Metody serologiczne i genetyczne bakterii i wirusów stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej

Transkrypt

1 Metody serologiczne i genetyczne bakterii i wirusów stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej Anna Majewska Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej WUM Warszawa 2014

2 Diagnostyka mikrobiologiczna 1. Bezpośrednia identyfikacja wykrycie drobnoustrojów w lub ich fragmentów w (antygenów, toksyn, białek, produktów w metabolizmu, wykrycie kwasu nukleinowego) 2. Pośrednia identyfikacja wykrycie i badanie poziomu specyficznych przeciwciał

3 Diagnostyka mikrobiologiczna Hodowla drobnoustrojów ograniczenia długi czas generacji niektórych bakterii drobnoustroje wewnątrzkomórkowe (wirusy, Chlamydiae sp., Legionella sp.) brak podłoży do hodowli in vitro (T. pallidum)

4 Czynniki które decydują o wyborze metody Właściwości próbki Właściwości mikroorganizmu Czułość i specyficzność metody Powtarzalność Potencjał różnicujący metody Stopień trudności metody (doświadczenia personelu) Zaplecze badawcze Łatwość interpretacji wyników Czas wymagany do analizy Całkowity koszt stosowanej metody Koszty pojedynczej próbki

5 Immunologia i mikrobiologia Immunologia nauka zajmująca się poznaniem budowy i funkcji układu odpornościowego Mikrobiologia dała początek immunologii, młodej, dynamicznie rozwijającej się nauce

6 Historia immunologii: Epidemie: dżuma, ospa prawdziwa, cholera Starożytni: Przebycie i przeżycie choroby zakaźnej chroni przed nią później Stosowanie działań profilaktycznych (Chiny ospa prawdziwa podanie na błony nosa suszonej krosty osoby chorej, Indie na skórę wydzieliny ze zmian skórnych) 1798 Jenner bezpieczne szczepionki przeciw ospie (szczepienie krowianką)

7 Działanie układu odpornościowego Reaguje na różne substancje, reakcja ta to odpowiedź immunologiczna Substancje pobudzające układ odpornościowy to antygeny Cel pobudzenia eliminacja patogenu (antygenu) z organizmu

8 Rodzaje odpowiedzi humoralnej: Pierwotna Po pierwszym kontakcie z Ag Dominuje przeciwciało klasy IgM (pentametry) Wtórna Po kolejnym kontakcie z tym samym antygenem Dominuje przeciwciało klasy IgG Przeciwciała te mają większe powinowactwo do Ag Odpowiedź immunologiczna utrzymuje się dłużej

9 Struktura białkowa Immunoglobuliny Skierowane swoiście przeciw antygenowi Najprostszą formą jest monomer, który składa się z: 2 łańcuchów ciężkich (H) 2 łańcuchów lekkich (L)

10 Łańcuch ciężki decyduje o przynależności przeciwciał do klasy immunoglobulin (5 klas): IgD IgA IgM IgG Ig E

11 IgM 5 czterołańcuchowych jednostek Transport immunoglobulin przez łożysko

12 Wykrycie i badanie poziomu specyficznych przeciwciał: metody immunoenzymatyczne (ELISA) metody immunofluorescencyjne (IF) metody radioimmunologiczna (RIA)

13 Wykrywanie antygenów odczyn seroneutralizacji odczyn wiązania dopełniacza metody immunochromatograficzne grypa, RSV, adenowirusy, rotawirusy, norowirusy,

14 Wykrywanie antygenów metody immunofluorescencyjne (IF) metody immunoenzymatyczne (ELISA) metody radioimmunologiczne (RIA)

15 Wykrywanie antygenów Stosowane najczęściej w przypadku: nasilonej wiremii - ELISA wykrywania antygenów wirusowych w próbkach klinicznych w przypadku zakażeń miejscowych (HHV-1, HHV-2, adenowirusy) ELISA, immunochromatografia lokalizacji antygenów w materiale klinicznym (wirusy oddechowe, enterowirusy) immunofluorescencja bezpośrednia (DIF), immunochromatografia Czas wykonania: w zależności od metody ( min)

16 RIA (Radio Immuno Assay) metody immunochemiczne, wykrywające reakcję antygenu ze swoistym dla niego przeciwciałem w oparciu o pomiar radioaktywności izotopu promieniotwórczego, którym wyznakowany jest jeden ze składników reakcji (antygen lub przeciwciało). ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) metody immunoenzymatyczne służące do wykrycia określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych, skoniugowanych z odpowiednim enzymem.

