Ćwiczenie nr 3: Rozdział barwników fotosyntetycznych przy pomocy TLC i RP-HPLC.

Transkrypt

1 Ćwiczenie nr 3: Rozdział barwników fotosyntetycznych przy pomocy TLC i RP-HPLC. Cel ćwiczenia: Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie rozdziału barwników fotosyntetycznych (chlorofili i karotenoidów) występujących w natce pietruszki i zapoznanie z widmami UV-Vis tych związków. Ćwiczenie ma na celu również zapoznanie z dwiema technikami chromatograficznymi: chromatografią cienkowarstwową (TLC) oraz wysokosprawną chromatografią cieczową w odwróconym układzie faz (RP-HPLC). Wstęp: Barwne związki chemiczne odgrywające kluczową rolę w procesie fotosyntezy nazywa się barwnikami fotosyntetycznymi lub asymilacyjnymi. Wśród tych związków można wyróżnić trzy główne grupy: chlorofile, karotenoidy i fikobiliny. Chlorofile to związki wyłapujące energię świetlną w trakcie fotosyntezy. Absorbują one światło o długości fali poniżej 480 nm oraz w zakresie nm. Światło pomiędzy tymi zakresami (zielone) nie jest absorbowane przez chlorofile i właśnie z tego powodu części roślin zawierające te barwniki mają zieloną barwę. Chlorofile zostały odkryte na początku XX wieku przez Richarda Willstättera i jego współpracowników, a w 1915 roku przyznano im za to odkrycie Nagrodę Nobla w dziedzinie Chemii. U roślin wyższych można wyróżnić dwa rodzaje chlorofilu o bardzo zbliżonej budowie, nazwane a i b. Chlorofil a jest głównym elementem składowym centrów reakcji fotosystemu pierwszego i drugiego, a chlorofil b wchodzi w skład systemów antenowych, czyli kompleksów zbierających energię świetlną. Dla roślin wyższych stosunek chlorofilu a do chlorofilu b wynosi zazwyczaj około 3:1. Inną grupą barwników fotosyntetycznych uczestniczących w procesie fotosyntezy i występujących w organizmach roślin są karotenoidy. Związki te są zintegrowane z białkami zbierającymi energię podczas fotosyntezy. Do karotenoidów należą ksantofile, np. luteina, oraz karoteny, w tym głównie β-karoten. Główną funkcją tych związków jest absorbowanie energii świetlnej z zakresu, w jakim nie mogą tego robić chlorofile. Co więcej karotenoidy chronią chloroplasty przed nadmiarem energii, rozpraszając ją, i zabezpieczają przed reaktywnymi formami tlenu powstającymi podczas fotosyntezy, czyli wykazują aktywność przeciwutleniającą. W liściach drzew barwa karotenoidów jest maskowana przez zieloną barwę chlorofili, uwidacznia się to jesienią, kiedy chlorofile są degradowane przez odpowiednie enzymy. Karotenoidy występują w komórkach roślin wyższych w zdecydowanie mniejszych stężeniach niż chlorofile. Odmienną grupę stanowią fikobiliny, które są chromoforami występującymi w komórkach takich organizmów jak sinice, czy krasnorosty i nieobecne w komórkach roślin wyższych. Jako jedyne barwniki fotosyntetyczne, wiążą się z białkami rozpuszczalnymi w wodzie (fikobiloproteinami), które przekazują energię na cząsteczki chlorofili z pochłoniętych kwantów energii świetlnej. Fikobiliny wykazują fluorescencję i są często 1

