(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/IE01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/IE01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO02/ (13) B1 (51) Int.Cl. C07K 1/04 ( ) C07K 1/06 ( ) C07K 1/10 ( ) C07K 7/23 ( ) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Sposób wytwarzania peptydu (30) Pierwszeństwo: , IE, 2000/1079 (73) Uprawniony z patentu: IPSEN MANUFACTURING IRELAND LIMITED, Dublin, IE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 21/04 (72) Twórca(y) wynalazku: STEVEN ALLEN JACKSON, Holliston, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/10 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Tykarski Wojciech SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH spółka jawna PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania peptydu o wzorze pglu-his-trp-ser-tyr-d-trp-leu- -Arg-Pro-Gly-NH 2. Hormon uwalniający hormon luteinizujący (LHRH) stanowi neuroprzekaźnik wytwarzany przez podwzgórze, stabilizujący wydzielanie hormonu luteinizującego (LHRH) i hormonu folikulotropowego (FSH) z przysadki mózgowej, które to hormony stymulują z kolei syntezę hormonów sterydowych, np. testosteronu, w gonadach. Wiele analogów peptydu LHRH (np. agonistów i antagonistów) sprzedaje się obecnie jako leki do leczenia endometriozy, raka prostaty, przedwczesnego dojrzewania oraz innych chorób związanych z zaburzeniami hormonalnymi. Synteza takich analogów LHRH jest trudna i kosztowna. Syntezę peptydów w fazie stałej wprowadzono w 1963 r., chcąc przezwyciężyć wiele problemów związanych z oczyszczaniem związków pośrednich występujących w przypadku syntezy peptydów w fazie ciekłej. Stewart i wsp., Solid Phase Peptide Syntesis (Pierce Chemical Co., wyd. 2) Podczas syntezy w fazie stałej aminokwasy łączy się ze sobą (tj. sprzęga) w peptyd o żądanej sekwencji, przy czym jeden z końców łańcucha (to jest C-koniec) jest zakotwiczony w nierozpuszczalnym nośniku. Po złożeniu oczekiwanej sekwencji na nośniku, peptyd oddziela się (to jest odszczepia) od nośnika. W opisie patentowym US nr (1977) opisano syntezę [D-Trp 6 ]-LHRH, w której łańcuchy boczne czterech z dziesięciu reszt agonisty LHRH są zabezpieczone (np. L-histydylo(tosyl), serylo(benzyl), tyrozylo(2,6-di-cl-bzl) i L-arginylo(tosyl)). Jednak Coy i wsp., Int. Peptide Protein Res. 14: 359 (1979) donieśli później o syntezie szeregu innych analogów LHRH, w przypadku których minimalne zabezpieczenie łańcuchów bocznych, np. zabezpieczenie tylko argininy w postaci soli (to jest Arg.HCl) prowadziło do wyższej wydajności w porównaniu do odpowiedniej syntezy z zabezpieczeniem. Niniejszy wynalazek jest oparty na odkryciu, że pomimo tendencji do niezabezpieczania łańcuchów bocznych aminokwasów podczas syntezy analogów LHRH, zabezpieczenie reszty tryptofanu podczas syntezy w fazie stałej istotnie zwiększa wydajność wytwarzania analogów LHRH zawierających resztę tryptofanu (np. [D-Trp 6 ]LHRH). Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania peptydu o wzorze (I): pglu-his-trp-ser-tyr-d-trp-leu-arg-pro-gly-nh 2 w którym reszta His jest zabezpieczona grupą tosylową oraz indolowa grupa NH w każdej z reszt Trp jest zabezpieczona, charakteryzującego się tym, że w kolejnych etapach: (a) przyłącza się sól cezową Boc-Gly do chlorometylowanej żywicy polistyrenowej z wytworzeniem Boc-Gly-żywicy; (b) odblokowuje się Boc-Gly-żywicę przez zmieszanie Boc-Gly-żywicy z mieszaniną kwasu organicznego usuwającego Boc, z wytworzeniem soli kwasu organicznego i H 2 N-Gly-żywicy; (c) zobojętnia się sól kwasu organicznego i H 2 N-Gly-żywicy z użyciem zasady, z wytworzeniem H 2 N-Gly-żywicy; (d) sprzęga się H 2 N-Gly-żywicę z Boc-α-amino-zabezpieczonym aminokwasem, który to zabezpieczony aminokwas odpowiada aminokwasowi zdefiniowanemu wzorem (I) w kolejności od C-końca do N-końca, przy czym: (i) H 2 N-Gly-żywicę poddaje się reakcji z Boc-α-amino-zabezpieczonym aminokwasem w obecności środka sprzęgającego peptyd, z wytworzeniem Boc-zablokowanego sprzęgniętego produktu; (ii) usuwa się grupę Boc z Boc-zablokowanego sprzęgniętego produktu przez zmieszanie tego Boc-zablokowanego sprzęgniętego produktu z kwasem organicznym usuwającym Boc, z wytworzeniem sprzęgniętego produktu; (iii) sprzęgnięty produkt poddaje się reakcji z następnym Boc-α-amino-zabezpieczonym aminokwasem w obecności środka sprzęgającego peptyd, z wytworzeniem Boc-zablokowanego sprzęgniętego produktu; (iv) usuwa się grupę Boc z Boc-zablokowanego sprzęgniętego produktu przez zmieszanie Boc-zablokowanego sprzęgniętego produktu z kwasem organicznym usuwającym Boc, z wytworzeniem kolejnego sprzęgniętego produktu; (v) powtarza się etapy (d) (iii) i (d) (iv) aż do sprzęgnięcia N-końcowego aminokwasu peptydu o wzorze (I), usunięcia grupy Boc z N-końcowego aminokwasu i tosylowej grupy zabezpieczającej łańcuch boczny z reszty His, z wytworzeniem zabezpieczonego gotowego peptydu-żywicy; (I),

3 PL B1 3 (e) odszczepia się i odbezpiecza zabezpieczony gotowy peptyd-żywicę, z wytworzeniem peptydu o wzorze (I), przy czym: (i) sporządza się roztwór zabezpieczonego gotowego peptydu-żywicy w mieszaninie metanol/obojętny polarny rozpuszczalnik aprotonowy; (ii) chłodzi się roztwór do około 0-10 C; (iii) powoli przepuszcza się pęcherzykami gazowy amoniak lub gazową etyloaminę przez roztwór aż do dokładnego wysycenia roztworu amoniakiem, z wytworzeniem roztworu nasyconego; (iv) miesza się ten roztwór nasycony bez chłodzenia przez godzin aż do przemiany > 95% wolnego estru metylowego w odpowiedni amid, w przypadku użycia gazowego amoniaku lub odpowiedni etyloamid, w przypadku użycia gazowej etyloaminy; oraz (f) wyodrębnia się peptyd z roztworu. Korzystnie następujące Boc-α-aminowane aminokwasy kolejno sprzęga się od C-końca do N-końca: N-α-Boc-L-prolinę, N-α-Boc-L-argininę HCl, N-α-Boc-L-leucynę, N-α-Boc-D-tryptofan(N'-indoloformyl), N-α-Boc-L-tyrozynę, hydrat N-α-Boc-L-seryny, N-α-Boc-tryptofan(N'-indoloformyl), sól N-α-Boc-L-histydyno(tosylo)cykloheksyloaminy i kwas piroglutaminowy. Korzystniej formylową grupę zabezpieczającą łańcuch boczny Trp usuwa się działając roztworem zawierającym amoniak, pierwszorzędową aminę lub drugorzędową