17 Wykrywanie antygenów Schemat testu ELISA do wykrywania antygenów: 1. Nośnik 2. Przeciwciało opłaszczone na nośniku niku 3. Szukany antygen 4. Przeciwciała a specyficzne dla antygenu 5. Enzym związany zany z przeciwciałem em 6. Zmiana zabarwienia substratu spowodowana przez enzym

18 Wykrywanie specyficznych przeciwciał Schemat testu ELISA do wykrywania przeciwciał 1. Nośnik 2. Antygen opłaszczony na nośniku niku 3. Szukane przeciwciało 4. Przeciwciała a specyficzne do szukanego przeciwciała 5. Enzym związany zany z przeciwciałem em 6. Zmiana zabarwienia substratu spowodowana przez enzym

19 Wykrywanie specyficznych przeciwciał Po dodaniu przeciwciał następuje utworzenie kompleksów immunologicznych - przeciwciało o zostaje unieruchomione. Po wypłukaniu niezwiązanego zanego przeciwciała a i dodaniu substratu dla enzymu związanego zanego z przeciwciałem em zajdzie reakcja enzymatyczna (zmiana barwy). Zasada działania ania testu ELISA polega na tym, że e przeciwciało o związane zane z określonym enzymem może e specyficznie rozpoznawać dane białko (zawarte w materiale biologicznym), które wcześniej zostało unieruchomione na podłożu. Wykrycie produktu świadczy o obecności ci danego białka w badanym materiale. Mierząc c z kolei ilość powstającego produktu można także przeprowadzić analizę ilościow ciową.

20 Wykrywanie specyficznych przeciwciał Wykrywanie specyficznych przeciwciał w klasach IgA, IgM i IgG Użyteczne do monitorowania statusu immunologicznego pacjenta oraz do stwierdzenia typu zakażenia (infekcjpierwotna/reaktywacja) Surowice parzyste Czas wykonania: ok. 180 min

21 Wykrywanie specyficznych przeciwciał Przeciwciała klasy IgG stanowią marker przebytego zakażenia wykrycie IgG jest mało przydatne w diagnozowaniu ostrych postaci zakażeń anty- HSV-1 IgG: 70% populacji anty-ebv VCA IgG: 90% populacji anty-cmv IgG: 60-90% populacji przeciw adenowirusom IgG: powyżej 50% populacji

22 Metoda immunofluorescencji Wykrywa w surowicy, plwocinie, wymazie z błon śluzowych, pł. m-r pacjenta obecność antygenu drobnoustroju Wykrywa przeciwciała surowica wykorzystują przeciwciała znakowane barwnikami fluorescencyjnymi: FITC - izotiocyjanian fluoresceiny, po wzbudzeniu emituje kolor zielony TRITC - po wzbudzeniu emituje kolor czerwony - izotiocyjanian tetrametylorodaminy Wynik pozytywny: fluorescencja obserwowana pod mikroskopem fluorescencyjnym Wynik negatywny: brak antygenu = brak fluorescencji

23 Diagnozowanie choroby kociego pazura (B. henselae) przeciwciała klasy IgM, IgG Ch. pneumoniae - przeciwciała IgA, IgM, IgG Ch. psittaci - przeciwciała IgM Chlamydia trachomatis - przeciwciała IgM gorączki Q (zakażenie Coxiella burnetii) - przeciwciała klasy IgM I i II fazy dur wysypkowy/gorączka plamista (Rickettsia rickettsi/ Rickettsia typhi) - przeciwciała klasy IgM, IgG

24 Western blot HIV, test potwierdzenia elektroforetyczne rozdzielenie białek wirusa (według ich mas oraz ładunku) rozdzielone białka są przenoszone na membranę (nitroceluloza, nylon) ekspozycja na surowicę pacjenta, unieruchomione białka wiążą swoiste przeciwciała Uwidocznienie kompleksu immunologicznego z użyciem związanego z enzymem przeciwciała antyludzkiego

25 Diagnostyka HIV badanie przesiewowe testy immunoenzymatyczne Elisa III i IV generacja (testy kombinowane) Elisa IV - oznaczenie przeciwciał i antygenu p24 antygen p24 oznaczany przed serokonwersją Western Blot RNA (metody molekularne) rutynowa diagnostyka HIV, Monitorowanie skuteczności leczenia ARV (leczenia antyretrowirusowego) diagnostyka zakażeń HIV u dzieci, urodzone przez zakażone matki. w wybranych przypadkach stosowane w diagnostyce wczesnej fazy zakażenia HIV.

