych

10

11 Przeciwciała monoklonalne (MAbs) Wytwarzane przez nieróżnicujące się, stanowiące jeden klon limfocyty B Rozpoznają tylko jedną determinantę antygenową Produkcja jest znacznie bardziej skomplikowana i droższa Stosowane, gdy wymagana jest wysoka specyficzność i powtarzalność reakcji z antygenem

12 Zalety MAbs Można ich używać w bardzo niskich stężeniach Umożliwiają odróżnienie minimalnie różniących się antygenów (zmiana jednego aminokwasu) Pozwalają na wykrywanie modyfikacji antygenu (utlenianie, fosforylacja itp.) Umożliwiają odróżnienie izoenzymu czy proenzymu od enzymu, białka prawidłowego od nowotworowego, szczepów bakterii czy mutacji wirusów

13 Wady stosowania MAbs w diagnostyce Niska zachłanność (awidność, siła wiązania poliwalentnego antygenu z kilkoma paratopami przeciwciała) Stąd ograniczone zastosowanie w immunoprecypitacji i aglutynacji Mogą rozpoznawać dwa antygeny na których jest obecny ten sam epitop

14 Przeciwciała monoklonalne w diagnostyce Najczęściej stosowane są przeciwciała mysie Stosowane do identyfikacji cząsteczek docelowych i ekspresji białek w tkankach lub na poziomie komórki Stosowane do wykrywania i określania stężeń leków, hormonów, enzymów nawet w bardzo niskich stężeniach. Usprawniają diagnostykę chorób zakaźnych

15 Funkcje efektorowe MAbs można wzmacniać przez wiązanie z: Radioizotopami Enzymami Fluorochromami Lekami Toksynami Immunokoniugaty przydatne w diagnostyce

16 Antibody conjugates can be generated by: targeting natural amino acids (1) interchain disulfides (2), ngineered cysteines (3), non-natural amino acids (4), the carbohydrate moiety (5), the N-terminus of heavy and light chain (6) engineered tags (7). Strong protein-protein interaction, i.e., Fc-binding domains (FcBD) can be used to form non-covalent antibody conjugates (8). Additionally, the nucleotide binding site (NBS) is a valuable antibody modification site for photoaffinity labeling (9) and antibodies with catalytic activity (10) can be exploited to form bioconjugates where the coupled pharmacophore, e.g., a peptide assumes the targeting function and the antibody acts as a cargo molecule. Antibody Conjugates: From Heterogeneous Populations to Defined Reagents Patrick Dennler 1, Eliane Fischer 1 and Roger Schibli 1,2, *

17 Toxins2011, 3(7), ; doi: /toxins

18 Koniugaty z fluorochromami Fluorochromy - przykłady pochodne fluoresceiny (np. FITC), Cy2, AlexaFluor 488 pochodne rodaminy (np. TRITC), Cy3, Texas Red, AlexaFluor 555 pochodne kumaryny (np. AMCA), AlexaFluor 405 Cy5, AlexaFluor 647 emisja w widmie podczerwieni

19 Koniugat MAb z fluorochromem Schematic diagram of conjugation. Latex was conjugated with glutaraldehyde and antibody by forming amide bonds in biocarbonate buffer (ph 8.5) (a-d). Theranostics 2014; 4(12): doi: /thno Fluorescence absorption and emission spectra

20 Koniugaty z radioizotopami a. monoclonal antibody conjugated directly to radionuclide. b. antibody-streptavidin (Ab-SA) conjugates, followed by radiolabelled DOTA-biotin. The tetrameric streptavidin molecule can bind four radio-dota-biotin moieties, amplifying tumourtargeted radioactivity. c. Bispecific antibody pre-targeting for RIT using radiolabelled bivalent haptens and affinity enhancement system. d. Pre-targeting using antibodies conjugated to an antisense phosphorodiamidate morpholino oligomer (MORF) oligonucleotide followed by administration of a radiolabelled complementary c-morf oligomer.

21 Koniugaty z enzymami Stosowane enzymy peroksydaza chrzanowa (HRP) alkaliczna fosfataza (AP) oksydaza glukozowa (Aspergillus niger) b-galaktozydaza (E. coli) Chromogeny alkaliczna fosfataza new fuchsin fast red peroksydaza chrzanowa 3,3 diaminobenzydyna (DAB) 3amino-9etylokarbazol (AEC) 4chloro-1naftol (CN) Nature Biotechnology 23, (2005)

22 Testy diagnostyczne z zastosowaniem MAb ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Testy radioimmunologiczne Western blotting Cytometria przepływowa Immunohistochemia Mikromacierze białkowe Immunoprecypitacja Immunodyfuzja Immunoelektroforeza Immunofiksacja Aglutynacja Test komplementacji

23 Wybór testu dla celu molekularnego

24 Immunoprecipitacja Precypitacja tyko przy właściwej proporcji antygen-przeciwciało Pozwala na ilościowe oznaczanie przeciwciał Stosowany np. w diagnostyce chorób zakaźnych