aminę oraz metanol. Najkorzystniej stosuje się roztwór zawierający amoniak i metanol. Korzystnie w sposobie przy sprzęganiu N-α-Boc-D-tryptofano(N'-indoloformylu), N-α-Boc-L- -tyrozyny, hydratu N-α-Boc-L-seryny i N-α-Boc-tryptofano(N'-indoloformylu) stosuje się hydroksybenzotriazol (HOBT). Korzystnie w sposobie w odniesieniu do syntezy na fazie stałej peptydu o wzorze (I) zdefiniowanym powyżej tymczasowo zabezpiecza się wszelkie reszty tryptofanu z użyciem wrażliwej na działanie zasady grupy zabezpieczającej łańcuch boczny, przy czym tę grupę zabezpieczającą usuwa się podczas odszczepiania peptydu o wzorze (I) od stałego nośnika drogą reakcji z zasadą. Korzystniej jako grupę zabezpieczającą łańcuch boczny Trp lub D-Trp stosuje się grupę acylową. Jeszcze korzystniej grupę zabezpieczającą łańcuch boczny Trp lub D-Trp usuwa się działając roztworem zawierającym amoniak, pierwszorzędową aminę lub drugorzędową aminę oraz metanol. Także korzystniej jako grupę zabezpieczającą łańcuch boczny stosuje się grupę formylową, a jako zasadę roztwór metanolowy zawierający amoniak. Inne cechy i korzyści wynalazku staną się oczywiste po zapoznaniu się ze szczegółowym opisem wynalazku i zastrzeżeniami patentowymi. Skróty: BOC = t-butoksykarbonyl Cit = cytrulina cpzacala = cis-3-(4-pirazynylokarbonyloamonicykloheksylo)alanina harg(bu) = N-guanidyno(butylo)homoarginina harg(et) 2 = N,N'-guanidyno(dimetylo)homoarginina harg(ch 2 CF 3 ) 2 = N,N'-guanidynobis(2,2,2-trifluoroetylo)homoarginina HOBT = 1-hydroksybenzotriazol Lys(iPr) = N ε -izopropylolizyna β-nal = β-1-naftyloalanina lub β-2-naftyloalanina, o ile nie podano inaczej, NicLys = N ε -nikotynoilolizyna Pal = pirydyloalanina p-cl-phe = 3-(4-chlorofenylo)alanina p-f-phe = 3-(4-fluorofenylo)alanina PicLys = N ε -pikolinoilolizyna Qal = chinoliloalanina Uważa się, że w oparciu o niniejszy opis fachowiec może użyć niniejszego wynalazku w jak najszerszym zakresie. Poniższe szczegółowe jego postacie mają zatem jedynie charakter ilustracji i nie ograniczają zakresu wynalazku. O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie zastosowane tu określenia techniczne i naukowe mają powszechnie przyjęte znaczenie, zrozumiałe dla fachowców. Wszystkie publikacje, zgłoszenia patentowe, opisy patentowe i inne źródła literaturowe są włączone jako odnośniki.

4 4 PL B1 Peptyd o wzorze (I) można wytworzyć drogą syntezy peptydu w fazie stałej z użyciem chemii Boc na żywicy Merrifielda, a następnie odszczepienia peptydu od żywicy z użyciem amoniaku, aminy pierwszorzędowej lub aminy drugorzędowej w alkoholu, z wytworzeniem tytułowego peptydu. Pierwszym etapem tego sposobu według wynalazku jest przyłączenie soli cezowej C-końcowego aminokwasu, Boc-A 10, gdzie A 10 oznacza końcowy aminokwas, którym jest Gly, do żywicy Merrifielda wiązaniem estrowym. Sól cezową Boc-A 10 wytwarza się przez dodanie Boc-A 10 do węglanu cezu w mieszaninie metanolu i wody. Sól cezową Boc-A 10 suszy się pod próżnią, a następnie poddaje reakcji z grupami chlorometylobenzylowymi na polistyrenie w środowisku niewodnego polarnego rozpuszczalnika