26 Reakcja precypitacji antygeny rozpuszczalne o masie w zakresie pomiędzy kda każda cząsteczka immunoglobuliny łączy się każdym miejscem wiążącym antygen z antygenem (tworzy się charakterystyczny układ sieci).

27 Reakcje aglutynacji Antygen nie jest rozpuszczony Nośnik (RBC, WBC, cząstki lateksu) opłaszczone przeciwciałem Przeciwciała IgM (więcej miejsc wiążących) 750x bardziej wydajne w porównaniu z IgG

28 Testy serologiczne - diagnostyka kiły Testy przesiewowe USR (odczyn mikroflokulacyjny z surowicą nie inaktywowaną) VDRL (odczyn mikroflokulacyjny z surowicą inaktywowaną) Testy potwierdzenia Odczyn immunofluorescencji krętków FTA-ABS (jakościowy), FTA ilościowy, FTA-ABS-IgM Odczyn hemaglutynacji biernej krętków TPHA Wykrywanie przeciwciał IgM (kiła wrodzona)

29 Diagnostyka kiły - odpowiedź immunologiczna Przeciwciała nie-krętkowe Przeciwciała krętkowe IgM koniec drugiego tygodnia zakażenia IgG czwarty tydzień Miano przeciwciał niekrętkowych i IgM szybko spada wskutek leczenia IgG utrzymują się przez długi czas

30 Odczyn Wassermana, WR przeciwciała wassermanowskie antygen (kardiolopina, dwufosfatydyloglicerol) odczyn wiązania dopełniacza jeden z pierwszych testów serologicznych stosowanych powszechnie w medycynie

31 Krętek blady, Treponema pallidum brak wzrostu na podłożu sztucznym podłożu utrzymywanie wirulentnych drobnoustrojów dla celów diagnostycznych wymaga pasażowania na zwierzętach doświadczalnych. 76 lat po odkryciu Krętka bladego opracowano podłoże, system hodowlany Fieldsteela, które umożliwia 100-krotny wzrost bakterii in vitro. głównymi składnikami są komórki nabłonka królika (linia komórkowa Sf1Ep), 20% płodowa surowica bydlęca i 0,63 mm ditiotreitol.

32 hodowla przebiega w warunkach ubogotlenowych i temperaturze C liczba krętków rośnie w sposób wykładniczy do dnia, a następnie maleje podwojenie liczby bakterii uzyskuje się po godzinach pomimo obiecujących wyników wstępnych badań, po dziesięciu latach brak jest prac na temat praktycznego zastosowania systemu Fieldsteela do rutynowej diagnostyki kiły

33 Mikroskopia-preparat bezpośredni mikroskop z kondensorem ciemnego pola widzenia materiał badany wydzielina z sączących zmian kiły pierwszego lub drugiego okresu. nawet trzykrotnie ujemny wynik nie rozstrzyga o wykluczeniu kiły. ze względu na obecność krętków saprofitycznych nie nadaje się do diagnostyki zmian zlokalizowanych w jamie ustnej i okolicy odbytu.

34 Testy przesiewowe Tanie Krótki czas oczekiwania na wynik Test nieswoisty antygeny zastępcze Kardiolopina frakcja lipidowa z serca wołu Wyniki fałszywie dodatnie test potwierdzenia z antygenem krętkowym Przeciwciała wykrywalne są 2-3 tygodnie od wystąpienia objawu pierwotnego

35 zastosowanie Badanie profilaktyczne Diagnostyczne Ocena postępów i wyników leczenia

36 VDRL - Venereal disease research laboratory Test przesiewowy (1946r.) Szybka jakościowa i ilościowa diagnostyka kiły Obserwacja postępów leczenia Diagnozowanie neuroinfekcji Odczyn precypitacji Antygen - Alkoholowy roztwór zawierający 0.03% kardiolipiny, 0.21% lecytyny 0.9% cholesterolu

37 VDRL odczyn jakościowy Ocena testu: jakościowa i ilościowa (1:2-1:256) antygen kardiolipidowy w zetknięciu z surowicą zawierającą przeciwciała strąca się w postaci widocznych kłaczków.