2 wykorzystywane w technikach immunofluorescencyjnych jako znaczniki fluorescencyjne przyłączone do przeciwciał. Zarówno chlorofile jak i karotenoidy są związkami źle rozpuszczalnymi w wodzie, co wynika z ich hydrofobowego charakteru. Z tego powodu do ekstrakcji tych związków z materiału roślinnego stosuje się takie rozpuszczalniki jak aceton, etanol czy chloroform. Do rozdziału barwników fotosyntetycznych (chlorofili i karotenoidów) można zastosować chromatografię cienkowarstwową (TLC, ang. Thin Layer Chromatography). Do rozdziału stosuje się płytki pokryte tlenkiem krzemu (SiO 2 ) lub tlenkiem glinu (Al 2 O 3 ), które mogą adsorbować na swojej powierzchni różne cząsteczki. Im dany związek jest bardziej polarny, tym silniej będzie się wiązał z polarnymi ziarnami tlenku krzemu lub glinu. Natomiast związki hydrofobowe, czyli mało polarne, słabo oddziałują ze złożem płytki i poruszają się szybciej wzdłuż niej razem ze stosowanym rozpuszczalnikiem. Inną techniką umożliwiającą rozdział barwników fotosyntetycznych jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC, ang. High Performance Liquid Chromatography). Jest to rodzaj chromatografii kolumnowej, w której na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi będącymi składnikami analizowanej próbki a wypełnieniem kolumny następuje ich rozdział. HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem pod jakim wprowadzany jest eluent na kolumnę. Są to dość znaczne ciśnienia, przekraczające 100 barów. Wysokie ciśnienie w takim układzie jest wynikiem budowy pomp HPLC i wąskich przekrojów stosowanych kapilar, uziarnienia wypełnienia kolumn (zazwyczaj kilka mikrometrów) i przepływu fazy ruchomej (od ułamków ml/min w chromatografii analitycznej do nawet kilkudziesięciu ml/min w przypadku chromatografii preparatywnej). W chromatografii cieczowej bardzo duże znaczenie dla przeprowadzanego rozdziału ma polarność zastosowanej fazy ruchomej. Aparatura: Przygotowanie materiału roślinnego: Homogenizator mechaniczny, homogenizator ultradźwiękowy, wirówka, filtry strzykawkowe 0,20 μm z membraną RC (regenerowana celuloza), wirówka próżniowa, Vortex, waga techniczna. Rozdział TLC: Arkusz aluminiowy z żelem krzemionkowym 60 (SiO 2 ) do TLC, kapilary szklane 50 1,3 mm, komora chromatograficzna. Rozdział RP-HPLC: Chromatograf HPLC Shimadzu (pompy tłokowe, detektor DAD, panel sterujący), kolumna chromatograficzna Luna (Phenomenex) ze złożem typu C 18 (długość 2 cm, średnica wewnętrzna 2 mm, średnica ziaren złoża 3 μm). 2

3 Odczynniki: Aceton (F, Xi), eter naftowy tw C (F, Xn), toluen (F, Xn), bezwodny etanol (F), octan amonu, metanol (F, T), woda. Wykonanie ćwiczenia: Przygotowanie materiału roślinnego: 1. Posiekać natkę pietruszki na drobne kawałeczki mniejsze niż 1 mm długości. Odważyć 2 g posiekanej natki i przenieść do zlewki pojemności 50 ml. 2. Odmierzyć 25 ml 90% acetonu w wodzie schłodzonego do temperatury C i przelać do zlewki z natką pietruszki. 3. Natkę pietruszki homogenizować w 90% acetonie przez kilka minut przy pomocy homogenizatora mechanicznego stosując maksymalną moc urządzenia. 4. Następnie przeprowadzić homogenizację przy pomocy homogenizatora ultradźwiękowego przez 2 minuty ustawiając cykl równy 1 i amplitudę 80% ml otrzymanego ekstraktu barwników przenieść do probówki typu Falkon pojemności 15 ml i wirować przez 10 minut (6000 RPM) w temp. 4 0 C. UWAGA: W ROTORZE WIRÓWKI NALEŻY UMIEŚCIĆ DRUGĄ PROBÓWKĘ Z WODĄ W CELU ZRÓWNOWAŻENIA! 6. Do strzykawki pojemności 2 ml pobrać 1 ml supernatantu barwników w 90% acetonie i przefiltrować przy pomocy filtru strzykawkowego 0,20 μm z membraną RC do probówki 1,5 ml typu Eppendorf (roztwór przeznaczony do rozdziału RP-HPLC). 7. Pozostałą część supernatantu po wirowaniu należy rozpipetować po 1 ml do 4 probówek 1,5 ml typu Eppendorf i osuszyć przy pomocy wirówki próżniowej w ciągu 1 godziny (temp C). Następnie osuszone barwniki w każdej z probówek należy rozpuścić w 100 μl mieszaniny elucyjnej do rozdziału TLC (patrz poniżej) i krótko wymieszać przy pomocy Vortexu do całkowitego rozpuszczenia osadu barwników (roztwory przeznaczone do rozdziału TLC). Rozdział TLC: 8. Na płytce TLC zaznaczyć ołówkiem linię startu (1 cm od dolnej krawędzi). 9. Próbkę badanego ekstraktu należy nanieść kilkakrotnie przy pomocy bardzo cienkiej szklanej kapilary na płytkę w miejscu zaznaczonej ołówkiem linii startu, do uzyskania plamki o małej średnicy i intensywnej barwie. 10. Umieścić płytkę w komorze chromatograficznej zawierającej odpowiedni eluent (mieszanina eteru naftowego tw C, toluenu, bezwodnego etanolu w stosunku objętościowym 8:3:2). Chromatogram należy rozwijać do czasu, gdy eluent znajdzie się w odległości 0,5 cm od górnej krawędzi płytki. Należy ją wyjąć za pomocy pęsety oraz zaznaczyć przy pomocy ołówka czoło rozpuszczalnika i obrysować poszczególne plamki. 3

