Tkanka limfoidalna i układ limfatyczny

Transkrypt

1 Mechanizmy obronne organizmu: Tkanka limfoidalna i układ limfatyczny Odporność wrodzona: bariery nabłonkowe komórki fagocytujące ostre stany zapalne (neutrofile, makrofagi, inne granulocyty, mastocyty) limfocyty NK układ dopełniacza Odporność adaptatywna (nabyta) reakcje immunologiczne (limfocyty B, T, komórki prezentujące antygen, makrofagi) Antygen: substancja (zazwyczaj białko) wywołująca reakcję immunologiczną Epitop: fragment antygenu rozpoznawany przez receptory limfocytów i/lub wiążący się z przeciwciałem Przeciwciało (immunoglobulina): białko (produkowane głównie przez komórki plazmatyczne) swoiście wiążące epitop klasy: IgG, IgM, IgD, IgE, IgA - zmodyfikowane przez komórki wydzielnicze Antygeny: własne (tolerowane przez układ immunologiczny; ważne: antygeny zgodności tkankowej MHC I i II) obce (atakowane przez układ immunologiczny, np. bakteryjne, wirusowe, pasożytnicze, przeszczepu) Subpopulacje limfocytów: Limfocyty B - odpowiedzialne za humoralną reakcję immunologiczną, BCR receptor BCR (immunoglobulina powierzchniowa) Limfocyty T - odpowiedzialne za komórkową reakcję immunologiczną, receptor TCR TCR limfocyty T pomocnicze (T H ) limfocyty T cytotoksyczne (T C ) limfocyty T regulatorowe (T reg ) = supresyjne (T S ) Limfocyty NK (natural killers) Specyficzne białka (antygeny) powierzchniowe limfocytów: CD20, CD40 limfocyty B CD4 limfocyty T H CD8 limfocyty T C CD4, CD25 limfocyty T reg CD16, CD56 limfocyty NK Komórki prezentujące antygen (APC): 1. Profesjonalne (działają spontanicznie) makrofagi komórki dendrytyczne - kom. dendrytyczne w tkance limfoidalnej - kom. splatające się w tkance limfoidalnej - kom. Langerhansa w naskórku i innych nabłonkach (jama ustna, drogi oddechowe) limfocyty B 2. Nieprofesjonalne (wymagają stymulacji cytokinami) komórki nabłonkowe zrębu grasicy komórki śródbłonka naczyń fibroblasty komórki mikrogleju Komórki APC pochłaniają antygen, nadtrawiają go (w lizosomach, niekiedy w proteasomach) i wystawiają jego fragmenty (epitopy) na swoją błonę komórkową razem z antygenem MHC II - prezentując w ten sposób antygen limfocytom T. 1

2 Typy reakcji immunologicznych: odpowiedź humoralna Typy reakcji immunologicznych: odpowiedź komórkowa 1. Przyłączenie obcego antygenu do receptora limfocytu B 2. Pobranie i prezentacja antygenu przez limfocyt B (pełni rolę APC) limfocytowi T H 2 aktywacja limfocytu T H 2 (wydziela cytokiny) 3. Aktywacja limfocytu B przez cytokiny limfocytu T H 2 4. Proliferacja limfocytu B (powstaje klon identycznych limfocytów B) 5. Transformacja limfocytów B w plazmocyty 6. Plazmocyty produkują przeciwciała (immunoglobuliny) skierowane przeciw antygenowi, który wywołał reakcję 1. Rozpoznanie obcego antygenu (związanego z komórką) przez komórkę APC i aktywacja limfocytu T H 1 2. Limfocyt T H 1 aktywuje limfocyty T C 3. Proliferacja limfocytów T C 4. Kontakt limfocytów T C z komórkami obcymi antygenowo 5. Limfocyty T C zabijają obce antygenowo komórki, wydzielając specjalne białka: perforyny i granzymy! Niektóre limfocyty T C pozostają jako limfocyty T pamięci! Niektóre limfocyty B nie przekształcają się w komórki plazmatyczne, pozostając jako limfocyty B pamięci Perforyny wbudowują się w błonę komórkową atakowanej komórki i tworzą w niej stale otwarte kanały Granzymy wnikają do wnętrza atakowanej komórki i indukują proces apoptozy Limfocyty NK (natural killers): nie mają cech limfocytów B ani T duże (12 µm) zawierają dość liczne, duże pęcherzyki hydrolazowe stała gotowość cytotoksyczna zabijają: - komórki obce antygenowo, zwłaszcza pokryte przeciwciałami (ADCC) - komórki bez własnych antygenów MHC lub z ich obniżoną ekspresją (np. komórki zainfekowane wirusami, komórki nowotworowe) mechanizm zabijania taki jak limfocytów Tc atak... i zwycięstwo Tkanka limfoidalna = tkanka łączna siateczkowa + bardzo liczne limfocyty Umiejscowienie tkanki limfoidalnej: narządy limfatyczne: węzły chłonne śledziona grasica* Tkanka łączna siateczkowa: sieć włókien siateczkowych tworzących rusztowanie dla komórek z wypustkami (fibroblasty, makrofagi, komórki dendrytyczne) tkanka limfoidalna błon śluzowych: - migdałki - przewód pokarmowy wraz z wyrostkiem robaczkowym - drogi oddechowe 2