38 VDRL odczyn jakościowy Tani, szybki, niespecyficzny, Rutynowo u dawców krwi Dodatni od 6 tygodnia od zakażenia

39 Testy potwierdzenia Odczyny swoiste Wykonywane z antygenami T. pallidum Żywe krętki szczepu Nicholsa pasażonane na zwierzętach laboratoryjnych (jądra królicze) Współcześnie - wybrane antygeny T. pallidum otrzymane drogą rekombinacji w hodowli E.coli lub syntetycznie Antygeny: TpN44, 5 (TmpA), TpN15, TpN17, TpN47 stymulują silną odpowiedź immunologiczną prawdopodobnie poprzez aktywację przez receptory toll-like2 komórek prezentujących antygen

40 Testy potwierdzenia Wykrywają przeciwciała swoiste Odczyny są dodatnie w kile pierwotnej 2-3 tygodnie od zakażenia i u wszystkich w kile wtórnej i trzeciorzędowej Odczyn immunofluorescencji krętków FTA-ABS (jakościowy), FTA ilościowy Odczyn hemaglutynacji biernej krętków TPHA

41 TPHA Treponema pallidum hemagglutination assay test hemaglitynacji biernej aglutynacja krwinki opłaszczone antygenami T. pallidum pochodzącymi ze szczepu Nicholsa wykrywa przeciwciała IgM i IgG,

42 FTA - fluorescent treponemal antibody Od 3-4 tygodnia jako antygenu używa się utrwalonych na szkiełku podstawowym krętków szczepu Nicholsa (antygen białkowy grupowy-wspólny dla krętków patogennych i saprofitycznych). Antygeny łączą się z przeciwciałami zawartymi w surowicy

43 FTA - fluorescent treponemal antibody antygen przeciwciało po dodaniu znakowanej izotiocjanianem fluoresceiny surowicy antygammaglobulinowej (poliwalentna: IgG, IgM, IgA), następuje połączenie powstałego kompleksu ze znakowanymi p-ciałami skierowanymi przeciw immunoglobulinom ludzkim, co pozwala na odczytywanie wyników w mikroskopie fluorescencyjnym

44 Chlamydia trachomatis Istotny czynnik etiologiczny chorób zakaźnych przenoszonych drogą płciową D-K serotypy okulogenitalne zakażenia okołoporodowe tendencja do zakażeń przewlekłych Zapalenie cewki moczowej, odbytu, gardła, spojówek, najądrzy, Zapalenie szyjki macicy, PID, zapalenie gruczołu przedsionkowego większego, bezpłodność

45 Problemy diagnostyczne Bakterie wewnątrzkomórkowe Niezdolne do syntezy ATP Energetycznie zależne od gospodarza Hodowla w komórkach McCoy

46 Diagnostyka bezpośrednia- DIF Badanie materiału bezpośredniego Przeciwciała monoklonalne pochodzenia zwierzęcego reagujące z głównym białkiem błony zewnętrznej MOMP (major outer membrane protein) 18 serotypów C. trachomatis znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny Jasno zielona fluorescencja potwierdza obecność ciałek elementarnych, widoczna na tle czerwono zabarwionych (błękit Evansa) komórek nabłonkowych

47 Diagnostyka bezpośrednia - DIF Ograniczenia: wykrywanie żywych i martwych form bakterii Konieczność interpretacji w oparciu o objawy kliniczne Wynik ujemny posiada ograniczoną wartość dowodową Wynik dodatni u osób z grupy niskiego ryzyka interpretować ostrożnie

48 Diagnostyka bezpośrednia - metody immunoenzymatyczne wykrywanie antygenu (EB) w materiale od pacjenta przy użyciu swoistych przeciwciał powstały kompleks antygen-przeciwciało wykrywa się poprzez wiązanie z gammaglobuliną znakowaną enzymem (peroksydaza chrzanowa) substratem dla enzymu jest ortofenylenodwuamina (OPD) zawierająca nadtlenek wodoru OPD w obecności enzymu zmienia zabarwienie, intensywność barwy oznacza się spektrofotometrycznie Ilość przyłączonego enzymu jest wprost proporcjonalna do ilości antygenu w próbce