4 Procent fazy B [%] Wstęp do biologii z genetyką 11. Po wysuszeniu płytki obliczyć R f dla poszczególnych barwników. Wiedząc, że w tych warunkach wartości R f wynoszą odpowiednio: β-karoten: 0,80 0,95; feofityna: 0,65 0,70 chlorofil a: 0,60 0,70; chlorofil b: 0,50 0,60; ksantofile: 0,20 0,50 należy zidentyfikować barwniki w badanej roślinie. Rozdział RP-HPLC: 12. Zapoznać się z budową stosowanej aparatury chromatograficznej i porównać ze schematem przedstawionym na rys Otworzyć aplikację Shimadzu Class-VP (ikona Class-VP na pulpicie) i wybrać Instrument1. Rys. 1. Schemat przedstawiający system chromatograficzny stosowany podczas rozdziału barwników fotosyntetycznych. 14. Wybrać File / Method / Open, a następnie otworzyć folder i wybrać odpowiednią metodę: (C:) / Class-vp / biologia i genetyka / Metoda1. Metoda ta zawiera informacje o stosowanym gradiencie fazy ruchomej podczas rozdziału chromatograficznego. Stosowane są dwa roztwory: Faza A o składzie: 0,5 M octan amonu w wodzie : metanol (20:80 v/v) oraz Faza B: aceton : metanol (20:80 v/v). W trakcie analizy stężenie poszczególnych faz zmienia się jak na rys. 2. Szybkość przepływu fazy ruchomej podczas całego rozdziału wynosi 500 μl/min Czas [min] Rys. 2. Wykres przedstawiający skład fazy ruchomej podczas rozdziału chromatograficznego. 15. Należy upewnić się, że lampa wolframowa detektora jest włączona (świeci się kontrolka W na module detektora). Jeśli nie, należy ją włączyć wybierając ikonę w górnym menu programu. Na kontrolerze systemu (górny moduł HPLC) wcisnąć przycisk act (ang. active). Zaświeci się zielona kontrolka sygnalizująca rozpoczęcie pracy systemu oraz automatycznie zostaną uruchomione pompy. 4

5 (418) (423) Wstęp do biologii z genetyką a) Chlorofil a b) Chlorofil b c) β-karoten d) Luteina e) Wiolaksantyna f) Zeaksantyna g) Neoksantyna h) Feofityna Rys. 3. Widma absorpcyjne barwników roślinnych w zakresie nm: a) chlorofil a, b) chlorofil b, c) β-karoten, d) luteina, e) wiolaksantyna, f) zeaksantyna, g) neoksantyna, h) feofityna. 5