aprotonowego, takiego jak dimetyloformamid (DMF). Reakcję tę prowadzi się przez około godzin, korzystnie 36 godzin, w temperaturze C, a korzystnie w 50 C. Po reakcji żywicę odsącza się, płucze wodą, polarnym rozpuszczalnikiem aprotonowym, takim jak DMF, i alkoholem, takim jak metanol, a następnie suszy do stałej masy, korzystnie pod zmniejszonym ciśnieniem. Wysuszoną żywicę można badać w celu określenia zawartości Boc-A 10, wyrażanej w milimolach A 10 na gram suchej żywicy. Obliczoną wartość stosuje się do określenia skali reakcji przyłączania dla potrzeb prowadzonych następnie obliczeń wykorzystania materiału i wydajności teoretycznej. Syntezę peptydu o wzorze (I) można prowadzić na Boc-A 10 -żywicy umieszczonej w szklanym reaktorze wyposażonym w koliste filtry ze spiekanego szkła znajdujące się na dnie reaktora. Zawartość reaktora miesza się z użyciem mieszadła mechanicznego, a reaktor opróżnia się z użyciem ciśnienia gazu obojętnego, takiego jak azot, które wymusza przepływ cieczy przez filtr spiekany na dnie, podczas gdy żywica pozostaje w reaktorze. W pierwszej kolejności odszczepia się grupę Boc w Boc-A 10 (odblokowanie) od A 10 -żywicy przez dwukrotne mieszanie A 10 -żywicy z mieszaniną kwasu organicznego i chlorowanego rozpuszczalnika, korzystnie z 25% roztworem kwasu trifluoroctowego (TFA) w dichlorometanie (DCM), najpierw przez około 2 minuty, a następnie przez 25 minut, po czym żywicę odsącza się pod ciśnieniem azotu. A 10 -żywicę następnie przemywa się trzykrotnie DCM i dwukrotnie alkoholem, takim jak alkohol izopropylowy (IPA), a otrzymaną sól amino-tfa zobojętnia się dwukrotnie zasadą w obojętnym rozpuszczalniku, korzystnie w 10% roztworem trietyloaminy w DCM, za każdym razem przez około 5 minut i ponownie trzykrotnie przemywa DCM. Następnie żywicę sprzęga się z Boc-α-amino- -zabezpieczonymi aminokwasami w postaci mieszanin zawierających 2,5 równoważnika molowego, odpowiadającymi aminokwasom zdefiniowanym we wzorze (I) począwszy od C-końca do N-końca, z użyciem środka sprzęgającego peptyd, korzystnie diizopropylokarboimidu (DIC), w polarnych rozpuszczalnikach aprotonowych, korzystnie w mieszaninach DMF/DCM. Po każdym sprzęganiu prowadzi się przemywanie DMF i DCM. Żywicę można badać z użyciem testu ninhydrynowego Kaisera po zakończeniu sprzęgania, z wyjątkiem sprzęgania argininy, które to sprzęganie może być badane przy użyciu izatyny dla wykrycia drugorzędowej grupy aminowej resztkowej nie sprzęgniętej proliny. Grupa Boc jest usuwana z każdego sprzęgniętego aminokwasu po wykonaniu testu opisanego powyżej. Następujące zabezpieczone aminokwasy odpowiadające aminokwasom ze wzoru (I) stosuje się korzystnie w syntezie według wynalazku: N-α-Boc-L-prolinę, N-α-Boc-L-argininę HCl, N-α-Boc-L-leucynę, N-α-Boc-D-tryptofan(N'-indoloformyl), N-α-Boc-L-tyrozynę, hydrat N-α-Boc-L-seryny, sól N-α-Boc-L- -histydyno(tosylo)cykloheksyloaminy i kwas piroglutaminianowy. Można również stosować 1-hydroksybenzotriazol (HOBT) (3-5 równ.) przy sprzęganiu zabezpieczonych pochodnych D-Trp, Tyr, Ser i Trp. Grupę tosylową zabezpieczającą