49 Diagnostyka pośrednia - MIF, IF MIF mikroimmunofluorescencja IF immunofluorescencja Wykrycie typowo swoistych przeciwciał w klasach IgM, IgA, IgG Różnicowanie serotypów w obrębie gatunku Chlamydia trachomatis

50 Diagnostyka pośrednia - m. immunoenzymatyczna Wykrywanie przeciwciał w klasach IgA, IgM, IgG oraz chsp60-igg Jako antygen służy LPS lub rekombinowane białko szoku termicznego C.trachomatis (chsp60-igg) IgM pojawiają się po 2-4 tyg. po zakażeniu i zanikają po 2-6 miesiącach IgG pojawiają się po 6 do 8 tygodniach od pierwszych objawów IgA wzost miana kiedy zaczyna obniżać się poziom IgM

51 Metody molekularne w diagnostyce mikrobiologicznej

52 Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

53 PCR (polymerase( chain reaction) Nazewnictwo: Reakcja łańcuchowa polimerazy Reakcja łańcuchowej polimeryzacji metoda powielania fragmentów w DNA wynaleziona w 1983 roku przez Kary ego Mullisa,, Nagroda Nobla

54 PCR (polymerase( chain reaction) Etapy PCR: Przygotowanie próbki izolacja i oczyszczenie DNA/RNA przepisanie RNA na komplementarne DNA (cdna( cdna) Amplifikacja DNA Wizualizacja produktu barwienie DNA i elektroforeza w żelu hybrydyzacja produktu ze znakowanymi sondami

55 PCR (polymerase chain reaction) Zasada metody opiera się na cyklicznej reakcji polimeryzacji swoistego fragmentu DNA cykler matryca swoiste startery (ang. primers) sekwencje oligonukleotydów komplementarne do końców w zdefiniowanej sekwencji matrycowego DNA termostabilna polimeraza DNA trójfosforany deoksynukleotydów (A,T,G,C) bufor reakcyjny (zawiera jony potasowe i magnezowe)

56 PCR (polymerase( chain reaction) Wykrywanie produktów w PCR: Barwienie DNA (elektroforeza) bromek etydyny SYBR Green I oranż akrydynowy Znakowane sondy hybrydyzujące w obrębie bie produktu ELHA (enzyme( enzyme-linked hybridization assay) izotopem (autoradiografia na membranie)

57 PCR (polymerase( chain reaction) Zastosowanie PCR w mikrobiologii: wykrycie/identyfikacja patogenu w dowolnym materiale klinicznym identyfikacja namnożonych onych drobnoustrojów identyfikacja patogenów w nie dających się hodować lub wolno rosnących problemy z identyfikacją fenotypową wykrywanie genów w związanych zanych z oporności cią (van, erm, mec) wykrywanie genów w czynników w zjadliwości (cdta( i cdtb)

58 Multiplex PCR w jednej mieszaninie reakcyjnej stosuje się kilka niezależnych par starterów, umożliwia jednoczesne wykrycie kilku różnych drobnoustrojów w próbie lub fragmentów kilku różnych genów tego samego patogenu równoczesna amplifikacja więcej niż jednego regionu DNA obniża koszty, oszczędza pracę i czas, zmniejsza ryzyko kontaminacji HHV-1, HHV-2

59 Nested PCR dwa następujące po sobie cykle reakcji amplifikacji, w których produkt pierwszego cyklu reakcji jest używany jako matryca do syntezy DNA w czasie drugiego cyklu. w reakcji tego typu stosowane są dwie niezależne pary starterów. służą one w drugim cyklu reakcji do powielania wewnętrznego fragmentu DNA w produkcie pierwszego cyklu reakcji. Zastosowanie: wykrywanie niskokopijnych patogenów w materiale klinicznym (krew, PMR)

60 RT PCR wykrywanie RNA, identyfikacja patogenów w zawierających jako materiał genetyczny RNA; sąs to np.. wirusy HIV, HCV. Dzięki obecności ci specyficznego mrna (warunkującego syntezę określonych białek wirusowych) można odróżni nić zakażenie aktywne od utajonego. W pierwszym etapie reakcji wyizolowany mrna jest przepisywany na komplementarny DNA (cdna( cdna) ) przy udziale odwrotnej transkryptazy.. Uzyskany w ten sposób cdna poddawany jest typowej reakcji PCR.