3 Formy tkanki limfoidalnej: Węzeł chłonny zrąb łącznotkankowy: grudkowa - torebka - beleczki/przegrody (głównie limfocyty B) rozproszona (limfocyty T i B) Grudki chłonne: pierwotne wtórne (po kontakcie z obcym antygenem) - mankiet - ośrodek odczynowy (namnażanie limfocytów B, przekształcanie w komórki plazmatyczne) B T obszary: - kora (grudki chłonne, głównie limfocyty B) - pas przykorowy (tkanka limfoidalna rozproszona, głównie limfocyty T) - rdzeń (sznury rdzenne, limfocyty B, T, komórki plazmatyczne) Węzły chłonne są filtrami na przebiegu naczyń limfatycznych, monitorują antygeny obecne w chłonce i w razie potrzeby inicjują reakcje immunologiczne Drogi przepływu chłonki przez węzeł chłonny 1. Naczynia chłonne doprowadzające 2. Zatoki brzeżne 3. Zatoki przybeleczkowe (promieniste) 4. Zatoki rdzenne 5. Naczynie chłonne wyprowadzające kora i pas przykorowy Zatoki: przestrzenie wyścielone nieciągłą warstwą komórek śródbłonkowych rdzeń zatoki brzeżne i przybeleczkowe Recyrkulacja limfocytów zatoki rdzenne Naczynia chłonne tkanka limfoidalna węzła zatoki przykorowe i rdzenne węzła wyprowadzające naczynie chłonne krew żyłki o wysokim śródbłonku tkanka limfoidalna węzła Żyłki o wysokim śródbłonku (HEV) postkapilary wyścielone sześciennymi lub walcowatymi komórkami śródbłonkowymi miejsce migracji limfocytów z krwi do tkanki limfatycznej Kapilary: kom. śródbłonkowe (ściana ciągła, ale o znacznej przepuszczalności) blaszka podstawna Większe naczynia chłonne: budowa ściany jak w cienkościennych żyłach obecne zastawki 3

4 Śledziona Zrąb łącznotkankowy: torebka beleczki Miazga biała: tkanka limfoidalna jest rozmieszczona na przebiegu małych tętnic (tętniczek centralnych) i tworzy: pochewki okołotętnicze (głównie limfocyty T) lokalne zgrubienia pochewek - grudki chłonne śledzionowe (głównie limfocyty B) TC Obszary: miazga biała (tkanka limfoidalna) miazga czerwona (tkanka łączna siateczkowa z licznymi cienkościennymi naczyniami krwionośnymi) Tkanka limfoidalna miazgi białej monitoruje skład antygenowy przepływającej krwi Miazga czerwona: sznury śledzionowe: tkanka łączna siateczkowa z licznymi makrofagami, obecna krew (otwarte krążenie) zatoki śledzionowe (kapilary o nieciągłej ścianie) żyły miazgowe Strefa brzeżna Zatoka śledzionowa: wrzecionowate komórki śródbłonkowe (komórki pręcikowe) z szerokimi szczelinami międzykomórkowymi okrężne włókna srebrochłonne nieciągła blaszka podstawna Makrofagi miazgi czerwonej fagocytują i trawią stare erytrocyty Strefa brzeżna (pogranicze miazgi białej i czerwonej) jest miejscem pierwszego kontaktu antygenów z tkanką limfoidalną śledziony liczne niewielkie naczynia zatokowe liczne komórki prezentujące antygeny Beleczki: - tętnice i żyły beleczkowe Otwarte krążenie krwi w śledzionie Miazga czerwona: tętnice beleczkowe (1) tętniczki centralne (2) tętniczki pędzelkowe (3) OTWARTE kapilary osłonkowe* (4) przestrzenie międzykomórkowe sznurów śledzionowych (5) OTWARTE zatoki śledzionowe (6) żyły miazgowe (7) żyły beleczkowe (8) Miazga biała: tętnice beleczkowe (1) tętniczki centralne (2) OTWARTE gałązki tętniczek centralnych (9) przestrzenie międzykomórkowe strefy brzeżnej OTWARTE zatoki strefy brzeżnej (10) miazga czerwona 4 6 *kapilary osłonkowe otoczone warstwą fibroblastycznych komórek siateczkowych i makrofagów beleczka miazga biała 9 2 strefa brzeżna Grasica różni się od innych narządów limfatycznych: pochodzenie nabłonkowe brak tkanki łącznej siateczkowej brak grudek chłonnych wyłącznie limfocyty T (tymocyty) nie zachodzą reakcje immunologiczne skierowane przeciw obcym antygenom funkcja: szkoła dla niedojrzałych limfocytów T Budowa pseudozrazikowa: torebka łącznotkankowa niekompletne przegrody łącznotkankowe dzielące miąższ na obszary (zraziki) o podobnej budowie Strefy zrazika grasiczego: kora (bardzo liczne limfocyty) rdzeń (mniej liczne limfocyty) 4

