Białko jako marker molekularny

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Białko jako marker molekularny"

Patryk Świątek
8 lat temu
Przeglądów:

1 Białko jako marker molekularny

2 Markery białkowe: - obecność lub brak (lub zmiana ilości) określonego białka wskazuje na istnienie określonej zmiany fizjologicznej lub chorobowej (np. pojawienie się we krwi/moczu gonadotropiny kosmówkowej wskazuje na ciążę). - o zmianie chorobowej świadczy obecność nieprawidłowego białka (np. zmutowane wersje białek w komórkach nowotworowych). - obecność określonego wariantu białka świadczy o określonym stanie fizjologicznym lub chorobowym (np. obecność przeciwciał rozpoznających białka obecne u patogenu oznacza, że badany organizm (człowiek) miał lub ma styczność z danym patogenem).

zmutowane wersje białek w komórkach nowotworowych).

3 Markery białkowe nierozerwalny związek dwóch parterów: Białko (antygen) Przeciwciało Przeciwciała jako specjalna klasa białek w głównej mierze służą do detekcji markerów białkowych, ale również same mogą być markerami białkowymi wykrywanymi przy użyciu białek, które rozpoznają.

głównej mierze służą do detekcji markerów białkowych, ale również

4 Metody wykrywania markerów białkowych i przykłady ich zastosowania.

5 Technika Western blot Rozdział białek w żelu akrylamidowym Transfer na błonę nitrocelulozową lub PVDF Inkubacja z przeciwciałami (I- i II-rzędowymi) Detekcja

6 Technika Western blot Wady: Bardzo pracochłonna i kosztowna; Trudna do seryjnego stosowania i standardyzacji; Niemożliwa do wprowadzenia do masowego użytku. Zalety: Umożliwia ocenę jakościową badanego białka; Szczególnie przydatna w przypadku białek błonowych i białek o charakterze hydrofobowym.

Dziedziczna paraplegia spastyczna zanik aksonów w neuronach motorycznych kory mózgowej; sztywność i osłabienie mięśni kończyn dolnych; choroba jest

7 Dziedziczna paraplegia spastyczna zanik aksonów w neuronach motorycznych kory mózgowej; sztywność i osłabienie mięśni kończyn dolnych; choroba jest autosomalna recesywna; mutacje w genie parapleginy, kodującym mitochondrialną proteazę typu m-aaa. mutacje prowadzą do destabilizacji białka i jego szybkiej degradacji.

autosomalna recesywna; mutacje w genie parapleginy, kodującym mitochondrialną

8 Bagnetowe testy immunosorpcyjne badaną próbkę miesza się z roztworem przeciwciał I rozpoznających białko markerowe. Przeciwciała I są sprzężone z enzymem przeprowadzającym reakcję barwną. w próbce umieszcza się bagnet, na którego powierzchni są przeciwciała II rozpoznające białko markerowe. po inkubacji bagnet przepłukuje się wodą, umieszcza się w roztworze substratu dla enzymu i obserwuje powstanie reakcji barwnej. na jednym bagnecie może być wiele pól, które zawierają przeciwciała rozpoznające inne białka markerowe.

w próbce umieszcza się bagnet, na którego powierzchni są przeciwciała II rozpoznające białko markerowe.

9 Bagnetowe testy immunosorpcyjne intensywność zabarwienia jest proporcjonalna ze stężeniem białka markerowego. Odczyt na oko poprzez porównywanie ze wzorcem

10 Bagnetowe testy immunosorpcyjne intensywność zabarwienia jest proporcjonalna ze stężeniem białka markerowego. Odczyt w odpowiednim urządzeniu.

11 Test immunoenzymatyczny (ELISA - Enzyme-linked immunosorbent assay) 1) Unieruchomienie antygenu na podłożu (płytce z dołkami); 2) Dodanie przeciwciała specyficznie rozpoznającego antygen. Przeciwciało posiada przyłączony enzym mogący przeprowadzać reakcję barwną; 3) Usunięcie nadmiaru przeciwciał i dodanie substratu dla enzymu; 4) Odczytanie ilości powstałego produktu.

12 Test kanapkowy ELISA W teście kanapkowym antygen jest unieruchomiony do podłoża przy pomocy innego przeciwciała. Wiązanie antygenu Detekcja antygenu

13 Test kanapkowy ELISA W teście kanapkowym pośrednim do detekcji antygenu stosuje się dwa rodzaje przeciwciał: I-rzędowe rozpoznające antygen i II-rzędowe sprzężone z enzymem, które rozpoznają przeciwciała I-rzędowe. Test bezpośredni Test pośredni

I-rzędowe rozpoznające antygen i II-rzędowe sprzężone z

14 Test kanapkowy ELISA

15 Test ELISA wykrywający przeciwciała Test ten ma na celu wykrycie w próbce (np. krwi) obecność określonego rodzaju przeciwciał, które wiązane są do podłoża pokrytego odpowiednim antygenem.