61 PCR (polymerase( chain reaction) Wady metody PCR: stosunkowo niewielka czułość (ok kopii/ml) ograniczona informacja o swoistości powstającego produktu brak możliwo liwości kalibracji ilościowej ryzyko kontaminacji laboratorium produktami reakcji trudno określi lić,, czy patogen byłżywy ywy

62 Real-time PCR

63 Real-time PCR Reakcja łańcuchowa polimerazy DNA z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym W technice real-time PCR ilość produktów amplifikacji jest oznaczana po każdym cyklu PCR, a nie tylko po ostatnim cyklu. Wskaźnikiem ilości produktów amplifikacji jest intensywność fluorescencji emitowanej przez badaną próbkę.

64 Zalety techniki real-time PCR: Real-time PCR Pełne monitorowanie przebiegu reakcji Krótki czas przebiegu reakcji (30 min do 2 godzin) Bardzo wysoka powtarzalność wyników Możliwość stosowania gotowych zestawów odczynników, szeregu barwników lub sond molekularnych

65 Zastosowanie w mikrobiologii Jakościowy real-time PCR: możliwość stosowania jako testu przeglądowego do badań dużych populacji pacjentów wykorzystywany do diagnostyki wymazów bezpośrednich i/lub bioptatów używany w badaniach, gdzie metody ilościowe są zbędne

66 Zastosowanie w mikrobiologii Ilościowy real-time PCR: używany do monitorowania wiremii stosowany do badania skuteczności terapii przeciwwirusowej

67 CMV u biorców narządów Zakażenie CMV, istotny problem po przeszczepieniu narządu, ryzyko wywołania choroby, pośredni wpływ na przeżycie pacjentów i czynność przeszczepu U 60-90% biorców stwierdza się replikację CMV w 1-4 m-cy po transplantacji Choroba przyjmuje postać wiremiczą (zap. błony śluzowej przewodu pokarmowego, wątroby, trzustki, śródmiąższowe zapalenie płuc, mięśnia sercowego, pęcherza moczowego, mózgu, siatkówki)

68 CMV u biorców narządów Ocena zakażenia u biorcy i dawcy przeszczepu na podstawie oznaczenia swoistych przeciwciał przeciw CMV w momencie transplantacji, udokumentowanie serokonwersji Pozwala to na ocenę zasad profilaktyki po przeszczepieniu

69 CMV u biorców narządów Zalecana diagnostyka mikrobiologiczna (wykrycie zakażenia przed pojawieniem się objawów klinicznych) jakościowy i ilościowy PCR oznaczenie antygenu pp65 w leukocytach krwi obwodowej Krew pełna, płyn mózgowo-rdzeniowy, materiał tkankowy monitorowanie wiremii CMV 1 raz/tydzień i leczenie do zahamowania wiremii zalecane są metody ilościowe ze względu na korelację ładunku wirusa z przebiegiem klinicznym zakażenia CMV

70 Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

71 Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Jest to zjawisko spontanicznego łączenia się komplementarnych nici kwasów nukleinowych (DNA:DNA, DNA:RNA lub RNA:RNA) Należy dysponować jednoniciowym fragmentem DNA, o dokładnie znanej kolejności nukleotydów. Powi-nien on być komplementarny do sekwencji występującej w kwasie nukleinowym pato-genu (DNA lub RNA), który chcemy wykryć lub ocenić ilościowo

72 Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Proces hybrydyzacji przebiega w kilku podstawowych etapach: izolacja badanego DNA; rozdzielenie badanego DNA w żelu elektroforetycznym; denaturacja badanego DNA w środowisku alkalicznym; przeniesienie i unieruchomienie badanego DNA na filtrze nylonowym lub nitrocelulozowym; hybrydyzacja badanego DNA z wyznakowaną sondą molekularną; wypłukanie niezwiązanych fragmentów sondy;

73 Hybrydyzacja kwasów w nukleinowych detekcja powstałych dupleksów zależnie od sposobu wyznakowania sondy, poprzez: autoradiografię (znakowanie radioaktywne), reakcje immunochemiczne, kolorymetrię lub chemiluminescencję (znakowanie nieradioaktywne)

74 Hybrydyzacja kwasów nukleinowych powszechniejszej znakuje się sondy technikami nieradioaktywnymi, polegającymi na dołączaniu np. biotyny, fluorochromów. produkty hybrydyzacji wykrywane są w procesach dwustopniowych I etap - używa się skierowanych przeciwko np. biotynie przeciwciał, skoniugowanych z enzymami (peroksydaza chrzanowa,alkaliczna fosfataza) II etap - enzymy te, w obecności odpowiednich substratów, powodują reakcje barwne lub wywołują zjawisko chemiluminescencji.