łańcuch boczny histydyny usuwa się poprzez dwukrotne podziałanie HOBT w DMF w ciągu 1 godziny (każde) po zakończeniu sprzęgania aminokwasów. Boc-D-tryptofan i Boc-L-tryptofan mają łańcuchy boczne zabezpieczone grupą formylową przy azocie pierścienia indolowego. Grupę formylową następnie usuwa się podczas odszczepiania peptydu od żywicy z użyciem zasady. Gotowy peptyd-żywicę spłukuje się do zważonego lejka ze spiekanego szkła z użyciem obojętnego chlorowanego rozpuszczalnika, takiego jak DCM, dwukrotnie przepłukuje alkoholem, takim jak metanol i suszy pod próżnią. Wysuszony peptyd-żywicę przenosi się do jednolitrowej, trójszyjnej, okrągłodennej kolby. Do tej okrągłodennej kolby wlewa się mieszaninę 9:1 metanolu/dmf w proporcji 15 ml na 1 g peptydu-żywicy. Roztwór chłodzi się do około < 10 C oraz, gdy wymagana jest amidowa postać C-końca, w trakcie intensywnego chłodzenia powoli przepuszcza się pęcherzykami gazowy amoniak do chwili wysycenia (czas dodawania około 1 godziny), przy czym peptyd uwalnia się od żywicy w postaci wolnego pośredniego estru metylowego. Roztwór następnie miesza się bez chłodzenia przez około godzin, podczas których około > 95% wolnego estru metylowego ulega konwersji do odpowiedniego produktu amidowego. Postęp reakcji może być monitorowany, np. metodą wy-

5 PL B1 5 sokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), a reakcja można zakończyć po uzyskaniu żądanego stopnia jej przebiegu. Produkt w roztworze przesącza się przez lejek ze spiekanego szkła, a żywicę przepłukuje się kilkakrotnie metanolem i DMF. Wszystkie ciecze z przemycia oraz przesącze zagęszcza się do postaci bardzo gęstego oleju. Po dodaniu octanu etylu roztwór rozciera się dla zestalenia produktu, dekantuje i ponownie rozciera z użyciem octanu etylu. Surowy produkt rozpuszcza się w metanolu, a następnie dodaje jednakową objętość 4N kwasu octowego. Roztwór zatęża się w celu całkowitego usunięcia metanolu. Następnie produkt rozcieńcza się 4N kwasem octowym. Postać peptydu z etyloamidem na C-końcu można otrzymać poprzez zastąpienie amoniaku etyloaminą w procedurze opisanej w powyższym akapicie, przy czym w trakcie wysycania roztworu etyloaminą temperaturę roztworu utrzymuje się poniżej około < 16 C, a korzystnie około 5-15 C. Surową substancję można oczyścić przez powtarzanie zabiegów preparatywnej chromatografii z odwróconymi fazami, a następnie liofilizować, z wytworzeniem produktu końcowego. Oczywiste dla fachowca będzie stosowanie innych układów rozpuszczalników, w tym między innymi alkoholi o małej masie cząsteczkowej, takich jak etanol, propanol, izopropanol, butanol, izobutanol, tert-butanol itp., innych polarnych rozpuszczalników aprotonowych oraz ich mieszanin. Następujący przykład opisano w celu zilustrowania sposobu według wynalazku i nie ogranicza on niniejszego wynalazku w żadnej mierze. P r z y k ł a d Synteza pglu-his-trp-ser-tyr-d-trp-leu-arg-pro-gly-nh 2 -([D-Trp 6 ]LHRH-NH 2 ) [D-Trp 6 ]LHRH-NH 2 wytworzono poprzez syntezę peptydu w fazie stałej z użyciem Boc na żywicy Merrifielda, a następnie poprzez odszczepienie