25 Immunodyfuzja

26 Testy aglutynacji Aglutynacja wykłaczanie (clumping)

27 Test aglutynacji lateksowej okrągłe cząstki opłaszczone przeciwciałem (antygenem) zlepiają się (aglutynują) w obecności antygenu (przeciwciała), a efekt jest widoczny gołym okiem lub przy użyciu nefelometru (jak podczas hemaglutynacji niezgodnych grupowo krwinek)

28 Test komplementacji Nowoczesne metody diagnostyczne, immunodiagnostyka, dr hab. B. Krawczyk

29 Test immunoenzymatyczny (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - ELISA) Metoda wykrywania antygenów patogennych we krwi i innych płynach ustrojowych Umożliwia analizę dużej liczby próbek w tym samym czasie Metoda diagnostyki serologicznej Test bardzo czuły Metoda relatywnie prosta Można ją zautomatyzować Istnieje kilkadziesiąt odmian

30 Wykonanie Testy ELISA standardowo wykonywane są na polistyrenowych lub pleksiglasowych, 96-dołkowych płytkach Płytkę opłaszcza się odpowiednim antygenem lub przeciwciałem. Reakcję antygen-przeciwciało uwidacznia enzymatyczna reakcja barwna. Najczęściej stosowane enzymy to:. - fosfataza alkaliczna (przekształca bezbarwny fosforan p-nitrofenolu w żółty p-nitrofenol), - peroksydaza chrzanowa (daje niebieskie zabarwienie w obecności tetrametylobenzydyny), - oksydaza glukozowa (z kwasem 5-aminosalicylowym daje kolor brunatny). Zmiana barwy roztworu mierzona jest spektrofotometrycznie.

31 Najczęściej stosowane wersje testu Elisa bezpośredni pośredni sandwich Wszystkie wersje wymagają wyznaczonego enzymem przeciwciała

32 Test ELISA bezpośredni. 1-opłaszczanie płytki antygenem. 2-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (połączonym z enzymem). 3-inkubacja z odpowiednim substratem powodująca reakcję

33 Test ELISA- pośredni 1-opłaszczanie płytki antygenem. 2-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (o wysokim powinowactwie do antygenu). 3-inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym. 4-inkubacja z odpowiednim substratem.

34 "Sandwich" ELISA 1-opłaszczanie płytki antygenem-przeciwciałem. 2-inkubacja z z badanym białkiem. 3-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (o wysokim powinowactwie do badanego białka). 4-inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym. 5-inkubacja z odpowiednim substratem powodująca reakcję.

35 Kompetycyjny test ELISA W kompetycyjnych (rywalizacyjnych) testach ELISA (c-elisa, z ang. competitive ELISA) wykorzystuje się współzawodnictwo o miejsca wiązania na antygenie mieszaniny różnych przeciwciał. W schemacie doświadczenia wyróżnia się metodę pośrednią oraz bezpośrednią (z wykorzystaniem wyznakowanych enzymem przeciwciał pierwszorzędowych).

36 Metoda złożona Bardzo specyficzna Western blotting Wykorzystywana jako ostateczne potwierdzenie diagnozy: w diagnostyce chorób bakteryjnych, jak borelioza wywoływana przez krętka Borelia burgdorferi, gruźlica wywoływana przez prątki Mycobacterium tuberculosis, w diagnostyce zakażeń wirusami, jak np. HIV, koronawirus wywołujący SARS czy wirus HSV będący czynnikiem etiologicznym opryszczki, w diagnostyce niektórych chorób pasożytniczych, jak wągrzyca spowodowana przez larwy tasiemca uzbrojonego, w diagnostyce chorób genetycznych, jak pewne formy niedokrwistości Fanconiego. Dane literaturowe wskazują, że możliwe jest również zastosowanie tej techniki w diagnostyce nowotworów.

37 Western blotting 1. Rozdrobnienie próbki do uzyskania zawiesiny białek 2. Rozdział białek - elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym 3. Rozdzielone białka są przenoszone na trwałe podłoże (np. nitroceluloza) 4. Błona zanurzona w roztworze zawierającym określone czyste przeciwciała 5. Odpłukanie niezwiązanych z antygenem przeciwciał 6. Zanurzenie błony w roztworze zawierającym skoniugowane np. z enzymem przeciwciała rozpoznające fragmenty Fc przeciwciał związanych z antygenem 7. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub luminescencję.

38 Western blot bezpośrednia metoda 1. Rozdrobnienie próbki do uzyskania zawiesiny białek 2. Rozdział białek - elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym 3. Rozdzielone białka są przenoszone na trwałe podłoże (np. nitroceluloza) 4. Błona zanurzona w roztworze zawierającym określone przeciwciała skoniugowane np. z enzymem 5. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub luminescencję.

