ĆWICZENIE Nr 4. Rys. 1. Budowa typowej komórki roślinnej (

Transkrypt

1 ĆWICZENIE Nr 4 BUDOWA KOMÓRKI ROŚLINNEJ. ROZDZIAŁ BARWNIKÓW Z LIŚCI SZPINAKU I PIETRUSZKI ZA POMOCĄ CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ. IZOLACJA CHLOROPLASTÓW Z LIŚCI SZPINAKU. I. BUDOWA KOMÓRKI ROŚLINNEJ Komórka roślinna jest rodzajem komórki eukariotycznej charakteryzującej się obecnością plastydów, silnym rozwojem wakuoli, celulozową ścianą komórkową oraz specyficznymi połączeniami, tzw. plazmodesmami łączącymi wnętrza sąsiadujących ze sobą komórek. Komórki roślinne dzielą się przez podział polegający na wytworzeniu po podziale jądra komórkowego ściany rozdzielającej komórkę macierzystą na dwie komórki potomne. Kształt większości komórek roślinnych, ze względu na istnienie sztywnej ściany komórkowej, jest stały i uzależniony od ich funkcji oraz mechanicznych oddziaływań między sąsiadującymi ze sobą komórkami w obrębie tkanki. Komórka roślinna przyjmuje zwykle postać wielościanów, które są mniej lub bardziej wydłużone (np. komórki tkanek mechanicznych i przewodzących). Przeciętna wielkość komórek roślinnych waha się w granicach od 20 do 300 μm; komórki wydłużone mogą osiągnąć kilka cm długości, natomiast długość rurek mlecznych może dochodzić do kilku metrów. Rys. 1. Budowa typowej komórki roślinnej ( Komórki zbudowane są z mniejszych jednostek tzw. organelli, które pełnią różne funkcje, jednak nie mogą samodzielnie działać poza komórką. Składniki budujące komórkę możemy podzielić na plazmatyczne (żywe) i nieplazmatyczne (martwe). Wszystkie składniki znajdujące się w komórce nazywamy protoplastem. Do protoplastu należą: błona komórkowa, jądro komórkowe, cytoplazma, mitochondria, plastydy, rybosomy, retikulum endoplazma 1

2 tyczne oraz aparat Golgiego, plazmodesmy. Do martwych części komórki należą wakuola i ściana komórkowa. Organelle takie jak: błona komórkowa, jądro komórkowe, jąderko, retikulum endoplazmatyczne (gładkie i szorstkie), rybosomy, mitochondria, aparaty Golgiego zbudowane są tak samo, jak u komórek zwierzęcych. W komórkach roślinnych nie występują: lizosomy, centriole i wici (obecne są tylko u niektórych plemników roślin). Rys. 2. Budowa typowej komórki roślinnej.( 1. Ściana komórkowa - otoczka komórki o funkcji ochronnej i szkieletowej. Ściana komórkowa występuje u roślin, grzybów, bakterii i niektórych Protistów. W każdej z tych grup jest zbudowana z innych substancji, np. u grzybów jest to chityna, a u roślin celuloza i jej pochodne (hemiceluloza i pektyna) oraz lignina, natomiast u bakterii podstawowym składnikiem jest mureina. Ściana komórkowa leży na zewnątrz błony komórkowej. W tkankach ściany komórkowe sąsiadujących ze sobą komórek są zlepione pektynową substancją tworzącą blaszkę środkową. Między komórkami istnieją wąskie połączenia w postaci plasmodesm wąskich pasm cytoplazmy przenikających ściany i zawierających fragmenty retikulum endoplazmatycznego. Młode komórki roślin otoczone są ścianą pierwotną, której strukturę wewnętrzną stanowią ułożone w sposób nieuporządkowany łańcuchy celulozowe wypełnione hemicelulozą i pektyną. W starszych komórkach obserwuje się również ścianę wtórną powstającą po wewnętrznej stronie ściany pierwotnej, zwykle grubszą i bardziej wytrzymałą niż pierwotna o uporządkowanej budowie szkieletu celulozowego, również wypełnionego hemicelulozą i pektyną. Ulega ona inkrustacji (węglan wapnia, krzemionka lub lignina) i adkrustacji (kutyna, suberyna, woski). Funkcje ściany komórkowej: Ogranicza ruchliwość Ogranicza wzrost komórki Chroni przed urazami mechanicznymi Chroni przed infekcjami bakteryjnymi i wirusowymi Zabezpiecza przed nadmiernym parowaniem Nadaje kształt i sztywność komórce 2