peptydu od żywicy metanolowym roztworem amoniaku, z wytworzeniem tytułowego peptydu. Pierwszym etapem procesu było przyłączenie soli cezowej C-końcowego aminokwasu, Boc- -glicyny, do żywicy Merrifielda poprzez wiązanie estrowe. Sól cezową Boc-glicyny wytworzono drogą reakcji Boc-glicyny (40,9 g) z węglanem cezu (37,9 g) w mieszaninie metanolu i wody (80 ml/40 ml). Sól cezową Boc-glicyny wysuszono pod próżnią, a następnie poddano reakcji z grupami chlorometylobenzylowymi umieszczonymi na perełkach polistyrenu (żywica Merrifielda; Advanced Chemtech, 88,2 g) w bezwodnym dimetyloformamidzie (DMF; 200 ml). Reakcję prowadzano przez około 36 godzin w około 50 C w obrotowej wyparce Buchi Model 110. Przereagowaną żywicę odsączono, przepłukano wodą, DMF i metanolem, a następnie wysuszono do stałej masy w T < 35 C pod próżnią. Wysuszoną żywicę zbadano w celu określenia zawartości Boc-glicyny, wyrażonej w milimolach glicyny na gram suchej żywicy. Obliczoną wartość 0,872 milimoli/gram stosowano do określania dokładnej skali reakcji składania do obliczeń zużycia substancji w dalszych etapach i wydajności teoretycznej. Syntezę peptydu prowadzono z użyciem Boc-glicyny-żywicy (12,5 g) znajdującej się w 500 ml szklanym reaktorze z filtrami ze spiekanego szkła na górze i na dole reaktora. Reaktor napełniono od dołu i wstrząsano poprzez inwersję (obracanie o 180 przez 3 sekundy). Najpierw grupę Boc usunięto (odblokowanie) z glicyny-żywicy poprzez dwukrotne zmieszanie żywicy z 175 ml 25% kwasu trifluoroctowego (TFA) w dichlorometanie (DCM) (przez 2 minuty i 25 minut), po czym żywicę wysuszono pod ciśnieniem azotu. Żywicę trzykrotnie przepłukano 125 ml DCM i dwukrotnie 125 ml alkoholu izopropylowego (IPA), a następnie trzy razy 125 ml DCM. Otrzymaną sól amino-tfa zobojętniono dwukrotnie z użyciem 125 ml 10% trietyloaminy w DCM przez 5 minut za każdym razem, a następnie ponownie przepłukano trzy razy DCM. W kolejnym etapie żywicę sprzęgano i odblokowywano z użyciem mieszanin zawierających po 2,5 równoważnika molowego poniższych aminokwasów zabezpieczonych Boc i 4,2 ml diizopropylokarbodiimidu (DIC) w 16 ml DMF i 47 ml DCM: 5,84 g Boc-L-proliny, 8,93 g Boc-L-argininy HCl, 6,77 g Boc-L-leucyny, 9,0 g Boc-D-tryptofanu(formyl), 7,64 g Boc-L-tyrozyny, 9,0 g Boc-L-tryptofanu (formyl), 6,06 g hydratu Boc-L-seryny, 16 g soli Boc-L-histydyno(tosylo)cykloheksyloaminy oraz 13,5 g kwasu piroglutaminowego. Przy sprzęganiu D-Trp, Tyr, Ser i Trp stosowano również 1-hydroksybenzotriazol (HOBT) (3-5 równ.). Przy sprzęganiu Arg użyto 75 ml dimetyloacetamidu (DMA) zamiast DMF i DCM. Żywicę płukano DMF i DCM i badano ninhydryną w teście Kaisera pod kątem zakończenia sprzęgania. Grupę Boc usuwano z każdego sprzęgniętego aminokwasu, jak opisano powyżej. Łańcuch boczny histydyny był zabezpieczony tosylem, który usunięto przez dwukrotne podziałanie 4,16 g HOBT w 105 ml DMF przez 1 godzinę (każde płukanie) po ostatnim sprzęganiu aminokwasów. Boc-D- -tryptofan i Boc-L-tryptofan miały łańcuchy boczne zabezpieczone grupą formylową usuwaną podczas odszczepiania peptydu od żywicy.