16 Wykrywanie zakażenia wirusem HBV Wirus zapalenia wątroby typu B, HBV (ang. Hepatitis B Virus), to otoczkowy wirus DNA, hepatotropowy i limfotropowy, z rodziny hepadnawirusów, powodujący wirusowe zapalenie wątroby, zwane kiedyś żółtaczką wszczepienną. Z wirusem HBV miało styczność 2 mld ludzi, 350 mln to chroniczni nosiciele; W Polsce 15-20% ludzi przeszło zakażenie wirusem HBV; Zakażenie w ostrej postaci występujące u kilku procent zakażonych powoduje zapalenie wątroby, wymioty, żółtaczkę, ale rzadko prowadzi do śmierci; W 90-95% przypadków zakażenie kończy się samoistnym wyleczeniem. Część zakażeń HBV (5-10%) przechodzi następnie w fazę przewlekłą; Chroniczne zapalenie wątroby B może prowadzić do marskości wątroby i raka wątroby, który jest nieuleczalny wobec małej skuteczności obecnej chemioterapii; Średni czas trwania zakażenia HBV od momentu zakażenia do pojawienia się poważnych problemów zdrowotnych u osoby dorosłej wynosi 15 do 20 lat.

Z wirusem HBV miało styczność 2 mld ludzi, 350 mln to chroniczni nosiciele; W Polsce 15-20% ludzi przeszło zakażenie wirusem HBV; Zakażenie w ostrej postaci występujące u kilku procent zakażonych

17 Wykrywanie zakażenia wirusem HBV Diagnostyka opiera się o badanie markerów serologicznych. Wykrywane są zarówno białka kodowane przez genom wirusa, jak i przeciwciała przeciwko tym przeciwciałom, które wytworzyła zakażona osoba. HBs Ag - antygen powierzchniowy (hepatits B surface antigen). Pojawia się w okresie 1 do 10 tygodni od ekspozycji na zakażenie. Przetrwanie HBsAg ponad 6 miesięcy jest klasyfikowane jako nosicielstwo. HBe Ag - wydzielnicza postać antygenu rdzeniowego (hepatitis B e antigen). Pojawia się zaraz po ujawnieniu HBsAg lub około tygodnia później w surowicy. Najszybciej zanika w okresie zdrowienia. Obecność tego antygenu u osób zakażonych HBV wskazuje na wysoką zakaźność.

HBs Ag - antygen powierzchniowy (hepatits B surface antigen). Pojawia się w okresie 1 do 10 tygodni od ekspozycji na zakażenie.

18 Wykrywanie zakażenia wirusem HBV Anty-Hbe - przeciwciała skierowane w przeciwko wydzielniczemu antygenowi HBe (HBe Ag). Ich pojawienie po zaniku HBeAg jest dobrą oznaką prognostyczną. Anty-HBc IgM - przeciwciała przeciw antygenowi rdzeniowemu. HBc-Ag (hepatitis B core antigen). Wykrywane w fazie wczesnej i późnej ostrego WZW B. Zazwyczaj stwierdza się ich zanik po upływie kilku tygodni. Anty-HBc IgG - przeciwciała przeciw antygenowi rdzeniowemu świadczące o przebytym zakażeniu HBV, mogą utrzymywać się w surowicy przez wiele lat po przebytym zakażeniu HBV. Anty-HBs - przeciwciała świadczące o uodpornieniu (szczepienie lub przebyte WZW B). Pojawiają się w okresie 3-4 miesięcy po ustąpieniu objawów chorobowych i po zaniknięciu HBsAg - w okresie rekonwalescencji. Zanik może nastąpić w okresie do 6 lat od zakażenia. U osób przewlekle zakażonych HBV nie wytwarzają się te przeciwciała.

Zazwyczaj stwierdza się ich zanik po upływie kilku tygodni.

19 Wykrywanie zakażenia wirusem HBV Typowe serotypy HBsAg+ HBeAg+ AntyHBcIgM+ : Ostre WZW B. Okres wczesny. HBsAg+ HBeAg- AntyHBcIgM+ : Ostre WZW B. Okres późny. HBsAg- AntyHBcIgM- AntyHBc+ AntyHBs- : Przebyte WZW B. Odporność. HBsAg+ HBeAg+ AntyHBcIgM- : Nosiciel. Wysoka zakaźność. HBsAg+ HBeAg- AntyHBcIgM- : Nosiciel. Mała zakaźność. HBSAg- AntyHBcIgM- AntyHBc- AntyHBs+ : Osoba szczepiona antyhbv.