3 Budowa ściany komórkowej: 1. Składniki szkieletowe, stanowiące 40% całej jej masy: u eukariota: celuloza, która tworzy regularne łańcuchy celulozowe. Ich pęczki to miofibryle. Kilka miofibryli to fibryla celulozowa. Jest zanurzona w macierzy i pełni funkcję głównego rusztowania ściany komórkowej; u prokariota: glony - koloza i mannoza (hemicelulozy). To mieszanina wielocukrów amorficznych, lżejsza od celulozy, grzyby chityna, sinice, bakterie - kwasy pileminowy, muraminowy, stanowiące razem mureinę. 2. Składniki podłoża, stanowiące 60% masy ściany komórkowej. Wypełniają one wnętrze rusztowania utworzonego przez składniki szkieletowe. : o białka o pektyny o hemicelulozy o woda (do 60%) Wtórne przekształcenia ściany komórkowej: Przekształcenia ściany komórkowej dorosłych organizmów, spowodowane czynnikami fizycznymi lub chemicznymi 1. Inkrustracja. Mineralizacja - odkładanie soli CaCO3, krzemionki - SiO2, drewnienie (lignifikacja) - odkładanie się ligniny 2. Adkrustracja. Kutynizacja. 2. Plasmodesma, plazmodesma - połączenie międzykomórkowe występujące w komórce roślinnej, pasma cytoplazmy i siateczki śródplazmatycznej (retikulum endoplazmatyczne) przechodzące przez szczeliny (jamki) w ścianie komórkowej. Plasmodesmy łączą ze sobą protoplasty komórek, które sąsiadują ze sobą. Dzięki nim komórki w łatwy sposób mogą wymieniać pomiędzy sobą różne substancje. Plazmodesmy są odpowiednikami złączy szczelinowych w komórkach zwierzęcych. 3. Wakuole (wodniczki) - struktury komórkowe występujące u roślin i niektórych pierwotniaków, w śladowych ilościach mogą znajdować się również w komórkach zwierzęcych. Wraz ze starzeniem się komórki wakuole zlewają się, tworząc jedną dużą wodniczkę. Wakuolę otacza błona, zwana tonoplastem. W skład soku komórkowego wypełniającego wakuolę wchodzą: związki nieorganiczne: o woda (ok. 90% całości składu) o jony potasowe, sodowe, wapniowe, magnezowe, cynkowe, siarczanowe, fosforanowe, chlorkowe o kryształy szczawianu wapnia (rafidy, druzy, styloidy) oraz węglanu wapnia (cystolity) związki organiczne: o wolne aminokwasy o białka o cukry o glikozydy (alkohol+cukier), np. strofantyna, digitalina, digitoksygenina (glikozydy nasercowe) o antocyjany (barwnik o barwie czerwonej bądź niebieskiej, zależnie od ph), np. cyjanidyna w owocach śliwy o o flawony (barwnik o barwie żółtej) alkaloidy (np. nikotyna, kofeina, kokaina, morfina, teofilina, teobromina, chinina, kolchicyna, skopolamina, atropina) 3