6 6 PL B1 Gotowy peptyd z żywicą spłukano do zważonego lejka ze spiekanego szkła z użyciem DCM, przepłukano dwukrotnie metanolem i wysuszono pod próżnią. Wysuszony peptyd-żywicę przeniesiono do jednolitrowej, trójszyjnej, okrągłodennej kolby. Do kolby dodano 15 ml/gram peptydu-żywicy w mieszaninie 9:1 metanol/dmf (380 ml na skalę 10,9 mm). Roztwór ochłodzono do około < 10 C i przepuszczono powoli pęcherzykami gazowy amoniak z silnym chłodzeniem do chwili wysycenia (dodawanie w ciągu około 1 godziny). Roztwór dalej mieszano bez chłodzenia przez około godzin, do chwili, gdy około > 95% wolnego estru metylowego uległo konwersji do produktu amidowego, co stwierdzono monitorując postęp reakcji metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Produkt przesączono do roztworu w lejku ze spiekiem szklanym, a żywicę przepłukano kilkakrotnie metanolem i DMF. Wszystkie ciecze z przemycia oraz przesącze zagęszczono do postaci bardzo gęstego oleju w wyparce obrotowej w T < 40 C. Dodano octanu etylu (0,08 litra), a roztwór roztarto do zestalenia się produktu, zdekantowano i te czynności powtórzono z użyciem 0,08 g octanu etylu. Twardy, żywiczny produkt namoczono w octanie etylu na noc i zdekantowano ciecz. Surowy produkt rozpuszczano w metanolu (0,07 litra), a następnie dodano tę samą objętość 4N kwasu octowego. Roztwór zatężono w celu całkowitego usunięcia metanolu na wyparce obrotowej w T < 40 C. Następnie produkt rozcieńczono 4N kwasem octowym do około 35 gramów produktu/litr. Surowy produkt oczyszczono następnie metodą preparatywnej chromatografii z odwróconymi fazami, a potem liofilizowano i otrzymano produkt końcowy (8,4 g, wydajność 59%) w postaci białej substancji stałej o czystości > 99%. Na podstawie powyższego opisu, fachowiec może z łatwością zapoznać się z zasadniczą charakterystyką niniejszego wynalazku oraz może dokonać szeregu zmian i modyfikacji wynalazku w celu zaadaptowania go do różnych zastosowań i warunków, bez zmiany założeń i zakresu wynalazku. Tym samym, inne wykonania są również objęte zakresem zastrzeżeń patentowych. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania peptydu o wzorze (I): pglu-his-trp-ser-tyr-d-trp-leu-arg-pro-gly-nh 2 (I), w którym reszta His jest zabezpieczona grupą tosylową, oraz indolowa grupa NH w każdej z reszt Trp jest zabezpieczona, znamienny tym, że w następujących etapach: (a) przyłącza się sól cezową Boc-Gly do chlorometylowanej żywicy polistyrenowej z wytworzeniem Boc-Gly-żywicy; (b) odblokowuje się Boc-Gly-żywicę przez zmieszanie Boc-Gly-żywicy z mieszaniną kwasu organicznego usuwającego Boc, z wytworzeniem soli kwasu organicznego i H 2 N-Gly-żywicy; (c) zobojętnia się sól kwasu organicznego i H 2 N-Gly-żywicy z użyciem zasady, z wytworzeniem H 2 N-Gly-żywicy; (d) sprzęga się H 2 N-Gly-żywicę z Boc-α-amino-zabezpieczonym aminokwasem, który to zabezpieczony aminokwas odpowiada aminokwasowi zdefiniowanemu wzorem (I) w kolejności od C-końca do N-końca, przy czym: (i) H 2 N-Gly-żywicę poddaje się reakcji z Boc-α-amino-zabezpieczonym aminokwasem w obecności środka sprzęgającego peptyd, z wytworzeniem Boc-zablokowanego sprzęgniętego produktu; (ii) usuwa się grupę Boc z Boc-zablokowanego sprzęgniętego produktu przez zmieszanie tego Boc-zablokowanego sprzęgniętego produktu z kwasem organicznym usuwającym Boc, z wytworzeniem sprzęgniętego