5 Wewnętrzne rusztowanie zrazików grasicy budują komórki nabłonkowe (nabłonkowo-siateczkowe) różnych typów: komórka gwiaździsta gwiaździste barierowe ciałek Hassalla 1. Komórki gwiaździste prezentują własne antygeny MHC dojrzewającym limfocytom T 2. Komórki barierowe Są połączone strefami zamykającymi, tworząc bariery oddzielające korę zrazika od tkanki łącznej, naczyń krwionośnych (bariera krew-grasica) i od rdzenia. Bariera uniemożliwia dostęp obcych antygenów na teren kory (przedwczesna aktywacja limfocytów prowadziłaby do ich apoptozy). Komórki nabłonkowo-siateczkowe tworzą sieć, w jej przestrzeniach leżą: limfocyty T makrofagi komórki dendrytyczne Dojrzewanie limfocytów w grasicy komórka gwiaździsta prezentująca MHC 3. Ciałka Hassalla tylko w rdzeniu zrazików koncentryczny układ komórek nabłonkowych, często degenerujacych (szkliwienie, rogowacenie) wydzielają cytokiny kontrolujące dojrzewanie limfocytów Treg ekspresja receptorów TCR receptory ekspresja antygenów CD (różnicowanie w komórki T H, T C lubtreg) selekcja: komórki gwiaździste i komórki dendrytyczne prezentują limfocytom własne niedojrzałe limfocyty T antygeny limfocyty, które ich nie rozpoznają albo rozpoznają, ale atakują giną na drodze apoptozy - przeżywa zaledwie ok. 2%! Przeżywają zatem te, które rozpoznają i tolerują własne antygeny organizmu. słabe wiązanie mocne wiązanie (atak) brak wiązania przechodzą do krwi Grasica zanika po okresie pokwitania zostaje zastąpiona przez tkankę tłuszczową. selekcja apoptoza i eliminacja przez makrofagi Limfocyty B dojrzewają w szpiku krwiotwórczym, gdzie ulegają podobnej selekcji własne antygeny są im prezentowane przez komórki zrębowe Migdałki są wbudowane w błonęśluzową (należą do tzw. tkanki limfoidalnej błon śluzowych) ich powierzchnię pokrywa nabłonek, który tworzy wpuklenia krypty) krypta otoczona tkanką limfoidalną = mieszek obecne grudki chłonne i rozproszona tkanka limfoidalna przeważają limfocyty B brak doprowadzających naczyń chłonnych, obecne naczynia wyprowadzające krypty Tkanka limfoidalna migdałków reaguje na antygeny obecne w jamie gardłowej (powietrze, pokarm), jeżeli przejdą one przez barierę nabłonkową 5

6 Migdałki podniebienne największe otoczone łącznotkankową torebką liczne (ok. 20) głębokie krypty nabłonek wielowarstwowy płaski Migdałek gardłowy wpuklenia nabłonka (rowki oddzielające fałdy błony śluzowej) nabłonek dróg oddechowych (wieloszeregowy z migawkami i komórkami kubkowymi) Migdałek językowy pojedyncza, rozgałęziona krypta nabłonek wielowarstwowy płaski krypta Migdałki trąbkowe zlokalizowane u ujścia trąbek słuchowych brak wpukleń nabłonka nabłonek dróg oddechowych PODSTAWY IMMUNOHISTOCHEMII Determinanty antygenowe (epitopy) - fragmenty cząsteczki antygenu, z którymi reagują przeciwciała Metody immunohistochemiczne wykorzystują swoiste wiązanie antygenu przez przeciwciało Jednak potocznie mówi się o reakcji antygenu z przeciwciałem Struktura cząsteczki immunonoglobuliny domeny Miejsce wiązania antygenu (Fab) Przeciwciała Miejsce wiązania antygenu (Fab) poliklonalne monoklonalne Fab 2x Wiążą różne epitopy antygenu Wiążą tylko jeden rodzaj epitopu 6