6 16. Przepłukać pięciokrotnie pętlę wstrzykową 90% acetonem przy pomocy strzykawki, a następnie wprowadzić badaną próbkę (przygotowany wcześniej ekstrakt barwników roślinnych) do pętli wstrzykowej pojemności 5 μl (zawór w pozycji Load). UWAGA: PODCZAS WPROWADZANIA PRÓBKI DO PĘTLI WSTRZYKOWEJ W STRZYKAWCE NIE MOGĄ ZNAJDOWAĆ SIĘ ŻADNE PĘCHERZYKI POWIETRZA! 17. Wybrać w górnym pasku menu ikonę (Single Run) i wprowadzić następujące dane: Sample ID: analiza_ numer grupy ćwiczeniowej Method: C:\CLASS-VP\biologia i genetyka\metoda1.met Data path: C:\CLASS-VP\biologia i genetyka Data file: analiza_ numer grupy ćwiczeniowej Czynności te należy zakończyć wybierając Start. 18. Na pytanie czy rozpocząć zapis danych (Start Acquisition) wybrać tak i równocześnie przekręcić zawór wstrzykowy w pozycję Inject. Następnie można wyjąć strzykawkę z zaworu wstrzykowego. 19. Po zakończeniu analizy na kontrolerze systemu ponownie wcisnąć przycisk act oraz przestawić zawór wstrzykowy w pozycję Load i przepłukać pięciokrotnie pętlę wstrzykową 90% acetonem. 20. Dla każdego piku widocznego na chromatogramie wykreślonym dla fali o długości 440 nm odczytać czas retencji. Następnie wyświetlić widma absorpcyjne dla wszystkich obserwowanych związków i dokonać analizy jakościowej porównując uzyskane widma absorpcyjne z widmami przedstawionymi na rys. 3. Dlaczego dla neoksantyny i wiolaksantyny widoczne są po dwa oddzielne piki różniące się czasami retencji? Czy na chromatogramie wykreślonym dla fali o długości 440 nm można zaobserwować pik pochodzący od feofityny? Uzasadnij odpowiedź. 21. Uzyskane wyniki należy porównać z wynikami otrzymanymi z TLC. Zagadnienia do opracowania: Zagadnienia dotyczące fotosyntezy i barwników fotosyntetycznych oraz chromatografii cieczowej. Przykładowe pytania: 1. Jakie jest sumaryczne równanie fotosyntezy i jaki barwnik odgrywa kluczową rolę w tym procesie? 2. Co to jest siła asymilacyjna i do czego jest wykorzystywana? 3. W jakich komórkach i jakich przedziałach komórkowych zlokalizowane są barwniki fotosyntetyczne? 4. Jaką rolę pełnią w roślinach wyższych karotenoidy i które elementy struktury tych cząsteczek są odpowiedzialne za te właściwości? 5. Jakie jest ewolucyjne pochodzenie chloroplastów i co tego dowodzi? 6

7 6. Jaka jest różnica w strukturze cząsteczek chlorofilu a i b? 7. Jak rozdzielone są faza jasna i ciemna fotosyntezy u roślin C 4 i CAM. Z czym związane są te przystosowana? 8. Niektóre bakterie mogą pochłaniać promieniowanie o długości fali 1000 nm. a) Jaka jest energia (w kj) mola fotonów o tej długości fali? b) Podaj maksymalny wzrost potencjału utleniająco-redukcyjnego (ΔE) na skutek indukcji fotonem o długości fali 1000 nm. c) Jaka jest minimalna liczna fotonów o tej długości fali, potrzebna do powstania ATP z ADP i P i, zakładając, że ΔG dla fosforylacji wynosi 50,2 kj mol Zdefiniuj pojęcia: transmitancja, absorbancja, widmo absorpcyjne, molowy współczynnik absorpcji (ekstynkcji). 10. Czym różni się chromatografia w odwróconym układzie faz od chromatografii w normalnym układzie faz? Który rodzaj chromatografii jest stosowany podczas ćwiczenia i na którym etapie? Literatura: 1. Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005, Rozdział 19 i 20, str Peter Williams Atkins, Chemia fizyczna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2007, Rozdział 17 (Charakterystyka przejść elektronowych), str Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), Katedra Analizy Środowiska, Uniwersytet Gdański, Gdańsk 2007 (opracownie dostępne na stronie internetowej: 7