produktu; (iii) sprzęgnięty produkt poddaje się reakcji z następnym Boc-α-amino-zabezpieczonym aminokwasem w obecności środka sprzęgającego peptyd, z wytworzeniem Boc-zablokowanego sprzęgniętego produktu; (iv) usuwa się grupę Boc z Boc-zablokowanego sprzęgniętego produktu przez zmieszanie Boc-zablokowanego sprzęgniętego produktu z kwasem organicznym usuwającym Boc, z wytworzeniem kolejnego sprzęgniętego produktu; (v) powtarza się etapy (d) (iii) i (d) (iv) aż do sprzęgnięcia N-końcowego aminokwasu peptydu o wzorze (I), usunięcia grupy Boc z N-końcowego aminokwasu i tosylowej grupy zabezpieczającej łańcuch boczny z reszty His, z wytworzeniem zabezpieczonego gotowego peptydu-żywicy;

7 PL B1 7 (e) odszczepia się i odbezpiecza zabezpieczony gotowy peptyd-żywicę, z wytworzeniem peptydu o wzorze (I), przy czym: (i) sporządza się roztwór zabezpieczonego gotowego peptydu-żywicy w mieszaninie metanol/obojętny polarny rozpuszczalnik aprotonowy; (ii) chłodzi się roztwór do około 0-10 C; (iii) powoli przepuszcza się pęcherzykami gazowy amoniak lub gazową etyloaminę przez roztwór aż do dokładnego wysycenia roztworu amoniakiem, z wytworzeniem roztworu nasyconego; (iv) miesza się ten roztwór nasycony bez chłodzenia przez godzin aż do przemiany > 95% wolnego estru metylowego w odpowiedni amid, w przypadku użycia gazowego amoniaku lub odpowiedni etyloamid, w przypadku użycia gazowej etyloaminy; oraz (f) wyodrębnia się peptyd z roztworu. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że następujące Boc-α-aminowane aminokwasy kolejno sprzęga się od C-końca do N-końca: N-α-Boc-L-prolinę, N-α-Boc-L-argininę HCl, N-α-Boc-L- -leucynę, N-α-Boc-D-tryptofan(N'-indoloformyl), N-α-Boc-L-tyrozynę, hydrat N-α-Boc-L-seryny, N-α- -Boc-tryptofan(N'-indoloformyl), sól N-α-Boc-L-histydyno(tosylo)cykloheksyloaminy i kwas piroglutaminowy. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że formylową grupę zabezpieczającą łańcuch boczny Trp usuwa się działając roztworem zawierającym amoniak, pierwszorzędową aminę lub drugorzędową aminę, oraz metanol. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się roztwór zawierający amoniak i metanol. 5. Sposób według zastrz. 1-4, znamienny tym, że przy sprzęganiu N-α-Boc-D-tryptofano(N'-indoloformylu), N-α-Boc-L-tyrozyny, hydratu N-α-Boc-L-seryny i N-α-Boc-tryptofano(N'-indoloformylu) stosuje się hydroksybenzotriazol (HOBT). 6. Sposób według zastrz. 1, w odniesieniu do syntezy na fazie stałej peptydu o wzorze (I) zdefiniowanym w zastrz. 1, znamienny tym, że tymczasowo zabezpiecza się wszelkie reszty tryptofanu z użyciem wrażliwej na działanie zasady grupy zabezpieczającej łańcuch boczny, przy czym tę grupę zabezpieczającą usuwa się podczas odszczepiania peptydu o wzorze (I) od stałego nośnika drogą reakcji z zasadą. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako grupę zabezpieczającą łańcuch boczny Trp lub D-Trp stosuje się grupę acylową. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że grupę zabezpieczającą łańcuch boczny Trp lub D-Trp usuwa się działając roztworem zawierającym amoniak, pierwszorzędową aminę lub drugorzędową aminę oraz metanol. 9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako grupę zabezpieczającą łańcuch boczny stosuje się grupę formylową, a jako zasadę roztwór metanolowy zawierający amoniak.

8 8 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)