39 Cytometria przepływowa Metoda wykrywania antygenów powierzchniowych przez immunofenotypowanie Wykorzystane MAbs wyznakowane fluorochromami (FITC, PE) Przeciwciała rozpoznają epitopy np. komórek krwi Zawiesinę komórek analizuje się ilościowo przy użyciu cytometru przepływowego Cytometr zasysa komórki układające się w liniowy strumień Wiązka laserowa wzbudza fluorescencję Detektor określa wielkość i ziarnistość komórek wyznakowanych przeciwciałami e-biotechnologia. pl

40 Immunofenotypowanie

41 Cytometria przepływowa Zastosowanie W hematologii: umożliwia określenie fenotypu komórek białaczkowych lub chłoniaków W chorobach zakaźnych: np. określa zaawansowanie AIDS W diagnostyce niedoborów immunologicznych Możliwe jest wykrywanie antygenów wewnątrzkomórkowych - po permeabilizowaniu komórek

42 Metody immunohistochemiczne dzięki wykorzystaniu swoistych przeciwciał pozwalają na identyfikację w materiale histologicznym specyficznych białek (antygeny) Immunohistochemia dzięki czułym metodom detekcji umożliwiają rozpoznanie bardzo małych ilości antygenu Immunohistochemiczna metoda identyfikacji komórek CD133+ w glioblastoma yadda.icm.edu.pl

43 Immunohistochemia Uwidocznienie miejsca wiązania się przeciwciała z antygenem zlokalizowanym w komórce czy tkance możliwe jest jedynie pod warunkiem odpowiedniego znakowania przeciwciała Przeciwciała mogą być znakowane: Fluorochromami metoda immunofluorescencji, barwniki fluorescencyjne, preparat ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym (czerwień teksańska TR - czerwona fluorescencja) Enzymami metody immunoenzymatyczne, preparat ogląda się w mikroskopie świetlnym lub elektronowym (peroksydaza, fosfataza zasadowa) Metalami preparat ogląda się w mikroskopie elektronowym - ferrytyna (białko zawierające żelazo), koloidalne złoto (mikroskopijne ziarenka metalicznego złota, widoczne w mikroskopie w postaci kontrastowych czarnych punktów)

44 Immunohistochemia c.d. Pobrana tkanka jest zamrożona lub utrwalana Utrwalana tkanka jest zatapiana w parafinie i cięta mikrotomem Skrawki są przyklejane do szkiełek mikroskopowych Przeprowadzana jest inkubacja z przeciwciałami, najczęściej skoniugowanymi z enzymami Po odpłukaniu przeciwciał do preparatu dodawane są substraty enzymów Strąt barwnika pozostaje w miejscu w którym znajdował się antygen blog.ptglab.com

45 Produkt reakcji chemicznej musi spełniać dwa podstawowe warunki: Musi być widoczny w obrazie mikroskopowym Powinien być nierozpuszczalny w środowisku reakcji Końcowa ocena reakcji histochemicznych odbywa się przy użyciu wszystkich typów mikroskopów świetlnych i elektronowych.

46 Wizualizacja sieci mikrotubul w komórkach nerki. Przeciwcialo I-rzędowe wyznakowane barwnikiem Alexa 486, co umożliwia wybarwienie tubuliny, a przeciwciało II-rzędowe wyznakowane barwnikiem Alexa 546, co umożliwia wybarwienie aktyny.

47 Radioimmunmologia (RIA) Metody radioimmunologiczne (RIA) izotopowe, oparte na pomiarze radioaktywności substancji znakowanej izotopem promieniotwórczym wchodzącej w skład reakcji antygenprzeciwciało. Znakowaniu można poddać antygen lub przeciwciało. Używa się izotopów: 125J, 131J oraz 14C, 3H, 99Tc, inne. Do znakowania antygenów białkowych używa się jodu a do związków drobnocząsteczkowych trytu lub węgla.

48 Radioimmunmologia (RIA) Protokół przypomina kompetycyjny test ELISA unoassay.html

49 RIA w diagnostyce nowotworów 1. Arcitumomab [CEA-Scan] przeciwciało przeciw antygenowi karcynoembrionalnemu (CEA) znakowane radioaktywnym izotopem technetu (99Tc), stosowane do diagnostyki raka jelita grubego i odbytu (scyntygrafia) Tc-Bectumomab [LymphoScan] stosowane w radioimmunoscyntygrafii chłoniaków nieziarniczych typu B (NHL, ang. Non-Hodgkin Lymphoma). 3. Tecnemab scyntygrafia nawrotów czerniaka 4. OncoScint wykrywanie raka jelita grubego i jajnika (scyntygrafia)

50 Przykłady zastosowania MAbs w diagnostyce - Wczesne wykrywanie ciąży (1-2 tydzień) - Wykrywanie infekcji wirusowych i bakteryjnych np HIV Herpes Grypa Chlamydie Streptokokki - Identyfikacja i charakteryzacja specyficznych antygenów nowotworowych; klasyfikacja nowotworów - Obrazowanie; np. lokalizacja nowotworów

51 Test wykrywający ciążę Test oznacza gonadotropinę kosmówkową CG za pomocą przeciwciał (3 rodzaje)

52 Rapid and Quantitative Detection of Zoonotic Influenza A Virus Infection Utilizing Coumarin-derived dendrimer-based Fluorescent Immunochromatographic Strip Test (FICT) Theranostics 2014; 4(12): doi: /thno.10255

53 Diagnostyka HIV

54