4 Funkcje wakuol: 1. Utrzymanie komórki w stanie turgoru (napięcia). 2. Magazynowanie zbędnych produktów przemiany materii (u roślin). 3. Wodniczki tętniące (u pierwotniaków wydalają nadmiar wody) 4. Wodniczki trawiące (u pierwotniaków) 4. Plastydy - organelle otoczone podwójną błoną komórkową, występujące tylko u roślin. Rozwijają się one z proplastydów - jednego rodzaju struktur wyjściowych, a niekiedy mogą się przekształcać z jednego rodzaju w inny. Plastydy dzielimy na: bezbarwne, wytwarzane bez udziału światła, aktywne podczas procesów metabolicznych: o leukoplasty, których główną funkcją jest przechowywanie materiałów zapasowych, do których zaliczają się: lipidoplasy, elajoplasty (magazynujące tłuszcze) amyloplasty (magazynujące węglowodany - w postaci ziaren skrobi) proteinoplasty (magazynujące białka - w postaci ziaren aleuronowych) o etioplasty, powstają z proplastów w etiolacji zawierają protochlorofil barwne, wytwarzane z udziałem światła: o aktywne w procesie fotosyntezy i innych procesach metabolicznych: chloroplasty oraz inne różnobarwne aktywne chromatofory, występujące u roślin i niektórych glonów, mając za zadanie produkowanie glukozy z wykorzystaniem energii świetlnej (fotosynteza) o nieaktywne podczas fotosyntezy i innych procesów metabolicznych chromoplasty - zawierające barwnik czerwony karoten lub żółty ksantofil, czyli barwniki nadające barwę kwiatom, owocom, a niekiedy także korzeniom (np. marchwi) 5. Chloroplasty Typowa komórka roślinna zawiera od 50 do 200 chloroplastów o owalnym kształcie i średnicy 5-10 m. Chloroplasty występują przede wszystkim w miękiszu asymilacyjnym liści oraz w łodydze. Chloroplast zawiera trzy odrębne błony: błonę zewnętrzną, błonę wewnętrzną (zawierającą białka transportujące) oraz błonę tylakoidu. Tylakoidy są to struktury membranowe, zawierające barwniki fotosyntetyczne (chlorofil a i b) oraz barwniki pomocnicze (karoten i ksantofil). Pojedyncze tylakoidy są ze sobą połączone i wykazują tendencje do zespalania się a tym samym do tworzenia gran. Chlorofil i barwniki pomocnicze ułożone są w sposób uporządkowany, tworząc układy antenowe zwane fotosystemami. U prokariota występuje tylko jeden fotosystem Fotosystem II (prawdopodobnie powstał jako pierwszy, ale nazwany tak, ponieważ jako drugi został odkryty). U eukariota występuje Fotosystem I i II. Fotosystem I zawiera chlorofil a i karoteny, fotosystem II chlorofil a i b oraz ksantofile. Przestrzeń w chloroplaście wypełnia stroma, która zawiera enzymy biorące udział w fotosyntezie (fazie ciemnej), cząsteczki kolistego DNA (zawiera kompletny genom chloroplastu) oraz rybosomy (70 S) (Rys. 3). 5a. Budowa i funkcje chlorofilu Najbardziej rozpowszechnionymi barwnikami roślinnymi są chlorofile. Występują one w liściach i zielonych częściach roślin. Cząsteczka chlorofilu zbudowana jest z 4-pierścieniowej pochodnej porfiryny, zwanej feoporfiryną, oraz reszty 20-węglowego alkoholu - fitolu, dołączonej wiązaniem estrowym do reszty kwasu propionowego, która jest jednym z podstawników IV pierścienia pirolowego feoporfiryny. Fragmenty czterech połą- 4

5 czonych pierścieni pirolowych tworzą układ naprzemiennie ułożonych wiązań pojedynczych i podwójnych. Układ taki nosi nazwę układu wiązań sprzężonych. Magnez jest połączony koordynacyjnie z atomami azotu pierścieni pirolowych. Hydrofobowy łańcuch fitolu nie uczestniczy w absorpcji światła, a jego funkcja polega na zakotwiczeniu i zapewnieniu odpowiedniej orientacji cząsteczki chlorofilu w błonie tylakoidów. Rys. 3. Budowa chloroplastu. Rys. 4. Struktura chemiczna chlorofilu a i b. 5