HBsAg- AntyHBcIgM- AntyHBc+ AntyHBs- : Przebyte WZW B. Odporność.

20 Testy typu immunochromatograficznego Wynik: dodatni ujemny błędny

21 Testy płytkowe/przepływu poprzecznego (lateral flow device)

22 Testy paskowe/bagnetowe (dipstick)

23 Wyniki testów immunochromatograficznych mogą być odczytywane w sposób ilościowy w specjalnych czytnikach.

24 Wykrywanie obecności gonadotropiny kosmówkowej w moczu. Gonadotropina kosmówkowa (hcg, human chorionic gonadotropin) produkowana w trakcie ciąży przez zarodek, a potem przez łożysko (syncytiotrofoblast). jej zadaniem jest utrzymywanie funkcji ciałka żółtego, struktury, która powstaje w jajniku, w miejscu uwolnienia komórki jajowej, a potem podtrzymywanie produkcji progesteronu. hcg daje się wykrywać standardowymi testami od 6 12 dnia po zapłodnieniu. hcg może być również wytwarzana przez komórki niektórych nowotworów złośliwych, np. ciążowej choroby trofoblastycznej i nowotworu zarodkowego. oznaczanie obecności hcg w moczu lub krwi kobiety jest metodą wykorzystywaną w testach ciążowych.

25 Testy ciążowe dostępne w aptece. Testy ciążowe różnią się czułością w stosunku do ilości wykrywanej hcg. Testy dostępne w aptece są mogą mieć następującą czułość: czułość mniejsza od 500 IU/l - wyniku dodatniego (czyli wykazania hcg) można się spodziewać 10 dni po zapłodnieniu, czyli 4 dni przed spodziewaną miesiączką. czułość IU/l - wynik dodatni 14 dni od momentu zapłodnienia, czyli w momencie spodziewanej miesiączki. czułość powyżej 800 IU/l wynik dodatni występuje po 3 tygodniach, a więc 7 dni po planowanej miesiączce. Dodatni wynik testu ciążowego w ok. 90% świadczy o ciąży.

26 Testy ciążowe dostępne w aptece. Od góry: test typu flamastra, test płytkowy (o przepływie poprzecznym) i test paskowy/bagnetowy.

27 Laboratoryjne testy ciążowe. Testy ultraczułe wykrywają hcg w 7 dniu po zapłodnieniu. Skuteczność dochodzi do 100%. laboratoryjny test moczu; laboratoryjny test krwi.

28 Oznaczanie stadium menopauzy u kobiet test płytkowy MediSmart. w okresie menopauzy spada produkcja estrogenów potrzebnych do obniżenia wysokiego poziomu FSH i zakończenia owulacji; jeśli produkcja estrogenów jest za niska, wartości FSH utrzymują się na wysokim poziomie; oznaczenie wartości FSH oraz właściwe rozpoznanie objawów dostarcza kobiecie informacji o stadium menopauzy, w którym się znajduje; test na menopauzę MediSmart pozwala kobietom na diagnozowanie, czy weszły już w okres menopauzy; test wykrywa hormon folikulotropowy (FSH) o stężeniu 25 mlu/ml; dokładność testu wynosi ponad 99%.

29 Wykrywanie zarodźca malarii we krwi w obszarach malarycznych żyje 3 mld ludzi, co stanowi połowę ludności na Ziemi; co roku na malarię choruje 200 mln ludzi, 2mln osób umiera; w Polsce co roku stwierdza się kilkadziesiąt zachorowań i kilka zgonów związanych z zachorowaniem na malarię; malaria jest powodowana zakażeniem 4 gatunkami pierwotniaków (zarodźca malarii) Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale i P. malaria. Dwa pierwsze gatunki odpowiadają za 95% zachorowań. chwili obecnej opracowano dwa testy na wykrywanie niektórych gatunków zarodźca malarii.

30 Wykrywanie zarodźca malarii we krwi (testy paskowe) test OptiMAL rozpoznaje P. vivax i P. falciparum; rozpoznaje specyficzną dla pasożyta dehydrogenazę mleczanową, która jest uwalniana do krwi podczas zakażenia; test ICT Malaria P.f./P.v. rozpoznaje P. vivax i P. falciparum; rozpoznaje białko 2 bogate w histydynę (HRP-2)

Podobne dokumenty

Wirus zapalenia wątroby typu B

Wirus zapalenia wątroby typu B Kliniczne następstwa zakażenia odsetek procentowy wyzdrowienie przewlekłe zakażenie Noworodki: 10% 90% Dzieci 1 5 lat: 70% 30% Dzieci starsze oraz 90% 5% - 10% Dorośli Choroby