75 Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Najprostszą metodą hybrydyzacji jest technika dot blot Polega ona na unieruchomieniu na filtrze całkowitego wyizolowanego z komórek DNA lub RNA i poddaniu go hybrydyzacji z sondą molekularną o określonej sekwencji. Wynik otrzymywany jest w postaci plam na filtrze podczas detekcji. Sygnałświadczy o rozpoznaniu przez sondę poszukiwanej sekwencji nukleotydowej. Metoda ta jest rzadko stosowana z diagnostyce ze względu na swoją niewystarczającą czułość

76 Hybrydyzacja kwasów nukleinowych - Southern blot, Northern blot 1975 r. E. Southern trawienie DNA przez wybrane nukleazy restrykcyjne (enzymy przecinające DNA w obrębie ściśle określonych kilkunukleotydowych sekwencji palindromowych), rozdział elektroforetyczny otrzymanych fragmentów w żelu agarozowym i przeniesienie ich - po denaturacji - z żelu na błonę nitrocelulozową z klasyczną procedurą hybrydyzacyjną przy zastosowaniu silnie wyznakowanych sond molekularnych, czułość techniki jest bardzo wysoka badanie RNA oparte jest o podobną zasadę (tzw. Northern blot).

77 Hybrydyzacja in situ utrwalanie skrawków tkankowych i rozmazów cytolo-gicznych, kwasy nukleinowe tkwiące w strukturze komórkowej, są zdolne do hybrydyzacji z sondami molekularnymi. Sondy te mogą być wyznakowane izotopowo lub fluorochromami, a obrazy po hybrydyzacji analizowane są autoradiograficznie lub oglądane są pod mikroskopem fluorescencyj-nym. Stąd też w tym drugim przypadku nazwa metody - hybrydyzacja FISH (Fluorescence in Situ Hybrydization).

78 Sekwencjonowanie - identyfikacja mikroorganizmów Porównanie nieznanej sekwencji z sekwencjami opublikowanymi w internetowych bazach danych: podstawowe bazy danych sekwencji nukleotydów (GenBank, EMBL, DDBJ) bazy danych sekwencji aminokwasów (SwissProt) bazy danych struktur makrocząsteczek (Mol, PDB, Cn3D) wirusologiczne bazy danych (Los Alamos, Stanford)

79 Techniki biologii molekularnej wykorzystywane w badaniach epidemiologicznych

80 Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych PCR/RFLP z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych (endonukleazy) metoda PFGE - bardzo wysoka zdolność różnicująca (siła dyskryminacji), duża powtarzalność metoda jest pracochłonna, analiza trwa kilka dni. obecnie metoda szeroko wykorzystywana w typowaniu szczepów różnych drobnoustrojów, uznana za,,złoty standard w epidemiologii szpitalnej.

81 Przykłady wykorzystania metody PFGE w dochodzeniu epidemiologicznym: Analiza ogniska epidemicznego przeprowadzona na oddziale neonatologicznym z powodu wystąpienia w ciągu jednego tygodnia u sześciu noworodków objawów liszajca pęcherzowego (impetigo bullosa) Porównanie uzyskanych wzorów genetycznych wykazało, że wszystkie noworodki uległy zakażeniu identycznym typem genetycznym gronkowca, który oznaczono jako typ A. Został on równocześnie zidentyfikowany u jednej osoby z personelu położnej, która odbierała poród pierwszego z zakażonych noworodków

82 Techniki genotypowania oparte na analizie całego genomu, wykorzystujące reakcje PCR PCR-fingerprinting (RAPD) RAPD ang. Random Amplified Polymorphic Amplified Polymorphic DNA DNA Przypadkowe amplifikowanie polimorficznego DNA Metoda nie wymaga znajomości sekwencji genomowego DNA badanego drobnoustroju