7 Otrzymywanie przeciwciał poliklonalnych Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych immunizacja zwierząt kilkukrotne podanie parenteralne antygenu z adjuwantem pobranie krwi i uzyskanie oczyszczonej surowicy Reakcja antygen-przeciwciało stereospecyficzne łączenie przeciwciała i determinanty antygenowej - odległość pomiędzy cząsteczkami nm sprzyja powstawaniu bardzo licznych wiązań van Der Waalsa i innych słabych oddziaływań nie powstają wiązania kowalencyjne Reakcja antygen-przeciwciało, a metoda IHC - każda substancja (białko) pochodzące od jednego gatunku jest antygenem dla osobnika innego gatunku - immunoglobuliny jednego gatunku stanowią antygen dla osobników innego gatunku Metody immunohistochemiczne dzięki wykorzystaniu swoistych przeciwciał pozwalają na identyfikację w materiale histologicznym specyficznych białek (antygeny) dzięki czułym metodom detekcji umożliwiają rozpoznanie bardzo małych ilości antygenu Znakowanie przeciwciał MIKROSKOPIA ŚWIETLNA enzymy fluorochromy MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA ferrytyna złoto koloidalne 7

8 Znakowanie enzymami SUBSTRAT PRODUKT Przeciwciała znakowane enzymami wymagają przeprowadzenia dodatkowej reakcji histochemicznej wykrywającej aktywność enzymu. Stosowane do tego celu odczynniki noszą nazwe chromogenów E Enzymy stosowane w IHC peroksydaza chrzanowa (HRP) alkaliczna fosfataza (AP) oksydaza glukozowa (Aspergillus niger) β-galaktozydaza (E. coli) Chromogeny PEROKSYDAZA 3,3 diaminobenzydyna (DAB) 3amino-9etylokarbazol (AEC) 4chloro-1naftol (CN) Znakowanie fluorochromami FOSFATAZA ALKALICZNA new fuchsin fast red F Fluorochromy Fluorochromy - przykłady ENERGIA światło wzbudzenia F światło emisji ENERGIA pochodne fluoresceiny (np. FITC), Cy2, AlexaFluor 488 pochodne rodaminy (np. TRITC), Cy3, Texas Red, AlexaFluor 555 pochodne kumaryny (np. AMCA), AlexaFluor 405 FITC wzbudzenie - max. 494 nm emisja - max. 520 nm Mikroskop epifluorescencyjny Cy5, AlexaFluor 647 emisja w widmie podczerwieni 8

9 Typy reakcji immunohistochemicznych reakcja bezpośrednia Typy reakcji immunohistochemicznych reakcja pośrednia dwuetapowa znacznik np. fluorochrom przeciwciało pierwotne przeciwciało wtórne przeciw immunoglobulinom (antyglobulina) - znakowane Typy reakcji immunohistochemicznych reakcja pośrednia PAP (peroxidase anti-peroxidase) Typy reakcji immunohistochemicznych reakcja pośrednia ABC (avidin-biotin complex) SUBSTRAT HRP PRODUKT przeciwciało wtórne - biotynylowane HRP SUBSTRAT PRODUKT Typy reakcji immunohistochemicznych reakcja pośrednia LAB (labeled avidin*-biotin) Reakcja z polimerami reakcja dwuetapowa HRP SUBSTRAT przeciwciało wtórne - biotynylowane *... lub streptavidin (LSAB) PRODUKT 9

10 Uwagi praktyczne utrwalanie materiału i odtwarzanie miejsc wiązania przeciwciał (metody przygotowania skrawków) preinkubacja z normalną, nieimmunogenną surowicą blokowanie endogennej aktywności enzymatycznej inkubacje z przeciwciałami (rozcieńczenia, czas) oraz płukanie w buforze pomiędzy etapami (przyklejanie skrawków) podwójne barwienia reakcje kontrolne tło i podbarwianie problemy z fluorochromami Zawiązek kończyny wzrastające włókna nerwowe GAP-43 HE GFAP Mózg człowieka - astrocyty Migdałek podniebienny CD20 CD3 Płuca ciałka neuroepitelialne (NEBs) w drogach oddechowych Unerwienie tętnicy w mięśniu szkieletowym GAP-43 PGP 9.5 CGRP PARV 10

11 Zwój międzykręgowy GAP-43 CGRP Linia komórek HeLa α tubulina 11