6 Wszystkie fotosyntetyzujące organizmy posiadają chlorofil a, który absorbuje światło czerwone o długości fali 680 nm i światło fioletowe o długości fali 440 nm (P-680). Chlorofil b najintensywniej absorbuje światło pomarańczowoczerwone i światło niebieskie (P-700) (Rys.5). Rys. 5. Maksima absorpcyjne chlorofili na tle widma światła białego ( 5b. Budowa i funkcje karotenoidów W chloroplastach, obok chlorofilów występują również karotenoidy. Karotenoidy są pochodnymi izoprenu i dzielą się na: pomarańczowo-czerwone karoteny, zbudowane wyłącznie z węgla i wodoru, żółte i żółtopomarańczowe ksantofile, zawierające także tlen (najczęściej są to grupy wodorotlenowe). W większości karotenoidów występują dwa pierścienie połączone długim łańcuchem węglowodorowym, w którym na przemian występują wiązania pojedyncze i podwójne, tworzące układ wiązań sprzężonych. Podobnie jak w cząsteczce chlorofilu układ ten umożliwia absorpcję światła. Dzięki innej budowie chemicznej karotenoidy absorbują światło w nieco odmiennym zakresie niż chlorofil. Ta właściwość karotenoidów ma istotne znaczenie dla ich funkcji. Mogą one absorbować światło w zakresie długości fali nie absorbowanym przez chlorofil i następnie przekazywać energie stanu wzbudzonego na cząsteczkę chlorofilu. Drugą istotną funkcją jest ich rola ochronna przed procesami fotooksydacji, na które narażone są głównie nienasycone kwasy tłuszczowe lipidów chloroplastowych. 5c. Budowa i funkcje antocyjanów Antocyjany to grupa barwników niebieskich, fioletowych, czerwonych i pomarańczowych, których barwa zależy od ph roztworu (np. cyjanidyna w środowisku kwaśnym jest czerwona, a w obojętnym lub zasadowym ma barwę niebieską). Pod względem budowy chemicznej należą do glikozydów, w których reszty cukrowe są związane z barwnymi częściami niecukrowymi (aglikony). Antocyjany są związkami nietrwałymi, są one rozpuszczalne w wodzie. Utrwalenie barwy antocyjanów w tkankach roślinnych następuje w wyniku tworzenia kompleksów z jonami metali: Fe 3+, Sn 2+, Al 3+, Mg 2+ i Ca 2+, co powoduje przesunięcie maksimum absorpcji promieniowania widzialnego. W owocach, warzywach i kwiatach, w zależności od ich rodzaju, występuje od kilku do kilkunastu różnych antocyjanin. Najczęściej występujące antocyjany to: pelargonidyna, cyjanidyna i delfinidyna. 6

7 Tabela 1. Wybrane przykłady karotenoidów roślinnych. Nazwa Wzór strukturalny Występowanie w marchewkach i większości roślin zielo- 1 α -Karoten nych 2 β -Karoten 3 α Kryptoksantyna 4 Likopen 5 Luteina w marchewkach i większości innych roślin w wielu roślinach, włączając kukurydzę i papaję u wielu roślin, przede wszystkim w pomidorach w wielu roślinach zielonych 6 Neoksantyna w chloroplastach większości roślin 7 Zeaksantyna w wielu roślinach, przede wszystkim w kukurydzy 7

8 I. ROZDZIAŁ BARWNIKÓW LIŚCI SZPINAKU I PIETRUSZKI ZA POMOCĄ CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ Barwa chlorofilu a jest szaroniebieskawa, a chlorofilu b - niebieskozielona (natomiast chloroformowy oliwkowozielony ekstrakt liści, w świetle UV fluoryzuje wiśniowo!). Zielony kolor liści powstaje z nałożenia pozostałych barwników: karotenoidów (na chromatogramie są to plamy o największej wartości Rf) i ksantofilu, a czasem dodatkowo antocyjanów. Malownicze zmiany barwy liści jesienią powodowane są przez stopniowy zanik poszczególnych barwników (pierwszy zanika chlorofil). Różowa fluorescencja chlorofilu daje się obserwować dopiero po ekstrakcji lub innym uszkodzeniu komórek. Wykorzystywane jest to do lokalizacji obszarów Ziemi, na których szata roślinna jest uszkodzona mechanicznie lub biologicznie. Na zdjęciach satelitarnych takich miejsc wyraźnie widoczna jest fluorescencja chlorofilu. WYKONANIE: 1. Pobrać niedużą ilość mrożonych liści szpinaku i pietruszki. 2. Umieścić je w moździerzu i dodać niedużą ilość chloroformu. 3. Próbki ucierać w moździerzu do uzyskania chloroformowego ekstraktu liści. 4. Na płytce chromatograficznej zaznaczyć ołówkiem linię startu w odległości 2 cm od brzegu. Na niej w równych odstępach nanieść po 20 l ekstraktu z liści szpinaku i pietruszki (punkty startowe powinny znajdować się w odległości, co najmniej 1 cm od siebie). 5. Płytkę chromatograficzną z naniesionymi próbami umieścić w komorze chromatograficznej. Dochodzi do kontaktu rozpuszczalnika z brzegiem warstwy adsorbentu. 6. Komorę przykryć płytką, która zapobiega parowaniu rozpuszczalnika na zewnątrz. Rozwijanie chromatogramu zakończyć, gdy front rozpuszczalnika dochodzi do przeciwległego brzegu płytki. Barwniki od linii startu będą ułożone w następujący sposób: ksantofile, chlorofil b, chlorofil a, β-karoten. 7. Przeanalizować otrzymany chromatogram. Przykład: ROZDZIAŁ CHROMATOGRAFICZNY BARWNIKÓW Z LIŚCI TRAWY Do powyższej analizy użyto chloroformowego ekstraktu liści trawy roztartej w moździerzu. Plamy, które na chromatogramie oznaczone są jako "x", w świetle lampy UV intensywnie fluoryzują różowo; zawierają, więc chlorofil. W roślinach znajduje się tylko chlorofil a i chlorofil b, więc pozostałe plamy są prawdopodobnie produktami degradacji kompleksów chlorofilów z białkami. Plama ksantofilu na tym chromatogramie jest nałożona na plamę jednego z chlorofilów. 8

9 II. IZOLACJA CHLOROPLASTÓW Z LIŚCI SZPINAKU WYKONANIE: 1. Pobrać niedużą ilość mrożonych liści szpinaku. 2. Umieścić je w homogenizatorze ręcznym i dodać 1 ml zimnego buforu Tris-NaCl. 3. Homogenizować próbkę przez 3 min. 4. Homogenat przenieść do probówki wirówkowej typu Eppendorf na 1.5 ml i odwirować 200 x g przez 1 min 5. Supernatant zebrać do czystej schłodzonej probówki wirówkowej i odwirować 1300 x g przez 5 min. 6. Supernatant usunąć. Do osadu dodać 0.1 ml zimnego buforu Tris-NaCl. Za pomocą pipety automatycznej zawiesić osad zawierający frakcję chloroplastów. 7. Probówkę umieścić w lodzie. 8. Obejrzeć izolowaną frakcję chloroplastów pod mikroskopem. ODCZYNNIKI: - mrożone liście szpinaku, świeże liście pietruszki - bufor Tris/NaCl ph 7.5 (0.02 M Tris, 0.35 M NaCl) - układ rozwijający: cykloheksan + aceton (w stosunku 4 : 1.5) - chloroform (ekstrahent) - płytka chromatograficzna (Silica Gel 60 firmy Merck) APARATURA I SPRZĘT: - moździerz - komora chromatograficzna - probówki typu Eppendorf - pipety automatyczne - wirówka - mikroskop - homogenizator ręczny - pipety pasterowskie - probówki wirówkowe - lód 9